JP2008178421A - リンパ球機能の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血液、唾液、または尿などの生体液試料においてミトゲンまたは抗原に対するリンパ球のセットまたはサブセットの反応を測定する方法であって、細胞の母集団をミトゲンまたは抗原とともに培養する過程と、所望の細胞サブセットに存在する細胞表面決定因子で固相に付着する特異的な結合試薬の相互作用により所望の細胞サブセットを分離する過程と、分離した細胞を溶解する過程と、細胞が刺激に反応した場合に増加する細胞間成分を測定する過程とを含む方法を開示している。この方法は多様な条件の下での免疫作用の測定のための便利で単純で高信頼性の方法を提供する。
【選択図】図1
Description
of the International Federation of Clinical Chemistry)第6巻第84-94頁(1994年)所載のグレーンベルトほか(Groeneveld
et al)共著の論文、およびJAMA第206巻第1208ー1216頁(1995年)所載のクローおよびロス(Clough and Roth)共著の論文参照)。
al 組織抗原(Tissue Antigen)第28巻第46-52頁(1986年)、およびJ.S. Bernan et
al 免疫学雑誌(J. Immunol.)第138巻第2100-03頁(1987年)を参照されたい。これらの方法の実施においては、結合分子(例えば、単クローン性抗体)を磁性微粒子やプラスチック・ビーズなどの固相支持体に通常接合させ、さらに、分析対象の特徴的な決定因子への結合をもたらす条件下で試験標本に加える。次に、固相支持体と複合体を形成した細胞を固相支持体の性質に応じ磁界に曝しまたは濾過その他の処理を加えて非複合化細胞から分離する。移植前に骨髄細胞由来のリンパ球の中のいくつかの下位母集団を分離し移植後の移植片対宿主反応を除去するためにこの方法を利用したことも報告されている。Burturini et al 骨髄移植の進歩(Prog. Bone
Marrow Transpl.)第4巻第13-22頁(1987年)参照。この方法の使用例を紹介した他の報告としては、腫瘍細胞の分離(Kernshead et al, B.J. Cancer 第54巻第771-78頁(1986))、および後続の機能評価のためのリンパ球下位母集団分離などの例がある。
Biol.)第62巻第338-43頁(1984年)、およびLundin et al 酵素方法学誌(Meth. Enzymol.)第133巻第27-42頁参照。ATP濃度の測定は、化学療法製剤および細胞系統のその他の研究に使われてきており、生体質量や細胞数の増加を監視するのに用いられてきている。ATP濃度は、蛍のルシフェラーゼとルシフェリンとの間の生物発光反応を用いることによって極めて高感度に測定することができる。例えば、Leach & Webster 酵素方法学誌(Meth. Enzymol.)第13巻第51-70頁(1986年)参照。細菌または体細胞の中のATP濃度の測定は多数報告されている。例えば、ここに引用してその内容をこの明細書に組み入れる米国特許第3,690,832号、同第5,283,179号、同第4,144,134号、同第4,283,490号および同第4,303,752号参照。従来技術において認識されていなかったものは、ミトゲンや抗原などの誘発因子へのT細胞の反応の結果として、反応細胞の代謝活動が大幅に増加すること、その増加がATP濃度の著しい増加に反映されることである。さらに、ATP濃度の僅かな変化、または少数の細胞におけるATP濃度の変化も、ルシフェリン・ルシフェラーゼ系の高感度によって測定可能である。
本発明において、誘発剤とは、リンパ球との間でそのリンパ球細胞の状態に変化をもたらす相互作用を有する物質である。より詳細に述べると、「誘発剤」とは、安静状態のリンパ球を活性化させ、その細胞内に機能的活動を誘発できる物質をいう。一般に、誘発剤は二つの部類、すなわち、(i)特定のサブセットのリンパ球すべてと相互作用する誘発剤であって、反応細胞の増殖に至る活性化を誘発するミトゲン、および(ii)限られた下位細胞母集団に対して特異的受容体を通じて相互作用を示す抗原である。しかし、サイトカイン、成長因子、アレルゲン、同種抗原類、炭水化物(多糖類)や脂質類および核酸類などの蛋白搬送体に接合したペプチドまたは低分子量化合物など上記以外の物質を誘発因子として用いることもできる。
