CN108896772A - 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108896772A CN108896772A CN201810879496.2A CN201810879496A CN108896772A CN 108896772 A CN108896772 A CN 108896772A CN 201810879496 A CN201810879496 A CN 201810879496A CN 108896772 A CN108896772 A CN 108896772A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- insulin antibody
- antibody
- streptavidin
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法，利用吖啶酯瞬时发光及磁珠分离技术，并利用生物素‑亲和素体系级联放大效应，与其他厂家的链霉亲和素磁珠‑生物素‑胰岛素抗体相比本发明将步骤1)制得的包被有链霉亲和素的磁珠与步骤2)制得的标记有生物素的胰岛素抗体第一抗体结合反应，得磁珠‑SA‑生物素‑胰岛素抗溶剂，大大提高了检测试剂的灵敏度，减少反应时间，降低噪音。本发明提供的试剂盒的制备方法，具有工艺简单、制得的磁珠的分散态良好，磁珠不易凝集，所用试剂重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
胰岛素(Insulin,Ins)是由胰腺内胰岛β细胞合成、储存和分泌的蛋白质激素，是体内唯一能够降低血糖的激素。人胰岛素是由51个氨基酸组成的多肽，分子量约为5808Da，含A链(21个氨基酸)和B链(30个氨基酸)，肽链间以两条二硫键相连。最初，胰岛素作为一个大分子—前胰岛素原(110个氨基酸)储存于胰岛β细胞中。前胰岛素原裂解出一个含有24个氨基酸的肽，形成胰岛素原。胰岛素原经蛋白酶和羧肽酶的作用切下中间部分C链(C肽)，将胰岛素原的羧基端部分(A链)和氨基端部分(B链)通过二硫键结合在一起形成胰岛素。胰岛素在血清或者血浆中的半衰期是5至10分钟。
成熟的胰岛素储存在胰岛β细胞内的分泌囊泡中，与锌离子配位形成六聚体。在内源性或者外源性物质如葡萄糖、乳糖和核糖等刺激下随分泌囊泡释放至血液中，并发挥其生理作用。循环中的胰岛素大约50％被肝脏清除。胰岛素的生物作用是通过与靶细胞膜上的受体结合而发挥作用，靶组织主要是肝脏、脂肪和肌肉组织。胰岛素主要通过刺激肝糖原的合成、脂肪组织中甘油三酯的合成以及肌肉中蛋白质的合成来降低血液中葡萄糖的浓度。
胰岛素代谢紊乱会引发糖尿病。胰岛素检测包括空腹和餐后，可以用于判定糖尿病的类型(Ⅰ型或者Ⅱ型)。临床上，糖尿病分为两种类型:Ⅰ型(胰岛素依赖型，IDDM)和Ⅱ型(胰岛素非依赖型，NIDDM)。Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫损坏或者存在胰岛素自身抗体导致胰岛素绝对缺乏引起，Ⅱ型糖尿病是由于肥胖、高热量饮食、体力活动不足等导致患者的胰岛素分泌能力及身体对胰岛素的敏感性下降，导致血糖升高。
目前用于检测胰岛素的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定性长等特点，但试剂的检测灵敏度较低。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。
目前市售的胰岛素检测试剂盒主要分为以下2种：一是ELISA方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株胰岛素抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株胰岛素抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中胰岛素的浓度；二是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株胰岛素抗体标记生物素，另一株胰岛素抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。
以上定量检测胰岛素的方法存在以下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器昂贵。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明提供的检测试剂盒用于检测血清/血浆中胰岛素，具有灵敏度高，特异性好，操作简单等优点。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，包括：
1)用20mM PB缓冲液稀释的链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)校准品；
5)质控品；
所述校准品和质控品分别各含高、低两个浓度点。
在上述技术方案中，所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20。
在上述技术方案中，所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：15。
在上述技术方案中，所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：5-1：20。
在上述技术方案中，所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：10。
在上述技术方案中，所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：5-1：20。
在上述技术方案中，所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：10。
一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取磁微粒，用PB缓冲液清洗，然后稀释，添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用PB缓冲液清洗，加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用PB缓冲液清洗，最后用20mM PB缓冲液稀释后保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取胰岛素抗体，用PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用PB缓冲液稀释，添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取胰岛素抗体，用PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用PB缓冲液稀释，添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，采用一步法两步孵育，具体步骤如下：
1)样本中胰岛素抗原与生物素标记的胰岛素抗体、吖啶酯标记的胰岛素抗体发生免疫反应，形成生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯溶剂；
2)向步骤1)的溶剂中加入链霉亲和素包被的磁微粒溶液，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与胰岛素的量成正比。
在上述技术方案中，所述酸性激发液为过氧化氢和硝酸的混合溶液，所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法，利用吖啶酯瞬时发光及磁珠分离技术，并利用生物素-亲和素体系级联放大效应，与其他厂家的链霉亲和素磁珠-生物素-胰岛素抗体相比本发明将步骤1)制得的包被有链霉亲和素的磁珠与步骤2)制得的标记有生物素的胰岛素抗体第一抗体结合反应，得磁珠-SA-生物素-胰岛素抗溶剂，大大提高了检测试剂的灵敏度，减少反应时间，降低噪音。
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，具有工艺简单、制得的磁珠的分散态良好，磁珠不易凝集，所用试剂重复性好等优点。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明提供的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒剂量反应曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做以详细说明。
本发明提供一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，包括：
