CN107904278B - 检测药物对细胞增殖影响的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测药物对细胞增殖影响的方法，通过将CFSE荧光染料标记的待测细胞与细胞特异性抗体磁珠混合，通过加或不加待测药物，分别可以获得对照组细胞和加药组细胞，再根据增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例、加入细胞特异性抗体磁珠的总数，计算出增殖细胞各分裂代次的细胞数。该方法使用细胞特异性抗体磁珠既可以起到待测细胞增殖刺激剂的作用，还可以起到流式细胞术绝对计数参比磁珠的作用；可以检测化学药物或细胞药物对待测细胞增殖的影响；不但可以反映增殖细胞百分比的变化，还可以反映增殖细胞各分裂代次细胞数的变化，从而能够更加全面、准确地反映出药物对待测细胞增殖的影响。

Description

检测药物对细胞增殖影响的方法
技术领域
本发明涉及细胞增殖检测领域，尤其是涉及一种检测药物对细胞增殖影响的方法。
背景技术
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞，以用来补充体内衰老和死亡的细胞。在很多药物研发过程中都需要评估其对细胞增殖的影响。因此，细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。如鉴于T淋巴细胞在免疫系统中的重要作用，免疫疾病相关医药研发过程中通常都需要检测药物对T淋巴细胞增殖功能的影响，常用的试验方法包括：分离PBMC细胞，使用刺激剂刺激细胞增殖，加入待测药物培养三到五天后，采用荧光标记、胸腺嘧啶核苷渗入或参比磁珠等方法检测细胞增殖状况。
然而，传统的研究药物等对细胞增殖影响的方法难以全面反映增殖细胞百分比的变化以及具体数量，因而无法准确地反映出物质对细胞增殖的影响。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测药物对细胞增殖影响的方法，以全面反映物质对细胞增殖情况的影响。
一种检测药物对细胞增殖影响的方法，包括如下步骤：
对照组：将第一待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出对照组的所述第一待测细胞的各分裂代次的绝对数量；
加药组：将与所述第一待测细胞来源相同的第二待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠以及预设含量的待测药物混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出加药组的所述第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量；
比较所述对照组的所述第一待测细胞与所述加药组的所述第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量，分析所述待测药物对待测细胞增殖的影响。
在其中一个实施例中，所述第一待测细胞及所述第二待测细胞均为外周血单个核细胞。
在其中一个实施例中，所述第一待测细胞及所述第二待测细胞均为T淋巴细胞，所述细胞特异性抗体磁珠是CD3/CD28抗体磁珠。
在其中一个实施例中，所述培养容器为圆底多孔板。
在其中一个实施例中，所述检测分析是使用流式细胞术进行检测，并使用相应地Flowjo软件进行分析。
在其中一个实施例中，所述待测药物是化学药物。
在其中一个实施例中，所述待测药物是细胞药物。
在其中一个实施例中，所述细胞药物包括免疫细胞和干细胞。
在其中一个实施例中，所述使用CFSE荧光染料标记是将所述第一待测细胞或所述第二待测细胞重悬于含有1～10μM CFSE的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育10～30分钟后，加入含有5～15％人AB血清的AIM-V培养基混匀，再置于37℃避光孵育5～10分钟，之后使用PBS缓冲液洗涤。
优选的，所述使用CFSE荧光染料标记是将所述第一待测细胞或所述第二待测细胞重悬于含有5μM CFSE、pH为7.4的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育20分钟后，加入含有10％人AB血清的AIM-V培养基混匀，再置于37℃避光孵育5分钟，之后使用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤。
在其中一个实施例中，所述对照组及所述加药组在细胞培养时使用的培养基是含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基。
在其中一个实施例中，所述对照组及所述加药组在细胞培养时使用的培养基是含有10％人AB血清和300IU/ml IL-2的AIM-V培养基。
在其中一个实施例中，所述对照组和加药组均是按照每200μl含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基加入1×105～4×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105～4×105个CFSE荧光染料标记的待测细胞的比例混合培养。
