CN101427135B

CN101427135B - T细胞测定

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Publication number: CN101427135B
Application number: CN200780014169.0A
Authority: CN
Inventors: 马修·贝克; 弗朗西斯·J·卡尔; 艾丽森·鲁斯特; 劳拉·戴维斯
Original assignee: Antitope Ltd
Current assignee: Abzena Cambridge Ltd
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: GB0604170D0; CN101427135A; ES2366971T3

Abstract

本发明涉及新T细胞测定方法，具体而言是其中通过除去调节T细胞以增加对测试抗原的T细胞应答。描述了其中为优化检测T细胞应答，改变与抗原或其他样品孵育时间安排的新测定法。本发明特别用于测量对药物、变应原、刺激物或其他物质的人类T细胞应答。

Description

T细胞测定

本发明涉及新T细胞测定方法，具体而言是其中通过除去调节T细胞以增加对测试抗原的T细胞应答。本发明还涉及新测定法，其中为优化检测T细胞应答，改变与抗原或其他样品孵育时间安排。具体而言，本发明涉及用蛋白质样品的T细胞测定，其中使用多时间点测量T细胞增殖或细胞因子释放，实现T细胞表位的优化检测。此外，本发明涉及为优化检测T细胞表位，改变抗原与抗原递呈细胞(APC)或T细胞或APC和T细胞二者孵育时间安排的T细胞测定。本发明尤其涉及用免疫调节性或毒性样品的T细胞测定，所述样品直接影响APC、T细胞，或者APC和T细胞二者。本发明特别用于测量对人类接触的药物、变应原、刺激物或其他物质的人类T细胞应答。

T细胞测定提供了用于测量对抗原和其他样品的T细胞应答的有效方法，尤其在人类中。这种测定被认为是“体外”测定，其中血样从供体中取出并处理，使得血细胞原代培养物直接用于这种测定。对于肽和蛋白质样品，体外人类T细胞测定已经用于检测人类T细胞表位，其有几个目的，包括评估这种样品在人类中的潜在免疫原性(Jones等，J.InterferonCytokine Res.，24卷(2004)p560-572)，确定蛋白质序列中T细胞表位然后包含入疫苗，和确定蛋白质序列中T细胞表位然后除去以避免免疫原性(Jones等，J.Interferon Cytokine Res.，24卷(2004)p560-572，和Jones等，J.Thromb.Haemost.，卷3(2005)p1-10)。当前的T细胞测定方法广泛包括了，在测量T细胞应答前用APC和T细胞混合物孵育肽或蛋白质样品，或者在测量T细胞应答前用APC孵育肽或蛋白质样品然后加入T细胞。在这两种测定中，使用多个血样单独平行测试每个单独的肽或蛋白质样品，然后通常在单一时间点测量T细胞应答。通常通过引入脉冲的放射性标记如氚化胸腺嘧啶(3HTdR)到增殖性T细胞(“T细胞增殖”)，或者通过从激活的T细胞释放细胞因子例如IL-2(“细胞因子释放”)，测量T细胞应答。

检测T细胞表位的当前T细胞测定方法受限于下述因素的一个或两者：低灵敏度和/或由免疫调节性或毒性样品的干扰，所述样品抑制、刺激或以其他方式改变APC、T细胞或者APC和T细胞二者。像这样，当前T细胞测定方法可能不检测在某些肽和蛋白质样品中的一些或全部T细胞表位，并可能不适用于测量对免疫调节性或毒性样品的T细胞应答，所述样品包括肽和蛋白质样品、含有有机分子的非蛋白质样品、和蛋白质和非蛋白质样品的制剂，其中所述制剂本身可以具有免疫调节性或毒性。

关于灵敏度，体外T细胞测定低灵敏度的主要原因可能与测定混合物中因子有关，所述因子(包含细胞类型或测定培养物中因子)降低了对测试抗原的T细胞应答，或由测试抗原或测试样品本身引起。体外T细胞测定低灵敏度的进一步原因可能与对肽或蛋白质样品中T细胞表位的T细胞应答的动力学有关，其中个体T细胞表位可在不同时间诱导T细胞应答。对于其中使用单一时间点的T细胞增殖，加入某种样品后的T细胞增殖，可能一方面在最初时快速，然后在加入脉冲放射性标记时下降，以致没有明显增殖反应被检测。另一方面，T细胞增殖在加入某种其他样品后可能在最初时(在加入脉冲放射性标记时)缓慢，使得没有明显增殖反应被检测，即使接下来的增殖变得明显。对于其中使用单一时间点的细胞因子释放，加入某种样品后的细胞因子产生，可能一方面在最初时快速，但这些细胞因子可能接下来被测定混合物中的细胞消耗，使得在单一测定时间点没有明显细胞因子可检测得到。另一方面，细胞因子释放可最初时缓慢，使得在单一测定时间点没有明显增殖反应检测得到，即使接下来的细胞因子释放变得明显。增殖或细胞因子释放的动力学可被一系列因素影响，例如在不同血样间T细胞应答中的同种异型差异、APC摄取和处理的效率和动力学、APC中肽或蛋白质样品的蛋白水解效率、肽或蛋白质样品中T细胞表位的强度和频率、T细胞表位对特定II类MHC同种异型的亲和力、T细胞受体对肽-II类MHC复合物识别效率、共刺激细胞表面分子的频率和浓度、共刺激细胞因子的浓度、测定混合物中其他细胞例如CD8⁺T细胞或抑制性T细胞的刺激、记忆T细胞的存在和一些样品(例如小肽)直接加载到APC表面表达的II类MHC分子上的能力。

