ES2235231T3

ES2235231T3 - Metodos para la medicion de la funcion linfocitica.

Info

Publication number: ES2235231T3
Application number: ES97916955T
Authority: ES
Inventors: Marjorie L. Wier
Original assignee: Biotechnology Transfer Inc
Current assignee: Biotechnology Transfer Inc
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2017-03-24
Also published as: EP1019546A4; JP4127724B2; CA2248792C; AU724703B2; DE69731982D1; AU2543797A; EP1019546B1; JP4151986B2; JP2008178421A; ATE284974T1; JP2000510687A; US6630316B1; WO1997036008A1; CA2248792A1; US5773232A; DE69731982T2; EP1019546A1

Abstract

Método para analizar muestras biológicas que contienen linfocitos, que se exponen a un agente inductor, caracterizado porque a) dicha muestra que contiene una población mixta de tipos celulares que incluyen linfocitos se incuba con dicho agente inductor, después de lo cual b) se detecta el nivel de ATP, NADP o PCNA en un subconjunto seleccionado de los linfocitos.

Description

Métodos para la medición de la función linfocítica.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para medir la función de los linfocitos y sus repuestas frente a mitógenos o antígenos específicos. Los métodos son adecuados para la medición de las respuestas de linfocitos T cuando son una subpoblación de células y también para medir la función de subconjuntos específicos de linfocitos T, teniendo cada subpoblación o subconjunto de una subpoblación características determinantes sobre su superficie celular. La invención también se refiere a kits de prueba utilizados para llevar a cabo tales métodos. Los métodos de la invención facilitan la detección de líquidos biológicos complejos, tales como la sangre completa, por medio de la incubación de una muestra del líquido con un mitógeno o antígeno, la separación del subconjunto de interés seleccionado, por ejemplo, a través de separación por afinidad, y la detección de la presencia de un componente celular interno, ATP, que está aumentado como resultado de la respuesta.

Descripción de los antecedentes

El sistema inmunitario es primordial para el control de las enfermedades infecciosas y el cáncer. Los linfocitos, una clase de leucocitos, son tipos celulares críticos que son responsables de las actividades del sistema inmunitario. Los linfocitos se dividen en dos categorías principales, los linfocitos T y los linfocitos B. La valoración general de la función de los sistemas inmunitarios y, en particular, de los linfocitos es importante para valorar la inmunodeficiencia producida por factores genéticos, enfermedades infecciosas tales como (VIH), fármacos tras trasplantes, estrés, envejecimiento o desnutrición.

Los linfocitos expresan receptores sobre la superficie celular que se unen con antígenos o epítopos específicos. La exposición al antígeno da como resultado la expansión de la población de los linfocitos que son reactivos a ese antígeno. La medición de la respuesta del sistema inmunitario frente a un antígeno específico puede ser útil en el diagnóstico de enfermedad infecciosa, hipersensibilidad a determinados agentes, exposición a fármacos inmunológicamente reactivos o respuesta frente a la vacunación.

La función de los linfocitos B o su respuesta frente a un antígeno específico puede valorarse midiendo el nivel de antígeno específico en líquidos corporales, tales como sangre, saliva u orina. La función de los linfocitos B o su respuesta frente a antígenos específicos es más difícil de medir. La medición de las funciones de los linfocitos T o células T se complica por varios factores. En primer lugar, hay varios subconjuntos diferentes de células T con diferentes funciones. Estos subconjuntos se han clasificado en parte mediante la expresión de marcadores característicos de la superficie celular y en parte mediante una variedad de ensayos funcionales que incluyen la medición de citocinas. En segundo lugar, las células T responden a antígenos sólo cuando éstos son presentados por otras células en el contexto de los antígenos de histocompatibilidad mayor sobre la superficie de la célula presentadora. En tercer lugar, muchas de las funciones de las células T dependen del contacto intercelular con células efectoras o las funciones son bastante localizadas. Los métodos actuales para medir la función inmunitaria son tediosos, requieren mucho tiempo y están mal adaptados a las prácticas de laboratorio clínico.

Los métodos que se utilizan actualmente para la medición de la función inmunitaria incluyen: métodos basados en el recuento del número de células T o diferentes subconjuntos; métodos basados en la medición de la proliferación de linfocitos, métodos basados en la medición de la actividad citotóxica o la secreción de citocinas y métodos utilizados in vivo, tales como pruebas dermatológicas y transferencia adoptiva. Estos métodos se describen con detalle en la bibliografía (véase por ejemplo, Groeneveld et al., Journal of the International Federation of Clinical Chemistry, 6:84-94; 1994; Clough y Roth, JAVMA 206:1208-1216, 1995).

Los métodos utilizados más comúnmente en los laboratorios clínicos se basan en el recuento del número de subconjuntos o células T. Se ha descrito una variedad de técnicas que incluyen la microscopía de inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, inmunoensayo enzimático y citometría de flujo. La citometría de flujo, en particular, se utiliza ampliamente en prácticas de laboratorio clínico. La citometría de flujo es particularmente útil en la medición de subconjuntos de interés dentro de una población compleja de células. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.727.020 concedida a Recktenwald describe el uso de dos canales fluorescentes para detectar células en una subpoblación específicamente marcada con dos agentes inmunofluorescentes diferentes. La patente de los EE.UU. número 4.284.412 concedida a Hansen et al., describe el uso de canales de fluorescencia para detectar la dispersión de la luz en ángulo recto y frontal de las células de diferentes subpoblaciones en la sangre. Las principales desventajas de la citometría de flujo son que requiere un equipo complejo y costoso, cada muestra debe pasarse y analizarse individualmente y los resultados requieren interpretación y con frecuencia no son reproducibles. Estas desventajas son particularmente agudas en un laboratorio clínico que debe procesar múltiples muestras de pacientes diariamente y donde la necesidad de resultados sistemáticos y fiables es extremadamente importante.

Las patentes de los EE.UU. 5.385.822 concedida a Melnicoffet et al., y 5.374.531 concedida a Jensen, dan a conocer métodos alternativos a la citometría de flujo para el recuento del número de linfocitos o de un subconjunto de linfocitos dentro de una población mixta de células. Los métodos descritos en estas patentes suponen acoplar una sustancia informadora ("reporter") detectable a la membrana biológica o incorporar la sustancia informadora en el interior de la célula, después separar el subconjunto o población de interés y detectar la sustancia informadora. Estos métodos utilizan separación por afinidad para aislar poblaciones de interés de una mezcla compleja de células. Esta técnica ofrece mejoras sobre la citometría de flujo pero sigue basándose en las técnicas de recuento de células.

La principal dificultad en todas las técnicas de recuento de células es que no miden la función de células específicas o sus respuestas frente a antígenos o mitógenos específicos. Las células que responden a mitógenos o antígenos tienen marcadores de superficie celular únicos que se encuentran sólo en las células que responden. Se han descrito métodos de recuento del número de células que presentan estos marcadores, pero estos métodos son relativamente insensibles debido al hecho de que las células que responden son generalmente una pequeña fracción de la población total. Estos métodos también son tediosos y sometidos a una mala reproducibilidad.

