CN110579609A - Akr1b10化学发光定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种用磁微粒化学发光法检测醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白含量的定量试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。所述试剂盒包括：AKR1B10校准品、AKR1B10质控品、链霉亲和素磁珠、生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、激发液1和2。待测血清中的AKR1B10与生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体结合形成双抗体夹心复合物，加入链霉亲和素磁珠，用激发液1和2激发检测发光值，通过标准曲线计算得出样品中AKR1B10的浓度。采用本试剂盒进行检测具有稳定性好、灵敏度高、线性范围广等特点。

Description

AKR1B10化学发光定量检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及一种用磁微粒化学发光法检测醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白含量的定量试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。该试剂盒基于夹心ELISA的免疫比浊法、酶联免疫法、时间分辨免疫荧光法、化学发光及电化学发光法。
背景技术
肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌等均是目前多发和常见的癌症，并且致死率非常高。目前还缺乏有效地针对肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌患者的早期检测、疗效判断、预后评估或复发监测的方法。因此，急需新的特异性好、灵敏度高、操作简易、对人体无危害、能在癌症发病的早期及时诊断、并且对于疗效判断、预后评估或复发监测等具有实用价值的靶标和检测评估方法。
通过本发明研究发现，AKR1B10是一种人类醛酮还原酶蛋白，属于一种全新的肿瘤蛋白标志物，可用于多种癌症病变的检测。AKR1B10在肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌等肿瘤中高表达，促进肿瘤的生长并产生耐药性。通过抑制AKR1B10可以抑制肿瘤的生长，并增加肿瘤对化疗药物的敏感性。在肿瘤细胞中表达的AKR1B10可以分泌到血液中，使癌症患者血液中AKR1B10蛋白的表达水平升高。因此，通过检测血清中AKR1B10蛋白的水平，可以提示肿瘤的存在/复发，及抗癌治疗或复发监测的效果。
发明内容
针对上述问题，我们开发了一种检测肿瘤特异性标志物醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白的化学发光定量检测试剂盒。该试剂盒将化学发光技术与磁分离技术相结合，用于受试者血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本中的AKR1B10蛋白的检测，采用本试剂盒进行检测具有稳定性好、灵敏度高、线性范围广等特点。
具体而言，本发明涉及如下内容：
1.本发明涉及一种化学发光法定量检测醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白的测定试剂盒。
2.项1中所述试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测，包括：
a）利用所述试剂盒检测来自受试者样本中AKR1B10蛋白的水平；
b）将a中测得的AKR1B10蛋白水平与正常样本中的相应水平比较。
3.项1-2中所述试剂盒包括：AKR1B10校准品、AKR1B10质控品、链霉亲和素磁珠溶液、生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、激发液1和激发液2。
4.项3中所述AKR1B10校准品和AKR1B10质控品为AKR1B10抗原以一定浓度溶解于样品缓冲液中配制而成。
5.项3中所述试剂盒中：
a) 所述生物素标记抗体为生物素标记的兔抗AKR1B10多克隆抗体，作为试剂盒的捕获抗体，特异性的识别AKR1B10抗原；
b) 所述吖啶酯标记抗体为吖啶酯标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体，作为试剂盒的检测抗体，可特异性的识别AKR1B10抗原。
6.项5中所述的捕获抗体是AKR1B10抗原免疫家兔后获得的兔抗AKR1B10多克隆抗体，检测抗体使用鼠源性AKR1B10单克隆抗体细胞株亲和纯化获得，本申请人研发了两株鼠源性单抗细胞株8-DC-1和9-DC-2，保藏号分别为CGMCC No. 9249和CGMCC No. 9250，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是：北京朝阳区北辰西路1号院3号，经检测存活。
所述试剂盒还包括：
样品稀释液：1x PBS（pH值为7.2），内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）。
浓缩清洗液：50mM Tris-HCl（PH7.8），21%氯化钠，2.5% Tween20。
链霉亲和素磁珠（购于Thermo Fisher公司）。
激发液1，是将0.05M HNO3和0.65% H2O2溶于纯化水中，pH值为1.21；激发液2，是将0.25M NaOH溶于纯化水中，pH值为13.31。本发明的试剂盒中未详细描述的试剂组分（如一些必要的缓冲液）、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。
