CN102220416A - 一种监测细胞分裂次数的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种监测细胞分裂次数的方法及其应用。本发明的辅助监测细胞分裂次数的方法,包括如下步骤:(1)用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,将标记后的待监测细胞记作未进行细胞分裂的初始细胞;将标记有碱基类似物的染色体记作标记染色体;(2)按照如下1)或2)所述方法确定所述初始细胞的分裂次数;1)观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据单个子代细胞内的标记染色体数量得出初始细胞的分裂次数。本发明方法的结果准确可靠,在整个追踪期间除了常规的细胞培养、动物饲养和最终的细胞染色操作外,无须额外操作。因此,本发明方法操作简便,省时省力。
Description
技术领域
本发明涉及一种监测细胞分裂次数的方法及其应用。
背景技术
对于细胞增殖速度的有效和精确检测具有广泛用途和重要意义。例如,对抗癌药物的筛选,在使用体外培养的肿瘤细胞时,通常使用MTT等细胞计数以及活细胞镜检计数等技术,统计不同时间点的细胞数量,然后做出变化曲线,从而判断增殖速度的变化快慢。当进行体内成瘤分析时,是不可能针对同一个肿瘤结节进行多次的细胞计数的。现有的方法主要是通过测量肿瘤结节的直径大小和数量,通过大量平行样本的统计,来估算肿瘤的生长体积变化,从而反映肿瘤细胞的生长速度变化。不但需要大量动物和时间,也不够精确。同时,这种整体性分析掩盖了一个重要的现实,就是肿瘤细胞具有多样性,有些细胞(如肿瘤干细胞)可能是药物不敏感的。因此,要能区分在药物作用之下还依然能够继续增殖的细胞,分析它们的增殖变化才是评价药物效果的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种辅助监测细胞分裂次数的方法。
本发明所提供的辅助监测细胞分裂次数的方法,包括如下步骤:
(1)用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,将标记后的待监测细胞记作未进行细胞分裂的初始细胞;将标记有碱基类似物的染色体记作标记染色体;
(2)按照如下1)或2)或3)所述方法确定初始细胞的分裂次数;
1)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量不能辨别,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数,记作面积百分比,当所述面积百分比为71%-83%时,确定初始细胞候选分裂了一次,当所述面积百分比为37%-53%时,确定初始细胞候选分裂了两次;
2)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量能够辨别,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据等式I得到初始细胞的分裂次数;
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
3)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,则观察统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比,根据等式II得到初始细胞的分裂次数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
所述初始细胞至少为一个;
其中,所述观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体的方法包括如下步骤:
1)对所述子代细胞的标记染色体进行染色;
2)在步骤1)基础上,观察所述子代细胞中染色的标记染色体。
实际应用时细胞或者组织切片经过固定后直接染色就可以统计标记染色体数。
在实际应用中,根据等式计算出的结果可能是小数,如4.1,此时可根据使用者的需求,自己定细胞分裂了4次还是5次。
用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,实际是利用DNA的半保留复制原理,在细胞分裂的S期,以碱基类似物为原料,进行DNA合成,合成的DNA单链中即含有碱基类似物,从而所有DNA双链中新合成的DNA单链被标记碱基类似物。
上述辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述进行染色的方法包括如下步骤:将所述子代细胞固定,再将一抗与所述固定后的细胞共同孵育,得到结合一抗的细胞;再将荧光染料标记的二抗与所述结合一抗的细胞共同孵育,得到结合二抗的细胞;所述一抗为抗所述碱基类似物的IgG;所述二抗为与所述一抗结合的抗体。
上述辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述抗碱基类似物的IgG为小鼠抗碱基类似物的IgG;所述二抗为驴抗小鼠的IgG;所述荧光染料为FITC。