La medición directa de las respuestas de linfocitos ha incluido ensayos de linfoproliferación, ensayos de citotoxicidad y medición de las citocinas. En general, estos métodos requieren la separación de los leucocitos de la muestra original seguido de incubación con antígeno o mitógeno. La medición de la función de subconjuntos específicos de linfocitos requiere extensas manipulaciones antes del ensayo. El requisito para las células presentadoras de antígeno significa entonces que deben añadirse células adicionales de nuevo al cultivo. Los ensayos de linfoproliferación se basan en la división de las células que responden y se realizan habitualmente usando isótopos radiactivos. Debido a que evalúan la división de una pequeña población de células y requieren cultivo tisular, los ensayos duran 3-10 días y están sometidos a una variabilidad significativa basada en la técnica específica y los reactivos utilizados en el ensayo. Las pruebas citotóxicas también requieren una manipulación celular significativa y, de manera similar, son sumamente variables dependiendo de las condiciones específicas utilizadas. También pueden realizarse ensayos de citocinas, pero requieren muchas etapas y la separación de los subconjuntos de interés antes de la estimulación de las células. La patente de los EE.UU. 5.344.755 concedida a McMicheals describe una modificación del ensayo citotóxico basada en la separación inmunomagnética inicial de los linfocitos T, pero este método requiere todavía manipulación extensa de las células efectoras. La patente de los EE.UU. número 5.344.755 proporciona un ejemplo del uso de mediciones de citocinas para valorar el estado inmunológico en pacientes positivos para VIH pero es tedioso y requiere múltiples etapas. Estos métodos han necesitado la separación de tipos celulares críticos, largos tiempos de incubación y, en algunos casos, el uso de sustancias radiactivas. Por estas razones, estos métodos no han sido adecuados para las aplicaciones clínicas.

Se conoce la separación por afinidad de células utilizando partículas magnéticas recubiertas con proteínas u otros tipos de soportes sólidos, tales como partículas de poliestireno, y se utiliza como parte de varios de los métodos anteriormente citados, véase las patentes de los EE.UU. números 5.374.531, 5.385.822, 5.344.755. Se han descrito varios métodos para seleccionar poblaciones biológicas a través de separaciones por afinidad sobre soportes sólidos en la bibliografía de patentes y en otros lugares. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 3.970.518, 4.710.472, 4.677.067, 4.666.595, 4.230.685, 4.219.411, 4.157.323; véase también E. T. Menz et al., Am. Biotech. Lab. (1986); J. S. Kemshead et al., Molec. Cell. Biochem., 67:11-18 (1985); T. Leivestag et al., Tissue Antigens, 28:46-52 (1986); y J. S. Bernan et al., J. Immunol., 138:2100-03 (1987). Al llevar a cabo estos métodos, normalmente se conjuga una molécula de unión (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) a los soportes sólidos, tales como las partículas magnéticas o las perlas de plástico y se añaden a una muestra de prueba en condiciones que producen la unión con un determinante característico sobre el analito de interés. Las células complejadas con el soporte sólido se separan entonces de las células no complejadas mediante exposición a un campo magnético o filtración u otro método, dependiendo de la naturaleza del soporte sólido. También se ha informado sobre el uso de esta tecnología para separar determinadas subpoblaciones de linfocitos de las células de médula ósea antes del trasplante y para eliminar la reacción injerto contra huésped posterior al trasplante. Véase A. Butturini et al., Prog. Bone Marrow Transpl. 4:13-22 (1987). Otros usos notificados de esta tecnología incluyen la separación de células tumorales (véase: Kemshead et al., B. J. Cancer 54:771-78 (1986)) y la separación de subpoblaciones de linfocitos para su posterior evaluación funcional.

Los problemas que surgen cuando los linfocitos se separan en primer lugar mediante técnicas de afinidad magnética u otras en fase sólida o separación mediante centrifugación en gradiente, tal como en "Journal of Immun. Meth"., 72, 1984, 127-32, Ishizaka, A. "Evaluation of the Proliferative Response of Lymphocytes by Measurement of Intracellular ATP" y después se utilizan para ensayos funcionales, son que la interacción del linfocito con la molécula de unión puede inducir ella misma cambios funcionales en el linfocito que pueden ocultar cambios posteriores que van a medirse. Además, las células accesorias necesarias para la respuesta de las células T pueden no estar ya presentes, especialmente si se aísla un subconjunto específico de células. Además, las células aisladas se eliminan del entorno natural y es difícil mantener la esterilidad de la muestra requerida para el cultivo tisular posterior.

Sumario de la invención

La invención objeto proporciona un método conveniente, fiable y relativamente rápido para analizar la función de varios conjuntos o subconjuntos de linfocitos. En una realización preferida, el método de la invención supone incubar una población de células con un mitógeno o antígeno, separar el subconjunto deseado de células por medio de la interacción de un reactivo de unión específico que se fija a la fase sólida con un determinante de superficie celular que está presente en el subconjunto de células de interés, lisar las células separadas y medir un componente intracelular que está aumentado si las células han respondido al estímulo. Sin embargo, inicialmente pueden usarse otros agentes inductores además de mitógenos y antígenos en la práctica de esta invención. Agentes inductores adecuados pueden incluir citocinas y factores de crecimiento, alergenos, aloantígenos, péptidos o compuestos de bajo peso molecular conjugados con un vehículo proteico, tal como hidratos de carbono (polisacáridos), lípidos y ácidos nucleicos.

En una realización ventajosa de la invención, la actividad funcional de un conjunto o subconjunto de linfocitos que se distingue por un determinante característico de la superficie celular y que está contenido dentro de una población celular mixta, se mide mediante: exponer la muestra a un mitógeno o antígeno u otro agente inductor, incubar la muestra durante un periodo de tiempo, unir el conjunto o subconjunto de linfocitos a un soporte sólido a través de la interacción del determinante de la superficie celular y una sustancia de unión específica que se une al soporte sólido, lavar las células para eliminar cualquier célula no unida así como sustancias que pueden interferir potencialmente en los medios, lisar las células y detectar el ATP en la disolución. Los resultados obtenidos pueden compararse frente a un patrón conocido. Alternativamente, la muestra puede dividirse en dos o más partes, incubándose al menos una de las partes sin adición de ningún estimulante, mientras que la segunda parte se incuba con la adición de un antígeno o mitógeno u otro agente inductor.