在其中一个实施例中，所述对照组和加药组均是按照每200μl含有10％人AB血清和300IU/ml IL-2的AIM-V培养基加入2×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105个CFSE荧光染料标记的待测细胞的比例混合培养。
上述检测药物对细胞增殖影响的方法通过将CFSE荧光染料标记的第一待测细胞与细胞特异性抗体磁珠混合，经过细胞培养，获得对照组细胞；将CFSE荧光染料标记的第二待测细胞与细胞特异性抗体磁珠以及待测药物混合，经过细胞培养，获得加药组细胞；再分析得到CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例、加入细胞特异性抗体磁珠的总数，计算出增殖细胞各分裂代次的细胞数。该方法使用细胞特异性抗体磁珠既可以起到待测细胞增殖刺激剂的作用，还可以起到流式细胞术绝对计数参比磁珠的作用；不但可以检测化学药物对待测细胞增殖的影响，还可以检测细胞药物(如免疫细胞、干细胞等)对待测细胞增殖的影响；不但可以反映增殖细胞百分比的变化，还可以反映增殖细胞各分裂代次细胞数的变化，从而能够更加全面、准确地反映出药物对待测细胞增殖的影响。
附图说明
图1为FSC和SSC通道散点图；
图2为FITC和SSC通道散点图；
图3为CFSE通道直方图；
图4为Proliferation工具分析图；
图5为增殖细胞绝对数量柱状图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的检测药物对细胞增殖影响的方法，包括如下步骤：
对照组：将第一待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出对照组的第一待测细胞的各分裂代次的绝对数量；
加药组：将与第一待测细胞来源相同的第二待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠以及预设含量的待测药物混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出加药组的第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量；
比较对照组的第一待测细胞与加药组的第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量，分析待测药物对待测细胞增殖的影响。
CFSE荧光染料，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个琥珀酰胺脂功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性。同时，其含有的琥珀酰胺脂基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
在一个实施例中，第一待测细胞及第二待测细胞可以是但不限于外周血单个核细胞，如T淋巴细胞等。当第一待测细胞及第二待测细胞均为T淋巴细胞时，细胞特异性抗体磁珠优选是CD3/CD28抗体磁珠。
淋巴细胞(lymphocyte)是白细胞的一种，由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。根据淋巴细胞的发育部位、表面、抗原、受体及功能等不同，可将淋巴细胞分为T淋巴细胞和B淋巴细胞等多种。其中，T淋巴细胞(Tlymphocyte)简称T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中，T淋巴细胞的主要作用是抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等重要免疫功能。鉴于T淋巴细胞在免疫系统中的重要作用，免疫疾病相关医药研发过程中通常都需要检测药品对T淋巴细胞增殖功能的影响。
经过研究发现，CD3与CD28抗体可以刺激T细胞增殖。诱导T淋巴细胞活化、增殖需要双信号刺激：第一信号来自T细胞表面TCR-CD3复合物与APC表面MHC分子-抗原肽的结合；第二信号即协同刺激信号由APCs表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生。CD3抗体可特异地识别T细胞表面的CD3分子，模拟第一信号刺激T细胞活化并增殖。将抗CD3/CD28抗体联合用于T淋巴细胞的体外激活，在抗CD28抗体的协同作用下模拟产生第二信号，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，因此可采用抗CD28抗体协同抗CD3抗体体外活化T淋巴细胞。
利用抗体标记的荧光参比磁珠进行流式细胞仪绝对计数，是流式细胞仪单平台绝对计数方法之一。在待测目的细胞悬液样本制备过程中，先将样本直接加入含已知绝对数量荧光参比磁珠的绝对计数管中，或者在流式管中加人与待测目的细胞悬液样本等体积、已知绝对数量的荧光参比磁珠，再加人用于标记待测目的细胞的抗体，待抗体标记后，混匀细胞悬液与荧光参比磁珠上流式细胞仪检测，同时记录目的细胞与荧光参比磁珠的计数结果。因为两者在数量上存在一定的比例关系，根据荧光参比磁珠的计数结果与绝对数量即可换算出目的细胞的绝对计数值。
在一个实施例中，培养容器可以是但不限于圆底多孔板，如圆底96孔板等。
在一个实施例中，所述检测分析是使用流式细胞术进行检测，并使用相应地Flowjo软件进行分析。
在一个实施例中，待测药物可以是化学药物，也可以是细胞药物，如免疫细胞和干细胞等。