本发明的另一目的是提供另一种辅助监测细胞分裂次数的方法。
本发明所提供的另一种辅助监测细胞分裂次数的方法,包括如下步骤:
(1)用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,将标记后的待监测细胞记作未进行细胞分裂的初始细胞;将标记有碱基类似物的染色体记作标记染色体;
(2)按照如下1)或2)所述方法确定所述初始细胞的分裂次数;
1)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据单个子代细胞内的标记染色体数量得出初始细胞的分裂次数;
2)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,则观察统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比,根据所述百分比得出初始细胞的分裂次数;
所述初始细胞至少为一个。
用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,实际是利用DNA的半保留复制原理,在细胞分裂的S期,以碱基类似物为原料,进行DNA合成,合成的DNA单链中即含有碱基类似物,从而所有DNA双链中新合成的DNA单链被标记碱基类似物。
上述另一种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述步骤1)中,所述根据单个子代细胞内的标记染色体数量得出初始细胞的分裂次数的方法包括如下步骤:将所述单个子代细胞内的标记染色体数量代入等式I,得出初始细胞的分裂次数;
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
所述步骤2)中,根据所述百分比得出初始细胞的分裂次数的方法包括如下步骤:将所述百分比代入等式II,得出初始细胞的分裂次数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数。
在实际应用中,根据等式计算出的结果可能是小数,如4.1,此时可根据使用者的需求,自己定细胞分裂了4次还是5次。
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述碱基类似物为胸腺嘧啶类似物、腺嘌呤类似物、鸟嘌呤类似物、胞嘧啶类似物或尿嘧啶类似物;所述胸腺嘧啶类似物为CldU、IdU、BrdU、EdU或H3-thymidine。
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述用碱基类似物标记待监测细胞的方法包括如下步骤:将处于有丝分裂中期的母细胞接于用于培养母细胞的细胞培养基中,再向其中加入所述碱基类似物,培养至母细胞完成有丝分裂得到子细胞,所述子细胞即为所述待监测细胞。
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述待监测细胞为植物细胞或离体的动物细胞;
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述离体的动物细胞优选为CHO细胞。
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述细胞分裂为有丝分裂。
上述两种辅助监测细胞分裂次数的方法中,所述分裂的次数为1-9次或1-5次或2-5次。
上述任一所述辅助监测细胞分裂次数的方法在辅助监测细胞的增值速度中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述辅助监测细胞分裂次数的方法在筛选药物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述在辅助监测细胞的增值速度中的应用在筛选药物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法或应用中,所述药物可为抗肿瘤的药物等。
本发明的理论基础:本发明基于下述重要实验判断:1、BrdU等胸腺嘧啶类似物,能够掺入细胞新合成的DNA中,并长期存留,2、在合适剂量下,对细胞的增殖无明显影响,3、基于DNA的半保留复制和染色体的随机对称分配原则,被标记的染色体将随着细胞增殖分裂而逐代减半,4、掺入的标记物通过对应的荧光抗体可以识别,5、染色质在间期(实际应用中95%以上的细胞都处于细胞周期的间期)细胞核中各自占据独立分隔的空间,因此标记染色体的数量是可以计数的。因此,只需要通过最终一幅荧光图像,计数细胞内被标记的染色体数量,就能够计算出每个细胞从标记时刻以来所经历的增殖代次,并进而可以提供增殖不同代次细胞的“地图”。
本发明提供了一种利用核苷酸类似物在活体细胞标记DNA,经过设定时间段后,通过直接计数细胞内存留的标记染色体数量来判断各细胞所经历的增殖代次的技术方法,提供细胞增殖速度改变的时间和空间规律。
实验证明,本发明方法的结果准确可靠,在整个追踪期间除了常规的细胞培养、动物饲养和最终的细胞染色操作外,无须额外操作。因此,本发明方法操作简便,省时省力。