Un aspecto de la invención es la determinación de la respuesta de linfocitos frente a un mitógeno. En este caso, la respuesta de un conjunto de linfocitos a un mitógeno es una medida general de la función inmunitaria. Esta aplicación es de particular importancia en la medición de los efectos de los fármacos o agentes inmunosupresores. En este caso, puede determinarse la capacidad de respuesta de un conjunto entero de linfocitos, tal como los linfocitos T. Alternativamente, puede valorarse el efecto de un virus, tal como VIH, evaluando la respuesta frente a mitógenos de un subconjunto de linfocitos T que expresan el determinante de la superficie celular, CD4.

Otro aspecto de la invención es la determinación de la respuesta de linfocitos frente a antígenos que podrían incluir agentes infecciosos, fármacos, productos químicos, autoantígenos o antígenos tumorales. Este aspecto de la invención es particularmente importante en la monitorización de la exposición de un individuo a una enfermedad infecciosa o a un agente o para el diagnóstico de hipersensibilidad, enfermedad autoinmunitaria o cáncer. Este aspecto de la invención también es útil para la monitorización de la eficacia de las vacunas y para la valoración de la inmunotoxicidad de productos químicos, fármacos y compuestos industriales.

Otro aspecto de la invención es que la respuesta de linfocitos T de varios subconjuntos que incluyen subconjuntos funcionales o basados en la diferenciación, frente a un mitógeno o antígeno puede valorarse basándose en la expresión de diferentes determinantes específicos para un marcador funcional, de diferenciación o de activación sobre la superficie celular. En este aspecto de la invención, se añade un antígeno a una muestra y se incuba durante un periodo de tiempo. Tras la incubación, el subconjunto celular de interés se aísla mediante la unión de las células a un soporte sólido a través de un determinante sobre la superficie celular. Se lavan las células y se lisan y se mide el nivel de un componente intracelular que aumenta como resultado de la activación.

El método de la invención es sumamente sensible debido a la medición de un componente intracelular cuyo nivel aumenta rápidamente tras la exposición de los linfocitos a un mitógeno o antígeno, ATP, NADP o PCNA. En una realización ventajosa, se mide el nivel de ATP utilizando la reacción de bioluminiscencia de la luciferina : luciferasa. La medición de la bioluminiscencia de ATP es una medida sumamente sensible.

Un aspecto adicional de la invención es que el tiempo total necesario para los métodos suele ser de 6-72 horas y normalmente 18-24 horas. El periodo de tiempo relativamente corto es una ventaja en comparación con los métodos actuales que requieren 3-10 días para finalizar.

Se proporcionan kits de prueba para llevar a cabo los métodos de la invención. Los kits de prueba contienen normalmente el antígeno o mitógeno (u otro agente inductor), el estado sólido con la sustancia de unión apropiada, los reactivos requeridos para la detección de los niveles de ATP, el diluyente apropiado y disoluciones de lavado, patrones o instrucciones para preparar los mismos y opcionalmente, otros accesorios tales como tubos de ensayo, separadores magnéticos, lavadores y pipetas de transferencia, que son útiles para llevar a cabo los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Los objetos, aspectos y ventajas anteriores y otros se entenderán mejor a partir de la descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención con referencia a los dibujos en los que:

la figura 1 es un gráfico de barras que muestra las unidades luminosas relativas obtenidas de los linfocitos estimulados con varios mitógenos y antígenos, tal como se trata en el ejemplo 2; y

la figura 2 es un gráfico lineal con tres partes que muestra la estimulación con PHA de linfocitos T separados por CD4, CD69 o CD3.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

La presente invención proporciona métodos sensibles y eficientes para medir la capacidad de respuesta de un conjunto o subconjunto de linfocitos (por ejemplo, células T o células B 25) distinguidos por algún determinante característico expresado sobre la superficie celular, dentro de una población de células mixtas. En particular, la invención proporciona un método para medir la respuesta de linfocitos frente a agentes inductores que incluyen mitógenos o antígenos, así como citocinas y factores de crecimiento, alergenos, aloantígenos, péptidos o compuestos de bajo peso molecular conjugados con vehículos proteicos, tales como hidratos de carbono (polisacáridos), lípidos y ácidos nucleicos.

La presente invención salva los problemas de la técnica anterior mediante la separación de las células T de la muestra después de que las células se hayan expuesto al antígeno y en un espacio de tiempo en el que la interacción del linfocito con la molécula de unión sobre las perlas no afectará a los resultados.

Un segundo aspecto distintivo de la invención supone la medición de los niveles de ATP en las células tras la separación del subconjunto de interés. Es bien conocido que los niveles de ATP son indicativos de actividad metabólica. Véase, por ejemplo, Kangas et al., Med. Biol. 62:338-43 (1984) y Lundin et al., Meth. Enzymol. 133:27-42. La medición de los niveles de ATP se ha usado en estudios de fármacos quimioterápicos y otros agentes de líneas celulares y se han usado para monitorizar los aumentos en la biomasa y el número celular. Los niveles de ATP pueden medirse de manera muy sensible usando la reacción de bioluminiscencia de la luciferasa de luciérnaga con luciferina. Véase, por ejemplo, Leach y Webster, Meth. Enzymol. 13\sim:51-70 (1986). Se ha informado sobre varios métodos para valorar los niveles de ATP en las bacterias o en células somáticas. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 3.690.832; 5.283.179; 4.144.134; 4.283.490; y 4.303.752. Lo que no se ha apreciado en la técnica anterior es que como resultado de la respuesta de las células T frente a un agente inductor tal como un mitógeno o antígeno, la actividad metabólica de las células que responden aumente de manera significativa y que este aumento se refleja en aumentos significativos del nivel de los niveles de ATP. Además, pueden medirse pequeños cambios en los niveles de ATP o cambios en los niveles de ATP en un pequeño número de células debido a la sensibilidad del sistema luciferina : luciferasa.

La invención trata una importante necesidad existente de métodos mejorados para medir la capacidad de respuesta de linfocitos T frente a mitógenos y antígenos, es decir, la función de las células T. Estos métodos muestran sensibilidad comparable o superior a métodos disponibles hasta la fecha. Estos métodos también permiten al usuario analizar múltiples muestras en un tiempo relativamente breve y eliminan la necesidad de equipos costosos y personal sumamente especializado para llevar a cabo el método y no utilizan materiales radiactivos.

Los métodos de la invención pueden utilizarse como un complemento o una sustitución de los métodos y pruebas realizados en los laboratorios clínicos para contar el número de linfocitos en diferentes subpoblaciones. Los métodos descritos en el presente documento incorporan la sensibilidad necesaria de los ensayos que requieren un tiempo más largo con el espacio de tiempo reducido de los ensayos de recuento de células. La utilización de patrones y el suministro de kits basados en estos métodos que incorporan todos los reactivos necesarios dan como resultado un aumento de la reproducibilidad y sistematicidad requeridas para las pruebas usadas en el laboratorio clínico.