在本实施方式中，通过研究发现，在CFSE染色时，CFSE对待测细胞具有一定的毒性，其能够导致染色后的细胞不增殖，如在同样CFSE浓度条件下，比如在浓度为5μM的CFSE条件下，当待测细胞密度为1×107/ml时，进行染色之后细胞可以正常增殖，而如果待测细胞密度较低，如待测细胞密度为1×106/ml时，进行染色之后则细胞不会增殖。因而本实施方式一方面通过选用合适的CFSE浓度，另一方面确保具有合适的细胞密度。
在一个具体地实施例中，使用CFSE荧光染料标记是将第一待测细胞或第二待测细胞重悬于含有1～10μM CFSE的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育10～30分钟后，加入含有5～15％人AB血清的AIM-V培养基混匀，再置于37℃避光孵育5～10分钟，之后使用PBS缓冲液洗涤，优选的，是将第一待测细胞或第二待测细胞重悬于含有5μM CFSE、pH为7.4的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育20分钟后，加入含有10％人AB血清的AIM-V培养基混匀，再置于37℃避光孵育5分钟，之后使用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤。
更进一步，在一个实施例中，对照组及加药组在细胞培养时使用的培养基是含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基，优选的，培养基是含有10％人AB血清和300IU/ml IL-2的AIM-V培养基。
再进一步，在一个实施例中，对照组和加药组均是按照每200μl含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基加入1×105～4×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105～4×105个CFSE荧光染料标记的待测细胞的比例混合培养，优选的，是按照每200μl含有10％人AB血清和300IU/ml IL-2的AIM-V培养基加入2×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105个CFSE荧光染料标记的待测细胞的比例混合培养。
具体地，在培养时，将上多孔板等培养容器放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，在显微镜观察细胞增殖的情况，到第3天或者第4天，将对照组和加药组的细胞及免疫磁珠吹打混匀转移到流式管中，使用PBS洗涤两次，然后上流式仪检测。
此外，本实施方式还研究发现即使按照上述正常参数操作，经常还出现CFSE标记的细胞增殖实验流式结果看不到区分明显的手指状峰图的情况。经过对多种实验因素的综合分析，本实施方式创造性地发现新鲜分离得到的T淋巴细胞等待测细胞处在不同的细胞周期状态，直接进行刺激培养后细胞开始增殖的时间不统一则导致流式检测CFSE信号结果图中各个子代峰互相重叠没有明显区分，也会影响分析软件对各个子代细胞数分析计算的准确性。因此，在本实施方式中，对分离得到的待测PBMC细胞，首先使用冻存液(含90％人AB血清和10％DMSO)进行冻存，在使用前一天进行复苏，在静息培养基(AIM-V，含5％人AB血清和100IU/ml IL-2)中培养过夜，使待测细胞处在相同细胞周期状态，之后再进行增殖实验就可以检测到区分比较明显的手指状峰图。另外，提前分离冻存待测细胞，后续不同实验可以使用相同批次的待测细胞，也更有利于不同实验之间的结果进行平行比较，进而有利于保证实验结果的准确性和可信度。
传统的，单纯使用参比微球进行流式细胞术计数分析，只能检测化学药物的影响，如果是细胞药物，则不能区分加入的药物细胞和待测细胞。而单纯使用CFSE荧光标记方法，只能检测细胞增殖的百分比，得不到具体增殖细胞数，反应细胞增殖状况不够准确。在本实施方式中，使用CFSE标记待测细胞，即使与细胞药物共培养之后，在流式细胞仪检测中也能够区分待测细胞与药物细胞，同时结合流式细胞术计数方法，能够准确反映待测细胞的增殖状况，因而本实施方式的方法可适用于检测化学药物和细胞药物对待测细胞的影响。
传统的CD3/CD28抗体磁珠，通常是用来单纯用作刺激T淋巴细胞增殖的试剂。而在本实施方式中，除了将抗体磁珠用来作为T淋巴细胞增殖的刺激剂，同时还起到流式细胞术进行细胞计数的参比微球作用。使用这一种试剂，代替了其他方法中分别加入刺激剂和参比微球两种试剂，一举两得，检测过程更简单易行。
因而，上述检测药物对细胞增殖影响的方法使用细胞特异性抗体磁珠既可以起到待测细胞增殖刺激剂的作用，还可以起到流式细胞术绝对计数参比磁珠的作用；不但可以检测化学药物对待测细胞增殖的影响，还可以检测细胞药物对待测细胞增殖的影响；不但可以反映增殖细胞百分比的变化，还可以反映增殖细胞各分裂代次细胞数的变化，从而能够更加全面、准确地反映出药物对待测细胞增殖的影响，具有广泛的推广应用价值。
以下为具体实施例部分。
本实施例检测调节性T细胞(Treg)对PBMC细胞(外周血单个核细胞)的增殖抑制效果。
本实施例所提供的检测药物对T淋巴细胞增殖效果影响的方法中，所使用的仪器及试剂均可由市场购得。其中，CFSE荧光染料购自Invitrogen公司，货号C34554；CD3/CD28抗体磁珠购自Gibco公司，货号11131D；人AB血清购自ACCESS公司，货号516；AIM-V培养基购自Gibco公司，货号A3021002；重组人白细胞介素2(IL-2)购自近岸蛋白公司，货号GMP-CD66；圆底96孔板购自Corning公司，货号3788。