本发明方法既可以观察单一初始细胞的分裂次数,又可同时观察多个初始细胞的平均分裂次数,既可实现对体外细胞分裂次数的监测,又可以实现对动物体内细胞分裂次数的监测,因此可满足不同的实际需要。具体地,可同时获得不同组织或区域内细胞增殖代次数据,例如癌与癌旁;具有自身对照,可在同一动物中获得不同阶段增殖速度的比较数据,例如给药前后。
当将本发明方法用于利用动物进行药物筛选时,不须按时间点多次重复取样,节省大量动物(这是抗癌等药物筛选的最大成本之一),理论上只需一只动物样品,不须通过大量样本的统计平均,可以针对每一个细胞直接确定其分裂次数。
本发明方法还具有开发成自动计数、自动比较分析技术的潜力。
附图说明
图1:CHO子代细胞在12h-60h中BrdU标记的中期染色体鉴定。左侧是BrdU染色(绿色,FITC),中间是DNA染色(红色,PI),右侧是叠加结果。
图2:CHO子代细胞在12h-60h中BrdU标记的染色单体百分比。图中每个圆圈代表1个细胞,每个时间点统计15个细胞。统计结果表示为平均值±标准方差。
图3:CHO子代细胞在60h-108h中BrdU阳性细胞的百分比。每个时间点统计1000个细胞,重复5次,统计结果表示为平均值±标准方差。
图4:CHO子代细胞在12h和24h中BrdU阳性的染色面积在细胞核面积中的百分比。图中每个圆圈代表1个细胞,每个时间点统计20个细胞。统计结果表示为平均值±标准方差。
图5:CHO细胞的第1至5代的子代细胞中BrdU标记染色体鉴定。其中第2代细胞的标记染色体具有两种不同的染色形态。第一种是斑块型,如图2中2nd-1,只能通过计算面积分析代次。第二种是散点型,如图2中2nd-1,可以通过统计标记染色体数来计算代次。左侧是BrdU染色(绿色,FITC),中间是DNA染色(蓝色,DAPI),右侧是叠加结果。
图6:肝细胞的第1至4代的子代细胞中BrdU标记染色体鉴定。其中第2代细胞的标记染色体具有两种不同的染色形态。第一种是斑块型,如图2中2nd-1,只能通过计算面积分析代次。第二种是散点型,如图2中2nd-1,可以通过统计标记染色体数来计算代次。左侧是BrdU染色(绿色,FITC),中间是DNA染色(蓝色,DAPI),右侧是叠加结果。
图7:针对肝再生第一阶段增殖的肝细胞的代次作图分析。左图是BrdU染色(绿色,FITC)。右图是BrdU染色(绿色,FITC)和DNA染色(蓝色,DAPI)的叠加结果。下图是根据左图和右图建立的肝细胞代次图,其中紫色代表第一代细胞,蓝色代表第二代细胞,青色第三代细胞,绿色代表第四代细胞,空白代表非肝再生第一阶段增殖的细胞和部分在样品切片时细胞核破损的标记细胞。
图8:每个子代细胞都含有标记染色体时的标记染色体数量与细胞分裂次数的拟合曲线。
图9:出现子代细胞不含有标记染色体时的含有标记染色体的子代细胞数量占所有子代细胞数量的百分比与细胞分裂次数的拟合曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例中实验设置的思路:将初始CHO细胞进行BrdU标记,标记后的细胞记作已经分裂0次的初始细胞,即第0代细胞,此时间点记作第0小时;然后在如下时间点进行观察统计BrdU标记的染色体,从而确定初始细胞的分裂次数:第12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时。若本发明方法的检测结果与理论推测结果吻合,则证明本发明方法正确。
实施例1、监测体外细胞分裂次数的方法
一、材料:
1.BrdU(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
2.小鼠抗BrdU的IgG(Becton Dickinson,San Jose,CA)
3.FITC偶联的驴抗小鼠的IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)
4.DAPI(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
5.PI(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
6.o-Phenylenediamine(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
7.Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM,Gibco,Long Island,NY)
8.Fetal Bovine Serum(Gibco,New Zealand)
9.CHO细胞系购自ATCC,产品目录号为CCL-61。
10.多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
二、CHO细胞在各监测时间点的理论分裂次数
CHO细胞周期约12小时;CHO细胞的总染色体数量为19(N=19)。
将待检测细胞记作已经分裂0次的第0代细胞,此第0代细胞所处的时间点记作分裂次数监测过程的第0小时。那么从理论上得出:从第0小时计起,在第12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时的时间点,待检测细胞(第0代细胞)的分裂次数理论上应分别是第1次、第2次、第3次、第4次、第5次、第6次、第7次、第8次、第9次。
