CN109490549A - 一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。本发明的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，包括：1)链霉亲和素包被的磁微粒；2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；4)校准品与质控品；所述校准品与质控品各含高、低两个浓度点。本发明提供的一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法的原理，同时利用亲和素‑生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本。

Description

一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测 试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌酸激酶CK是由两个亚基组成的二聚体，分别由位于14和19号染色体不同基因编码的M和B两个亚基构成，可以组成3种同工酶，分别为CKMM、 CKMB和CKBB，其中混合单体的肌酸激酶同工酶主要来源于心肌(心肌中CK-MB占CK总量的15％～25％)。这三种同工酶分子量相同，催化相同的化学反应，但其分子结构和来源不同。
肌酸激酶CK是一个大的二聚体蛋白质，其中M亚基具有一个小的N-末端结构和一个大的C-末端结构；M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为 43kDa左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶是一个紧密的球状结构，近来关于肌酸激酶构象变化和活力变化关系的研究显示了酶分子活性部位构象的柔性，即酶分子活性部位的微区构象在变性剂作用下易发生改变而导致酶分子快速失活，此时酶分子整体构象尚未发生明显变化。
血清中CK-MB含量的测定可以辅助诊断心肌损伤。心肌梗塞(AMI)并伴有胸痛的患者，心肌损伤发作3～8小时后出现CK-MB含量升高，12～24h时达到高峰浓度，24～48h内通常恢复到基准水平。这种上升而后迅速下降的模式是表现心肌梗塞的典型模式，但在某些情况下，心肌梗塞可能作为并发症出现，因此监测病人的CK-MB水平有助于早期发现心肌梗塞情况。
除心肌梗塞外，冠状动脉旁路手术、瓣膜替换术或先天性缺损修复术等心脏手术也可能导致血清中CK-MB含量升高，但不表现出心肌梗塞的典型模式。骨骼肌损伤、皮肌炎、雷依氏综合征、横纹肌损伤或慢性酒精中毒等情况也可能导致血清中CK-MB含量升高。
目前用于检测肌酸激酶同工酶的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定性长等特点，但试剂的检测灵敏度较低。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。
目前市售的肌酸激酶同工酶检测试剂盒主要分为以下2种：一是Elisa方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株肌酸激酶同工酶抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株肌酸激酶同工酶抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中肌酸激酶同工酶的浓度；二是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株肌酸激酶同工酶抗体标记生物素，另一株肌酸激酶同工酶抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。
以上定量检测肌酸激酶同工酶的方法存在以下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器昂贵。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，包括：
1)链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品与质控品；
所述校准品与质控品各含高、低两个浓度点。
在上述技术方案中，所述链霉亲和素包被的磁微粒中磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20。
在上述技术方案中，所述生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体中肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：5-1：20。
在上述技术方案中，所述吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体中肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：5-1：20。
一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)链霉亲和素包被的磁微粒的制备
取磁微粒，用缓冲液清洗，然后稀释，添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h 后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用缓冲液清洗，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用缓冲液清洗，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取肌酸激酶同工酶抗体，用缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用缓冲液稀释，添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取肌酸激酶同工酶抗体，用缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用缓冲液稀释，添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)制备标准品；
5)制备质控品；
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
在上述技术方案中，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液。
在上述技术方案中，所述缓冲液为20mM PB缓冲液。
在上述技术方案中，步骤1)中稀释后的磁微粒的浓度为10mg/mL。
在上述技术方案中，步骤1)中制备的链霉亲和素包被的磁微粒用20mM PB 缓冲液稀释至10mg/mL。
本发明的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，步骤如下：
1)样本中肌酸激酶同工酶抗原与生物素标记的肌酸激酶同工酶第一抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶第二抗体发生免疫反应，形成生物素-肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯溶剂；
2)链霉亲和素包被的磁微粒与生物素结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素- 肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与肌酸激酶同工酶的量成正比。
本发明具有以下的有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法的原理，同时利用亲和素-生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒剂量反应校准曲线。
图1中具体相关参数如下表：
校准点 校准品浓(ng/mL) 光量
1 0.00 86
2 2.52 2323
3 5.28 5260
4 18.06 20938
5 67.94 99341
6 306.04 561737
具体实施方式
下面结合附图对本发明做以详细说明。
本发明提供一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：
1)链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品与质控品，各含高、低两个浓度点。
本发明还提供一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
1)链霉亲和素包被的磁微粒
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育 18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：5-1：20添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：5-1：20添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)制备标准品；
5)制备质控品；
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
本发明的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，步骤如下：
1)样本中肌酸激酶同工酶抗原与生物素标记的肌酸激酶同工酶第一抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶第二抗体发生免疫反应，形成生物素-肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯溶剂；
2)链霉亲和素包被的磁微粒与生物素结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素- 肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与肌酸激酶同工酶的量成正比。
所述校准品可通过以下方法制备得到：
①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、67.94ng/mL、306.04ng/mL 的校准品，等量分装成浓度分别为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、67.94ng/mL、306.04ng/mL的6瓶校准品。校准曲线参见图1。
实施例1
本实施例提供了一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
1)链霉亲和素包被的磁微粒的制备
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：15的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18h 后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育18h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至 10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：10添加生物素，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液 (含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：10添加吖啶酯，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液 (含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品的制备：
①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、67.94ng/mL、306.04ng/mL 的校准品，等量分装成浓度分别为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、 67.94ng/mL、306.04ng/mL的6瓶校准品；
