CN111413505B - 全面检测非hla类供者特异性抗体的细胞学方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于全面检测移植物受者样本中和移植排异有关的，非HLA类供者特异性抗体(Donor Specific Antibody，DSA)的细胞学方法。本发明利用移植物供者或潜在供者来源的组织细胞作为靶细胞，通过对细胞表面HLA类抗原采取封闭反应的实验设计，阻断受检样本中HLA类DSA和靶细胞表面相应HLA的结合，因而只有非HLA类的DSA才能被检出。在目前对非HLA类抗原的品类和数量不完全明确的现实情况下，本发明首次给临床上提供了一种可以全面检测所有已知或未知的非HLA类抗原的相应抗体的方法。本发明为移植临床排异反应的非HLA类DSA的病因确认、抗排异治疗方法的选择、以及治疗有效性的验证，提供了简易的监测手段。

Description

全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法
技术领域
本发明属于抗体检测技术领域，涉及全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法。
背景技术
在器官、组织、和非自体的(造血)干细胞移植中，移植物受者产生的针对供者移植物抗原的抗体，被称为供者特异性抗体(Donor Specific Antibody，DSA)，DSA是导致抗体介导的排斥反应主要原因，并作为确诊用必须指标，被写入了BANFF国际诊断标准。
根据其所针对的供者来源的抗原的特异性，DSA被分为HLA类DSA和非HLA类DSA两类。人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)是最早被发现的、具有人群多态性的移植排斥相关抗原，目前已经有上万种HLA类抗原被人类发现。非HLA类抗原的品类非常繁多，其中包括各类组织的特异性抗原，如血小板特异性抗原，内皮细胞表面特异性抗原，等等。但遗憾的是，目前为止被发现的非HLA类抗原仍然非常有限的。
目前，用供者或潜在供者来源的细胞来检测移植物受者样本中DSA的方法包括以下两类：
(一)以抗体的补体依赖性细胞杀伤作用为机理的细胞学方法
如图1所示，移植物受者的血清等生物样本，和移植物供者或潜在供者来源的细胞发生孵育反应(图1A)；受者样本中含有的HLA或非HLA类DSA，就会和供者来源细胞表面相对应的靶抗原发生结合反应，未结合的游离抗体被清洗后清除(图1B)；在补体存在的前提下，根据抗体的补体依赖性细胞杀伤(Complement dependent cytotoxicity，CDC)作用机理，移植物受者生物学样本中，能激活补体的HLA或非HLA类DSA，会对表达HLA或非HLA类靶抗原的细胞产生杀伤作用，导致细胞死亡(图1C)，靶细胞被杀伤，即表示受检样本中存在可以激活补体的针对靶细胞表面抗原的抗体(HLA或非HLA抗体)。
(二)以抗体结合供者细胞表面抗原为机理的标记二抗显色法
如图2所示，移植物受者的血清等生物样本，和供者或潜在供者来源的细胞混合进行孵育(图2A)；样本中含有的HLA或非HLA类DSA就会和供者来源细胞表面相对应的靶抗原发生结合反应(图2B)；不结合的游离抗体被清洗清除后，加入可以识别结合到细胞表面的HLA或非HLA类DSA的标记二抗，不结合的标记二抗被清洗清除后，被标记二抗识别的HLA或非HLA类DSA的阳性结合反应，可以通过化学发光或免疫荧光的形式被检出(图2C)。
对于以上两种检测DSA的细胞学方法，需要重点指出的是，由于检测DSA所用的供者或潜在供者来源的靶细胞表面既表达HLA(仅有红细胞不表达HLA)，也表达非HLA类抗原，因此，现行的细胞学检测方法的优点是能够同时检出HLA类和非HLA类的DSA；但他们共同的致命缺点是，不能区分结合到靶细胞表面的抗体到底是HLA类还是非HLA类DSA。
在HLA类DSA检测方面，由于HLA体外克隆、表达、纯化技术的进展，用纯化的HLA体外检测HLA类DSA的方法已经得到了广泛的临床应用，HLA抗体和排斥反应的因果关系已被大量临床和实验室数据所确认(Transplantation.2008Aug 15；86(3):377-83)。
在非HLA类DSA检测方面，由于非HLA抗原品类繁多，被发现的却非常少，未被发现的非HLA类抗原比例非常高。目前对于非HLA类DSA的检测，只能利用一些已知的非HLA类抗原，来检测极小部分的非HLA类DSA，从而漏检了很多其他已知和大量未知的非HLA类DSA。
目前，临床检验上没有很好的方法可以全面系统地对非HLA类DSA进行检测。然而，临床研究却又发现，在HLA完全相同的供受者之间进行器官移植时，排除了HLA类DSA的作用，仍然有相当比例的移植病例最终因非HLA类免疫因素引起的排斥反应，而导致移植物最终失去功能，非HLA类DSA在排异反应中的占比甚至超过了HLA类DSA(Current Opinion inImmunology 2005,17:541–545；Lancet 2005；365:1570–76)。