対象の細胞サブセットは全血、尿、大便、唾液、脳脊髄液、羊水、組織抽出物、洗浄液、腫瘍バイオプシー、移植臓器バイオプシーなどの生体液を含む多様な試料の中に存在し、培養試料からのものであってもよい。対象の細胞はヒト由来のものであっても動物由来のものであってもよい。試料としては、一部密度勾配遠心分離などの分離手法によって部分精製した各種生物由来の標本を含む。
対象の機能的サブセットは特徴的細胞表面決定因子の発現によって区別される。また、同一サブセット由来であるが分化段階の異なる細胞同士は細胞表面における特徴的決定因子の発現によって区別される。機能的活性状態の異なる細胞またはミトゲンや抗原との初期の相互作用後の時間の異なる細胞も互いに異なる細胞表面決定因子を発現する。
本発明の方法による細胞サブセットの存在の判定または量の測定は、対象のサブセット細胞と、特異的結合物質間の選択的相互作用によって実現される。本発明の実施の際に用いられる特異的結合物質は特徴的な細胞決定因子に対して選択的認識を示すものでなければならない。混合細胞集団を分析して例えば特徴的な細胞表面抗原を持つ下位母集団やサブセットを特定する場合は、その特異的結合物質は、対象の抗原を免疫特異的に認識する相補的抗体であってもよい。このような選択的認識に基づき、特異的結合物質は対象のサブセットと選択的な相互作用および結合を行うことができ、それによって試験媒質ほか対象外の培養液中成分とは物理的および化学的に別の複合体または凝集体を形成する。有利な実施態様においては、表面抗原CD4を担うTリンパ球と単球を含む血液標本をCD4単クローン性抗体を含む特異的結合物質に曝す。
対象の細胞の分離のあと、分離した細胞集団をリンパ球を溶解できる物質を含む溶液を添加して溶解する。この種の溶液としては多様のものが存在し当業者には周知である。すなわち、この種の溶液としては、蒸留水、トリトン-XまたはNP-40などの洗剤液を含む溶液、および、0.1M塩化ベンザルコニウムを含むヒーペス(HEPES)などのpH7.4緩衝液が挙げられる。材料と選んだ溶液とがATP測定系と干渉せず、ATPを含まず、ATPを変性させないものであることが重要である。
細胞の破壊ののち溶液の中のATP濃度を測定する。有利な実施態様では、ATPをマグネシウム・イオンの存在下で、蛍のルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む溶液を添加することによって測定する。ATPの測定は免疫化学的または生化学的反応系を含む上記以外の手段でも行うことができる。
本発明のもう一つの側面によれば、本方法の実施に用いる各種付属品とともに、希釈用溶媒、細胞固定用固相支持体、細胞溶解用試薬、抗原またはミトゲンおよび洗浄緩衝剤、1個以上の基準液などの試薬を調合のための説明書を含めて一つの試験用キットにまとめてあるので便利である。この試験用キットに含まれる試薬は多様な形態で提供し、適当な希釈剤と一緒に乾燥状態で包装するか、すぐに使える形で提供する。
正常な個人からFicoll-Hypaque上で密度勾配遠心分離して得た起源白血球(Gulf Coast血液銀行より入手)から抹消血単核細胞(PBMC)を分離した。バフ皮状の層から得た細胞を10%牛胎児血清(FCS)を含むRPMIで遠心分離して洗浄し、5%牛胎児血清(FCS)を含むRPMIで約1x105個/mlの細胞濃度に調整した。1分液の細胞を未刺激のまま培養し、一方もう一つの分液の細胞をファイトヘムアグルチニン(PHA)、1μg/ml濃度のT細胞ミトゲンで24時間刺激した。この分液を10%FBSを含むRPMI 1640で1:20に希釈した。2μg/mlの濃度でCD4に対する抗体をすべての培養体に加えた。細胞を室温で30分培養し、次に100μlのヤギ抗マウス抗体で被覆した常磁性ビーズ(Advanced