三、构建标记染色体数量与细胞分裂次数的关系等式,以及标记细胞比例与细胞分裂次数的关系等式
1、染色体标记:
1)CHO细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于5%CO2培养箱内37℃培养。
2)第一次拍落中期细胞。当CHO细胞培养至覆盖70%附着表面时,轻拍细胞培养瓶壁,每瓶100次,震落中期细胞(通常称为Mitotic shaking)。
3)迅速收集悬浮有中期细胞的培养上清,于1000rpm离心5分钟收集细胞。
4)BrdU标记。吸弃上清后用DMEM培养基轻吹沉淀的细胞团,均匀重悬,将重悬的中期细胞接种到新的含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中,加入BrdU至终浓度10uM,避光培养一个细胞周期时长12小时。
5)第二次拍落中期细胞。当BrdU标记12小时后,轻拍细胞培养瓶壁,每瓶100次,震落中期细胞。
6)迅速收集悬浮有中期细胞的培养上清,于1000rpm离心5分钟收集细胞。此步骤重复3次以充分去除剩余的BrdU。每次吸弃上清后用DMEM培养基轻吹沉淀的细胞团,均匀重悬后再次离心收集。
7)取新的细胞培养皿加入细胞培养玻片,将离心收集的中期细胞均匀分散在玻片上,避光培养约2小时。此时中期细胞已经贴壁并且完成分裂进入G1期,所有细胞的DNA双链中的一条单链已经被完整复制并且充分标记有BrdU。将此时的细胞记作已经分裂0次的初始细胞,即第0代细胞,此时间点记作监测过程的第0小时。
2、观察细胞分裂情况
在如下时间点(从第0小时计起,第12小时、24小时、36小时、48小时、60小时),观察初始细胞分裂产生的子代细胞中单个子代细胞内的标记染色体数量。在如下时间点(从第0小时计起,第60小时、72小时、84小时、96小时、108小时),观察统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比。
其中,所述观察统计方法包括如下步骤:
1)对所述子代细胞的标记染色体进行染色;
2)在步骤1)基础上,观察所述子代细胞中染色的标记染色体。
其中染色等方法如下:
2-1:中期染色体铺片
1)根据CHO细胞周期约12小时,从第0小时计起,在第12小时、24小时、36小时、48小时、60小时,分别拍落细胞。
2)将拍落收集的中期细胞转移至1.5ml EP管中,加入PBS后1000rpm离心5分钟,弃尽上清,重复洗三次。
3)逐滴加入1ml 37℃预热的低渗液(0.075mol/L KCl水溶液),立即轻摇混匀,置于37℃水浴锅内作用20min,期间轻混。
4)立即加入0.5ml现配的固定剂(甲醇∶乙酸=3∶1,体积比)混匀,室温(25℃)作用1min,800rpm离心10min收集细胞。弃尽上清,
5)加入固定剂1ml重悬细胞,室温作用1h,期间轻混。
取出-20℃预冷的载玻片,以45℃角放置。调整细胞密度后,将细胞悬液从高度1.5m处逐滴滴落至载玻片上,自然干燥,4℃保存。
2-2:染色方法:
1)根据CHO细胞周期约12小时,从第0小时计起,在第60小时、72小时、84小时、96小时、108小时,分别将待检测的细胞培养玻片置于PBS洗3次,每次5分钟,然后置于预冷的4%多聚甲醛,于4℃固定30分钟。
2)取出细胞培养玻片或上述4℃保存的中期染色体铺片,PBS洗3次,每次5分钟。
3)置于现配的2M Hcl中,于37℃水浴中作用30分钟。
4)PBS洗3次,每次10分钟。
5)加入封闭液,置于湿盒内37℃封闭1小时。封闭液:将5mg BSA、1mg TritonX100、1mg Tween20和PBS缓冲液混合,用PBS缓冲液定容至1升,得到的混合溶液即为封闭液。
6)吸弃封闭液,加入一抗(小鼠抗BrdU的IgG),经封闭液稀释至工作浓度1ug/ml,置于湿盒内4℃孵育过夜。
7)PBS洗3次,每次10分钟。
8)加入二抗(FITC偶联的驴抗小鼠的IgG),经封闭液稀释至工作浓度10ug/ml,置于湿盒内37℃避光孵育1小时。
9)PBS洗3次,每次10分钟。
10)加入DAPI或者PI,工作浓度1ug/ml,室温避光孵育5分钟。
11)PBS洗3次,每次10分钟。
12)加入含0.5%o-Phenylenediamine和90%甘油的PBS,指甲油封片,避光保存。
2-3、统计方法
照相方法:使用普通荧光显微镜。本实验中采用Carl Zeiss公司的倒置荧光显微镜(Axio Observer Z1)和激光共聚焦显微镜(LSM 700)。物镜配置Plan-Neofluar 40Xoil(N.A.1.30)和Plan-Neofluar 63X oil(N.A.1.40),光学切片厚度0.5um。
采用Origin8.0软件统计如下数量:单个细胞内的标记染色体面积占细胞核面积的百分数、单个细胞内的标记染色体数量、子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比。
3、观察结果及关系等式