1)用20mM PB缓冲液稀释的链霉亲和素包被的磁微粒溶液；2)生物素标记的胰岛素抗体；3)吖啶酯标记的胰岛素抗体；4)校准品；5)质控品；所述校准品和质控品分别各含高、低两个浓度点。优选所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20。最优选所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：15。优选所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：5-1：20。最优选所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：10。优选所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：5-1：20。最优选所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：10。
所述校准品可通过以下方法制备得到：
①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，pH值6.5，2-8℃存放备用；
②取一定量的胰岛素用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0mU/L，5mU/L、10mU/L、25mU/L、100mU/L、250mU/L、800mU/L、1000mU/L的校准品，等量分装成浓度分别为0mU/L，5mU/L、10mU/L、25mU/L、100mU/L、250mU/L、800mU/L、1000mU/L的8瓶校准品。
本发明还提供一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释后保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与生物素摩尔比1：5-1：20添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与吖啶酯摩尔比1：5-1：20添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2-5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
作为本发明一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备方法的一个优选方案，步骤1)中所述磁微粒与链霉亲和素质量比1：15；步骤2)中所述胰岛素抗体与生物素摩尔比1：10；步骤3)中所述胰岛素抗体与吖啶酯摩尔比1：10。
本发明还提供一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，采用一步法两步孵育，具体步骤如下：
1)样本中胰岛素抗原与生物素标记的胰岛素抗体、吖啶酯标记的胰岛素抗体发生免疫反应，形成生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯溶剂；
2)向步骤1)的溶剂中加入链霉亲和素包被的磁微粒溶液，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与胰岛素的量成正比。
优选所述酸性激发液为过氧化氢和硝酸的混合溶液，所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，采用双抗体夹心法的原理，同时利用链霉亲和素-生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本。
实施例1：
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：15的比例添加链霉亲和素，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与生物素摩尔比1：10添加生物素，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与吖啶酯摩尔比1：10添加吖啶酯，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含2％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
图1是本发明实施例1制备的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒剂量反应曲线；图中具体相关参数如下表：
| 校准点 | 校准品浓度(mU/L) | 光量 |
| 1 | 0 | 346 |
| 2 | 5 | 3738 |
| 3 | 10 | 8151 |
| 4 | 25 | 19567 |
| 5 | 100 | 84157 |
| 6 | 250 | 241753 |
| 7 | 800 | 930944 |
| 8 | 1000 | 1179745 |
本发明实施例1制备的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒剂的性能评估：
①最低检测限检测
用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次检测结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度—RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限，结果应符合应小于＜0.2mU/L。结果如表1所示：
表1.最低检测限数据
②线性检测
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。按照试剂盒说明书进行操作，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应符合线性范围为0.2-1000mU/L，线性相关系数r应≥0.9900。结果如表2所示：
表2.线性数据
③重复性检测
用同一批号试剂盒，对高值和低值两个浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值X和标准差SD，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合变异系数(CV)应≤8.0％。
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
—测量结果的平均值。
结果如表3所示：
表3.重复性数据
| 测定次数 | 重复性样本1 | 重复性样本2 |
| Rep1 | 9.06 | 258.16 |
| Rep2 | 9.25 | 258.45 |
| Rep3 | 9.25 | 264.57 |
| Rep4 | 9.55 | 260.95 |
| Rep5 | 9.36 | 259.56 |
| Rep6 | 9.12 | 263.08 |
| Rep7 | 9.37 | 259.15 |
| Rep8 | 9.20 | 266.02 |
| Rep9 | 9.25 | 259.61 |
| Rep10 | 9.23 | 264.41 |
| 测定均值 | 9.26 | 261.37 |
| SD | 0.14 | 2.84 |
| CV | 1.48％ | 1.09％ |
由检测结果显示本发明所涉及试剂盒检测线性相关系数r≥0.9900，即线性检测合格；最低检测限是＜0.2M U/L；重复性检测结果符合变异系数(CV)应≤8.0％要求，即重复性检测合格。本试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点。
实施例2：
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：10的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育18h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与生物素摩尔比1：5添加生物素，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与吖啶酯摩尔比1：5添加吖啶酯，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含3％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
本实施例制备的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒利用链霉亲和素-生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本。
实施例3：
