CN116449030B - 一种血小板交叉配型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于血小板检测领域，具体涉及一种血小板交叉配型的方法。本发明首先提供了一种磁性血小板吸附复合物，其组成包括亲和素磁珠和生物素‑RGD肽；其中所述生物素‑RGD肽由生物素上噻吩环侧链末端的羧基与RGD肽上的氨基缩合形成或直接化学合成，1个生物素与1个RGD肽偶联；所述亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成所述磁性血小板吸附复合物，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素‑RGD肽。
Description
技术领域
本发明属于血小板检测领域，具体涉及一种血小板交叉配型的方法。
背景技术
随着临床血小板输注量逐年增长，血小板输注无效（PTR）已成为国内外临床极为棘手的问题。在免疫因素引起的PTR中，血小板特异性抗体（HPA）和组织相容性抗体（HLA）是引起PTR的主要原因。然而HPA种类多，HLA又具有高度多态性，要每次输注都找到HPA和HLA完全相容的血小板是不现实的，因此要解决由免疫因素引起的输注无效的较为安全有效的方法是输注HPA和HLA相容的血小板。因此，在血小板输注前进行血小板交叉配型具有必要性。
现有的血小板抗体检测技术主要包括以下几类：血小板黏附免疫荧光试验（PAIFT）、微柱凝胶技术、MAIPA、免疫细胞化学法（SABC）、简易致敏红细胞血小板血清学实验（SEPSA）放射免疫微球法和流式细胞仪（FCM）技术等，但都存在各自的局限。基于流式细胞技术发展起来的流式微球技术目前被广泛用于血小板的抗体检测中。其基本原理是利用包被有特异性单克隆抗体的检测微球捕获特定的血小板膜糖蛋白，然后与待检样本孵育后，再与FITC标记的羊抗人多克隆抗体孵育，如果血小板膜糖蛋白上结合有血小板特异性自身抗体，就会形成检测微球-血小板膜糖蛋白-血小板特异性自身抗体-FITC标记的羊抗人多克隆抗体复合物，流式细胞仪检测表现为检测微球荧光强度增高，从而进行辨别。但是，目前微球主要还是用于血小板抗体的检测，而用于血小板交叉配型尚未见报道。
基于此，本发明提供一种新的血小板交叉配型的方法，以期缓解现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于血小板交叉配型的磁性血小板吸附复合物和一种血小板交叉配型的方法，具体技术方案如下。
一种用于血小板交叉配型的磁性血小板吸附复合物，其组成包括亲和素磁珠和生物素-RGD肽；其中所述生物素-RGD肽由生物素上噻吩环侧链末端的羧基与RGD肽上的氨基缩合形成或直接化学合成，1个生物素与1个RGD肽偶联；所述亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成所述磁性血小板吸附复合物，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素-RGD肽。
生物素（Biotin）由咪唑酮环和噻吩环组成，与亲和素结合的主要是咪唑酮环，而噻吩环侧链末端的羧基则与RGD肽上的氨基结合。
进一步，所述亲和素磁珠的粒径为0.5-50.0μm。所述粒径大小由流式细胞仪的性能决定，本发明所述的粒径大小可以满足绝大部分流式细胞仪检测的要求。
进一步，所述RGD肽包括如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq IDNO.4、Seq ID NO.5或Seq ID NO.6所示的全长或片段。具体序列信息如表1所示。
表1
Arg-Gly-Asp(RGD)序列是广泛存在于许多细胞外基质蛋白的最小活性片段，是黏附蛋白与细胞表面特异受体蛋白相互作用的识别位点。然而天然蛋白的小分子RGD肽段一般半衰期短，生物利用度较低，易酶解，减弱了治疗效果和生物活性，因此现在有很多研究致力于对天然肽进行结构优化改造，包括对肽段上的氨基酸进行替换、将直链的RGD肽修饰为环形的RGD肽等。本发明将RGD肽与生物素-亲和素（BSA）系统进行偶联，借助生物素-亲和素的多级放大效应，可以提高检测的灵敏度和特异性。
一种利用磁性微珠来进行血小板交叉配型的方法，包括如下步骤：
1）用生物素上噻吩环侧链末端的羧基与RGD肽上的氨基进行缩合反应形成生物素-RGD肽或直接化学合成生物素-RGD肽，然后将亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成RGD肽-BSA磁珠复合物，其中1个生物素偶联1个RGD肽，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素-RGD肽；
2）将所述RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血在30℃-40℃条件下孵育20-40min，使RGD肽与血小板结合，进一步形成血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物以将血小板从供者全血中分离；
3）将分离得到的所述血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物与受者血浆或血清在30℃-40℃条件下孵育20-40min；
4）将用荧光酶、荧光素或吖啶酯标记的抗人IgG/IgM/IgA单克隆抗体或多克隆抗体与步骤3）得到的复合物再孵育20-40min；
5）用流式细胞仪或化学发光仪检测步骤4）得到的复合物的荧光信号（使用荧光标记的抗人IgG/IgM/IgA单/多克隆抗体可以确定抗体是否已结合以及抗体与相应细胞的结合程度）；
6）数据处理：将用磁珠复合物偶联的的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于所述CutOff值表示交叉配型失败，低于所述CutOff表示交叉配型成功。
在本发明的其中一个实施例中，取10份正常人的血小板与10份未怀过孕，未输过血的人的血浆进行交叉配型。用流式细胞仪测荧光值，这100个荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于该值表示交叉配型失败，低于该值表示交叉配型成功。