CHO细胞共有19条染色体,当细胞分裂一次和两次后,由于单个细胞内剩余的标记染色体数依然较多,大多数情况下观察到的是细胞核内出现区域化的染色斑块,尚未出现散点状的清晰独立的单个标记染色体,因此无法准确统计出标记染色体数量。但可以统计单个细胞内染色的标记染色体面积占细胞核面积的百分数。并且通过大量的细胞观察显示,第一次有丝分裂产生的子代细胞中染色的标记染色体面积占细胞核面积的百分数均在71%-83%之间;第二次有丝分裂产生的子代细胞中染色的标记染色体面积占细胞核面积的百分数均在37%-53%之间(图4)。
从第0小时计起,第60小时内,都观察到由初始细胞分裂产生的子代细胞中的每一个子代细胞都含有标记染色体;且在第12小时,24小时,36小时,48小时、60小时,单个细胞内标记的染色体会随细胞分裂而逐代递减,子代单个细胞内的标记染色体数量占细胞内所有染色体数量的百分比如图2和图1所示。其中,第12小时平均有13.3条标记染色体,第24小时平均有8.2条标记染色体,第36小时平均有5.2条标记染色体,第48小时平均有3.1条标记染色体,第60小时平均有2.1条标记染色体,单个细胞内的标记染色体数量符合指数衰减趋势,即符合指数衰减等式Y=Y0+A×EXP(R0×X)。
从第0小时计起,在第72小时观察到由初始细胞分裂产生的子代细胞中出现不含有标记染色体的细胞;在第60小时、72小时、84小时,96小时、108小时检测到的由初始细胞分裂产生的子代细胞中的含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比依次分别为:100%、59%±5%、50%±4%、39%±5%、27%±3%(图3),也符合指数衰减等式Y=Y0+A×EXP(R0×X)。
根据统计结果拟合回归曲线。
拟合结果如下:
当子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量能够辨别时,使用等式I;拟合回归曲线如图8所示。
当子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,使用等式II;拟合回归曲线如图9所示。
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数。
四、本发明方法进行监测
每个物种的染色体数量都是常见的基本信息资料,可以通过美国的国家生物技术信息中心National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询。由于不同种类的人类肿瘤细胞的染色体数量差异非常大,例如Hela细胞有60-70条,所以也可以通过中期染色体分离后计数的方法统计出初始细胞的染色体数量。
(一)本发明方法步骤
(1)用BrdU标记CHO细胞,标记后的CHO细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上BrdU;此标记细胞定义为未进行细胞分裂的初始细胞,即第0代细胞;将标记有BrdU的染色体定义为标记染色体;将初始细胞所处的时间点记作监测过程的第0小时;
(2)在如下时间点(从第0小时计起,第12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时),观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,按照如下1)或2)或3)所述方法确定初始细胞的分裂次数:
1)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个细胞内的标记染色体数量不能辨别,则统计单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数,记作面积百分比,当所述面积百分比为77%±6%时,确定初始细胞分裂了1次,当所述面积百分比为45%±8%时,确定初始细胞分裂了2次;
2)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量能够辨别,则统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据等式I得到初始细胞的分裂次数;
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
3)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,则统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比,根据等式II得到初始细胞的分裂次数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数。
其中,观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体的方法包括如下步骤:
1)对所述子代细胞的标记染色体进行染色;
2)在步骤1)基础上,观察所述子代细胞中染色的标记染色体。
(二)本发明方法中所用的具体实验方法
1、染色体的体外标记方法(两次拍落标记法):