分离得到的PBMC细胞，首先使用冻存液(含90％人AB血清和10％DMSO)进行冻存，在使用前一天进行复苏，在静息培养基(AIM-V，含5％人AB血清和100IU/ml IL-2)中培养过夜，使待测细胞处在相同细胞周期状态，之后再进行增殖实验。并且，提前分离冻存待测细胞，以保证后续不同实验可以使用相同批次的待测细胞。
实验分组：实验分为对照组(PBMC细胞与CD3/CD28抗体磁珠混合培养)和加药组(PBMC细胞与CD3/CD28抗体磁珠同时加入Treg细胞混合培养)。
实验方法如下：
将PBMC细胞重悬于含有5μM CFSE荧光染料的pH为7.4的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育20分钟后，加入含有10％人AB血清的AIM-V培养基混匀，置于37℃避光孵育5分钟，之后使用pH为7.4的PBS洗涤，待用。
使用圆底96孔板，对照组每孔加入200μl培养基(AIM-V，含10％人AB血清和300IU/ml IL-2)、2×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105个CFSE荧光染料标记的PBMC细胞，加药组每孔加入200μl培养基(AIM-V，含10％人AB血清和300IU/ml IL-2)、2×105个CD3/CD28抗体磁珠、1×105个CFSE荧光染料标记的PBMC细胞和5×104个Treg细胞。
将上述96孔板放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养3天。第3天，将对照组和加药组的细胞及磁珠吹打混匀转移到流式管中，使用PBS洗涤两次，然后上流式仪检测。流式检测结果使用Flowjo软件分析，在FSC和SSC通道散点图中分别圈出磁珠和细胞群，在FITC和SSC通道散点图中圈出CFSE阳性的增殖PBMC细胞群，结果分别见图1和图2。并得到如图3所示的增殖PBMC细胞FITC通道直方图，分析CFSE荧光信号减弱的增殖细胞所占百分比，使用Flowjo软件的Proliferation工具分析得到第0-5代分裂增殖细胞情况，得出磁珠和增殖细胞各子代的event数，结果见表1、表2和图4。
根据以下公式计算增殖细胞绝对数量，结果见表3和图5。
增殖细胞绝对数量＝增殖细胞Events/磁珠Events×磁珠总数
表1增殖细胞百分比
对照组 加药组
增殖细胞百分比 96.9％ 85.3％
表2增殖细胞及磁珠event数
events 0代 1代 2代 3代 4代 5代 磁珠
对照组 259 1432 4084 3490 531 322 6234
加药组 1247 4418 3849 428 54 45 11278
表3增殖细胞绝对数量
绝对数量 0代 1代 2代 3代 4代 5代 1-5代
对照组 24928 137825 393070 335900 51107 30991 948893
加药组 66342 235042 204770 22770 2873 2394 467849
由上述数据和结果可以看出，CD3/CD28抗体磁珠能够有效刺激T淋巴细胞增殖，但是加药组中细胞增殖程度明显低于对照组，证明Treg细胞对T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用。加药组增殖细胞(子1-5代)占85.3％，总数为467849，且增殖细胞主要处在子1代和2代，对照组增殖细胞(子1-5代)占96.9％，总数为948893，且增殖细胞主要处在子2代和3代。
由此可见，采用本实施例提供的检测药物对T淋巴细胞增殖影响的方法，不仅可以从增殖细胞百分比来反映待测药物对T淋巴细胞增殖的影响，还可以从各增殖细胞各子代的情况上准确反映出对细胞增殖的具体影响。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用冻存液分别对第一待测细胞和与所述第一待测细胞来源相同的第二待测细胞进行冻存处理，在培养增殖使用前一天进行复苏，在静息培养基中培养过夜，所述第一待测细胞及所述第二待测细胞均为外周血单个核细胞；
对照组：将静息培养后的第一待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出对照组的所述第一待测细胞的各分裂代次的绝对数量，所述细胞特异性抗体磁珠是CD3/CD28抗体磁珠；
加药组：将静息培养后的第二待测细胞使用CFSE荧光染料标记之后，按照预设的细胞数量在培养容器中与预设数量的细胞特异性抗体磁珠以及预设含量的待测药物混合，经过培养后，检测分析得到其CFSE荧光信号降低的增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数，根据该增殖细胞各分裂代次计数和细胞特异性抗体磁珠计数的比例以及加入的细胞特异性抗体磁珠的总数，计算得出加药组的所述第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量；
比较所述对照组的所述第一待测细胞与所述加药组的所述第二待测细胞的各分裂代次的绝对数量，分析所述待测药物对待测细胞增殖的影响。
2.如权利要求1所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述培养容器是圆底多孔板。
3.如权利要求1所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述第一待测细胞及所述第二待测细胞均为T淋巴细胞。