关于免疫调节性或毒性样品对T细胞测定的干扰，这类样品可直接结合APC、T细胞或APC和T细胞二者或被APC、T细胞或APC和T细胞二者吸收。这类样品能负-或正-调节APC和/或T细胞的正常免疫功能，使得检测不到针对样品的T细胞表位或T细胞应答。另一个T细胞测定被免疫调节性样品干扰的原因是通过对APC、T细胞或APC和T细胞二者的毒性作用。T细胞测定被免疫调节性样品干扰的其他原因包括正-或负-调节APC或T细胞亚型，例如正-调节CD8⁺T细胞或抑制性T细胞。

为有效开发T细胞测定在一定范围的应用(尤其关于人类药物)，需要用于优化检测T细胞表位的更灵敏的T细胞测定方法，并且也需要可用于免疫调节性或毒性样品的T细胞测定。

本发明是部分基于，从T细胞测定混合物中除去调节T细胞会导致针对测试抗原的辅助性T细胞应答明显增加的发现。因此，本发明提供了用于优化检测T细胞表位的新T细胞测定方法，其中抑制性T细胞从培养物中除去导致针对测试抗原的T细胞应答增加。此外，本发明提供了用于优化检测调节T细胞和/或APC的蛋白质或对T细胞和/或APC有毒性效应的蛋白质的免疫原性的新T细胞测定方法。本发明还可用于检测非蛋白质化合物，所述化合物可直接通过T细胞受体、或者通过共价结合到蛋白质、或者通过直接结合到被II类MHC分子结合的肽、或者通过直接结合到II类MHC分子来刺激T细胞。具体而言，本发明提供了其中在测量针对测试抗原的应答前，从培养物除去了通常负-调节效应T细胞应答的调节T细胞的方法。此外，本发明提供了用多时间点测量的方法，其中与抗原或其他样品孵育后检测T细胞应答的时间点被优化。

本发明第一方面提供了测量针对测试物质的辅助性T细胞应答的方法，包括下列步骤：

(a)从获自生物体的样品中分离抗原递呈细胞(APC)和T细胞；

(b)从所分离细胞中排除调节T细胞；

(c)使所述APC和在(b)中获得的排除了调节T细胞的细胞与所述测试物质一起孵育；以及

(d)测定对所述测试物质的T细胞应答。

APC和T细胞通常从血样中获得。然而，不同来源的T细胞和/或APC能被用于本发明，包括来源于扁桃体、派伊尔氏淋巴集结、肿瘤和细胞系的那些。在一个优选实施方案中，所述方法的执行使用了人类外周血单核细胞(PBMC)。

本文使用的术语“排除”是指除去一些调节T细胞。这可通过物理去除细胞或通过抑制或调节T细胞的作用来进行。因此降低了靶标T细胞活性。优选75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的靶标T细胞活性通过排除处理除去。

本领域技术人员应理解，作为本发明部分，一定范围的用于排除或靶向调节T细胞的方法可用作通过CD25^hi排除调节T细胞的替代方法。也应理解本发明也包括调节T细胞测定中调节T细胞的效应的方法。对于排除或靶向，调节T细胞表面表达的分子可结合或替代CD25用于排除这些细胞。这种分子可包括但不限于GITR、CTLA-4、CD103、CC趋化因子受体4、CD62L和CD45RA，并且也可包括表面结合的细胞因子或细胞因子例如IL-10和TGFβ的表面形式。排除可通过几种方法实现，所述方法包括结合到特异性抗体以将调节T细胞吸附到固相或引起这种调节T细胞的破坏或抑制，或另外从其他T细胞中分离调节T细胞用于T细胞测定。对于调节，调节T细胞分泌的分子可被防止这种分泌或可在分泌后被阻断/抑制/破坏。这种分子可包括细胞因子例如IL-10、IL-4、IL-5和TGFβ，并且这种分子可用结合到这种分子上的有机或者无机分子(例如抗体或可溶受体)，或者通过抑制性核酸例如siRNA、反义寡核苷酸或者递送入调节T细胞或在这种细胞中诱导的其他核酸阻断。以打破这些细胞的抑制功能的方式，调节T细胞活性的调节也可通过靶向调节T细胞上的受体或其他表面分子来实现，所述受体或其他表面分子包括但不限于GITR、CTLA-4、CD103、CC趋化因子受体4、CD62L和CD45RA。这种功能抑制可例如，通过具有激动剂功能或可阻断配基-靶标相互作用使得调节T细胞没有除去但却无法实施功能的特异性抗体实现。

