CN109239356A - C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109239356A CN109239356A CN201811060508.5A CN201811060508A CN109239356A CN 109239356 A CN109239356 A CN 109239356A CN 201811060508 A CN201811060508 A CN 201811060508A CN 109239356 A CN109239356 A CN 109239356A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- peptide antibody
- concentration
- antibody
- biotin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/553—Metal or metal coated
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
C肽化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法,属于免疫分析领域,解决了现有定C‑P检测方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题。该试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒;生物素标记的C肽抗体;吖啶酯标记的C肽抗体;清洗缓冲液;化学发光预激发液;校准品;质控品。检测方法为:样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应,形成生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯溶剂;链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合,形成磁珠‑链霉亲和素‑生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯复合物;加入清洗缓冲液等,计算出C肽浓度。本发明灵敏度高、特异性好、反应时间短、成本低。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域,具体涉及一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
C肽原是由C肽B链、C肽和C肽A链组成。C肽B链是从第1个氨基酸到第30个氨基酸;C肽是从第33个氨基酸到第63个氨基酸;C肽A链是从第66个氨基酸到第86个氨基酸。C肽是通过第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸连接C肽的B连和A链。C肽原随细胞浆中的微泡进入高尔基体,经蛋白水解酶的作用,切去第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸,生成没有活性的C肽,同时C肽原中的A链和B链连接生成C肽。一分子的C肽原分解为一分子C肽和一分子C-肽。C肽由31个氨基酸分子组成,分子量为3020Da。C肽与C肽以等克分子量从B细胞分泌到血液中,不被肝细胞所摄取,主要在肾脏中代谢并从肾脏排出体外。
C肽不受C肽抗体的干扰,对于接受C肽治疗的病人,测定C肽水平可以评估残存β细胞的功能。C肽主要通过肾脏降解和排泄,所以尿液中的C肽浓度高于血清中的浓度。尿C肽具有不受C肽原的影响、留取样本方便等特点,检测24小时尿C肽可反映受检者一段时间内血中C肽的平均值。
人胰岛素原(proinsulin)是由胰岛素和C肽组成,具有双重免疫活性,既可与胰岛素抗体结合,又可与C肽抗体结合。在生理情况下,只有极少量的C肽原释放入血,在病理情况下,胰岛β细胞释放C肽原增多,血中C肽原水平升高。由于C肽原的浓度还不到C肽的十分之一,故一般测得C肽(总C肽)可代表血中的游离C肽。
目前用于检测C肽的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体,用于催化发光底物产生颜色变化,操作简单,但是标记物易失活,发光底物需要避光,试剂的检测灵敏度较低,导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体,当激发态中间体回到稳定的基态时,发出光子,具有操作简单,自动化程度高,检测速度快等优点。
目前市售的C肽(C-P)检测试剂盒主要分为以下3种:一是ELISA方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株C-P抗体,固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株C-P抗体,利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化,检测血清或血浆中C-P的浓度;二是采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体,采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面;三是三联吡啶钌电化学发光法,采用链霉亲和素磁珠,一株C-P抗体标记生物素,另一株C-P抗体标记三联吡啶钌,经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C-P抗体-C-P抗原-C-P抗体-三联吡啶钌复合物,在电场加压条件下发光。
以上定量检测C-P的方法存在以下缺陷:1)ELISA方法采用微孔板或固相微粒作为固相载体,包被密度有限,灵敏度较低,反应时间较长;2)采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体,采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面,将引入更多的影响因素,影响检测结果的灵敏度;3)采用三联吡啶钌的电化学发光法,仪器要求较高,试剂及仪器都比较昂贵。
发明内容
为了解决现有定量检测C-P的方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题,本发明提供一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒,包括:链霉亲和素包被的磁微粒;生物素标记的C肽抗体;吖啶酯标记的C肽抗体;清洗缓冲液;化学发光预激发液;校准品;质控品。
作为优选的实施方式,所述校准品包括低值校准品和高值校准品,所述低值校准品浓度为1ng/ml,所述高值校准品浓度为20ng/ml。
作为优选的实施方式,所述质控品包括低值质控品和高值质控品,所述低值质控品浓度为1ng/ml,所述高值质控品浓度为20ng/ml。
作为优选的实施方式,所述化学发光预激发液包括酸性激发液和碱性激发液,所述酸性激发液为硝酸和过氧化氢溶液,所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。
作为优选的实施方式,所述清洗缓冲液为PB缓冲液。
作为优选的实施方式,所述链霉亲和素包被的磁微粒中,磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10~20)。
作为优选的实施方式,所述生物素标记的C肽抗体中,C肽抗体与生物素的摩尔比为1:(5~20)。
作为优选的实施方式,所述吖啶酯标记的C肽抗体中,C肽抗体与吖啶酯的摩尔比为1:(5~20)。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、链霉亲和素包被磁微粒
取磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:(10~20)的比例添加链霉亲和素,37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入封闭液,37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒,2~8℃保存备用;