Magnetics)を加えた。この細胞懸濁液を緩やかに混合し、室温で30分培養した。細胞とビーズを再懸濁し、重力に対し磁界が垂直方向に向くように永久磁石に接して置いた。ビーズが緻密なペレットを形成したのち、培養液を吸引し磁石を取り去った。別の緩衝液を加え、細胞とビーズを再懸濁した。この工程を数回繰り返した。培養液を完全に除去した後、ビーズ・ペレットの中の細胞を体細胞溶解剤(Sigma)とされる洗剤液で破壊し、培養管を光度計の中に置いた。0.25M ヒーペス、0.1M DTT、および、0.5% BSAを含む溶液に、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびMg2+を含む混合物を溶解した液100マイクロリットルをこの管に注入し、数値を判定した。
抹消血単核細胞を互いに異なる数人の個人から密度勾配遠心分離により分離し、洗浄し、5% FCSを含むRPMI 1640にて培養した。この細胞を分注し、刺激なしで放置、またはPHA、CD3抗体、破傷風類毒素またはインフルエンザ・ウィルス抗原による刺激のいずれかの処置を施した。すべての試料を同一の抗原で処理したわけではない。48時間の培養ののち細胞をRPMI
1640で希釈し、CD4抗原に対するマウス・単クローン性抗体で室温で30分培養し、次に常磁性ビーズに接合させたマウスIgG抗体(Advanced Magnetic社)で室温で30分培養した。試料を永久磁石により分離し洗浄したのち、細胞を体細胞破壊用試薬(Sigma Chemical)で破壊した。ルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬(Sigma Chemical)を1:10に希釈し、100マイクロリットルを添加した。次に、相対的光度単位を測定した。図1はこれらミトゲンや抗原に対する異なる患者試料の反応を示すものであるが、本発明の方法が個々の患者試料においてミトゲンや抗原に対する反応を検出できることを実証している。
この例は互いに異なる細胞表面マーカーを用いて実施した定量の能力を調べるものである。抹消血単核細胞に刺激なしまたはPHA(1%)による24時間、48時間、72時間または96時間刺激のいずれかの処置を施した。刺激なしまたはPHA刺激細胞の分液をCD3、T細胞受容体、CD4またはCD69に対するマウス単クローン性抗体で室温で30分培養した。次に、全ての分液をヤギ抗マウスIgGを予め吸着させておいた常磁性ビーズとともに室温で30分培養した。このビーズと細胞複合体とを永久磁石を用いて分離し、10% FCSを含むRPMIで3回洗浄した。この細胞を0.5% NP-40溶液で溶解した。ルシフェリン・ルシフェラーゼ混合物(Sigma Chemical社)を1:10に希釈し、100μlを各培養管に加えた。図2は、これらの定量の結果を示す。いずれの場合も、刺激ずみ細胞からの相対的光度単位は、刺激なしの細胞からの相対的光度単位よりも大きかった。この試験結果は互いに異なるサブセット由来のリンパ球の反応を評価するのに、互いに異なる細胞表面マーカーが有用であることを実証している。
全フロイント補助剤に乳化させたナイン・マイル菌株(Integrated Diagnostics社)から調製した合計100μgのQ熱抗原によりBalb/cマウスに免疫処置した。初回血液サンプルを10匹のマウスの眼窩洞から採取した。後続血液サンプルを接種から7日のちに採取した。各マウスから約100-200mlの血液を採取した。抹消血単核細胞を密度勾配遠心分離により分離した。白血球層を取り出し、10%
FCSを含むRPMI-1640で洗浄した。約100μlの細胞を各培養管に入れた。細胞ペレットを他の添加物の全くない状態、または、Q熱抗原(10μg/mlないし1μg/ml)の存在下で培養した。24時間後培養体を10% FCSを含むRPMI-1640で1:40に希釈し、マウスCD4に対する抗体で被覆した超常磁性ビーズ(Advanced Magnetics社)100μlを添加した。このビーズと細胞を室温で30分培養した。ビーズを複合細胞とともに永久磁石で分離し、10% FCSを含むRPMIで3回洗浄した。体細胞溶解試薬(Sigma