4.如权利要求1所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述检测分析是使用流式细胞术进行检测，并使用相应地Flowjo软件进行分析。
5.如权利要求1所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述待测药物是化学药物。
6.如权利要求1所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述待测药物是细胞药物。
7.如权利要求6所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述细胞药物包括免疫细胞和干细胞。
8.如权利要求1～7中任一项所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述使用CFSE荧光染料标记是将所述第一待测细胞或所述第二待测细胞重悬于含有1～10μMCFSE的PBS缓冲液中，置于37℃避光孵育10～30分钟后，加入含有5～15％人AB血清的AIM-V培养基混匀，再置于37℃避光孵育5～10分钟，之后使用PBS缓冲液洗涤。
9.如权利要求1～7中任一项所述的检测药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述对照组及所述加药组在细胞培养时使用的培养基是含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基。
10.如权利要求1～7中任一项所述的检测而药物对细胞增殖影响的方法，其特征在于，所述对照组和加药组均是按照每200μl含有5～15％人AB血清和100～1000IU/ml IL-2的AIM-V培养基加入1×105～4×105个CD3/CD28抗体磁珠和1×105～4×105个CFSE荧光染料标记的待测细胞的比例混合培养。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402179B (zh) * 2018-11-21 2020-12-04 新乡医学院 一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法
CN117106847A (zh) * 2020-03-09 2023-11-24 山东大学齐鲁医院 干细胞制剂的免疫调控功能的评估方法
CN114486645A (zh) * 2020-11-13 2022-05-13 深圳安侣医学科技有限公司 细胞悬浮液样品成像方法和系统及试剂盒
CN114486646A (zh) * 2020-11-13 2022-05-13 深圳安侣医学科技有限公司 细胞分析方法和系统及定量方法和系统

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006124668A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Zymogenetics, Inc. Methods of using pnkp30, a member of the b7 family, to modulate the immune system
CN102220416A (zh) * 2011-04-20 2011-10-19 北京师范大学 一种监测细胞分裂次数的方法及其应用
CN102288587A (zh) * 2011-06-15 2011-12-21 顾鹏 一种检测调节性t细胞免疫抑制功能的方法
CN106190972A (zh) * 2015-04-30 2016-12-07 广州复大医疗股份有限公司 一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法
CN106414724A (zh) * 2014-04-16 2017-02-15 朱诺治疗有限公司 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006124668A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Zymogenetics, Inc. Methods of using pnkp30, a member of the b7 family, to modulate the immune system
CN102220416A (zh) * 2011-04-20 2011-10-19 北京师范大学 一种监测细胞分裂次数的方法及其应用
CN102288587A (zh) * 2011-06-15 2011-12-21 顾鹏 一种检测调节性t细胞免疫抑制功能的方法
CN106414724A (zh) * 2014-04-16 2017-02-15 朱诺治疗有限公司 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置
CN106190972A (zh) * 2015-04-30 2016-12-07 广州复大医疗股份有限公司 一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法

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