CN111474368B - 全面检测非hla类供者特异性抗体的纯化抗原法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种全面检测非HLA类供者特异性抗体(DSA)的纯化抗原法，通过对移植物供者或潜在供者的组织细胞抗原进行分离纯化，并固定到固相载体，在其中的HLA类抗原被特异性抗体或其类似物封闭的基础上，建立了一个在大多数非HLA类抗原未知的情况下，也可以全面检测非HLA类DSA的检测方法。

Description

全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法
技术领域
本发明属于抗体检测技术领域，涉及全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法。
背景技术
在器官、组织、和非自体的(造血)干细胞移植中，移植物受者产生的针对供者移植物抗原的抗体被称为供者特异性抗体(Donor Specific Antibody，DSA)， DSA是导致抗体介导的排斥反应主要原因并作为确诊用必须指标被写入了 BANFF国际诊断标准。
移植病人产生的DSA，根据其所针对的靶抗原，被分为HLA类DSA和非 HLA类DSA两类。人类白细胞抗原HLA(Human Leukocyte Antigen，HLA)是最早被发现的、具有人群多态性的移植排斥相关抗原。非HLA类抗原的品类非常繁多，其中包括各类组织特异性的抗原，如血小板特异性抗原，内皮细胞表面特异性抗原等等。尽管已经有上万种HLA类抗原被人类发现，但遗憾的是，目前为止被发现的非HLA类抗原仍然非常有限的。
临床研究指出，在HLA没有错配的供受者之间进行移植时，也就是说，在没有HLA类DSA的作用的情况下，仍然有很多病人最终因非HLA类DSA导致移植物失去功能，其比例甚至超过HLA(Current Opinion in Immunology 2005， 17:541-545；Lancet 2005；365：1570-76)。类似的大量证据都说明了非HLA类抗原的现实存在。遗憾的是，在已有的科学研究中，被明确发现的、和移植排异相关的非HLA类抗原却很少，绝大多数仍然未知。
由于我们对抗体的检测是根据免疫学抗原和抗体相互作用的原理，因此，在通常情况下，要检测非HLA类DSA，必须要有纯化的、已知的非HLA类抗原，作为检测用材料。由于目前被发现的和移植排异相关的非HLA类抗原非常少，所以我们能检测到的非HLA类DSA极为有限，大量未知的非HLA类DSA无法被明确地检出。
尽管我们已经确知非HLA类DSA能够引起排斥反应，而且其重要性甚至超过HLA类DSA，但是我们对非HLA类抗原的品类和数量却尚不完全明了。目前已有的相关检测，也只是针对个别已经被发现的非HLA抗原做相应的抗体检测，比如用纯化的MICA抗原检测相应的MICA抗体。在这种大量非HLA类抗原未知的情况下，如何检测非HLA类DSA是移植检验中一个亟待解决的问题。
在针对如何全面检测非HLA类DSA的技术探索中，我们先后提出了以下两种方法，发明的具体内容和优缺点概括如下：
1)用于检测同种异体的、或供者特异性的非HLA抗体的方法(专利申请号202010074999.X)
本发明利用供者或潜在供者来源的组织细胞为原材料，分离、提纯出靶细胞表面包含HLA和所有非HLA类抗原的混合物。通过对纯化的混合抗原中HLA类抗原的清除处理，剩余的含有非HLA类抗原的混合物作为检测用材料，通过常规的固相载体包被技术，检测相应的非HLA类抗体。
该检测技术的优点：本检测方法既解决了目前以细胞为基础的同种异体的、或供者特异性的抗体检测技术中，由于HLA类抗原和非HLA类抗原在靶细胞的共表达导致无法直接区分HLA和非HLA抗体的缺点；也解决了以纯化抗原为基础的抗体检测技术中，纯化的HLA抗原只能检出相应的HLA 抗体、纯化的特定非HLA抗原只检测特定非HLA抗体的缺点。
该检测技术的缺点：该技术方案操作流程复杂，费时较长。
2)全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法(专利申请号202010269772.0)
本发明利用移植物供者或潜在供者来源的组织细胞作为靶细胞，通过对细胞表面HLA类抗原采取封闭反应的实验设计，阻断受检样本中HLA类 DSA和靶细胞表面相应HLA的结合，因而只有非HLA类的DSA才能被检出。
该检测技术的优点：和上述混合抗原的HLA清除法检测非HLA类抗体的技术相比，本方法用供者或潜在供者来源的细胞为原材料，采取对HLA 封闭的实验设计，实验方法简洁，费时较少。
该检测技术的缺点：由于本技术是以活细胞为检测材料，实验容易受到供者组织细胞的可获取性、细胞的分离纯化、活性保持、数量要求等诸多因素限制。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，通过对移植物供者或潜在供者的组织细胞抗原进行分离纯化，并固定到固相载体，在其中的HLA类抗原被特异性抗体或其类似物封闭的基础上，建立了一个在大多数非HLA类抗原未知的情况下，也可以全面检测非HLA类DSA 的检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，包括如下步骤：