Los métodos de la invención tienen varias ventajas sobre los métodos actuales. El tiempo necesario para la respuesta es significativamente inferior al necesario para otros ensayos. El suministro de todos los materiales necesarios para el ensayo en un kit de prueba y la sencillez de la naturaleza de la medición da como resultado una sistematicidad en los resultados de laboratorio en laboratorio. Además, pueden pasarse múltiples muestras simultáneamente. Los métodos son sencillos, rápidos, sensibles y aplicables a las prácticas de laboratorio clínico.

Agentes inductores

En el contexto de esta invención, los agentes inductores son sustancias que interactúan con los linfocitos de tal modo que el resultado de la interacción es un cambio en el estado de la célula. En particular, "agentes inductores" se refiere a sustancias que hacen que los linfocitos en reposo se activen y que también pueden inducir actividad funcional en la célula. En general, los agentes inductores pertenecen a dos clases: (i) mitógenos son agentes inductores que interactúan con todos los linfocitos de un subconjunto particular e inducen la activación seguida de proliferación en las células que responden y (ii) antígenos que interactúan a través de receptores específicos sobre subpoblaciones limitadas de células. Sin embargo, también pueden usarse otras sustancias como agentes inductores que incluyen citocinas y factores de crecimiento, alergenos, aloantígenos, péptidos o compuestos de bajo peso molecular conjugados con un vehículo proteico, tal como hidratos de carbono (polisacáridos), lípidos y ácidos nucleicos.

Se conocen mitógenos para diferentes poblaciones de linfocitos e incluyen lectinas, anticuerpos dirigidos contra determinados receptores de la superficie celular de los linfocitos, tales como CD3 para los linfocitos T o CD2 para los linfocitos B, factores de crecimiento y linfocinas, ésteres de forbol y otras sustancias bioquímicas que aquellos expertos en la técnica conocen. Mitógenos ventajosos incluyen fitohemaglutinina (PHA), Con A y anticuerpo monoclonal para CD3.

Los antígenos reaccionan con un subconjunto más pequeño de linfocitos a través de receptores específicos sobre la superficie celular. Cada linfocito tiene sobre su superficie celular un receptor para un antígeno o molécula específico. Para los linfocitos B, el receptor de superficie celular es un anticuerpo que está unido a la membrana. Para los linfocitos T, el receptor de superficie celular es el receptor de células T con un antígeno reconocido que está presente en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad mayor sobre la superficie de otra célula. La respuesta del sistema inmunitario frente a invasores extraños específicos se basa en el reconocimiento de los antígenos por los receptores sobre la superficie celular de estas células y la resultante activación funcional que se produce como resultado de esta interacción. En general, los antígenos que se unen a estos receptores de la superficie celular son partes pequeñas de moléculas mayores y pueden incluir partes de agentes infecciosos, tales como virus, bacterias, hongos y similares, fármacos, productos químicos orgánicos y productos químicos inorgánicos tales como silicona, metales tales como berilio y proteínas tales como proteínas de células tumorales o proteínas derivadas de órganos implantados o trasplantados. Antígenos ventajosos incluyen la proteína gp 120 o péptidos de gp 120 de la glucoproteína de la envoltura del virus VIH; proteínas de superficie externa de bacterias tales como OSPA, B o C de Borrelia burgdorferi, SiO2, células de fiebre Q inactivadas y modificadas, PPD o toxoide tetánico.

Linfocitos diana

Los subconjuntos celulares de interés están presentes en las muestras de prueba o muestras de origen variado que incluyen líquidos biológicos tales como sangre completa, orina, heces, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquidos amnióticos, extractos tisulares, líquidos de lavado, biopsias tumorales, biopsias de trasplante o pueden proceder de cultivo. Las células de interés son de origen humano o animal. Las muestras también incluyen muestras de varios orígenes biológicos que se han purificado parcialmente mediante centrifugación en gradiente de densidad u otros métodos de separación que se usan para aislar muestras de células parcialmente purificadas.

La invención también puede usarse con líneas celulares de vida prolongada tales como MDLT-4, HL-60, TF-1, NFS60 y L-929. Estas células, así como las procedentes de líquidos biológicos, pueden derivarse de reservas congeladas. En una realización ventajosa, el uso de linfocitos congelados proporciona un mecanismo para transportar muestras clínicas o experimentales sin degradación.

Al analizar una muestra que contiene un subconjunto celular de interés según el método de la invención, la población celular suspendida en su líquido biológico natural o en un medio sintético o biológico adecuado, se expone inicialmente al mitógeno o antígeno específico u otro agente inductor de interés. Es un aspecto particular de la invención que la exposición se produzca durante un periodo de tiempo relativamente corto. Dependiendo de la naturaleza del antígeno o mitógeno que se está examinando, el periodo de tiempo de exposición es de 6-72 horas o superior, pero normalmente tiene una duración de 24 horas.

Tienen un interés particular con fines diagnósticos, terapéuticos y de investigación la medición de las respuestas de los linfocitos T y subconjuntos de linfocitos, que incluyen subconjuntos funcionales principales, tales como células T colaboradoras y células supresoras/citotóxicas para mitógenos o para antígenos específicos. La cuantificación de la capacidad de respuesta de un subconjunto específico de linfocitos T es importante en determinadas condiciones fisiológicas. Por ejemplo, los individuos infectados con el virus de inmunodeficiencia humana pierden su capacidad de respuesta en la población celular CD4 tanto frente a mitógenos como antígenos antes de la pérdida de actividad en otros subconjuntos celulares. Asimismo, la capacidad de respuesta de las subclases de células T frente a mitógenos es importante en la monitorización de individuos que están potencialmente inmunodeprimidos debido al estrés crónico, la quimioterapia o el tratamiento farmacológico. La cuantificación de la capacidad de respuesta de un subconjunto de linfocitos frente a antígenos específicos es importante en la medición de la exposición de los individuos a agentes infecciosos o a un fármaco o compuesto o para determinar una reacción de hipersensibilidad frente a un fármaco o producto químico. Además de los subconjuntos funcionales principales, otros subconjuntos celulares de interés incluyen células en diferentes estadios de diferenciación o células en diferentes puntos de tiempo tras la interacción inicial con un mitógeno o antígeno.

Determinantes característicos

Los subconjuntos funcionales de interés se distinguen por la expresión de determinantes característicos de la superficie celular. Además, las células del mismo subconjunto pero en diferentes estadios de diferenciación se distinguen por la expresión de determinantes característicos sobre la superficie celular. Las células con diferente actividad funcional o en diferentes tiempos tras la interacción inicial con un mitógeno o antígeno también pueden expresar diferentes determinantes de superficie celular.

En esta invención, el determinante característico indica un elemento que identifica o determina la naturaleza de algo. Cuando se usa con referencia a los métodos de la invención, "determinante" significa una molécula expresada sobre la superficie celular que caracteriza la célula de alguna manera. Los determinantes asociados a células incluyen, por ejemplo, componentes de la membrana celular, tales como glucolípidos o lípidos o glucoproteínas o proteínas unidos a la membrana y que incluyen antígenos de superficie celular tanto de la célula huésped como de origen viral, antígenos de histocompatibilidad o receptores de membrana.