调节T细胞活性的调节也可通过，阻断调节T细胞分泌分子的靶标受体，或通过阻断由这种分泌分子激活或负-调节的途径实现。同样对于调节，调节T细胞可被直接抑制，例如通过阻断转录因子(例如foxp3)或阻断与调节T细胞相关的其他功能或途径。这种抑制或阻断可通过有机或无机分子、或通过抑制性核酸例如siRNA、反义寡核苷酸或递送入调节T细胞或在这种细胞中诱导的其他核酸实现。在其中有机、无机或核酸分子用于抑制调节T细胞作用或以其他方式调节调节T细胞，其中的所述分子本身干扰T细胞测定的所有情况下，这种分子优选从这种测定中除去或被修饰到不干扰这种测定的形式。例如，用于除去调节T细胞分泌分子的特异性抗体或蛋白质，在T细胞测定前被选择性除去或者以不干扰T细胞测定的特定形式使用。例如对于人类T细胞测定，人类形式的抗体或蛋白质被用于避免针对自身抗体或蛋白质的T细胞应答。

使用不调节T细胞和/或APC的测试抗原(通常是蛋白质或肽而且也可是非蛋白质化合物)的本发明T细胞测定的主要步骤如下：

(1)从人类血样中分离PBMC

(2)可选择地除去CD8⁺T细胞

(3)排除CD25^hi+T细胞

(4)培养物与一种或多种浓度的测试抗原孵育，并且在一个或多个时间点测试T细胞增殖和/或细胞因子释放

本发明T细胞测定(其中测试抗原调节T细胞和/或APC)的主要步骤如下：

(1)从人类血样中分离PBMC

(2)分离APC，通常通过粘着至塑料，使用细胞因子诱导分化APC并将测试抗原加入到APC

(3)将通过预先排除CD25^hi+T细胞和可选择的CD8⁺T细胞处理的自体PBMC与APC混合

当测试物质是对APC或T细胞不具有免疫调节性或毒性的肽或蛋白质样品或非蛋白质样品时，血液能用作CD4⁺T细胞和APC(以单核细胞和树突状细胞形式)的来源。通常选择最能代表世界上种群或被研究种群中表达的HLA-DR同种异型的数量和频率的一组供体。在所述组中表达的同种异型通常是全部主要HLA-DR等位基因(单个同种异型在世界种群中表达的频率>5％)被良好表达的种群中表达的同种异型的>80％。可选择地，在所述组中表达的同种异型被选择为过表达或包括HLA同种异型，所述同种异型被认为与在研究的一种特殊疾病相关。在本发明一个优选实施方案中，PBMC通过密度梯度分级分离从血样制备，并且随后排除了CD8⁺T细胞和CD25^hiT细胞，使得剩余的PBMC主要包括CD4⁺T细胞(～70％)和APC(单核细胞10-20％和树突状细胞1-3％)。排除了CD8⁺CD25^hi的PBMC在细胞培养中建立，并且加入一种或多种肽或蛋白质样品或非蛋白质样品并孵育培养物。

测量T细胞应答能在一个固定时间点或者在多个时间点进行。这些时间点通过测量针对相似样品或最佳物质的T细胞应答动力学可预先确定。

用于测定的最佳条件能通过使用最佳物质确定。本文使用的“最佳物质”是已知为诱导T细胞应答的化合物，例如单个免疫调节性/毒性的肽/全蛋白，其具有与被测试样品相似的大小和结构或具有与测试物质相似性质。对于肽或蛋白质样品或非蛋白质样品，具有与被测试样品相似的大小和结构的一种或多种肽(通常长度为9-40个氨基酸)或全蛋白或非蛋白质化合物，能被用作最佳物质。测定最佳物质，结果用于确定典型T细胞应答的动力学。例如，在不同时间点测量T细胞应答，最通常是在加入样品后的第4-9天间，使用一系列不同的可选择的测定的一种或多种。一旦建立了针对最佳物质的T细胞应答动力学，能确定一组测定时间点用于随后测试样品。以这种方式，能以一个或多个合适时间点测定针对测试样品的T细胞应答。可选择地或另外地，二种或多种浓度用于建立针对最佳物质的T细胞应答动力学，并且随后样品能在这些浓度下测试。