1)CHO细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于5%CO2培养箱内37℃培养。
2)第一次拍落中期细胞。当CHO细胞培养至70%愈合度时,轻拍细胞培养瓶壁,每瓶100次,震落中期细胞。
3)迅速收集悬浮有中期细胞的培养上清,于1000rpm离心5分钟收集细胞。
4)BrdU标记。吸弃上清后用DMEM培养基轻吹沉淀的细胞团,均匀重悬,将重悬的中期细胞接种到新的含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中,加入BrdU至终浓度10uM,避光培养一个细胞周期时长12小时。
5)第二次拍落中期细胞。当BrdU标记12小时后,轻拍细胞培养瓶壁,每瓶100次,震落中期细胞。
6)迅速收集悬浮有中期细胞的培养上清,于1000rpm离心5分钟收集细胞。此步骤重复3次以充分去除剩余的BrdU。每次吸弃上清后用DMEM培养基轻吹沉淀的细胞团,均匀重悬后再次离心收集。
7)取新的细胞培养皿加入细胞培养玻片,将离心收集的中期细胞均匀分散在玻片上,避光培养约2小时。此时中期细胞已经贴壁并且完成分裂进入G1期,所有细胞的DNA双链中的一条单链已经被完整复制并且充分标记有BrdU。将此时的细胞记作已经分裂0次的初始细胞,即第0代细胞,此时间点记作监测过程的第0小时。
2、染色方法:
1)将待检测的细胞培养玻片于PBS洗3次,每次5分钟,然后置于预冷的4%多聚甲醛,于4℃固定30分钟。
2)取出细胞培养玻片,PBS洗3次,每次5分钟。
3)置于现配的2M Hcl中,于37℃水浴中作用30分钟。
4)PBS洗3次,每次10分钟。
5)加入封闭液,置于湿盒内37℃封闭1小时。封闭液:将5mg BSA、1mg TritonX100、1mg Tween20和PBS缓冲液混合,用PBS缓冲液定容至1升,得到的混合溶液即为封闭液。
6)吸弃封闭液,加入一抗(小鼠抗BrdU的IgG),经封闭液稀释至工作浓度1ug/ml,置于湿盒内4℃孵育过夜。
7)PBS洗3次,每次10分钟。
8)加入二抗(FITC偶联的驴抗小鼠的IgG),经封闭液稀释至工作浓度10ug/ml,置于湿盒内37℃避光孵育1小时。
9)PBS洗3次,每次10分钟。
10)加入DAPI或者PI,工作浓度1ug/ml,室温避光孵育5分钟。
11)PBS洗3次,每次10分钟。
12)加入含0.5%o-Phenylenediamine和90%甘油的PBS,指甲油封片,避光保存。
3、统计方法
照相方法:使用普通荧光显微镜。本实验中采用Carl Zeiss公司的倒置荧光显微镜(Axio Observer Z1)和激光共聚焦显微镜(LSM 700)。物镜配置Plan-Neofluar 40Xoil(N.A.1.30)和Plan-Neofluar 63X oil(N.A.1.40),光学切片厚度0.5um。
采用Origin8.0软件统计如下数量:统计单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数、统计单个子代细胞内的标记染色体数量、统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比。
(三)本发明方法的结果
1、第1次和第2次分裂
结果:从第0小时计起,第24小时内,都观察到由初始细胞分裂产生的子代细胞中的每一个子代细胞都含有标记染色体并且单个子代细胞内的标记染色体数量不能辨别(图5);
从第0小时计起,第12小时时单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数为83%,在71%-83%之间,表明初始细胞分裂了1次;
从第0小时计起,第24小时时单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数为51%,在37%-53%之间,表明初始细胞分裂了2次;
结果与理论分析相符,表明本发明方法结果准确。
2、第3次至第5次分裂
第0小时计起,第36小时、48小时、60小时,都观察到由初始细胞分裂产生的子代细胞中的每一个子代细胞都含有标记染色体,并且在第36小时,48小时、60小时时单个子代细胞内的标记染色体数量能够辨别(图5);
在第36小时,48小时、60小时时单个子代细胞内的标记染色体数量分别为5、3、2,代入等式I,得到三个时刻的初始细胞的分裂次数为3.2、4.2、4.8,即初始细胞在第36小时、48小时、60小时时,初始细胞的分裂次数依次为3次、4次、5次。
结果与理论分析相符,表明本发明方法结果准确。
3、第6次至第9次分裂
从第0小时计起,在第72小时观察到由初始细胞分裂产生的子代细胞中出现不含有标记染色体的细胞;在第60小时、72小时、84小时,96小时、108小时检测到的由初始细胞分裂产生的子代细胞中的含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比依次分别为:100%、59%±5%、50%±4%、39%±5%、27%±3%。
得出在第72小时、84小时、96小时、108小时时,初始细胞的分裂次数依次为6次、7次、8次、9次。
结果与理论分析相符,表明本发明方法结果准确。