本发明提供的一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取一定量的磁微粒，用20mM PB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/mL，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1：20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育21h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，加入封闭液(含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育21h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mM PB缓冲液清洗3次，用20mM PB缓冲液稀释至10mg/mL保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与生物素摩尔比1：20添加生物素，37℃孵育3h进行标记，然后加入封闭液(含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育3h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取一定量的胰岛素抗体，用20mM PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照胰岛素抗体与吖啶酯摩尔比1：20添加吖啶酯，37℃孵育3h进行标记，然后加入封闭液(含5％BSA的20mM PB缓冲液)，37℃孵育3h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
本实施例制备的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒利用链霉亲和素-生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括：
1)用20mM PB缓冲液稀释的链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)校准品；
5)质控品；
所述校准品和质控品分别各含高、低两个浓度点。
2.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：10-1：20。
3.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒溶液中磁微粒与链霉亲和素质量比1：15。
4.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：5-1：20。
5.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与生物素的摩尔比1：10。
6.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：5-1：20。
7.根据权利要求1所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的胰岛素抗体中胰岛素抗体与吖啶酯的摩尔比1：10。
8.一种权利要求1-7任意一项所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)链霉亲和素包被的磁微粒溶液
取磁微粒，用PB缓冲液清洗，然后稀释，添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用PB缓冲液清洗，加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mMPB缓冲液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用PB缓冲液清洗，最后用20mM PB缓冲液稀释后保存备用，得到链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
2)生物素标记的胰岛素抗体
取胰岛素抗体，用PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用PB缓冲液稀释，添加生物素，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的胰岛素抗体；
3)吖啶酯标记的胰岛素抗体
取胰岛素抗体，用PB缓冲液置换胰岛素抗体保存液，然后用PB缓冲液稀释，添加吖啶酯，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，所述封闭液为含2-5％BSA的20mM PB缓冲液，37℃孵育2-4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的胰岛素抗体；
4)分装校准品、质控品、链霉亲和素包被的磁微粒溶液、生物素标记的胰岛素抗体和吖啶酯标记的胰岛素抗体，再组装成成品。
9.一种权利要求1-7任意一项所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，采用一步法两步孵育，具体步骤如下：
1)样本中胰岛素抗原与生物素标记的胰岛素抗体、吖啶酯标记的胰岛素抗体发生免疫反应，形成生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯溶剂；
2)向步骤1)的溶剂中加入链霉亲和素包被的磁微粒溶液，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-胰岛素抗体-胰岛素-胰岛素抗体-吖啶酯复合物；
3)加入清洗缓冲液，将未反应的溶液清洗去除；
4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与胰岛素的量成正比。
10.根据权利要求9所述的检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述酸性激发液为过氧化氢和硝酸的混合溶液，所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810879496.2A CN108896772A (zh) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810879496.2A CN108896772A (zh) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108896772A true CN108896772A (zh) | 2018-11-27 |
Family
ID=64353093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810879496.2A Pending CN108896772A (zh) | 2018-08-03 | 2018-08-03 | 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108896772A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109682963A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-26 | 重庆派金生物科技有限公司 | 一种分析重组人胰岛素及其类似物或偶联物与胰岛素受体结合率的方法 |
| CN109725162A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-07 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种完全均相测定胰岛素的检测试剂盒及其方法 |
| CN113203867A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲液 |
| CN113933512A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-14 | 泛肽生物科技(浙江)有限公司 | 一种检测her2蛋白含量的流式试剂盒及检测方法 |
| CN114062684A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-18 | 沈阳易康元血液透析科技有限公司 | 一种血小板膜α颗粒蛋白140的化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114441610A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
| CN114778817A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-07-22 | 山东中鸿特检生物科技有限公司 | 一种检测血清和血浆中干扰素的试剂盒及检测方法与应用 |