使用许多不同测定，例如通过引入脉冲3HTdR(或被增殖性T细胞吸收的其他放射性、荧光或化学发光化合物)的T细胞增殖、细胞因子如IL-2或IFNγ的释放、mRNA的转录改变增加的激活标记mRNA(activationmarker mRNA)的转录、Ca2⁺流(Ca²⁺flux)和表型标记尤其是活化T细胞标记的改变，能测定T细胞应答。通常，对于肽或蛋白质样品，通过在加入样品后第5、6、7和8天引入脉冲3HTdR，或通过测量加入样品后8天细胞因子释放(特别是IL-2)(或通过3HTdR引入和细胞因子释放测量二者)，测量T细胞应答。作为一个供选方案，尤其对于具有高度重叠序列的肽(例如含有12个氨基酸重叠的蛋白质序列中的15mer)，能使用引入脉冲3HTdR和/或在单一时间点(通常加入测试肽后第7天)测量细胞因子释放。毗连重叠肽(adjacent overlapping peptide)倾向于含有T细胞表位，它们一起增加了T细胞表位检测的灵敏度。

当肽或蛋白质样品对于APC或T细胞具有免疫调节性或毒性时，要处理从生物体获得的样品并且从其他细胞分离APC。这通常通过塑料粘着实施，并且然后肽或蛋白质样品与这些APC一起孵育。APC能与细胞因子例如白细胞介素4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α和诱导成熟APC表型的白细胞介素1α一起孵育。在使用预分级分离APC的标准T细胞测定中的样品通常需要样品：APC孵育时间达到48小时。优选地，通过在菌种生长培养基中孵育达到4天产生半成熟APC，所述培养基含有白细胞介素4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。然后把包含免疫调节性或毒性样品的样品加入到半成熟APC中并且孵育短暂时间。取决于样品的毒性或免疫调节功能，与半成熟APC的孵育时间可为3到10小时。样品：APC孵育后，接下来通过重复冲洗半成熟APC除去外源性样品。通过与促炎刺激物例如肿瘤坏死因子或白细胞介素1或CD40配基或脂多糖的一起孵育然后产生了成熟样品脉冲APC(mature sample pulsedAPC)。加入自体T细胞，通常是由上述PBMC制备的排除了CD4⁺CD8^-CD25^hi的T细胞，到成熟样品-脉冲APC。排除CD4⁺CD8^-CD25^hi的T细胞与成熟样品脉冲APC以一系列进一步孵育时间点一起孵育。如上描述的最佳物质能用于以不同的APC孵育时间点和/或不同的T细胞孵育时间点建立应答的动力学。用最佳物质获得的结果能用于确定一组用于后续测试样品的APC孵育和/或T细胞孵育时间点。以这种方式，能以一个或多个测定时间点检测针对测试样品的T细胞应答。可选择地或另外地，二种或多种浓度用于建立针对最佳物质的T细胞应答动力学，并且随后样品能在这些浓度下测定。

当被测试的样品是非蛋白质物质时，取决于非蛋白质样品是否对APC、T细胞或二者是免疫调节性或毒性，能使用上述方法中(即，对于具有或不具有免疫调节性或毒性性质的肽或蛋白质样品的方法)任一种。

对于免疫调节APC、T细胞或二者的蛋白质或非蛋白质样品，一个可选择的附加步骤是直接测试例如T细胞活化或APC分化的表型标志物的正-或负-调节。T细胞活化典型标志物包括CD69、CD25、CTLA4和GITR表达的变化，以及测量细胞内Ca²⁺流。用以评估APC分化的通常表型标志物包括II类MHC、CD80和CD86，它们都在成熟APC上高度表达。这些附加步骤能提供针对测试样品的T细胞应答的动力学信息，该信息协助确定为优化检测针对测试样品的T细胞应答的测定时间点。

本发明的新体外T细胞测定方法有一系列应用，尤其关于人类使用的药物。对于有前景作为药物应用的蛋白质，本发明的T细胞测定通过检测蛋白质序列的重叠肽能用于鉴定蛋白质序列内的T细胞表位。这种T细胞表位的部位和强度则能用于评估所述蛋白质在人类中的潜在免疫原性。可选择地，在用于人类前通过蛋白质序列突变能随后除去蛋白质内的T细胞表位。某些蛋白质内T细胞表位通过本发明方法也可被鉴定，并且随后通过将T细胞表位序列(或其变体)加入蛋白质疫苗中或者加入到作为疫苗部分的其他组分，合并到疫苗中。