5)质控品的制备：
①质控品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得质控品缓冲液分别配制成浓度为17.92ng/mL，176.72ng/mL的质控品，等量分装成浓度分别为17.92ng/mL， 176.72ng/mL的2瓶质控品。
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
实施例2
本实施例提供了一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
1)链霉亲和素包被的磁微粒的制备
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：10的比例添加链霉亲和素，37℃孵育20h 后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育20h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至 10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：5添加生物素，37℃孵育3h进行标记，然后加入封闭液 (含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育3h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：5添加吖啶酯，37℃孵育3h进行标记，然后加入封闭液 (含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育3h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品的制备：
①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、67.94ng/mL、306.04ng/mL 的校准品，等量分装成浓度分别为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、 67.94ng/mL、306.04ng/mL的6瓶校准品；
5)质控品的制备：
①质控品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得质控品缓冲液分别配制成浓度为17.92ng/mL，176.72ng/mL的质控品，等量分装成浓度分别为17.92ng/mL， 176.72ng/mL的2瓶质控品。
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
实施例3
本实施例提供了一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
1)链霉亲和素包被的磁微粒的制备
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育24h 后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至 10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：20添加生物素，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取一定量的肌酸激酶同工酶抗体，用20mM PB缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用20mM PB缓冲液稀释至1mg/mL，按照肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：20添加吖啶酯，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液 (含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品的制备：
①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、67.94ng/mL、306.04ng/mL 的校准品，等量分装成浓度分别为0ng/mL，2.52ng/mL、5.28ng/mL、18.06ng/mL、 67.94ng/mL、306.04ng/mL的6瓶校准品；
5)质控品的制备：
①质控品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的肌酸激酶同工酶用①步所得质控品缓冲液分别配制成浓度为17.92ng/mL，176.72ng/mL的质控品，等量分装成浓度分别为17.92ng/mL， 176.72ng/mL的2瓶质控品。
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
实施例4
本发明提供一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，采用一步法两步孵育，具体步骤如下：
1)样本中肌酸激酶同工酶抗原与生物素标记肌酸激酶同工酶第一抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶第二抗体发生免疫反应，形成生物素-肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯溶剂；
2)链霉亲和素包被的磁珠与生物素结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-肌酸激酶同工酶抗体-肌酸激酶同工酶-肌酸激酶同工酶抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与肌酸激酶同工酶的量成正比。
本发明提供的一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法，利用吖啶酯瞬时发光及磁珠分离技术，并利用生物素- 亲和素体系级联放大效应，大大提高了检测试剂的灵敏度，减少反应时间，降低噪音干扰等优点。
本试剂盒主要由三项试剂组成，分别包括1)链霉亲和素包被的磁微粒；2) 生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；与其他厂家的链霉亲和素磁珠-生物素-肌酸激酶同工酶抗体相比，具有工艺简单、磁珠的分散态良好，磁珠不易凝集，试剂重复性好等优点。
将步骤1)制得的链霉亲和素包被的磁微粒与步骤2)制得的生物素标记的肌酸激酶同工酶单克隆抗体第一抗体结合反应，得磁珠-SA-生物素-肌酸激酶同工酶抗溶剂。
实施例5
本发明实施例1制备的试剂盒的性能评估
①最低检测限检测
用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20 次检测结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度—RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限，结果应符合应小于＜0.18ng/mL。结果如表1所示：
表1.最低检测限数据
②线性检测
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。按照试剂盒说明书进行操作，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应符合线性范围为0.3ng/mL～ 300ng/mL，线性相关系数r应≥0.9900。结果如表2所示：
表2.线性数据
③重复性检测
用同一批号试剂盒，对高值和低值两个浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值和标准差SD，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合变异系数(CV)应≤8.0％。
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
—测量结果的平均值。
结果如表3所示：
表3.重复性数据
测定次数 重复性样本1 重复性样本2
Rep1 19.50 231.05
Rep2 19.55 226.28
Rep3 18.08 229.71
Rep4 19.00 225.14
Rep5 19.16 229.46
Rep6 19.13 224.11
Rep7 18.26 223.34
Rep8 19.61 228.57
Rep9 20.54 221.08
Rep10 19.75 228.41
测定均值 19.26 226.72
SD 0.72 3.23
CV 3.72％ 1.43％
由检测结果显示本发明的试剂盒检测线性相关系数r≥0.9900，即线性检测合格；最低检测限是＜0.18ng/mL；重复性检测结果符合变异系数(CV)应≤8.0％要求，即重复性检测合格。本试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括：
1)链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)校准品与质控品；
所述校准品与质控品各含高、低两个浓度点。
2.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒中磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20。
3.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体中肌酸激酶同工酶抗体与生物素摩尔比1：5-1：20。
4.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体中肌酸激酶同工酶抗体与吖啶酯摩尔比1：5-1：20。
5.一种权利要求1-4任意一项所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)链霉亲和素包被的磁微粒的制备
取磁微粒，用缓冲液清洗，然后稀释，添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用缓冲液清洗，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用缓冲液清洗，得到链霉亲和素包被的磁微粒；
2)生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取肌酸激酶同工酶抗体，用缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用缓冲液稀释，添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体；
3)吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备
取肌酸激酶同工酶抗体，用缓冲液置换肌酸激酶同工酶抗体保存液，然后用缓冲液稀释，添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体；
4)制备标准品；
5)制备质控品；
6)分装上述链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的肌酸激酶同工酶抗体、吖啶酯标记的肌酸激酶同工酶抗体、校准品与质控品，组装成成品。
6.根据权利要求5所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液。
7.根据权利要求5所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为20mM PB缓冲液。
8.根据权利要求5所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)中稀释后的磁微粒的浓度为10mg/mL。
9.根据权利要求5所述的检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1)中制备的链霉亲和素包被的磁微粒用20mM PB缓冲液稀释至10mg/mL。
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