进一步，所述步骤2)中RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血的体积比为5-10:2-5。以确保每个磁珠复合物上都结合有足够的血小板。
优选地，RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血的体积比为5:2。
进一步，所述RGD肽包括如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq IDNO.4、Seq ID NO.5或Seq ID NO.6所示的全长或片段。
进一步，所述步骤1)中的亲和素磁珠粒径为0.5-50.0μm。
上述磁性血小板吸附复合物在自动化血小板交叉配型中的应用。
进一步，所述磁性血小板吸附复合物用于在磁场作用下从全血样品中分离血小板。
进一步，所述磁性血小板吸附复合物偶联的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于所述CutOff值表示交叉配型失败，低于所述CutOff表示交叉配型成功。
进一步，所述磁性血小板吸附复合物中的RGD肽用于结合血小板膜糖蛋白。
本发明提供的磁性血小板吸附复合物可以特异性地吸附血小板，在磁场的作用下，磁珠血小板复合物被吸附在离心管的管侧壁或者是管底，其余的废液可以被轻松移走，或者直接甩掉。如果不采用磁珠系统，血小板的分离只能利用常规离心以后弃去上清液，底部的沉淀就是血小板，采用这种方法会出现分离不彻底的情况。此外，采用这种传统的分离方法，需要依赖人工操作，不能实现仪器自动化操作。
有益技术效果
1）本发明合成了一种包含RGD肽与生物素-亲和素（BSA）系统的磁性血小板吸附复合物，该复合物用于从全血中分离血小板，进而用于血小板交叉配型，并且可以实现血小板的自动化分离。
2）本发明创新地将BSA系统与磁珠偶联后去吸附血小板，与传统的直接用血小板交叉配型相比，将检测灵敏度提高至8倍以上。并且传统的方法分离和清洗都只能用离心的方法，依赖于实验人员的手动操作，而本发明利用磁珠可以实现仪器自动化操作。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述是“灵敏度”指血小板交叉配型的方法可以检测到的低浓度抗体的能力。
实施例1
本实施例提供一种血小板交叉配型的方法示例。
1）用亲和素磁珠（SA-磁珠）偶联Biotin-RGD肽合成磁性血小板吸附复合物。
2）RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血在37℃孵育30分钟与全血中的血小板连接。
3）用磁分离血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物，用PBST洗3遍。
6）用FITC标记的抗人IgG/IgM/IgA单克隆抗体（多克隆抗体）与步骤3）的复合物孵育30分钟。
7）用PBST洗3遍。
8）用流式细胞仪检测荧光信号。
9）数据处理。
在本实施例中，取10份正常人的血小板与10份未怀过孕，未输过血的人的血浆交叉配型。设置这100个荧光值的平均值（Mean FITC-H）+2*标准差为CutOff值，高于该值表示交叉配型失败，低于该值表示交叉配型成功。
可以理解的是，本发明制备的磁性血小板吸附复合物可用于仪器自动化操作，即，从本实施例的步骤2）开始就用仪器进行操作，而无需人力操作。
实施例2
本实施例提供一种SA-磁珠与Biotin-RGD偶联的示例。
SA-磁珠采用SPHEROTM Avidin Magnetic Particles。
1）清洗：取1mg/1ml SA-磁珠磁分离去上清液，加入1ml磁珠偶联液，混匀10s，然后超声1min。用磁分离去上清液，重复2次。所述磁珠偶联液如表2所示。
表2
2）复溶：加入1ml磁珠偶联液混匀10s，然后超声1min。
3）偶联：20ulBiotin-RGD与步骤2）的SA磁珠，室温孵育15min。
4）清洗：用PBST洗3遍。
5）复溶：1ml磁珠偶联液复溶。
实施例3
本实施例提供一种从供者全血中分离血小板的示例。
1）将RGD肽-BSA磁珠复合物（以下简称磁珠复合物）与磁珠稀释液按照体积比1:100的比例进行稀释，磁珠复合物的浓度为1mg/ml。所述磁珠稀释液如表3所示。
表3
2）将磁珠复合物与供者全血按照体积比5:2的比例进行孵育，其条件为37℃下孵育30min。
3）用磁珠清洗液清洗两次。所述磁珠清洗液如表4所示。
表4
实施例4
本实施例提供直接交叉配型和用本发明方法交叉配型的对比。
对比试验1：血液交叉配型检测。
直接交叉配型操作步骤如表5所示。
表5
本发明交叉配型操作步骤如下。
1）用亲和素磁珠（SA-磁珠）偶联Biotin-RGD肽合成磁性血小板吸附复合物。
2）上机操作：
RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血在37℃孵育30分钟与全血中的血小板连接；然后用磁分离血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物；加入用FITC标记的抗人IgG/IgM/IgA单克隆抗体（多克隆抗体）与用磁分离血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物孵育30分钟；流式细胞仪检测孵育得到的复合物的荧光信号。
3）数据分析：将用磁珠复合物偶联的的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光素标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于所述CutOff值表示交叉配型失败，低于所述CutOff表示交叉配型成功。
直接交叉配型结果如表6。
表6 直接交叉配型结果
磁珠复合物交叉配型结果如表7。
表7 磁珠复合物交叉配型结果