本发明的方法中未详细描述的操作步骤也可以参照所属领域的常规操作进行。例如，在检测前可将各试剂组分放置室温（18~25℃）平衡，加样前充分混匀等；所用仪器设备，如化学发光测定仪的使用按照说明书操作进行。
本发明中，未特别注明单位的比例与含量，固体组分为质量比例与含量，液体组分为体积比例与含量。
本发明提供的AKR1B10化学发光定量检测试剂盒具有如下优势：
a) 本发明以生物素标记捕获抗体，同时以吖啶酯标记检测抗体，通过化学反应标记抗体，分离纯化，极大的提高了反应的灵敏度；
b) 本发明以链霉亲和素磁珠为固相载体，利用生物素-链霉亲和素系统，使免疫反应更容易混匀和结合，而且大大提高了反应速度；
c) 本发明以吖啶酯为发光物质，无需底物催化即可发光，具有发光迅速、信号强、本底值低等特点，有利于信号的检测，提高了试剂盒最终的灵敏度和特异性；
d) 本试剂盒稳定性良好，有效期可至一年以上。
附图说明
图1.本发明试剂盒的校准品曲线线性图。
图2.本发明试剂盒检测正常人和肝癌患者血清中AKR1B10蛋白的含量。
图3.本发明试剂盒检测正常人和乳腺癌患者血清中AKR1B10蛋白的含量。
图4.本发明试剂盒检测正常人和肺癌患者血清中AKR1B10蛋白的含量。
具体实施方法
本发明提供了一种醛酮还原酶1B10（AKR1B10）化学发光定量检测试剂盒，具体实施例仅用于更清楚的说明本发明，参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用到的部分试剂材料均可商购获得（捕获抗体和检测抗体为本公司专利产品，专利号：ZL 20141057977.0，授权公告号：CN 104650234 B），所用各仪器设备也是所属领域的现有设备，未注明具体条件的实验方法均为所属领域熟知的常规方法和条件。
实例1. AKR1B10化学发光定量检测试剂盒的制备。
一，AKR1B10校准品、AKR1B10质控品的配制方法如下：
用1x PBS溶液溶解AKR1B10抗原，配制AKR1B10校准品，工作浓度分别为0、375、750、1500、3000、6000pg/ml。其中所述1x PBS溶液pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）。
用1x PBS溶液溶解AKR1B10抗原，配制AKR1B10质控品，工作浓度分别为375、3000pg/ml。其中所述1x PBS溶液pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）。
二，生物素标记抗体制备方法如下：
将兔抗AKR1B10多克隆抗体与生物素藕联制备得到生物素标记抗体。
（1）将待标记的兔抗AKR1B10多克隆抗体用脱盐柱置换成缓冲液为1x PBS溶液中。
（2）将步骤（1）中的抗体与10mM浓度的生物素混合，使用生物素和抗体的分子比为20:1，室温（18~25℃）轻轻振荡反应2小时。
（3）再将标记后的抗体溶液用脱盐柱置换成缓冲液为1x PBS溶液中，去除游离的生物素，-80℃保存，制备得到所需的生物素标记抗体。
三，吖啶酯标记抗体制备方法如下：
将鼠抗AKR1B10单克隆抗体与吖啶酯藕联制备得到吖啶酯标记抗体。
（1）将待标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体用脱盐柱置换成缓冲液为1x PBS溶液中。
（2）将步骤（1）中的抗体与浓度为1mg/ml浓度的吖啶酯混合，吖啶酯和抗体的分子比为5：1，室温（18~25℃）轻轻振荡反应30分钟。
（3）再将标记后的抗体溶液用脱盐柱置换成缓冲液为1x PBS溶液中，去除游离的吖啶酯，-80℃保存，制备得到所需的吖啶酯标记抗体。
四，激发液1和2的制备方法如下：
激发液1，是将0.05M HNO3和0.65% H2O2充分溶解于纯化水中，调整pH值为1.21；
激发液2，是将0.25M NaOH充分溶解于纯化水中，调整pH值为13.31。
本发明的AKR1B10化学发光定量检测试剂盒还包含清洗液，该清洗液主要用于检测过程中清洗链霉亲和素磁珠与免疫反应复合物结合后的样品，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是Tris-HCl、氯化钠、Tween20和Proclin300的混合溶液，在该试剂盒中以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配制方法是：50mM Tris-HCl（PH7.8），21%氯化钠，2.5% Tween20，充分混匀后2~8℃保存，使用前稀释25倍。
实例2. 用AKR1B10化学发光定量检测试剂盒检测AKR1B10抗原
检测AKR1B10抗原的步骤如下：
（1）分别取6支试管，各管中分别加入10ul各组分AKR1B10校准品，再加入100ul生物素标记抗体和100ul吖啶酯标记抗体，37℃振荡反应15分钟；
（2）各管中分别加入50ul链霉亲和素磁珠溶液，37℃振荡反应15分钟；
（3）使用磁分离，每管加入300ul清洗液，将反应管中试剂反复洗涤3次 ；
（4）各管中分别加入100ul激发液1和激发液2，用化学发光仪器检测发光强度；
（5）数据分析：
通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线（参见图1）。其中，横坐标代表校准品的浓度值，纵坐标代表校准品的发光值，R2=0.9982。
实例3. 用AKR1B10化学发光定量检测试剂盒检测正常人和肝癌患者血清样本中AKR1B10蛋白的含量
（1）各管中分别加入10ul血清样本和AKR1B10校准品，分别再加入100ul生物素标记抗体和100ul吖啶酯标记抗体，37℃振荡反应15分钟；