步骤二、生物素标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:(5~20)的比例添加生物素,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液,37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体;
步骤三、吖啶酯标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:(5~20)的比例添加吖啶酯,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液,37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
作为优选的实施方式,所述封闭液选用浓度为20mM的PB缓冲液,其中含有2~5%的BSA。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
步骤一、向样品中依次加入生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体和链霉亲和素包被的磁微粒,样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应,形成生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯溶剂;
步骤二、链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合,形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯复合物;
步骤三、加入清洗缓冲液,将杂质清洗去除;
步骤四、加入酸性激发液,使吖啶酯游离;
步骤五、加入碱性激发液,使吖啶酯发射光子;
步骤六、根据样品的光量子数计算出C肽的浓度。
本发明的有益效果是:与现有技术相比,本发明提供的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,能够实现对血清/血浆/尿液中C肽的检测,采用双抗体夹心法,同时利用生物素-亲和素体系级联放大效应,采用吖啶酯瞬时化学发光及磁珠分离技术,大大提高了试剂盒的检测灵敏度,减少了反应时间,降低了试剂成本,同时降低了噪音干扰。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒与其他厂家的链霉亲和素磁珠-生物素-C肽抗体相比,具有工艺及操作简单、特异性好、磁珠的分散态良好、磁珠不易凝集、试剂重复性好等优点。
附图说明
图1为本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒剂量反应标准曲线。
具体实施方式
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒,主要包括:链霉亲和素包被的磁微粒;生物素标记的C肽抗体;吖啶酯标记的C肽抗体;清洗缓冲液;化学发光预激发液;校准品;质控品。
校准品包括低值校准品和高值校准品,所述低值校准品浓度为1ng/ml,所述高值校准品浓度为20ng/ml。
质控品包括低值质控品和高值质控品,低值质控品浓度为1ng/ml,高值质控品浓度为20ng/ml。
化学发光预激发液包括酸性激发液和碱性激发液,酸性激发液为硝酸和过氧化氢溶液,碱性激发液为氢氧化钠溶液。
清洗缓冲液为加入表面活性剂的PB缓冲液。
链霉亲和素包被的磁微粒中,磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10~20)。
生物素标记的C肽抗体中,C肽抗体与生物素的摩尔比为1:(5~20)。
吖啶酯标记的C肽抗体中,C肽抗体与吖啶酯的摩尔比为1:(5~20)。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,主要包括以下步骤:
步骤一、链霉亲和素包被磁微粒
取磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:(10~20)的比例添加链霉亲和素,37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入封闭液(浓度为20mM的PB缓冲液,其中含有2~5%的BSA),37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒,2~8℃保存备用;
步骤二、生物素标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:(5~20)的比例添加生物素,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液(浓度为20mM的PB缓冲液,其中含有2~5%的BSA),37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体;
步骤三、吖啶酯标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:(5~20)的比例添加吖啶酯,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液(浓度为20mM的PB缓冲液,其中含有2~5%的BSA),37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒的检测方法,主要包括以下步骤:
步骤一、将样品加入试剂盒中,样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应,形成生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯溶剂;
步骤二、链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合,形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯复合物;
步骤三、加入清洗缓冲液,将杂质(这部分属于游离的吖啶酯或者是样品中不与抗体结合的其他物质的混合物)清洗去除;
步骤四、加入酸性激发液,使吖啶酯游离;
步骤五、加入碱性激发液,使吖啶酯发射光子;
步骤六、根据样品的光量子数计算出C肽的浓度。
本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒用于检测C肽含量时,利用全自动化学发光免疫分析仪对C肽校准品进行检测,绘制标准曲线,内置于电脑软件;然后根据需求按照上述的检测方法测试临床样品,根据样品的光量子数与C肽浓度成正比的关系计算出C肽的浓度;最后对本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒进行性能(灵敏度、线性、抗干扰/特异性)的评价。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例中所用到的校准品可通过以下方法制备得到:
①校准品缓冲液的配制:校准品缓冲液由0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1%的牛血清白蛋白和0.05%的tween-20组成,pH值为6.5,2~8℃保存备用。
②取一定量的C肽用第①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/mL,0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、60.00ng/mL的校准品,等量分装成浓度分别为0ng/mL,0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、60.00ng/mL的7瓶校准品。