Un determinante es la parte de la célula que interactúa con una sustancia de unión específica. Las células se separan por medio de las interacciones específicas entre los determinantes sobre la superficie celular y sustancias de unión específicas que se fijan a fases sólidas. A este proceso se hace referencia en el presente documento como "separación por afinidad". Las sustancias de unión específicas que pueden interactuar con determinantes de la superficie celular incluyen anticuerpos capaces de reconocer los determinantes.

La invención puede usarse como un método para medir cualquier célula inmunológicamente activa que se distingue por algún determinante característico de superficie. Por ejemplo, la invención puede usarse para medir células cancerosas, timocitos, células dendríticas, células de Langerhans, células NK, monocitos, células mieloides, plaquetas, eosinófilos, basófilos, megacariocitos, granulocitos, macrófagos, células de Reed-Sternberg, células B precursoras, panmieloides, células precursoras hematopoyéticas, células endoteliales, células plasmáticas, pan-leucocitos, células proliferativas, progenitores que incluyen pan B, células de linfoma de Burkitt, células dendríticas reticulares interdigitantes y circulantes, neutrófilos, linfocitos T asociados a la mucosa y células de coriocarcinoma.

Sustancias de unión

La determinación de la presencia o cantidad de subconjuntos celulares según los métodos de la invención se consigue mediante la interacción selectiva entre células del subconjunto de interés y una sustancia de unión específica. La sustancia de unión específica usada en la práctica de esta invención debe mostrar un reconocimiento selectivo para el determinante celular característico. Al analizar una población celular mixta para una subpoblación y/o subconjunto que tiene un antígeno característico de superficie celular, por ejemplo, la sustancia de unión específica puede ser el anticuerpo complementario que reconoce inmunoespecíficamente el antígeno de interés. Basándose en tal reconocimiento selectivo, la sustancia de unión específica es capaz de dar una interacción selectiva y de unirse con el subconjunto de interés para formar complejos o agregados que están física o químicamente separados del medio de prueba y otros componentes del mismo que no son de interés. En una realización ventajosa, las muestras de sangre que contienen linfocitos T y monocitos que llevan el antígeno de superficie CD4 se exponen a una sustancia de unión específica que comprende un anticuerpo monoclonal CD4.

El término "anticuerpos" tal como se usa en el presente documento incluye inmunoglobulinas monoclonales o policlonales y fragmentos de inmunoglobulina inmunorreactivos. Otros tipos de sustancias de unión específicas incluyen lectinas, hormonas, citocinas, ligandos de receptor, etc.

Los anticuerpos monoclonales frente a determinantes particulares de superficie celular son de particular importancia en esta realización de la invención. Por ejemplo, pueden seleccionarse linfocitos que comprenden una subpoblación de la sangre completa, mediante un anticuerpo monoclonal que está dirigido contra un antígeno de superficie del leucocito. El antígeno CD45 se expresa uniformemente sobre todos los linfocitos; sin embargo, el antígeno CD45 también se expresa sobre los monocitos. Por tanto, si se desea la unión selectiva de los linfocitos, es necesario seleccionar un anticuerpo monoclonal CD45 que se una de manera significativa a más sitios de unión por célula sobre los linfocitos que los monocitos o que se una con mayor fuerza a los linfocitos que a los monocitos.

En una realización particularmente ventajosa, se desea separar sólo linfocitos T colaboradores dentro de una muestra de sangre completa. Esto se consigue, tal como se describió anteriormente, usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antígenos de superficie de células T, tales como CD4, o se consigue usando una combinación de anticuerpos que reaccionan principalmente con linfocitos T colaboradores. En otra realización de la invención, los linfocitos que se han activado por la exposición a un antígeno específico se separan utilizando anticuerpos dirigidos contra antígenos que se expresan sólo tras la activación sobre la superficie celular. Estos anticuerpos reaccionan con uno o una combinación de los siguientes antígenos de la superficie celular, CD25, CD69, CD71, CD45RO o antígenos de clase II del MHC. El uso de estos antígenos para la separación da como resultado una amplificación significativa de la señal procedente del ensayo, ya que sólo las células que expresan estos marcadores han respondido a la señal procedente del antígeno o mitógeno.

Las sustancias de unión específicas se fijan convenientemente a una fase sólida o fase líquida insoluble para facilitar la separación del medio de prueba. Puede usarse una variedad de materiales de soporte sólido, por ejemplo, perlas de poliestireno, nylon o agarosa y se conocen bien para aquellos expertos en la técnica. En una realización particularmente ventajosa de la invención, la sustancia de unión específica se fija a una pluralidad de perlas magnéticas, que comprenden material ferromagnético, paramagnético o diamagnético. Los expertos en la técnica conocen las técnicas para fijar la sustancia de unión específica a las perlas. Técnicas adecuadas incluyen reticulación, unión covalente o absorción física. Alternativamente, una fase no sólida, sustancia de unión específica primaria, se usa conjuntamente con una sustancia de unión específica segunda o auxiliar que es capaz de interactuar selectivamente con la sustancia de unión específica primaria, y que se fija a una fase sólida. Sustancias específicas primarias y auxiliares representativas útiles para este fin son: anticuerpo murino soluble/proteína A fijados a una fase sólida; anticuerpo murino soluble/inmunoglobulina anti-ratón obtenidos en otra especie y fijados a una fase sólida; y anticuerpo biotinilado/avidina fijados a una fase sólida.

En el caso en el que la muestra que se está probando deriva de un cultivo o se separa mediante separación en gradiente de densidad antes de la separación sobre un soporte sólido, basta un procedimiento sencillo de separación para separar el subconjunto de linfocitos de interés del resto de la población celular. En el caso de muestras más complejas, tales como sangre completa, es necesario a veces lavar el complejo para eliminar células que quedan atrapadas o unidas de manera no específica. Los expertos en la técnica conocen una variedad de disoluciones (por ejemplo, cloruro de amonio 0,15 M, carbonato de potasio 1,0 M, EDTA 0,1 M, pH 7,2) que lisan específicamente los eritrocitos, las plaquetas u otros posibles contaminantes. Además, las disoluciones que contienen otras sustancias tales como proteínas, azúcares o sales o que tienen valores de pH específicos pueden ser útiles en la reducción de la unión no específica de otros tipos celulares o en la eliminación o lisado de tipos celulares que están separados de los de interés (por ejemplo, la disolución de solución salina de Hank tamponada que contiene el 10% de FCS es particularmente útil). Tras la separación y después del lavado, si es necesario, el medio se elimina del complejo.