实验结论：用磁珠复合物进行交叉配型，100份血液样品全部配型成功，与直接配型成功率一致。说明用本发明制备的磁珠复合物不仅可以用于血液交叉配型检测，而且可以替代人力操作的直接交叉配型实现机器化标准化、自动化操作。
对比试验2：灵敏度检测。
直接交叉配型和本发明交叉配型的操作步骤与对比试验1一致。
以下检测含有HPA抗体和HLA抗体的2份血浆样本，分别用无抗体血浆梯度稀释成HPA、1/2HPA、1/4HPA、1/8HPA、1/16HPA、1/32HPA；HLA、1/2HLA、1/4HLA、1/8HLA、1/16HLA、1/32HLA。然后上机检测。
灵敏度检测结果如表8所示。
表8 灵敏度检测结果
实验结论：
血小板特异性抗体（HPA）和组织相容性抗体（HLA）是引起血小板输注无效的主要原因，因此，在血小板输注前进行血小板交叉配型的目的是为了找到HPA和HLA相容的血小板。本实验是一种为了检测不相容的HPA和HLA的示例，即两种方法（直接交叉配型/磁珠复合物交叉配型）检出不相容抗体的能力，即方法灵敏度。
根据此原理，在上述实验中，直接交叉配型组的cutoff值是72，高于该值表示检测结果为阳性，即交叉配型失败。根据表3的数据，直接交叉配型仅能检测到1/2HPA和1/2HLA。
磁珠复合物交叉配型组的cutoff值是116，高于该值表示检测结果为阳性，即交叉配型失败。根据表3的数据，磁珠复合物可以检到1/16HPA和1/16HLA，其检测阳性结果的灵敏度为直接交叉配型的8倍。
上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种用于血小板交叉配型的磁性血小板吸附复合物，其特征在于，其组成包括亲和素磁珠和生物素-RGD肽；其中所述生物素-RGD肽由生物素上噻吩环侧链末端的羧基与RGD肽上的氨基缩合形成或直接化学合成，1个生物素与1个RGD肽偶联；所述亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成所述磁性血小板吸附复合物，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素-RGD肽。
2.如权利要求1所述的磁性血小板吸附复合物，其特征在于，所述亲和素磁珠的粒径为0.5-50.0μm。
3.如权利要求1所述的磁性血小板吸附复合物，其特征在于，所述RGD肽如Seq IDNO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5或Seq ID NO.6所示。
4.一种利用磁性微珠来进行血小板交叉配型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）用生物素上噻吩环侧链末端的羧基与RGD肽上的氨基进行缩合反应形成生物素-RGD肽或直接化学合成生物素-RGD肽，然后将亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成RGD肽-BSA磁珠复合物，其中1个生物素与1个RGD肽偶联，亲和素磁珠上的每个亲和素与4个生物素-RGD肽进行偶联；
2）将所述RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血在30℃-40℃条件下孵育20-40min，使RGD肽与血小板结合，进一步形成血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物以将血小板从供者全血中分离；
3）将分离得到的所述血小板-RGD肽-BSA磁珠复合物与受者血浆或血清在30℃-40℃条件下孵育20-40min；
4）将用荧光酶、荧光素或吖啶酯标记的抗人IgG/IgM/IgA单克隆抗体或多克隆抗体与步骤3）得到的复合物再孵育20-40min；
5）用流式细胞仪或化学发光仪检测步骤4）得到的复合物的荧光信号；
6）数据处理：将用磁珠复合物偶联的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于所述CutOff值表示交叉配型失败，低于所述CutOff表示交叉配型成功。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中RGD肽-BSA磁珠复合物与供者全血的体积比为5-10:2-5。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RGD肽如Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、SeqID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5或Seq ID NO.6所示。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的亲和素磁珠粒径为0.5-50.0μm。
8.权利要求1所述的磁性血小板吸附复合物在自动化血小板交叉配型中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述磁性血小板吸附复合物用于在磁场作用下从全血样品中分离血小板。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述磁性血小板吸附复合物偶联的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为CutOff值，高于所述CutOff值表示交叉配型失败，低于所述CutOff表示交叉配型成功。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001079291A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Incyte Genomics, Inc. | Secreted proteins |
| AU2001290964A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-26 | Musc Foundation For Research Development | Non-natural basic amino acids, their preparation and use |