实施例1 C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备
1)链霉亲和素包被磁微粒
取一定量的磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,然后用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:15的比例添加链霉亲和素,37℃孵育21h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有3%的BSA)作为封闭液,37℃孵育21h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒试剂,2~8℃保存备用。
2)生物素标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:10的比例添加生物素,37℃孵育3h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有3%的BSA)作为封闭液,37℃孵育3h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体。
3)吖啶酯标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:10的比例添加吖啶酯,37℃孵育3h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有3%的BSA)作为封闭液,37℃孵育3h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
实施例2 C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备
1)链霉亲和素包被磁微粒
取一定量的磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,然后用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:10的比例添加链霉亲和素,37℃孵育18h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有2%的BSA)作为封闭液,37℃孵育18h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒试剂,2~8℃保存备用。
2)生物素标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:5的比例添加生物素,37℃孵育2h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有2%的BSA)作为封闭液,37℃孵育2h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体。
3)吖啶酯标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:5的比例添加吖啶酯,37℃孵育2h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有2%的BSA)作为封闭液,37℃孵育2h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
实施例3 C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备
1)链霉亲和素包被磁微粒
取一定量的磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,然后用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:20的比例添加链霉亲和素,37℃孵育24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有5%的BSA)作为封闭液,37℃孵育24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒试剂,2~8℃保存备用。
2)生物素标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:20的比例添加生物素,37℃孵育4h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有5%的BSA)作为封闭液,37℃孵育4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体。
3)吖啶酯标记C肽抗体
取一定量的C肽抗体,首先用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:20的比例添加吖啶酯,37℃孵育4h进行标记;加入浓度为20mM的PB缓冲液(含有5%的BSA)作为封闭液,37℃孵育4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
实施例4样品检测
利用本发明的C肽化学发光免疫检测试剂盒检测C肽含量时,以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具对C肽校准品进行检测,根据表1中的数据绘制标准曲线,如图1所示,内置于电脑软件。图1中具体相关参数如表1所示。
表1
校准点 | 校准品浓度(ng/mL) | 光量子数 |
1 | 0.00 | 677 |
2 | 0.63 | 5556 |
3 | 1.11 | 10717 |
4 | 4.96 | 57525 |
5 | 10.20 | 172403 |
6 | 47.89 | 1083307 |
7 | 59.75 | 1421833 |
然后根据需求按照本发明的检测方法测试临床样品,同时采用一步法两步孵育对样品中的C肽进行检测,具体的检测过程如下:
1)向样品中依次加入生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体和链霉亲和素包被的磁微粒,样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体(第一抗体)、吖啶酯标记的C肽抗体(第二抗体)发生免疫反应,形成生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯溶剂;
2)链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合,形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯复合物;
3)加入清洗缓冲液,将杂质(这部分属于游离的吖啶酯或者是样品中不与抗体结合的其他物质的混合物)清洗去除;
4)加入酸性激发液,使吖啶酯游离;
5)加入碱性激发液,使吖啶酯发射光子;
6)记录样品的光量子数,根据样品的光量子数与C肽浓度成正比的关系计算出C肽的浓度。
实施例5 C肽化学发光免疫检测试剂盒的性能评价
①最低检测限检测
用零浓度校准品(一级校准品A)和样本稀释液(一级校准品B)作为样品进行检测,重复测定20次,得出20次检测结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度—RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的RLU值带入上述一次方程,求出对应的浓度值,即为最低检测限,结果应符合应小于0.1ng/mL。结果如表2所示。
表2最低检测限数据
②线性检测
线性检测的标准曲线如图1所示。将接近线性范围上限的高值浓度样品按一定比例稀释为至少5种浓度,其中低值浓度样品须接近线性范围的下限。按照试剂盒说明书进行操作,将每一浓度的样品重复检测3次,计算平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数r,结果应符合线性范围为0.2~1000ng/mL,线性相关系数r应≥0.9900。结果如表3所示。