Lisis

Tras la separación de las células de interés, la población celular separada se lisa mediante la adición de una disolución que contiene sustancias que pueden lisar los linfocitos. Existe una variedad de tales disoluciones y los expertos en la técnica las conocen bien. Estas disoluciones incluyen agua destilada, disoluciones que contienen detergentes tales como Triton-X o NP-40 y disolución tamponada tal como HEPES que contiene cloruro de benzalconio 0,1 M, pH 7,4. Es importante que el material y la disolución elegidos no interfieran con el sistema para medir ATP, no contengan ATP y no degraden ATP.

Una característica significativa de la invención es que el tiempo desde la exposición de la muestra hasta el momento en que las células se lisan es mínimo, normalmente inferior a 2 horas, preferiblemente inferior a 1 hora. Esto es significativo porque la interacción de los linfocitos con muchos anticuerpos contra antígenos de superficie celular puede dar como resultado una respuesta. Esto ha sido un problema importante en la determinación de la función de tipos celulares específicos, ya que el aislamiento del tipo celular puede inducir la activación celular.

Medición de los niveles de ATP

Tras la lisis de las células, se mide el nivel de ATP en la disolución. En una realización ventajosa, el ATP se mide mediante la adición de una disolución que contiene luciferasa de luciérnaga y luciferina en presencia de iones de magnesio. El ATP también puede medirse por otros medios que incluyen sistemas de reacción imnunoquímica o bioquímica.

La medición de un componente intrínseco de la célula es importante porque elimina una etapa adicional, así como la variabilidad intrínseca de cualquier proceso de marcado. El aumento del ATP se ha usado como un marcador del aumento de la masa celular, pero ha sido relativamente insensible porque todas las células en la población muestran un nivel inicial de ATP. La invención objeto funciona porque la medición de ATP se realiza tras la separación de la población celular de interés.

Kits

Los diferentes reactivos, junto con los diversos accesorios usados en la práctica de los métodos de la invención, incluyendo medios para diluciones, soportes sólidos para inmovilizar las células, reactivos de lisis, antígenos o mitógenos y tampones de lavado, uno o más patrones, o instrucciones para la preparación de los mismos se envasan convenientemente en un kit de prueba. Los reactivos incluidos en el kit de prueba pueden adoptar diversas formas y se envasan en seco, junto con diluyentes apropiados o pueden suministrarse en una forma lista para su uso.

Según los métodos de la presente invención, se prevén kits para evaluar las respuestas de las células T. En particular, un kit que contiene antígenos o mitógenos u otros agentes inductores en forma líquida o liofilizada, perlas paramagnéticas acopladas con un anticuerpo para el aislamiento del subconjunto de células predeterminado, medios de cultivo celular para la dilución de las muestras, tampón de lavado para lavar los complejos y reactivos asociados para realizar el ensayo.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir la invención con más detalle. Estos ejemplos pretenden ilustrar las aplicaciones específicas de los métodos de la invención y no deben considerarse de ninguna manera como limitantes de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Detección de la capacidad de respuesta frente a mitógeno de linfocitos T positivos para CD4 útil para medir la función inmunitaria en la infección por VIH, en la respuesta frente al estrés o tras la quimioterapia

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de leucocitos fuente (Gulf Coast Blood Bank) originalmente obtenidos a partir de sangre periférica de individuos sanos, mediante centrifugación en gradiente sobre Ficoll-Hypaque. Se aclararon las células de la capa leucocítica ("buffy") mediante centrifugación en RPMI que contenía un 10% de suero bovino fetal (FCS) y se ajustaron hasta una densidad celular de aproximadamente 1x10^{5} células/ml con RPMI que contenía un 5% de suero bovino fetal (FCS). Se cultivó una alícuota de células sin estimular mientras una segunda alícuota de células se estimuló con fitohemaglutinina (PHA), un mitógeno de células T, a una concentración de 1 \mug/ml durante 24 horas. Se diluyeron 1:20 las alícuotas con RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS. Se añadió anticuerpo contra CD4 en una concentración de 2 \mug/ml a todos los cultivos. Se incubaron las células a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se añadieron 100 \mul de perlas paramagnéticas recubiertas con anticuerpo de cabra anti-ratón (obtenido de Advanced Magnetics). Se mezcló suavemente la suspensión celular y se incubó durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se resuspendieron las células y las perlas, después se colocaron cerca de un imán permanente que se situó de modo que el campo magnético estaba en una dirección perpendicular a la gravedad. Después de que las perlas formaran un sedimento denso, el medio se aspiró y se retiró el imán. Se añadió tampón adicional y se resuspendieron las células y las perlas. Se repitió este proceso varias veces. Después de la eliminación completa del medio, se lisaron las células en el sedimento de perlas con una disolución detergente
identificada como reactivo de lisis de células somáticas ("Somatic Cell Lysis Reagent") (Sigma) y se colocó el tubo en el luminómetro. Se inyectaron en el tubo cien microlitros de una mezcla que contenía luciferina, luciferasa y Mg^{2+} en una disolución que contenía HEPES 0,25 mM, DTT 0,1 mM y un 0,5% de BSA y se determinaron los
recuentos.

También se probaron controles negativos que consistían en tampón de lisis sólo o células que se incuban con perlas no específicas, es decir, perlas recubiertas con un isotipo diferente del del anticuerpo primario. Finalmente, se utilizó un patrón de ATP en cada ensayo para confirmar que la reacción luciferina : luciferasa estaba produciéndose en los niveles apropiados. La tabla 1 siguiente muestra los resultados obtenidos.

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TABLA 1

1

Ejemplo 2 Medición de la respuesta de linfocitos T positivos para CD4 frente a mitógenos, citocinas y frente a un antígeno de toxina

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de varios individuos diferentes mediante centrifugación en gradiente, se lavaron y se cultivaron en RPMI 1640 que contenía un 5% de FCS. Se prepararon alícuotas de las células y se dejaron sin estimulación o con estimulación con PHA, anticuerpo contra CD3, toxoide tetánico o antígeno del virus Influenza. No se incubaron todas las muestras con los mismos antígenos. Tras una incubación de 48 horas, se diluyeron las células con RPMI 1640, se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra el antígeno CD4 durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se incubaron con anticuerpo de cabra contra IgG de ratón conjugado con perlas paramagnéticas (Advanced Magnetics, Inc.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la separación usando un imán permanente y lavado de la muestra, se lisaron las células usando reactivo de lisis de células somáticas (Sigma Chemical). Se diluyó 1:10 el reactivo luciferina/luciferasa (Sigma Chemical) y se añadieron 100 \mul. Se determinaron las unidades luminosas relativas. La figura 1 muestra la respuesta de las diferentes muestras de pacientes frente a estos mitógenos y antígenos y demuestra la capacidad de los métodos de la invención para detectar respuestas frente a mitógenos y antígenos en muestras de pacientes individuales.