| CN115493919B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-07 | 保定佳瑞源生物芯片有限公司 | 一种c肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液 |
| CN116466097A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-07-21 | 天津市协和医药科技集团有限公司 | 一种人胰岛素检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
| CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
-
2018
- 2018-08-03 CN CN201810879496.2A patent/CN108896772A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
| CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109725162A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-07 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种完全均相测定胰岛素的检测试剂盒及其方法 |
| CN109682963A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-26 | 重庆派金生物科技有限公司 | 一种分析重组人胰岛素及其类似物或偶联物与胰岛素受体结合率的方法 |
| CN109682963B (zh) * | 2019-01-15 | 2021-09-21 | 重庆派金生物科技有限公司 | 一种分析重组人胰岛素及其类似物或偶联物与胰岛素受体结合率的方法 |
| CN113203867A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲液 |
| CN113933512A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-14 | 泛肽生物科技(浙江)有限公司 | 一种检测her2蛋白含量的流式试剂盒及检测方法 |
| CN114062684A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-18 | 沈阳易康元血液透析科技有限公司 | 一种血小板膜α颗粒蛋白140的化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114441610A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
| CN114441610B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-02-24 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种检测胰岛素抗体各亚型的电化学发光法检测试剂盒 |
| CN114778817A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-07-22 | 山东中鸿特检生物科技有限公司 | 一种检测血清和血浆中干扰素的试剂盒及检测方法与应用 |
| CN115493919B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-07 | 保定佳瑞源生物芯片有限公司 | 一种c肽和胰岛素检测试剂盒的校准品稀释液 |
| CN116466097A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-07-21 | 天津市协和医药科技集团有限公司 | 一种人胰岛素检测试剂盒 |
| CN116466097B (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-29 | 天津市协和医药科技集团有限公司 | 一种人胰岛素检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108896772A (zh) | 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
| CN109239356A (zh) | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
| CN109991425A (zh) | 肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
| CN109490549A (zh) | 一种检测血清/血浆中肌酸激酶同工酶的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| EP3258270A1 (en) | Cardiac troponin i ultra-sensitive detection reagent kit, and ultra-sensitive detection method therefor | |
| Moore et al. | A simple automated colorimetric method for determination of N-acetyl-β-D-glucosaminidase | |
| MXPA94006538A (en) | Immunoassayo de complementacion enzimaticaelectroquim | |
| CN107831163A (zh) | 一种甲状腺球蛋白的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| Ho et al. | Amperometric detection of alkaline phosphatase activity at a horseradish peroxidase enzyme electrode based on activated carbon: potential application to electrochemical immunoassay | |
| CN111781385A (zh) | 一种NT-proBNP检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN108519487A (zh) | 一种白介素-6的定量检测方法及检测试剂盒 | |
| CN110579593A (zh) | 一种刺激性促甲状腺激素受体抗体浓度的检测试剂盒 | |
| CN107643282A (zh) | 一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 | |
| CN111175494A (zh) | 一种甲状腺球蛋白抗体检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN109001471A (zh) | 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
| CN108931652A (zh) | 一种用磁微粒化学发光法检测肌红蛋白含量的试剂盒 | |
| CN111007266A (zh) | 一种检测血浆中b型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒 | |
| CN113640511B (zh) | 一种磁微粒电化学发光试剂盒 | |
| CN109613232A (zh) | 一种完全均相测定脂联素的检测试剂盒及检测方法 | |
| CN1225134A (zh) | 用固相法检测生物活性物质 | |
| CN108152488A (zh) | 一种人类t淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110441531B (zh) | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 | |
| CN109239358A (zh) | 铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN109085343A (zh) | 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN109239371A (zh) | 一种游离三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181127 |