本发明的新T细胞测定能用于评估一系列类型分子的潜在免疫原性，所述分子包括肽、蛋白质和非蛋白质，所述非蛋白质包括有机分子、脂质、碳水化合物或主要由二个或多个不同部分组成的分子，包括共轭物、混合物和制剂。本发明的T细胞测定在药物的研究、开发、制造和临床试验中有广泛应用。在研究方面例如，针对不同活性分子类似物的T细胞应答能用于评估在人体中这些类似物的潜在免疫原性。这种T细胞应答因此能用作选择先导药物(lead pharmaceutical)用于进一步开发的标准。在开发方面例如，针对相同分子不同制剂的T细胞应答能被测定用于评估在人体中这些制剂的潜在免疫原性。这种T细胞应答因此能用作选择最佳制剂用于临床试验的标准。在制造方面例如，针对相同分子的制造批的T细胞应答能被测定用于评估这些批的潜在免疫原性，并且也可评估批间分子中的任何变化。这种T细胞应答能用作制造的质量测试。在临床试验方面例如，用患者血液能测定T细胞应答为了例如评估正在进行试验的药物的免疫原性。本发明的T细胞测定也能被用于临床试验以测定任何针对药物的T细胞应答的MHC限制。

作为供选方案用于检测T细胞表位，本发明的T细胞测定方法能用于评估针对优选用于人类的药物的潜在不良反应。这些不良反应包括超敏反应、变态反应、刺激、免疫抑制、超免疫刺激(hyperimmune stimulation)和注射部位反应。本发明的T细胞测定方法也能用于评估针对非药物治疗(如移植)、环境物质(如草花粉变应原)、粮食、化妆品和一系列工业生产试剂(例如去污剂和酶)的潜在不良反应。

本领域技术人员应理解本发明T细胞测定方法中一系列改变能被使用，而且这些改变是在本发明范围内，例如通过在分析T细胞应答中使用多个测定时间点。例如，应理解在所述范围内有一系列本领域已知的用于分析T细胞应答的不同方法，包括例如测定关于T细胞应答单个步骤的MHC-肽结合(MHC-peptide binding)方法。作为供选方案分级分离如上所述的T细胞和APC，可分级分离其他细胞用于本发明T细胞测定。T细胞测定能用富集了朗格汉斯细胞的APC、不同的巨噬细胞亚型或APC的不同亚型，和/或使用或富集T细胞不同亚型执行。也应理解细胞因子能加入到(或从中除去)本发明T细胞测定的测定混合物中，例如为了提高灵敏度或负-或正-调节特异性APC或T细胞。T细胞测定的不同形式能被用于本发明中，例如回忆测定形式(recall assayformats)，其中T细胞用APC预处理递呈蛋白质或肽而接触了抗原，并且然后用相同或相关的蛋白质或肽再次免疫。

提供下列的实施例用于说明本发明，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。

实施例1：排除CD25⁺T细胞对T细胞应答的影响

外周血单核细胞是从获自国家输血服务中心(National BloodTransfusion Service)(Addenbrooke′s医院，Cambridge，UK)的健康社区供体的血沉棕黄层中分离的，并且经过Addenbrooke′s医院当地研究伦理委员会(Addenbrooke′s Hospital Local Research Ethics Committee)批准。PBMC通过Ficoll(GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK)密度离心从血沉棕黄层中分离，并且使用CD8+RossetteSep^TM(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)排除CD8+T细胞。通过使用基于Allset^TM SSP-PCR的组织分型试剂盒(Dynal，Wirral，UK)鉴定HLA-DR单体型，以及测定针对对照抗原钥孔戚血蓝素(KLH)(Pierce，Cramlington，UK)、破伤风类毒素(AventisPasteur，Lyon，France)和来自于流感HA(C32，aa307-319)的对照肽表位的T细胞应答，来表征供体。

CD25^hi T细胞排除使用Miltenyi Biotech(Guildford，UK)的抗-CD25微珠，使用厂商的标准方案和磁体实现。解冻每个供体10个小管，用30ml2％灭活人血清/PBS(Autogen Bioclear，Calne，Wiltshire，UK)重悬细胞。5x10⁷细胞转移到3x15ml管中，剩余细胞保持为全PBMC。抗-CD25微珠稀释混合物用300μl珠+4200μl分离缓冲液(0.5％人血清/2mMEDTA/PBS)制成。离心15ml管并且用500μl微珠稀释混合物重悬。然后管在上柱分离前在4℃保持5、10或20分钟。柱的装备是通过将柱放置在被支架支撑在其上的磁体中，加入2ml分离缓冲液到柱中并允许它滴出。与珠孵育后加入10ml分离缓冲液，管以1500rpm离心7分钟。然后用500μl分离缓冲液重悬细胞并且加入到柱中，接着用分离缓冲液2x1ml冲洗。柱流出液被收集于15ml管并含有排除了CD25^hiT细胞的部分。这些细胞在计数前以1500rpm悬沉7分钟并重悬于3ml AIMV培养基(Invitrogen，Paisley，UK)。