Ejemplo 3 Comparación de los resultados obtenidos tras estimulación con PHA de los linfocitos T separados por CD4, CD69 o CD3

Este ejemplo examina la capacidad de poder realizar el ensayo usando diferentes marcadores de superficie celular. Las células mononucleares periféricas no se estimularon o se estimularon con PHA (al 1%) durante 24, 48, 72 o 96 horas. Se incubaron alícuotas de las células no estimuladas o de las células estimuladas con PHA, con anticuerpo monoclonal de ratón contra CD3, el receptor de las células T, CD4 o CD69 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, se incubaron todas las alícuotas con perlas paramagnéticas sobre las que se había adsorbido IgG de cabra anti-ratón durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se separaron los complejos de células y perlas usando un imán permanente y se lavaron tres veces con RPMI que contenía un 10% de FCS. Se lisaron las células con una disolución de NP-40 al 0,5%. Se diluyó 1:10 una mezcla de luciferina : luciferasa (Sigma Chemical Company) y se añadieron 100 \mul a cada tubo. La figura 2 muestra los resultados de estos ensayos. En todos los casos, las unidades luminosas relativas procedentes de las células estimuladas eran superiores que las procedentes de las células no estimuladas. Esto demuestra el uso de diferentes marcadores de superficie celular para evaluar la respuesta de linfocitos de diferentes subconjuntos.

Ejemplo 4 Medición de la respuesta de linfocitos T frente a un antígeno bacteriano

Se inmunizaron ratones Balb/c con un total de 100 \mug de antígeno de fiebre Q preparado a partir de la cepa Nine mile (Integrated Diagnostics, Inc.) emulsionados en adyuvante completo de Freund. Se tomaron previamente muestras de sangre del seno orbital de 10 ratones. Se obtuvieron muestras de sangre adicionales a los 7 días después de la inoculación. Se obtuvieron aproximadamente 100-200 ml de sangre de cada ratón. Se prepararon las células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad. Se eliminó la capa leucocítica y se lavó con RPMI-1640 que contenía un 10% de FCS. Se colocaron aproximadamente 100 \mul de células en cada tubo. Los sedimentos celulares se cultivaron sin ninguna otra adición o en presencia de antígeno de fiebre Q (10 \mug/ml o 1 \mug/ml). Tras 24 horas, se diluyeron 1:10 los cultivos con RPMI-1640 que contenía un 10% de FCS y se añadieron 100 \mul de perlas superparamagnéticas recubiertas con anticuerpo contra CD4 de ratón (Advanced Magnetics, Inc.). Se incubaron las perlas y las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se separaron las perlas, junto con cualquier célula complejada, usando un imán permanente y se lavaron 3 veces en RPMI que contenía un 10% de FCS. Se lisaron las células añadiendo 100 \mul de reactivo de lisis de células somáticas (Sigma Chemical Co.). Tras 10 minutos adicionales a temperatura ambiente, se inyectaron 100 \mul de mezcla de reacción luciferasa : luciferina (Sigma Chemical Co.) y se determinó la emisión luminosa mediante un luminómetro.

En las extracciones de sangre previas de los ratones, las muestras incubadas con antígeno de fiebre Q dieron señales de que eran idénticas a las de aquellas incubadas sin el antígeno de fiebre Q. La siguiente tabla muestra los resultados de las muestras obtenidas a los 7 días tras la inyección del antígeno. Se detectó una respuesta dependiente de la dosis, de las células T.

TABLA 2

2

Ejemplo 5 Medición de la respuesta de linfocitos T usando sangre completa como muestra

Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos y se extrajeron con heparina como anticoagulante. Se diluyeron 1:5 alícuotas de la sangre (100 \mul) con RPMI 1640. Los duplicados recibieron o bien ninguna adición, PHA al 1% o bien IL-2 a 100 U/ml de concentración final. Se incubaron las muestras durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, se retiraron 100 \mul de las muestras, se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra el antígeno CD4 durante 30 minutos a 37ºC. Se añadieron perlas paramagnéticas recubiertas con IgG de cabra anti-ratón a cada muestra (100 \mul) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Se aislaron los complejos perla : célula de las muestras usando un imán permanente y se lavaron los complejos tres veces con PBS que contenía un 10% de FCS y un 0,1% de BSA. Se lisaron las células usando agua destilada. Se añadió luciferina : luciferasa y se determinaron las unidades luminosas relativas. La siguiente tabla muestra los resultados.

TABLA 3

3

Ejemplo 6 Medición de las respuestas de linfocitos T positivos para CD8 frente a un antígeno viral

Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre completa heparinizada de donantes de sangre sanos mediante centrifugación de densidad en gradiente. Se lavaron las células en RPMI que contenía un 10% de FCS y se resuspendieron en este medio con una densidad de 1 x 10^{5} células/ml y se prepararon alícuotas. Los duplicados recibieron o bien ninguna adición o bien diferentes niveles de antígeno de Influenza A o PHA. Tras 24 horas, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón contra CD8 y se incubaron las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron perlas paramagnéticas acopladas con antígeno de cabra contra IgG de ratón y se separaron los complejos colocando los cultivos cerca de un imán permanente. Se lavaron los complejos tres veces con PBS que contenía un 10% de FCS, después se lisaron las células añadiendo Triton X 100 al 0,05% en PBS. Se determinaron los niveles de ATP usando luciferina : luciferasa. Todos los individuos mostraron respuestas frente a PHA con índices de estimulación > 10, mientras que el intervalo de los índices de estimulación frente a antígenos de virus Influenza oscila desde 1,2-4,0.

Ejemplo 7 Medición de la respuesta de linfocitos T frente a antígenos de recuerdo comparado con la citometría de flujo

Se extrajo sangre de un donante sano en un tubo de extracción que contenía heparina. Se añadió toxoide tetánico a 10 ng/ml; Candida albicans a 20 ng/ml; Influenza A a una dilución de 14; transferrina humana a 10 ng/ml o ningún aditivo a 500 \mul de sangre y se incubaron a 37ºC durante 24-48 horas. Se retiraron muestras de cien microlitros y se incubaron con 20 \mul de perlas paramagnéticas recubiertas con anticuerpo monoclonal de ratón contra el antígeno CD4 (Perseptive BioSystems) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se eliminaron los complejos perla : célula de las muestras usando un imán permanente y después se lavaron tres veces usando medios RPMI 1640 que contenía un 5% de FCS. Se lisaron las células añadiendo 15 \mul de reactivo de lisis de células somáticas (Sigma Chemical Co.), seguido de 150 \mul de mezcla de reacción luciferasa : luciferasa (Sigma Chemical Co.). Se determinó la emisión luminosa mediante un luminómetro y se calcularon los índices de estimulación.

Se prepararon muestras para citometría de flujo incubando 50 \mul de sangre completa de cada muestra de antígeno de recuerdo con 10 \mul de anticuerpo monoclonal de ratón contra CD4 conjugado con FITC (Dako Corp.). Se contaron las células en un citómetro de flujo.