实施例2、监测体内细胞分裂次数的方法
材料:
1.BrdU(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
2.小鼠抗BrdU的IgG(Becton Dickinson,San Jose,CA)
3.FITC偶联的驴抗小鼠的IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)
4.DAPI(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
5.n-propyl gallate(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
6.SD品系大鼠(Vital River Laboratories,Beijing)
7.多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
8.多聚赖氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)
9.冰冻切片机(Leica 3050S)
肝再生背景:已知肝细胞在正常情况下几乎全部处于细胞周期的非增殖的静止状态(G0期),肝切除后将开始启动代偿性增殖,大鼠肝再生持续7天,之后再生肝脏将恢复到手术前的重量,肝细胞停止增殖并重新回到静止状态。根据已有文献报道,肝切除后12h开始有肝细胞进入DNA合成期(S期),24h达到高峰,30h降至12h水平。因此12h-30h是肝细胞增殖的第一个完整阶段,在12h-30h进行连续BrdU标记,将能够完整的标记所有在此阶段增殖细胞的全部染色体。
根据等式I,大鼠肝细胞共有42条染色体。当N=42时,肝细胞第一至五代的标记染色体的平均数量分别是28,19,12,7,4。
按照实施例1中所述方法进行监测。不同的是体内标记方法不同。
1、体内标记方法:
1)大鼠2/3肝切除手术(PHx)。按照Higgins(1931)方法,SD品系大鼠在上午9:00-10:00之间手术。首先将大鼠用乙醚麻醉后,在胸骨剑突下方约1cm处纵向打开腹腔,暴露出肝脏的中叶和左叶,约占肝脏自身重量的2/3,然后用医用缝合线结扎其基部后完全切除,最后缝合关闭腹腔。此时即为术后0h。
2)术后12h开始给予BrdU标记,腹腔注射,5mg/kg。已有文献报道BrdU进入体内1h后将从血液系统完全清除,为了尽可能充分标记,从12h开始每3h给予一次腹腔注射,5mg/kg,直到30h完成最后一次标记,共标记7次。完成标记7次的细胞记作初始细胞。
3)30h完成最后一次标记之后大鼠正常饲养至术后第七天(168h)处死,取出肝脏置于4%多聚甲醛固定8h。
4)冰冻切片。本例中考虑到肝细胞的细胞核在15um左右,为了尽可能保留完整的细胞核即保留所有的染色体,切片厚度20um。玻片提前经过1%多聚赖氨酸包被,防止切片脱落。
2、染色方法、照相方法和统计分析方法:与实施例1中所述一致。
3、结果:
检测结果如图7所示。
结果观察到如下4种细胞:
第一种:细胞内的标记染色体数量不能辨别,单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数为83%在71%-83%之间,表明初始细胞分裂了1次;
第二种:细胞内的标记染色体数量不能辨别,单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数为51%在37%-53%之间,表明初始细胞分裂了2次;
第三种:细胞内的标记染色体数量能辨别,细胞内的标记染色体数量为12,代入等式I,得到其分裂次数为2.9,即初始细胞分裂了3次;
第四种:细胞内的标记染色体数量能辨别,细胞内的标记染色体数量为6,代入等式I,得到其分裂次数为4.4,即初始细胞分裂了4次;
结果显示(图6),肝细胞的分裂速度并不同步,共有四种不同代次的细胞,有的细胞分裂了1次,有的细胞分裂了2次,有的细胞分裂了3次,有的细胞分裂了4次。没有观察到更多的分裂代次,是因为肝切除后肝细胞的增殖在7天后结束,进入静止期不在增殖。
左图是BrdU染色(绿色,FITC)。右图是BrdU染色(绿色,FITC)和DNA染色(蓝色,DAPI)的叠加结果。下图是根据左图和右图建立的肝细胞代次图,其中紫色(编号1)代表第一代细胞,深蓝色(编号2)代表第二代细胞,浅蓝色(编号3)第三代细胞,绿色代(编号4)表第四代细胞,空白代表非肝再生第一阶段增殖的细胞和部分在样品切片时细胞核破损的标记细胞。
Claims (10)
1.一种辅助监测细胞分裂次数的方法,包括如下步骤:
(1)用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,将标记后的待监测细胞记作未进行细胞分裂的初始细胞;将标记有碱基类似物的染色体记作标记染色体;
(2)按照如下1)或2)或3)所述方法确定初始细胞的分裂次数;
1)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量不能辨别,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体面积占单个子代细胞的细胞核面积的百分数,记作面积百分比,当所述面积百分比为71%-83%时,确定初始细胞候选分裂了一次,当所述面积百分比为37%-53%时,确定初始细胞候选分裂了两次;