| US7049140B1 (en) * | 1999-04-29 | 2006-05-23 | Vanderbilt University | X-ray guided drug delivery |
| CN1793928A (zh) * | 2005-12-12 | 2006-06-28 | 马印图 | 患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法 |
| CN104360087A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-02-18 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测Miltenberger血型抗体的方法 |
| CN105203752A (zh) * | 2015-11-05 | 2015-12-30 | 上海中山医疗科技发展公司 | 一种磁性血小板吸附颗粒及其制备方法 |
| CN109239356A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| CN113337463A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-09-03 | 天津德祥生物技术有限公司 | 一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用 |
| WO2022031857A2 (en) * | 2020-08-05 | 2022-02-10 | The Regents Of The University Of California | Degradable hollow shell particles for high-throughput screening and sorting of cells |
| CN116148463A (zh) * | 2022-09-08 | 2023-05-23 | 浙江省血液中心 | 一种磁珠-抗体-膜糖蛋白复合物、应用及试剂盒 |
-
2023
- 2023-06-12 CN CN202310686796.XA patent/CN116449030B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7049140B1 (en) * | 1999-04-29 | 2006-05-23 | Vanderbilt University | X-ray guided drug delivery |
| WO2001079291A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Incyte Genomics, Inc. | Secreted proteins |
| AU2001290964A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-26 | Musc Foundation For Research Development | Non-natural basic amino acids, their preparation and use |
| CN1793928A (zh) * | 2005-12-12 | 2006-06-28 | 马印图 | 患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法 |
| CN104360087A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-02-18 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测Miltenberger血型抗体的方法 |
| CN105203752A (zh) * | 2015-11-05 | 2015-12-30 | 上海中山医疗科技发展公司 | 一种磁性血小板吸附颗粒及其制备方法 |
| CN109239356A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| WO2022031857A2 (en) * | 2020-08-05 | 2022-02-10 | The Regents Of The University Of California | Degradable hollow shell particles for high-throughput screening and sorting of cells |
| CN113337463A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-09-03 | 天津德祥生物技术有限公司 | 一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用 |
| CN116148463A (zh) * | 2022-09-08 | 2023-05-23 | 浙江省血液中心 | 一种磁珠-抗体-膜糖蛋白复合物、应用及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dake Hao等.Rapid endothelialization of small diameter vascular grafts by a bioactive integrin-binding ligand specifically targeting endothelial progenitor cells and endothelial cells.《Acta Biomaterialia》.2020,第108卷第178-193页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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