基于以上事实，在不完全确定非HLA类抗原的品类和数量的现实情况下，如何系统全面地对其进行检测，是移植检验中一个亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于，提供一种全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法。本发明通过对靶细胞表面的HLA抗原进行封闭的方法，建立了一种在大多数非HLA类抗原未知的情况下，可以全面检测非HLA类DSA的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，包括：
1)封闭靶细胞表面的HLA；
2)将受检样本与HLA被封闭的靶细胞孵育后，清洗去除未结合的所有游离抗体；
3)检测受检样本中与靶细胞表面对应的非HLA抗原结合的非HLA类DSA。
优选地，步骤1)中，所述靶细胞取材于移植物供者或潜在供者(如潜在供者人群中选取的个体或群体)来源的器官、组织(包括上皮、结缔、肌肉、神经组织)、细胞或其组分，或上述组织、细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
优选地，步骤1)中，用于封闭HLA的物质包括HLA特异性抗体、其类似物、抗体片段，或它们(即上述HLA特异性抗体、其类似物、抗体片段)的组合。
优选地，步骤1)中，在封闭反应完成后，可以用已知具有HLA特异性的抗体或抗体的组合，来确认HLA被封闭后，靶细胞无法再结合HLA抗体。
优选地，步骤2)中，受检样本包括移植物受者的体液、移植器官或组织的灌洗或洗脱液。
优选地，步骤3)中，检测非HLA类DSA的方法包括细胞杀伤检测法，标记二抗显色法。
进一步地，所述细胞杀伤检测法包括：具有补体激活功能的非HLA类DSA结合到靶细胞表面，在加入补体后，通过抗体的补体依赖性细胞杀伤作用杀死靶细胞，在显微镜下检出经染色的死亡靶细胞。
进一步地，所述标记二抗显色法包括：非HLA类DSA结合到靶细胞表面后，再加入能识别受检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗，根据标记二抗所带的特异性标记物检出。
优选地，所述标记二抗显色法采用的显色方法，包括但不限于酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
本发明的有益效果在于：
本发明利用对靶细胞表面的HLA采取封闭反应的实验设计，阻断受检样本中HLA类DSA和靶细胞表面相应HLA抗原的结合，因而，只有非HLA类的DSA才能被检出。通过对非HLA类DSA的检测，本发明为移植临床排异反应的非HLA类DSA的病因确认、抗排异治疗方法的选择、以及治疗有效性的验证，提供了简易的监测手段。
附图说明
图1为现有技术中以抗体的补体依赖性细胞杀伤作用为机理的细胞学方法原理图。
图2为现有技术中以抗体结合供者细胞表面抗原为机理的标记二抗显色法原理图。
图3为本发明非HLA类DSA检测的细胞学方法原理图。
图4为本发明实施例血清样本中非HLA类抗体的流式细胞检测实验。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
本发明非HLA类DSA检测的细胞学方法原理如图3所示，主要包括：
3A.靶细胞表面HLA的封闭：将靶细胞和用于封闭HLA的抗体、其类似物，或抗体片段，或它们的组合进行孵育，阻断受检样本中HLA抗体的结合(图3A显示封闭反应使用了HLA特异性抗体的F(ab’)2片段)。
具体地，
1)靶细胞来源：
移植物供者或潜在供者(如潜在供者人群中选取的个体或群体)的器官、组织(包括上皮、结缔、肌肉、神经组织)、细胞或其组分，移植物组织的细胞组分，或以上组织、细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
2)对靶细胞膜表面的HLA进行封闭：
a)封闭HLA可以用HLA特异性抗体或者已被证实能和HLA分子结合的其他类似物；
b)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是完整抗体或抗体的片段；
c)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是单克隆或多克隆抗体；
d)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是单一的抗体或者两个以上抗体的组合；
e)封闭HLA所用HLA特异性抗体可以是人源性的、动物源性的、或重组抗体。
3)所选封闭抗体有效性验证：
在封闭反应完成后，可以用已知具有HLA特异性的单克隆、多克隆抗体、或抗体的组合，来确认HLA被封闭后的靶细胞无法再结合HLA抗体。
3B.非HLA类DSA和抗原的结合：受检样本(如移植物受者的体液、移植器官或组织的灌洗或洗脱液)与HLA被封闭的靶细胞孵育后，样本中非HLA类DSA与细胞表面对应的非HLA抗原结合，而HLA类的DSA由于其靶抗原被封闭而无法结合到细胞表面。清洗去除未结合的所有游离抗体；
3C.非HLA类DSA被检出：HLA被封闭的靶细胞结合了非HLA类DSA之后，结合在靶细胞表面的非HLA类DSA可以通过下列两种显示系统被检出：
a.细胞杀伤(检测)法：
结合到靶细胞表面的具有补体激活功能的非HLA类DSA，在加入补体后，可以通过补体依赖性细胞杀伤作用杀死靶细胞，死亡的靶细胞可经染色在显微镜下被检出(图3C，上)。
细胞杀伤检测法的缺点是只能检出能激活补体的非HLA类DSA，而漏检了不能激活补体的非HLA类DSA。
b.标记二抗显色法：