Las siguientes tablas muestran que la activación medible de las células T frente a antígenos de recuerdo puede conseguirse con el método descrito tras 24 horas o 48 horas de exposición. No se observó ningún aumento en el número de células en los experimentos con citometría de flujo paralelos. Esto se produce probablemente porque el método de ensayo es lo suficientemente sensible como para detectar un aumento en la actividad metabólica, tal como se demuestra por un aumento de los niveles de ATP antes que los niveles de proliferación celular se vuelvan lo suficientemente significativos como para poder medirse mediante citometría de flujo. La transferrina humana es un material natural no reconocido como extraño y por tanto no provoca ninguna respuesta inmunitaria. Se usa como control negativo en el ensayo.

TABLA 4

4

TABLA 5

5

Claims

```
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```
1. Método para analizar muestras biológicas que contienen linfocitos, que se exponen a un agente inductor, caracterizado porque

a)

dicha muestra que contiene una población mixta de tipos celulares que incluyen linfocitos se incuba con dicho agente inductor, después de lo cual

b)

se detecta el nivel de ATP, NADP o PCNA en un subconjunto seleccionado de los linfocitos.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho agente inductor se selecciona del grupo que consiste en mitógenos,antígenos, citocinas, factores de crecimiento, alergenos, aloantígenos, péptidos, fármacos, productos químicos y compuestos de bajo peso molecular conjugados con un vehículo proteico.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa b) comprende:

i)

poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido que tiene una sustancia de unión específica, siendo dicha sustancia de unión específica para al menos un determinante característico de dicho subconjunto de linfocitos, dando como resultado la formación de un complejo de células y soporte sólido;

ii)

separar dicho complejo del resto de dicha muestra;

iii)

añadir a dicho complejo una disolución para lisar cualquier célula en dicho complejo; y

iv)

detectar el nivel de ATP, NADP o PCNA en el producto de lisis de la etapa iii).
4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho mitógeno es un mitógeno de linfocitos T.
5. Método según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno es un microorganismo infeccioso.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho microorganismo infeccioso es hongos, virus o bacterias o un subcomponente de los mismos.
7. Método según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno es una proteína o péptido.
8. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho subconjunto de linfocitos se selecciona del grupo que consiste en linfocitos T, linfocitos T colaboradores, linfocitos TH1, linfocitos TH2, linfocitos T natural killer, linfocitos T citotóxicos y linfocitos T supresores.
9. Método según la reivindicación 3, en el que dicho determinante de células T es un marcador funcional, un marcador de un estadio de diferenciación particular o un marcador de activación.
10. Método según la reivindicación 3, en el que dicho soporte sólido comprende material magnético o paramagnético.
11. Método según la reivindicación 10, en el que en la etapa ii) dicho complejo se separa mediante separación magnética.
12. Método según la reivindicación 3, en el que dicho soporte sólido comprende poliestireno.
13. Método según la reivindicación 3, en el que la etapa iv) lleva a cabo una reacción de bioluminiscencia que usa luciferasa y luciferina.
14. Método según la reivindicación 3, en el que dicha sustancia de unión específica es un anticuerpo.
15. Método según la reivindicación 3, en el que dicha sustancia de unión específica es una citocina.
16. Método según la reivindicación 3, en el que la etapa i) comprende (a) poner en contacto dicha muestra con una primera sustancia de unión de una par de unión que se une específicamente a ala menos un determinante de superficie celular que es común para dicho subconjunto de linfocitos y (b) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un soporte sólido que tiene una segunda superficie de unión de dicho par de unión que se une específicamente a dicha primera sustancia de unión.
17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho par de unión se compone por dos anticuerpos, un primer anticuerpo que reconoce dicho determinante de superficie celular y un segundo anticuerpo que reconoce dicho primer anticuerpo.
18. Método según la reivindicación 16, en el que dicho par de unión comprende biotina y avidina.
19. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que se somete también una muestra patrón a la etapa b) y se compara el nivel de ATP, NADP o PCNA de dicha muestra de prueba con dicha muestra patrón.
20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha muestra patrón son liposomas que contienen ATP o NADP.
21. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tiempo total requerido para realizar todas las etapas es de 6-72 horas.
22. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho subconjunto de linfocitos son linfocitos B.
23. Método según las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de comparar el nivel de ATP, NADP o PCNA en dicha muestra con un nivel patrón de ATP, NADP o PCNA.
24. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende las etapas de:

a)

dividir dicha muestra de prueba en dos o más partes;

b)

incubar al menos una de dichas partes con dicho agente inductor e incubar al menos una de dichas partes sin dicho agente inductor;

c)

poner en contacto cada parte con un soporte sólido que tiene una sustancia de unión específica, siendo dicha sustancia de unión específica para al menos un determinante característico de dicho subconjunto de linfocitos, dando como resultado la formación de un complejo de células y soporte sólido para cada parte;

d)

separar dicho complejo del resto de dicha muestra para cada parte;

e)

lavar dicho complejo para cada parte;

f)

añadir a cada complejo una disolución que lisará cualquier célula en dicho complejo;

g)

medir el nivel de ATP, NADP o PCNA en cada uno de los producto de lisis de la etapa f), y

h)

comparar los resultados de g) para cada una de dichas partes que se han expuesto a dicho agente inductor con cada una de dichas partes que no se han expuesto a dicho agente inductor.
25. Método según la reivindicación 24, en el que la etapa e) de lavado se realiza con una disolución que lisa los eritrocitos.
26. Método según la reivindicación 24, en el que la etapa e) de lavado se realiza con una disolución que lisa las plaquetas.
27. Método según la reivindicación 24, en el que dicho determinante característico se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD69, CD25, CD26, CD27, CD28, antígenos de clase II del MHC y CD71.
28. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los linfocitos comprenden las etapas de:

a)

dividir dicha muestra de prueba en dos o más partes;

b)

poner en contacto al menos una de dichas partes de dicha muestra de prueba con dicho agente inductor y no poner en contacto al menos una de dichas partes de dicha muestra de prueba con dicho agente inductor;

c)

poner en contacto cada parte con un soporte sólido que tiene una sustancia de unión específica, siendo dicha sustancia de unión específica para al menos un determinante sobre la superficie de dichos linfocitos T, dando como resultado la formación de un complejo de células y soporte sólido;

d)

separar dicho complejo del resto de dicha muestra para cada parte;

e)

lavar dicho complejo para cada parte;

f)

añadir a cada complejo una disolución que lisará cualquier célula en dicho complejo;

g)

medir el nivel de ATP, NADP o PCNA en cada uno de los producto de lisis de la etapa f), y

h)

comparar los resultados de la etapa g) para cada una de dichas partes que se han expuesto a dicho agente inductor con cada una de dichas partes que no se han expuesto a dicho agente inductor.
29. Método según la reivindicación 28 en el que la concentración de dicho determinante aumenta como resultado de la respuesta de dichos linfocitos T frente a dicho agente inductor.