2)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,且单个子代细胞内的标记染色体数量能够辨别,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据等式I得到初始细胞的分裂次数;
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
3)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,则观察统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比,根据等式II得到初始细胞的分裂次数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
所述初始细胞至少为一个;
其中,所述观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体的方法包括如下步骤:
1)对所述子代细胞的标记染色体进行染色;
2)在步骤1)基础上,观察所述子代细胞中染色的标记染色体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述进行染色的方法包括如下步骤:将所述子代细胞固定,再将一抗与所述固定后的细胞共同孵育,得到结合一抗的细胞;再将荧光染料标记的二抗与所述结合一抗的细胞共同孵育,得到结合二抗的细胞;所述一抗为抗所述碱基类似物的IgG;所述二抗为与所述一抗结合的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述抗碱基类似物的IgG为小鼠抗碱基类似物的IgG;所述二抗为驴抗小鼠的IgG;所述荧光染料为FITC。
4.一种辅助监测细胞分裂次数的方法,包括如下步骤:
(1)用碱基类似物标记待监测细胞,标记后的待监测细胞内所有DNA双链中的一条单链被标记上所述碱基类似物,将标记后的待监测细胞记作未进行细胞分裂的初始细胞;将标记有碱基类似物的染色体记作标记染色体;
(2)按照如下1)或2)所述方法确定所述初始细胞的分裂次数;
1)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中的每一个细胞都含有标记染色体,则观察统计单个子代细胞内的标记染色体数量,根据单个子代细胞内的标记染色体数量得出初始细胞的分裂次数;
2)、观察由初始细胞分裂产生的子代细胞中的标记染色体,若子代细胞中至少有一个细胞不含有标记染色体,则观察统计子代细胞中含有标记染色体的细胞的数量占子代细胞中所有细胞数量的百分比,根据所述百分比得出初始细胞的分裂次数;
所述初始细胞至少为一个。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述根据单个子代细胞内的标记染色体数量得出初始细胞的分裂次数的方法包括如下步骤:将所述单个子代细胞内的标记染色体数量代入等式I,得出初始细胞的分裂次数;
等式I:Y=-0.51+6.93EXP(-2.47X/N),其中X表示单个子代细胞内的标记染色体数量,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数;
所述步骤2)中,根据所述百分比得出初始细胞的分裂次数的方法包括如下步骤:将所述百分比代入等式II,得出初始细胞的分裂次数;
等式II:Y=0.03+log2N+10.12EXP(-2.74X),其中X表示所述百分比,Y表示初始细胞的分裂次数,N表示该种初始细胞的染色体总数。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于:所述碱基类似物为胸腺嘧啶类似物、腺嘌呤类似物、鸟嘌呤类似物、胞嘧啶类似物或尿嘧啶类似物;所述胸腺嘧啶类似物为CldU、IdU、BrdU、EdU或H3-thymidine。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于:所述用碱基类似物标记待监测细胞的方法包括如下步骤:将处于有丝分裂中期的母细胞接于用于培养母细胞的细胞培养基中,再向其中加入所述碱基类似物,培养至母细胞完成有丝分裂得到子细胞,所述子细胞即为所述待监测细胞。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法,其特征在于:所述待监测细胞为植物细胞或离体的动物细胞;所述离体的动物细胞优选为CHO细胞;
和/或,所述细胞分裂为有丝分裂;
和/或,所述分裂的次数为1-9次或1-5次或2-5次。
9.权利要求1-8中任一所述的方法在辅助监测细胞的增值速度中的应用。
10.权利要求1-8中任一所述的方法或权利要求9所述的应用在筛选药物中的应用。
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