结合到靶细胞表面的所有的非HLA类DSA，在加入能识别受检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗后，可以根据标记二抗所带的特异性标记物，通过化学发光或免疫荧光的形式被检出，显色方法包括但不限于酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光(图3C，
下)。
标记二抗显色法的优点是它可以同时检出能激活或不能激活补体的两中非HLA类DSA。
实施例
根据图3所示检测技术原理图，本实施例采用了其中的标记二抗显色法，利用荧光标记二抗的流式细胞技术，检测血清样本中非HLA类抗体，如图4所示。
本实验所用的靶细胞是被预先鉴定并确认表达HLA-I类抗原的，经体外培养、扩增的淋巴细胞。
4A.阴性对照：靶细胞在不与任何含有HLA或非HLA类抗体的样本接触，表面未结合任何抗体的情况下，直接和荧光标记二抗孵育，显示阴性反应，此阴性对照的设立，用于排除荧光标记二抗直接和细胞发生结合反应，产生假阳性的可能。
4B.HLA被封闭前：靶细胞和纯化的HLA多克隆抗体发生孵育反应，清洗去除未结合的样本中的游离抗体；细胞进一步与小鼠来源的、PE-标记的抗人免疫球蛋白发生孵育反应，清洗去除未结合的游离PE-标记二抗；流式检测显示HLA抗体的阳性结合反应，该结果表示细胞表面的HLA类抗原在未封闭前，可以结合HLA类抗体。
4C.HLA被封闭后：封闭反应前被确认能与靶细胞发生阳性反应的、纯化的HLA多克隆抗体，在靶细胞表面HLA被封闭后，不再与靶细胞发生结合反应，该结果显示靶细胞表面HLA的封闭反应成功。封闭反应具体方法：取靶细胞1×106，用PBS缓冲液清洗三次，去上清，加入100μl的HLA-I特异性的鼠抗人单克隆抗体W6/32，浓度100μg/ml，充分混匀细胞成混悬液，在4℃孵育30分钟后，用1ml PBS缓冲液清洗三次，去上清后得HLA被封闭的靶细胞，取少量用HLA特异性抗体确认封闭成功后，其余被封闭的靶细胞用于非HLA类抗体的检测。
4D.HLA被封闭的靶细胞用于检测非HLA类抗体：把移植病人外周血血清样本和HLA被封闭的靶细胞发生孵育反应，清洗去除未结合的游离抗体；HLA被封闭的靶细胞进一步与小鼠来源的、PE-标记的抗人免疫球蛋白发生孵育反应，清洗去除未结合的游离PE-标记二抗；流式检测显示阳性结合反应，该结果表示HLA被封闭后，细胞表面的非HLA抗原和病人血清中含有的非HLA类抗体发生结合反应，继而被荧光标记二抗通过流式细胞方法检出。
可以理解的是，基于本发明，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他技术方案，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，包括：
1)封闭靶细胞表面的HLA；
2)将受检样本与HLA被封闭的靶细胞孵育后，清洗去除未结合的所有游离抗体；
3)检测受检样本中与靶细胞表面对应的非HLA抗原结合的非HLA类DSA。
2.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤1)中，所述靶细胞取材于移植物供者或潜在供者来源的器官、组织、细胞或其组分，或上述组织、细胞经体外分离、培养、扩增后的细胞。
3.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤1)中，用于封闭HLA的物质包括HLA特异性抗体、其类似物、抗体片段，或它们的组合。
4.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤1)中，在封闭反应完成后，用已知具有HLA特异性的抗体或抗体的组合，来确认HLA被封闭后，靶细胞无法再结合HLA抗体。
5.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤2)中，受检样本包括移植物受者的体液、移植器官或组织的灌洗或洗脱液。
6.根据权利要求1所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，步骤3)中，检测非HLA类DSA的方法包括细胞杀伤检测法，标记二抗显色法。
7.根据权利要求6所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，所述细胞杀伤检测法包括：具有补体激活功能的非HLA类DSA结合到靶细胞表面，在加入补体后，通过抗体的补体依赖性细胞杀伤作用杀死靶细胞，在显微镜下检出经染色的死亡靶细胞。
8.根据权利要求6所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，所述标记二抗显色法包括：非HLA类DSA结合到靶细胞表面后，再加入能识别受检样本中抗体的类型或其亚型的标记二抗，根据标记二抗所带的特异性标记物检出。
9.根据权利要求6或8所述的全面检测非HLA类供者特异性抗体的细胞学方法，其特征在于，所述标记二抗显色法采用的显色方法包括：酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光、免疫荧光。
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