对细胞进行CD4和CD25染色，细胞数量用FACS检测。每个细胞种群的5-10x10⁵细胞放入U形底96孔板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)中的一孔。所述板以1200rpm悬沉4分钟。弃去上清液，用50μl抗体稀释液重悬细胞。抗体稀释液由在FACS缓冲液(1％人血清/0.01％叠氮化钠/PBS)中1/50稀释的FITC标记的抗-CD4抗体(R&D Systems，Minneapolis，USA)+1/25稀释的PE标记的抗-CD25抗体(R&D Systems，Minneapolis，USA)组成。对照孔也不染色、用同种型对照染色或用标记抗体单染色。

在黑暗中板在冰上孵育30分钟。然后板以1200rpm悬沉4分钟。弃去上清液，细胞用200μl FACS缓冲液重悬。这个过程重复二次，然后将细胞转移到FACS管。细胞通过FACS Calibur(Becton Dickinson，Oxford，UK)，收集数据并基于大小、粒度和荧光标记进行分析。

增殖测定进行如下。全部的CD8⁺T细胞排除的PBMC和CD8⁺CD25^hi排除的PBMC以每孔2x10⁵加入到100μlAIMV中。使用平底96孔板，每个测试条件制定三个重复培养物。对于每种肽加入100μl到细胞培养物中以得到5μM终浓度。以1mCi/ml3HTdR(GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK)脉冲各孔18小时前，细胞与肽和蛋白质抗原一起孵育7天。

对于增殖测定，使用等于或大于2(SI≥2)的刺激指数阈值，其中诱导大于这个阈值的增殖应答的肽被认为是阳性的(虚线)。使用单向非配对斯氏t检验(Student′s T test)分析所有数据以确定变差系数(CV)、标准偏差(SD)和显著性(p<0.05)。显示SI≥2的所有应答与未处理培养基对照相比有显著差异(p<0.05)。

结果显示在图1中，图1代表了在来自三个人类供体(475、440和462)的PBMC中针对一系列边界(borderline)或弱T细胞表位(肽1(PGQTATITCSGHALG)、2(GDKFVSWYQQGSGQS)、6(IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY)、9(QSISNWLNWYQQKPG)、13(KGLEWLVVIWSDGSS)、17(AASGFTFSSFGMSWV)、20(DTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQV)和24(HQSLVIKLMPNITLL))，以及针对一对强T细胞表位(肽25(PKYRNMQPLNSLKIAT)和26(TVFYNIPPMPL))，和针对KLH抗原的T细胞增殖应答。这个结果显示在排除CD25^hiT细胞后对于所有肽的T细胞应答的增强。排除CD25^hiT细胞后10或20分钟测定得到对于所有肽的最强应答。这些结果说明在排除CD25^hiT细胞后极大增强T细胞应答，这在肽例如肽1和2的例子中，允许检测之前评为边界或T细胞应答阴性的肽中的T细胞表位。

实施例2-时程肽(Timecourse Peptide)T细胞测定

来源于人类sTNFR1序列的野生型(WT)和T细胞表位排除肽(分别是HLRHCLSCSKCRKEM和HARHCLSCSKCRKEM)被合成(PepscanSystems，Leystad，Netherlands)，并使用实施例1的方法测试，其中排除了CD8⁺CD25^hiT细胞的PBMC用于与来源于sTNFR-1的肽对比刺激来自20个健康供体的T细胞应答的能力。通过加入1ml含有2-4x10⁶/ml CD8⁺CD25^hi T细胞排除的PBMC的AIMV培养基到24孔板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)的每一孔来建立大批培养(bulk culture)。通过加入1ml10μM肽到每一个大批培养中(每个大批培养2ml，终浓度5μM)使每种肽针对每个供体单独测试。至于对比，为未处理和阳性(KLH)对照建立额外的大批培养。在第6-9天除去大批培养中复制样品(T胚细胞的)，在圆底96孔板中评估增殖。数据用来评估在刺激后的第6、7、8和9天针对每种肽T细胞应答的强度和动力学。此外，与TNFR1肽一起培养8天后用IL-2Elispot测定法来测定用于时程增殖测定的相同20个健康供体的IL-2产生。Elispot板用70％乙醇预湿润然后用IL-2捕获抗体(capture antibody)(R&D Systems，Minneapolis，USA)4℃过夜包被。用PBS(Invitrogen，Paisley，UK)洗板2次然后用1％BSA/PBS在室温下封闭2小时。在以每孔4x10⁵细胞加入CD8⁺CD25^hi T细胞排除的PBMC和终浓度是5μM的测试样品前用PBS洗板。以37℃/5％CO₂7天后，板进行显影。先用水然后用PBS冲洗后加入内含IL-2检测抗体(R&DSystems，Minneapolis，USA)的PBS/1％BSA，37℃2小时。用PBS进一步冲洗后加入链霉抗生物素-AP(R&D systems，Minneapolis，USA)1.5小时，再次洗板然后加入BCIP/NBT发色团(R&D systems，Minneapolis，USA)30分钟。用水洗板，干燥后使用Immunospot Elispot分析仪、软件版本3(Cleveland，Ohio，USA)分析斑点数。

对于T细胞增殖和IL-2Elispot测定，超过SI阈值2(虚线)并且与本底(^*)有显著(p<0.05)差异的应答被认为是阳性。图2中显示结果指示在相同的3个人类供体(3、8和11)中，在增殖和IL-2Elispot测定二者中WT肽产生应答，指示这种肽含有T细胞表位。增殖时程指示，对于这3个供体，加入肽后7天检测到最大增殖应答，并且每种情况下，如果增殖应答在加入肽后8或9天时间点测量，则作为T细胞表位WT TNFR1肽会被评为阴性。这些结果也显示通过增殖和IL-2Elispot测量的T细胞应答之间强相关性。

实施例3-时程全蛋白T细胞测定

野生型(WT)和突变型T细胞表位排除的人类sTNFR1蛋白质制备为WO/2004/113387中描述的人类Fc融和蛋白，所述表位排除的蛋白含有突变I10Q、T20R、H23P、L56A、L108T、L110H和L149D。增殖和IL-2Elispot测定如实施例2进行，除了加入1ml sTNFR1蛋白质到终浓度10μg/ml。图3中显示数据指示，对于增殖测定，在供体13和17中检测到对WT但不对突变型T细胞表位排除蛋白质的显著T细胞应答。在第8和9天观察到最大应答并且在第6天供体13或17都没有显示任何显著应答。对于IL-2Elispot测定，供体13和17二者对WT但不对突变型表位排除蛋白质的T细胞应答再次阳性。此外，在这个测定中供体4对于WT蛋白质产生显著应答。如实施例2一样，结果进一步说明时程测定在检测T细胞应答中的功用，所述T细胞应答在这种情况下针对全蛋白。如实施例2一样，结果显示通过增殖和IL-2Elispot测量的T细胞应答之间好的相关性。

实施例4-时程免疫调节蛋白T细胞测定

该实施例说明了本发明用于测量对免疫调节蛋白、人干扰素β的T细胞应答的情况，已知人干扰素β正调节树突状细胞的抑制性分子，例如HLA-G(Mitsdoerffer M等J Neuroimmunol.2005159：155-64)和B7-1H(Schreiner B等J Neuroimmunol.2004155：172-82)。为测试存在于IFNβ序列中的线性T细胞表位是否能在体外刺激T细胞，发展了用于把抗原载入单核细胞衍生的树突状细胞中的修改方法，其中对于树突状细胞(DC)和CD4⁺T细胞二者IFNβ的生物效应降到最低。

通过粘着到组织培养塑料，单核细胞从PBMC中分离(>90％CD14⁺)并在24孔板内在具有5％热灭活人AB血清(Autogen Bioclear，Calne，Wiltshire，UK)的AIM V培养基(生长培养基)中以近似每孔1x10⁶(24孔板)的密度培养。单核细胞在含有人IL-4(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)和GM-CSF(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)的生长培养基中孵育3天。在第3天，44μg/ml Betaferon(干扰素β-1b)(Schering AG，Berlin，Germany)加入到0.5ml的测试缓冲液加3％热灭活人AB血清和25mM(终浓度)HEPES pH8中。含有50μg/ml KLH或没有抗原(未处理细胞)的对照孔在1ml PBS+0.01％Tween20加3％热灭活人AB血清(标准缓冲液)中孵育。DC冲洗6次除去外源性IFNβ后，DC与抗原一起孵育6小时。然后用含有TNFα(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA)、GM-CSF和IL-4的生长培养基重悬细胞过夜。

在第4天，通过从PBMC(Dynal人CD4⁺阴性分离试剂盒(DynalHuman CD4⁺Negative Isolation Kit)，Wirral，UK)中阴性选择分离自体CD8⁺CD25^hi排除的CD4⁺T细胞，然后以每孔1x10⁵加入到增殖和Elispot板二者的DC中。Elispot板在显影(如实施例2)前要孵育6天，在通过加入3HTdR(以1μCi/孔脉冲6小时)测量增殖前增殖板孵育7天。

如实施例2一样，选择刺激指数≥2的经验阈值用于增殖和Elipsot测定，其中大于这个阈值的应答被认为阳性。此外也进行了统计学分析以确定所述应答与未治疗对照(^*)是否具有显著(p<0.05)差异。确定测定内变差程度的另外分析包括变差系数(CV)。

显示在图4中的结果指示，在29个供体中的4个中对于增殖测定以及29个供体中的相同4个中对于IL-2Elispot测定的显著T细胞应答。这个数据显示即使对于免疫调节蛋白，T细胞应答能被重复指示。

实施例5-时程小分子T细胞测定

对比卡马西平(Novartis Pharmaceuticals UK)和N-乙酰亚氨基芪(N-acetyl iminostilbene)(根据Ying等Journal of Allergy and ClinicalImmunology2006；118：233-241合成的卡马西平类似物)在一组健康供体中刺激T细胞应答能力。根据实施例2的方法，二种化合物都以对于每个供体单独大批培养中25μg/ml被测试。简要来说，使用在24孔板的每一孔中2-4x10⁶CD8⁺CD25^hi T细胞排除的PBMC建立大批培养。在第5-8天从大批培养中除去复制样品(T胚细胞的)，在96孔板中评估增殖。数据用来评估针对每种化合物T细胞应答的强度和动力学。

如实施例2一样，SI≥2被用作阳性应答的阈值，并且使用参数和非参数统计分析进一步分析数据以确定变差系数(CV)、标准偏差(SD)和显著性(p<0.05)。任何给定的化合物被认为具有免疫原性，只要应答是统计学上显著的(p<0.05)且SI≥2。

结果显示，当使用时程T细胞测定方法测试一系列浓度时，卡马西平代谢产物N-乙酰亚氨基芪与卡马西平(已知为患者迟发型过敏反应的有效诱导物)相比刺激较少的供体。显然，使用单一时间点T细胞测定在大量T细胞应答中是检测不到的。实际上针对卡马西平的大部分T细胞应答在第5天被诱导，仅有一个额外应答在第6和7天检测到。使用单一时间点T细胞测定在第6、7或8天评估对N-乙酰基和卡马西平的T细胞应答，将不能区分这两种化合物之间任何水平的免疫原性。

Claims

1.一种用于测量对测试物质的辅助性T细胞应答的方法，其包括下列步骤：

(a)从获自生物体的样品中分离抗原递呈细胞(APC)和T细胞；

(b)从所分离的细胞中排除CD25^hi调节T细胞和CD8⁺T细胞；

(c)使所述APC和在(b)中获得的排除了CD25^hi调节T细胞和CD8⁺T细胞的细胞与所述测试物质一起孵育；以及

(d)测定对所述测试物质的T细胞应答，

其中所述方法不用于疾病的诊断或治疗。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)还包括将抗原递呈细胞(APC)从其他细胞分开；并且步骤(c)包括在随后加入排除了CD25^hi调节T细胞和CD8⁺T细胞的细胞前，使所述测试物质与所分离的APC一起孵育。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述APC在加入所述测试物质前用细胞因子处理。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述APC和T细胞来自于外周血单核细胞(PBMC)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述APC和T细胞是人类的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞应答通过测量T细胞增殖、细胞因子释放、T细胞转录变化和/或与T细胞活化关联的其他标志物的任何一个或多个来测定。

7.根据权利要求6所述的方法，其中T细胞增殖通过氚化胸腺嘧啶的摄取来测量。

8.根据权利要求6所述的方法，其中细胞因子释放通过IL-2和/或IFNγ的释放来测量。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞应答在孵育过程中超过一个的时间点测定。

10.根据权利要求2所述的方法，其中在添加所述排除了T细胞的细胞前，使所述APC与所述测试物质一起孵育超过一个时长。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试物质以多于一种浓度测定。

12.根据权利要求1所述的方法，其中测定已知为诱导T细胞应答的化合物以确定用于测定所述测试物质的最佳时间和/或浓度。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试物质是蛋白质。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试物质是肽。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试物质是非蛋白质。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述测试物质是有机分子。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述有机分子是脂质或碳水化合物。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述测试物质是共轭物。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述测试物质是混合物。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述测试物质是制剂。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试物质具有对T细胞和/或APC的免疫调节性或毒性。

22.根据权利要求4所述的方法，其中使用了表达的HLA同种异型代表了世界上种群或被研究种群表达的>80％的供体PBMC。

23.根据权利要求4所述的方法，其中供体PBMC用于代表与被研究疾病关联的特定HLA同种异型。

24.根据权利要求1所述的方法，其中测试了蛋白质序列的重叠肽，以鉴定所述蛋白质序列中的T细胞表位。

25.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中分别测试了一系列分子以评估相对免疫原性。

26.根据权利要求25所述的方法，其中使用相对T细胞应答作为选择用于进一步开发的先导药物的基础。

27.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中分析测试物质以评估潜在免疫原性。

28.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中分析测试物质的不同制剂以评估相对免疫原性。

29.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中分析测试物质的不同制造批以评估潜在免疫原性。

30.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中使用患者血液作为T细胞源来分析测试物质以评估对所述测试物质的免疫原性。

31.根据权利要求1所述的方法鉴定蛋白质序列中T细胞表位的用途，其中所述用途不用于疾病的诊断或治疗。