（2）各管中分别加入50ul链霉亲和素磁珠溶液，37℃振荡反应15分钟；
（3）使用磁分离，每管加入300ul清洗液，将反应管中试剂反复洗涤3次 ；
（4）各管中分别加入100ul激发液1和激发液2，用化学发光仪器检测发光强度；
（5）数据分析：
选取50例健康人、105例肝癌患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10蛋白的平均水平具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（参见图2）。
实例4. 用AKR1B10化学发光定量检测试剂盒检测正常人和乳腺癌患者血清样本中AKR1B10蛋白的含量
采用与实例3相同的方法检测血清样本，选取37例健康人、74例乳腺癌患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10蛋白的平均水平具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（参见图3）。
实例5. 用AKR1B10化学发光定量检测试剂盒检测正常人和肺癌患者血清样本中AKR1B10蛋白的含量
采用与实例3相同的方法检测血清样本，选取43例健康人、80例乳腺癌患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10蛋白的平均水平具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（参见图4）。

Claims (8)

1.一种抗人肿瘤特异性标志物醛酮还原酶1B10（Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10）蛋白的化学发光定量检测试剂盒，主要用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测，所述试剂盒主要包括AKR1B10校准品、AKR1B10质控品、链霉亲和素磁珠溶液、生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、激发液1和2；所述激发液1，是将0.05M HNO3和0.65%H2O2充分溶解于纯化水中，调整pH值为1.21；激发液2，是将0.25M NaOH充分溶解于纯化水中，调整pH值为13.31。
2.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记抗体是将鼠抗AKR1B10单克隆抗体与生物素藕联制备而成，缓冲液为1x PBS，pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v），所述吖啶酯标记抗体是将兔抗AKR1B10多克隆抗体与吖啶酯藕联制备而成，缓冲液为1x PBS，pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）。
3.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述的AKR1B10校准品，其工作浓度分别为0、375、750、1500、3000、6000pg/mL，缓冲液为1x PBS，pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）；
所述的AKR1B10质控品，其工作浓度分别为1000 pg/mL、5000pg/mL，缓冲液为1x PBS，pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）；
所述链霉亲和素磁珠溶液，是将链霉亲和素磁珠溶于1x PBS，pH值为7.2，内含0.1%的吐温20（v/v）、1%的牛血清白蛋白（w/v）、0.5%的Proclin300（v/v）。
4.根据权利要求1至3任一项所述的试剂盒在血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本中的AKR1B10蛋白检测中的应用。
5.一种抗人肿瘤特异性标志物醛酮还原酶1B10（Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10）蛋白的化学发光定量检测方法，其特征在于：所述方法是利用权利要求1所述的试剂盒采用双抗体夹心免疫检测法：待测血清中的AKR1B10蛋白与生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体结合，再与链霉亲和素磁珠结合，加入激发液1和2，检测其发光值，通过标准曲线计算得出样品中AKR1B10的浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征于所述方法具体步骤如下：
（1）在不同反应管中分别加入10ul血清样本和AKR1B10校准品，分别再加入100ul生物素标记抗体和100ul吖啶酯标记抗体，37℃振荡反应15分钟；
（2）各管中分别加入50ul链霉亲和素磁珠溶液，37℃振荡反应15分钟；
（3）使用磁分离，每管加入300ul清洗液，将反应管中试剂反复洗涤3次 ；
（4）各管中分别加入100ul激发液1和激发液2，用化学发光仪器检测发光强度；
（5）数据分析：
通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征于所述方法主要用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
8.权利要求1所述的试剂盒或权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述癌症为肝癌、乳腺癌或肺癌。
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