表3线性数据
③重复性检测
用同一批号试剂盒,对高值和低值两个浓度的样品各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值和标准差SD,根据公式(1)计算变异系数(CV),结果应符合变异系数(CV)应≤8.0%。结果如表4所示。
式中:CV—变异系数;
SD—测量结果的标准差;
—测量结果的平均值。
表4重复性数据
测定次数 | 重复性样品1(低值) | 重复性样品2(高值) |
Rep1 | 0.95 | 19.61 |
Rep2 | 0.98 | 19.86 |
Rep3 | 1.01 | 19.65 |
Rep4 | 0.96 | 19.33 |
Rep5 | 0.99 | 20.01 |
Rep6 | 0.96 | 20.23 |
Rep7 | 1.01 | 19.88 |
Rep8 | 1.00 | 19.68 |
Rep9 | 1.02 | 20.29 |
Rep10 | 0.96 | 20.54 |
测定均值 | 0.984 | 19.908 |
SD | 0.026 | 0.366 |
CV | 2.59% | 1.84% |
由上述检测结果可知,本发明的试剂盒的检测线性相关系数r≥0.9900,即线性检测合格;最低检测限是0.012ng/mL;重复性检测结果符合变异系数(CV)应≤8.0%要求,即重复性检测合格。由此证明,本发明的试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,包括:链霉亲和素包被的磁微粒;生物素标记的C肽抗体;吖啶酯标记的C肽抗体;清洗缓冲液;化学发光预激发液;校准品;质控品。
2.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述校准品包括低值校准品和高值校准品,所述低值校准品浓度为1ng/ml,所述高值校准品浓度为20ng/ml;所述质控品包括低值质控品和高值质控品,所述低值质控品浓度为1ng/ml,所述高值质控品浓度为20ng/ml。
3.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述化学发光预激发液包括酸性激发液和碱性激发液,所述酸性激发液为硝酸和过氧化氢溶液,所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述清洗缓冲液为PB缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述链霉亲和素包被的磁微粒中,磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10~20)。
6.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述生物素标记的C肽抗体中,C肽抗体与生物素的摩尔比为1:(5~20)。
7.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述吖啶酯标记的C肽抗体中,C肽抗体与吖啶酯的摩尔比为1:(5~20)。
8.制备权利要求1至7中任意一项所述的C肽化学发光免疫检测试剂盒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、链霉亲和素包被磁微粒
取磁微粒,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml;按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:(10~20)的比例添加链霉亲和素,37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,加入封闭液,37℃孵育18~24h后,置于磁分离架上分离磁珠;去上清,用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml,得到链霉亲和素包被的磁微粒,2~8℃保存备用;
步骤二、生物素标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml;按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:(5~20)的比例添加生物素,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液,37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到生物素标记的C肽抗体;
步骤三、吖啶酯标记C肽抗体
取C肽抗体,用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液,用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml,按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:(5~20)的比例添加吖啶酯,37℃孵育2~4h进行标记;加入封闭液,37℃孵育2~4h后,用蛋白纯化仪进行纯化,收集蛋白峰值,得到吖啶酯标记的C肽抗体。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述封闭液选用浓度为20mM的PB缓冲液,其中含有2~5%的BSA。
10.如权利要求1至7中任意一项所述的C肽化学发光免疫检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、向样品中依次加入生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体和链霉亲和素包被的磁微粒,样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应,形成生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯溶剂;
步骤二、链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合,形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯复合物;
步骤三、加入清洗缓冲液,将杂质清洗去除;
步骤四、加入酸性激发液,使吖啶酯游离;
步骤五、加入碱性激发液,使吖啶酯发射光子;
步骤六、根据样品的光量子数计算出C肽的浓度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811060508.5A CN109239356A (zh) | 2018-09-12 | 2018-09-12 | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811060508.5A CN109239356A (zh) | 2018-09-12 | 2018-09-12 | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109239356A true CN109239356A (zh) | 2019-01-18 |
Family
ID=65061174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811060508.5A Pending CN109239356A (zh) | 2018-09-12 | 2018-09-12 | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109239356A (zh) |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109709323A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-05-03 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 高敏心肌肌钙蛋白i磁微粒化学发光免疫检测试剂盒、制备方法及用途 |