Chemical社)を100μl添加して細胞を溶解した。さらに10分室温に放置した後、100μlのルシフェリン・ルシフェラーゼ混合物(Sigma
Chemical社)を注入し、光度出力を光度計により測定した。
血液試料は正常の供血者から入手し、抗凝固剤のヘパリン中に収集した。血液の分液(100μl)をRPMIで1:5に希釈した。この分液を添加物なし1% PHA、または最終濃度が100U/mlのIL-2の添加のいずれかで処理した。試料を37℃でひと晩培養した。翌日、試料100μlを取り出し、CD4に対するマウス単クローン性抗体で37℃で30分間培養した。ヤギ抗マウスIgGで被覆した常磁性ビーズを各試料(100μl)に加え、37℃で30分間培養した。ビーズ・細胞複合体を、10% FCSと0.1% BSAとを含むPBSで3回洗浄した。細胞を蒸留水で溶解した。ルシフェリン・ルシフェラーゼを添加し、相対的光度単位を測定した。次の表は、その試験結果を示す。
抹消血単核細胞を正常の供血者からのヘパリン添加全血から密度勾配遠心分離により分離した。細胞を10% FCSを含むRPMIで洗浄し、同じ溶媒に1 x 105個/mlの密度に再懸濁し分液を調製した。分液は、添加物なしまたは各種濃度のインフルエンザA抗原またはPHAの添加のいずれかで処理した。24時間ののち、CD8に対するマウス単クローン性抗体を添加し、細胞を室温で30分培養した。マウスIgGに対するヤギ抗体に結合した常磁性ビーズを添加し、培養体を永久磁石に隣接配置することによって複合体を分離した。複合体を10% FCSを含むPBSで3回洗浄し、次に細胞をPBSに溶解した0.05% トリトンX100を添加して溶解した。ATP濃度をルシフェリン・ルシフェラーゼにより測定した。個々の試料は全てPHAに対して>10の刺激指数の反応を示したが、インフルエンザ・ウィルス抗原に対する刺激指数は1.2-4.0の範囲であった。
正常供血者からの血液をヘパリンを含む採取管に収集した。破傷風類毒素10ng/ml、鵞口瘡カンディダ20ng/ml、1:4希釈のインフルエンザA、またはヒト・トランスフェリン10ng/mlを500μlの血液に添加し、または添加物なしで37℃で24時間培養した。100μlの試料を取り出しCD4抗原に対するマウス・モノクローン性抗体で被覆した常磁性体(Perspective BioSystems)20μlと室温で30分培養した。ビーズ・細胞複合体を永久磁石を用いて試料から分離し、次に5% FCSを含むRPMI 1640で3回洗浄した。次に、体細胞溶解用試薬(Sigma Chemical社)15μlを添加して細胞を溶解し、150μlのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応混合物(Sigma Chemical社)を添加した。光度出力を光度計で測定し、刺激指数を算定した。
Claims (6)
- リンパ球の活性化を検出する方法であって、
相互間を互いに区別する特徴的決定因子をそれぞれ有するリンパ球からそれぞれ成る複数のリンパ球サブセットを含む細胞種類の混合した母集団を含む試料を、ミトゲンおよび抗原から成る群から選ばれた誘発剤とともに培養する過程と、
前記試料から被選択リンパ球サブセットを分離する過程と、
ATP、NADPおよびPCNAから成る群から選ばれた細胞内成分であって活性化に相関する細胞内成分を遊離させるように前記被選択リンパ球サブセットの中にリンパ球を溶解させる過程と、
前記活性化に相関する細胞内成分のレベルを測定する過程と、
前記測定する過程で測定した前記活性化に相関する細胞内成分の前記レベルから、前記被選択リンパ球サブセットについてリンパ球の活性化を算定する過程と
を含む方法。 - 前記活性化に相関する細胞内成分がATPである請求項1記載の方法。
- 前記誘発剤がミトゲンである請求項1記載の方法。
- 前記誘発剤がウィルス、バクテリアおよび真菌から成る群から選ばれた抗原である請求項1記載の方法。
- 前記試料として全血を選ぶ過程をさらに含む請求項1記載の方法。
- 前記リンパ球サブセットがBリンパ球である請求項1記載の方法。
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