1)对检测用原材料中的混合抗原进行分离、纯化；
2)将步骤1)纯化好的含有HLA和非HLA类的混合抗原，结合到固相载体表面；
3)对固相载体表面包被的HLA进行封闭后，用于检测被检样本中结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体。
优选地，步骤1)中，检测用原材料的来源包括：移植物供者或潜在供者来源的器官、组织(包括上皮、结缔、肌肉、神经组织)、细胞或其组分(如外周血细胞、或其组分:白细胞、血小板、红细胞)，或上述细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
优选地，步骤2)中，所述固相载体包括但不局限于：塑料平板(如聚苯乙烯ELISA板)，微颗粒(如Luminex或流式微球)和膜载体(如硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜)。
优选地，步骤2)还包括对包被了混合抗原的固相载体表面可能存在的未吸附位点进行封闭。
更优选地，用于封闭固相载体表面可能存在的未吸附位点的溶液包括但不局限于：血清白蛋白，或小牛血清等。
优选地，步骤3)中，用HLA特异性抗体或者已被证实能和HLA分子结合的其他类似物对固相载体表面包被的HLA进行封闭。
更优选地，所述HLA特异性抗体选自完整抗体或抗体的片段；单克隆或多克隆抗体；单一的抗体或者两个以上抗体的组合；人源性的、动物源性的、或重组抗体。
优选地，步骤3)还包括：在HLA封闭反应完成后，可以用已知具有HLA 特异性的单克隆、多克隆抗体、或抗体的组合，来确认HLA被封闭后的固相载体表面无法再结合HLA抗体。
优选地，步骤3)中，所述被检样本来源于器官、组织，和(造血)干细胞移植受者的体液、移植器官或组织的灌洗液、或洗脱液。
优选地，步骤3)中，检测被检样本中结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体的方法包括：
a.抗抗体的标记二抗检测法，包括：
结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体，在加入能识别被检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗后，根据标记二抗所带的特异性标记物，通过显色被检出。
更优选地，显色方法包括但不限于：酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
b.抗补体的标记二抗检测法，包括：
结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体中，对于能激活补体的部分抗体，可以通过依次或同时加入补体以及抗补体的标记二抗的方法检出。
阳性结果的显示方法可以根据标记二抗所带的特异性标记物，通过显色被检出。
更优选地，显色方法包括但不限于酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
本发明取得的有益效果如下：
本发明利用纯化组织细胞抗原后对其中的HLA类抗原封闭的方法，实现对非HLA类DSA的检测。本发明通过对非HLA类DSA的检测，为移植临床排异反应的非HLA类DSA的病因确认、抗排异治疗方法的选择、以及治疗有效性的验证，提供了简易的监测手段。
和混合抗原的HLA清除法检测非HLA类抗体的技术相比，本发明操作简单，费时少；和HLA封闭法的细胞学检测技术比，本发明的实验方法更简单易行，对细胞的分离纯化和活性保持，以及操作人员的技术水平要求相对较低，而且，一次性准备的试剂可以多次使用，避免了反复多次取供者血样的情况发生。
附图说明
图1.本发明纯化抗原HLA封闭法检测非HLA类DSA的技术原理图。
图2.本发明实施例HLA封闭法检测非HLA类抗体的流式微球检测技术。
具体实施方式
为了更清楚的描述本发明，以下将结合附图及实施例对本申请做进一步说明。应当理解的是，实施例仅为示例性说明，并非用于对本申请保护范围的限定。
本发明是根据抗原抗体相互作用的原理，检测移植物受者样本中存在的，抗供者、或潜在供者的非HLA类抗原的抗体。纯化抗原HLA封闭法检测非HLA 类DSA的技术原理如图1所示。
具体技术方案包括如下步骤：
1.抗原纯化
a.检测用抗原的原材料来源：取材于移植物供者或潜在供者来源的器官、组织(包括上皮、结缔、肌肉、神经组织)、细胞或其组分(如外周血细胞、或其组分：白细胞、血小板、红细胞)，或所述细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
b.对原材料中抗原(含HLA和非HLA类)的纯化：上述原材料细胞中所含有的、可能和移植排异相关的抗原，是一个多种抗原的混合物，其中既有HLA，又有其他非HLA类的抗原。具体应用时，可以根据需要，对整体细胞的所有抗原，或细胞的具体结构组分抗原，进行分离、纯化，例如膜组分、胞浆组分、细胞核组分。
2.抗原固定
纯化好的含有HLA和非HLA类的混合抗原，可以通过物理吸附、化学偶联的方式，结合到固相载体表面。固相载体包括，但不局限于塑料平板(如聚苯乙烯ELISA板)、微颗粒(如Luminex或流式微球)、膜载体(如硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜)。抗原固定到固相载体后，固相载体表面常余少量未吸附位点，有非特异地吸附能力，导致本底偏高。因此需要对可能存在的未吸附位点进行封闭，封闭可以采用但不局限于下列溶液：血清白蛋白，或小牛血清等。图1所示即为荧光(流式)微球被用作固相载体、采取化学偶联的方式包被抗原到微球表面。
3.封闭HLA
由于被包被到固相载体表面的抗原，是来源于供者或潜在供者的组织细胞，除了红细胞外，HLA类抗原在所有有核细胞都表达，因此，除非纯化抗原用的细胞来源是红细胞，其他所有细胞来源的纯化抗原，都是包含HLA和非 HLA两类抗原的混合抗原。
在用来检测非HLA类DSA前，需要对固相载体表面包被的HLA进行封闭，HLA抗原封闭技术的关键包括：
a)封闭HLA可以用HLA特异性抗体或者已被证实能和HLA分子结合的其他类似物；
b)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是完整抗体或抗体的片段；
c)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是单克隆或多克隆抗体；
d)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是单一的抗体或者两个以上抗体的组合；
e)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是人源性的、动物源性的、或重组抗体；
f)所选封闭抗体有效性验证：在封闭反应完成后，可以用已知具有HLA 特异性的单克隆、多克隆抗体、或抗体的组合，来确认HLA被封闭后的靶细胞无法再结合HLA抗体。
图中所示为，HLA特异性抗体的F(ab’)2片段被用作封闭试剂，对包被到荧光微球表面的混合抗原中的HLA进行封闭，以阻断被检样本中可能存在的HLA 抗体的结合。
4.非HLA类DSA的检出
含有HLA和非HLA两类抗原的固相载体表面的HLA被确认封闭后，可用于检测被检样本中含有的非HLA类DSA。
被检样本来源于器官、组织，和(造血)干细胞移植受者的体液、移植器官或组织的灌洗液、或洗脱液。
结合到固相载体的非HLA类DSA可以通过两类检测法检出：
A.抗抗体的标记二抗检测法
结合到固相载体的非HLA类DSA，在加入能识别被检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗(即抗抗体标记二抗)后，根据标记二抗所带的特异性标记物，通过化学发光或免疫荧光的形式被检出，显色方法包括但不限于酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
抗抗体标记二抗显色法的特点是，它可以同时检出能激活或不能激活补体的两种非HLA类DSA，但不能对它们加以区分。
图中所示为，用荧光标记抗抗体二抗的方法，通过流式细胞技术，检测荧光微球表面结合的非HLA类DSA。
B.抗补体的标记二抗检测法
结合到固相载体的非HLA类DSA中，对于能激活补体的部分抗体，可以通过依次或同时加入补体以及抗补体的标记二抗的方法检出。阳性结果的显示方法可以根据标记二抗所带的特异性标记物，通过化学发光或免疫荧光的形式被检出，显色方法包括但不限于酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
抗补体的标记二抗检测法的特点是，它可以确认样本种是否存在能激活补体的，也就是具有细胞杀伤作用的非HLA类DSA，但缺点是，无法检出不激活补体的非HLA类DSA。
图中所示为，用荧光标记抗补体二抗的方法，通过流式细胞技术，检测荧光微球表面结合的非HLA类DSA。
实施例
本实施例采用体外培养扩增的B淋巴细胞作为纯化细胞膜表面抗原的原材料来源，该细胞经HLA特异性的单克隆抗体鉴定，细胞膜表面表达HLA-I类和 II类抗原。
检测步骤如下：
1)采用细胞膜蛋白纯化试剂盒提纯B淋巴细胞细胞膜表面所有蛋白抗原，其中包括HLA类和其他非HLA类抗原。
2)采用共价偶联法把纯化的B细胞膜抗原固定到本实验的固相载体-流式荧光微球表面，抗原包被后可能剩余的抗原结合位点，用含有5％BSA的PBS 封闭，以减少抗体的非特异性结合而导致假阳性反应。
3)对固相载体表面包被的HLA进行封闭后，用于检测被检样本中结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体。
i.图2A为阴性对照：
包被了从细胞膜表面纯化的含有HLA和非HLA抗原的流式微球，在没有接触任何含有HLA或非HLA类特异性抗体的样本、或单克隆抗体的情况下(用PBS缓冲液作为阴性对照)，加入用于检测的荧光标记的二抗后显示阴性反应，该步骤用于排除荧光标记二抗非特异性结合微球，从而导致假阳性的可能性。
ii.图2B和2D为HLA类抗原被封闭前流式微球表面可以结合HLA-I类和 HLA-II类抗体：
由于包被到流式微球表面的混合抗原中含有HLA-I类和II类抗原，当加入含有HLA-I类和II类抗原特异性的抗体与微球进行孵育反应后， HLA-I类和II类抗原特异性的抗体分别和微球表面相对应的抗体发生结合反应，结合到微球表面的HLA-I类(图2B)和HLA-II类(图2D) 抗体，被荧光标记的抗人免疫球蛋白(荧光标记二抗)所识别而检出。
iii.图2C和2E为HLA-I类和II类抗原被分别封闭后，流式微球表面不再结合HLA-I类和HLA-II类抗体：
包被了从细胞膜表面纯化的含有HLA和非HLA抗原的流式微球，经过与HLA-I类和II类特异性抗体发生孵育反应，封闭微球表面HLA抗原，封闭后的微球不再与之前被证实和微球发生阳性结合反应的纯化抗体结合，呈现阴性反应结果。
具体封闭实验方法：
在1.5ml的EP离心管中加入1x106混合抗原包被的微球，再分别加入50μl 的HLA-I类和II类抗原特异性抗体，浓度20-100μg/ml，加入抗体后充分混匀微球，在4℃下孵育至少1小时，孵育期间定期轻弹离心管底部，防止微球沉底，影响封闭效果。孵育反应完成后，微球经三次清洗后即可使用，清洗用1ml的PBS。
iv.图2F和2G为HLA类抗原被封闭后的流式微球用于检测样本中非HLA 类抗体的阴性和阳性结果：
HLA类抗原被封闭后，流式微球经检验不再结合相应的HLA抗体，微球可以用来检测被检样本中是否含有非HLA类抗体。图2F和图2G分别显示了有代表性的阴性和阳性非HLA类抗体的检测结果。
可以理解的是，如未有特殊说明，以上各步骤中采用的材料及方法可通过本领域常规技术手段来实现，在此不做具体阐述及限定。

Claims (10)

1.全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，包括如下步骤：
1)对检测用原材料中的混合抗原进行分离、纯化；
2)将步骤1)纯化好的含有HLA和非HLA类的混合抗原，结合到固相载体表面；
3)对固相载体表面包被的HLA进行封闭后，用于检测被检样本中结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤1)中，检测用原材料的来源包括：移植物供者或潜在供者来源的器官、组织、细胞或其组分，或上述细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
3.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤2)中，所述固相载体包括：塑料平板，微颗粒和膜载体。
4.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤2)还包括对包被了混合抗原的固相载体表面可能存在的未吸附位点进行封闭。
5.根据权利要求4所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，用于封闭固相载体表面可能存在的未吸附位点的溶液包括：血清白蛋白，或小牛血清。
6.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤3)中，用HLA特异性抗体或者已被证实能和HLA分子结合的其他类似物对固相载体表面包被的HLA进行封闭。
7.根据权利要求6所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，所述HLA特异性抗体选自完整抗体或抗体的片段；单克隆或多克隆抗体；单一的抗体或者两个以上抗体的组合；人源性的、动物源性的、或重组抗体。
8.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤3)还包括：在HLA封闭反应完成后，用已知具有HLA特异性的单克隆、多克隆抗体、或抗体的组合，来确认HLA被封闭后的固相载体表面无法再结合HLA抗体。
9.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤3)中，所述被检样本来源于器官、组织，和干细胞移植受者的体液、移植器官或组织的灌洗液、或洗脱液。
10.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的纯化抗原法，其特征在于，步骤3)中，检测被检样本中结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体的方法包括：
a.抗抗体的标记二抗检测法，包括：
结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体，在加入能识别被检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗后，根据标记二抗所带的特异性标记物，通过显色被检出；
b.抗补体的标记二抗检测法，包括：
结合到固相载体的非HLA类供者特异性抗体中，对于能激活补体的部分抗体，通过依次或同时加入补体以及抗补体的标记二抗的方法检出；阳性结果根据标记二抗所带的特异性标记物，通过显色被检出。
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