CN110343702A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-18 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种c肽的核酸适配子及其应用和检测c肽的试剂盒 |
CN110579609A (zh) * | 2019-07-06 | 2019-12-17 | 湖南莱拓福生物科技有限公司 | Akr1b10化学发光定量检测试剂盒及其应用 |
CN111089965A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-05-01 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种抗原检测试剂盒及其制备方法以及一种抗原检测方法 |
CN111175491A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种sBCMA磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 |
CN111879758A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-03 | 江苏扬新生物医药有限公司 | 一种吖啶酯抗体标记方法及其应用 |
CN112698025A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-23 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒 |
CN112816716A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-18 | 北京联众泰克科技有限公司 | 用于c肽检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法 |
CN113125740A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-07-16 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法 |
CN113933497A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-01-14 | 辽宁中医药大学附属医院 | I型胶原氨基端延长肽磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 |
WO2022121151A1 (zh) * | 2020-12-10 | 2022-06-16 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种基于磁微粒化学发光的新型冠状病毒抗体检测试剂盒 |
CN116047087A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-05-02 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种判断样本中游离生物素的方法 |
CN116449030A (zh) * | 2023-06-12 | 2023-07-18 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种血小板交叉配型的方法 |
CN116953224A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-10-27 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测fgf21的发光试剂及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN105652018A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-08 | 广州科方生物技术有限公司 | 一种c-肽定量测定试剂盒 |
-
2018
- 2018-09-12 CN CN201811060508.5A patent/CN109239356A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101377490A (zh) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 用于检测疾病相关标志物的磁微粒分离化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN105652018A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-08 | 广州科方生物技术有限公司 | 一种c-肽定量测定试剂盒 |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109709323A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-05-03 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 高敏心肌肌钙蛋白i磁微粒化学发光免疫检测试剂盒、制备方法及用途 |
CN110579609A (zh) * | 2019-07-06 | 2019-12-17 | 湖南莱拓福生物科技有限公司 | Akr1b10化学发光定量检测试剂盒及其应用 |
CN110343702A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-18 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种c肽的核酸适配子及其应用和检测c肽的试剂盒 |
CN110343702B (zh) * | 2019-07-16 | 2021-05-14 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种c肽的核酸适配子及其应用和检测c肽的试剂盒 |
CN111089965A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-05-01 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种抗原检测试剂盒及其制备方法以及一种抗原检测方法 |
CN111089965B (zh) * | 2019-11-18 | 2023-09-22 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种抗原检测试剂盒及其制备方法以及一种抗原检测方法 |
CN111175491A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种sBCMA磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 |
CN111879758A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-11-03 | 江苏扬新生物医药有限公司 | 一种吖啶酯抗体标记方法及其应用 |
WO2022121151A1 (zh) * | 2020-12-10 | 2022-06-16 | 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 | 一种基于磁微粒化学发光的新型冠状病毒抗体检测试剂盒 |
CN112698025A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-23 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒 |
CN112816716A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-18 | 北京联众泰克科技有限公司 | 用于c肽检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法 |
CN113125740A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-07-16 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法 |
CN113125740B (zh) * | 2021-05-17 | 2022-03-01 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 化学发光免疫分析技术中磁微粒活化效率的鉴定方法 |
CN113933497A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-01-14 | 辽宁中医药大学附属医院 | I型胶原氨基端延长肽磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 |
CN116047087A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-05-02 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种判断样本中游离生物素的方法 |
CN116047087B (zh) * | 2022-12-29 | 2023-07-25 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种判断样本中游离生物素的方法 |
CN116953224A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-10-27 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测fgf21的发光试剂及其应用 |
CN116449030A (zh) * | 2023-06-12 | 2023-07-18 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种血小板交叉配型的方法 |
CN116449030B (zh) * | 2023-06-12 | 2023-08-15 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种血小板交叉配型的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109239356A (zh) | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
CN109991425A (zh) | 肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
CN108896772A (zh) | 一种检测血清/血浆中胰岛素的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
CN103901203B (zh) | 一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
US4016043A (en) | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies | |
CN110146692A (zh) | 一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系及检测试剂盒 | |
Moore et al. | A simple automated colorimetric method for determination of N-acetyl-β-D-glucosaminidase | |
CN107831163A (zh) | 一种甲状腺球蛋白的化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
CN108562752A (zh) | 一种游离甲状腺素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
Schall Jr et al. | A sensitive manual enzyme immunoassay for thyroxine. | |
Ho et al. | Amperometric detection of alkaline phosphatase activity at a horseradish peroxidase enzyme electrode based on activated carbon: potential application to electrochemical immunoassay | |
Geiger et al. | Bioluminescence enhanced enzyme immunoassay. New ultrasensitive detection systems for enzyme immunoassays, II. | |
CN108519487A (zh) | 一种白介素-6的定量检测方法及检测试剂盒 | |
CN105785017A (zh) | 基于psa磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒 | |
CN108802369A (zh) | 一种游离三碘甲状腺原氨酸磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN109001471A (zh) | 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
CN109725162A (zh) | 一种完全均相测定胰岛素的检测试剂盒及其方法 | |
CN101377509A (zh) | Iii型前胶原n端肽化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 | |
EP0245981B1 (en) | Signal enhancement in immunoassay by modulation of chemical catalysis | |
CN107860914A (zh) | 一种抗线粒体抗体IgG的检测试剂盒及其检测方法 | |
Seto et al. | Development of ultra‐high sensitivity bioluminescent enzyme immunoassay for prostate‐specific antigen (PSA) using firefly luciferase | |
Bier et al. | High sensitive competitive immunodetection of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid using enzymatic amplification with electrochemical detection | |
EP1542013B1 (en) | Chemiluminescence enhancer | |
CN108152488A (zh) | 一种人类t淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
CN109085343A (zh) | 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190118 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |