CN110412289B - 抑制性t细胞及筛选方法和抑制自身免疫反应中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种CD8+CXCR3+IL‑10+T细胞及筛选方法和抑制自身免疫反应中的应用。其细胞表面具有表达CD8、CXCR3抗原的亚群，这种亚群具有细胞因子IL‑10的表达来抑制活化的T细胞，通过Fas、FasL、PD‑1、PDL1分子接触杀死活化的T细胞,从而抑制免疫反应。通过筛选含有CD8+CXCR3+IL‑10+T细胞种群的样品，以便检测不同生物标志物的细胞表达水平，所述生物标志物包括CD8、CXCR3、CD62L、CD44和CCR7。其在制备用于抑制T细胞增殖和细胞因子生成的药物组合物中的应用，所述抑制T细胞增殖和细胞因子生成是通过将所述CD8+CXCR3+IL‑10+T细胞与所述活化反应性T细胞相接触来实现的。
Description
技术领域
本发明涉及调节性CD8+CXCR3+IL-10+T 细胞和长期、培养扩增、活化以及在免疫治疗和抑制免疫反应(包括移植、自身免疫性疾病、癌症治疗等) 中使用该细胞的方法。
背景技术
维持免疫平衡是至关重要的。免疫系统，对抗入侵人体的病原微生物，也可以破坏宿主的有机体，即自身免疫性疾病和过敏反应。因此，免疫反应必须受到包括专业调控细胞在内的多种机制的严格调控。这种专业的调控细胞T细胞被认为是免疫系统的“控制塔”。毫无疑问，近十年来T细胞研究的一个非凡进展是由自然产生CD4+CD25+T细胞的发现所引领的(Sakaguchi, S等人，J. Immunol. 1995. 155: 1151–1164；Sakaguchi, S等人，Annu.Rev. Immunol. 2004. 22:531–562；Shevach等人，Annu. Rev. Immunol. 2000. 18:423–449；Sakaguchi, S等人 Cell.2000. 101: 455–458)。
CD8+CD122+ T细胞在维持小鼠免疫稳态中具有重要的作用。因为CD8和CD122的表达模式人类与小鼠不同，与小鼠CD8+CD122+T细胞相对应的人类CD8+T细胞，尚未被鉴定。在这专利中，我们通过DNA芯片分析比较CD8+CD122+细胞和CD8+CD122-细胞在小鼠体内的基因表达谱，发现CXCR3在CD8+CD122+细胞中优先表达。当我们分析小鼠CD8+细胞中CD122和CXCR3的表达时，我们观察到一定数量CD122+CXCR3+细胞。小鼠CD8+CXCR3+细胞与CD8+CD122+细胞在体内和体外的调节活性相似。小鼠存在CD8+CD122+CXCR3+细胞，人体内存在CD8+CXCR3+细胞，但不存在CD8+CD122+细胞。在体外实验中，在体外实验中，人CD8+CXCR3+细胞表现出明显的免疫抑制作用，对CD8+CXCR3-细胞产生IL-10和抑制IFN-γ产生的调节活性。这些结果提示人类CD8+CXCR3+ T细胞和小鼠CD8+CD122+T细胞是相应的。
因为T细胞对某些特定抗原有反应，所以人们可能会想象存在抗原特异性T细胞，严格抑制某些特定的免疫反应而不影响其他免疫反应，这一想法也推动了T细胞的研究。成熟的T细胞一般通过细胞表面标记分为CD4+和CD8+两个群体，CD4+和CD8+细胞的良好平衡可以实现正常的免疫应答。虽然T细胞被认为分布在CD4+和CD8人群中，但T细胞的研究偏向于CD4+人群。
我们鉴定了小鼠CD8+CD122+T细胞，并证明了它们在体内维持免疫平衡的重要性(Rifa’i, M.等人，J. Exp. Med.2004. 200: 1123–1134)。CD8+CD122+T细胞被自然而然地分为T细胞出现的类型。处理自然产生的T细胞的一个好处是，它们使我们能够进行前瞻性的研究，并期待这些细胞用于治疗基于免疫的疾病。例如，我们可能能够收集自然产生的T细胞，在一些特殊的培养条件下将其扩增，并返回给宿主患者。这些T细胞有望成为免疫顽固性疾病患者的功能调节细胞。
CD8+CD122+T细胞与CD4+CD25+T细胞的区别不仅在于其细胞表面表型，还在于其调控机制和靶细胞的不同 (Endharti, A. T等人，J. Immunol. 2005. 175:7093–7097；Rifa’i, M.等人，cells. Int. Immunol. 2008. 20: 937–947；8 Shi, Z等人，Immunology2008. 124: 121–128；Sakaguchi, S等人，Eur. J. Immunol. 2007. 37S1: S116–S123；Mottet, C等人.，Swiss Mkly. 2007. 137:625–634.)。CD4+CD25+ T细胞可以通过常见标记物CD25和Fed. Woxp3在小鼠和人类中进行鉴定(Jonuleit, H等人，J. Exp.Med. 2001.193:1285–1294；Dieckmann, D等人，J. Exp. Med. 2001. 193: 1303–1310； Wildin, R.S等人，Nat. Genet. 2001. 27: 18–20； Bennett, C. L 等人，Nat. Genet. 2001. 27:20–21)，而CD8+CD122+ T细胞我们只能在小鼠中检测到，而不能在人类外周血细胞中检测到。由于CD8+CD122+T细胞在小鼠中是不可缺少的，因此存在与小鼠CD8+CD122+T细胞功能相同的T细胞是合理的，有望被CD122以外的其他标记分子识别。基于这个想法，我们开始寻找在功能上与小鼠CD8+CD122+T细胞相对应的人类CD8+T细胞。
我们发现CXCR3 (CD183)优先表达于CD8+CD122+T细胞，可以作为小鼠CD8+ T细胞的另一种标记分子。此外，在人CD8+细胞中观察到CXCR3+细胞，CD8+CXCR3+细胞在体外表现出调控活性，表明与小鼠CD8+CD122+T细胞相对应的人CD8+ T细胞存在，可能也包括在CD8+CXCR3+群体中。
需要用于生成足够数量的CD8+CXCR3+IL-10+ T细胞的方法，来实现鉴定并提供对人类患者安全有效的治疗应用。还需要更多理解CD8+CXCR3+IL-10+ T细胞及其在肿瘤免疫监视和癌症 (特别是实体瘤癌症，如肺癌 ) 的免疫治疗或免疫抑制中的功能。 同样重要的，还需要抑制体内异体反应和自身免疫反应，例如 (但不限于 )移植物抗宿主疾病(GVHD)，还需要阐明并扩展CD8+CXCR3+IL-10+T细胞细胞治疗以及确定分离或生产这样的CD8+CXCR3+IL-10+ T细胞抑制细胞的方法。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种CD8+CXCR3+IL-10+T细胞及筛选方法和抑制自身免疫反应中的应用。
一种筛选抑制异体反应性T细胞增殖和细胞因子生成的T细胞种群的方法，在人末梢血未激活状态，所述生物标志物包括CD8+、CXCR3+、CD62L+、CD44+和CCR7+，通过筛选含有这里生物标记物来纯化抑制性T细胞，经过抗CD3抗体激活后生物标志物为CD8+CXCR3+IL-10+T 细胞种群，以便检测不同生物标志物的细胞表达水平，用于分类免疫细胞亚群。
进一步的，先通过分离或者富集免疫抑制 CD8+CXCR3+IL-10+ T细胞种群，再通过CD8、CXCR3磁珠微珠和细胞分选技术，提纯用于人群治疗和商业用途。
进一步的，还包括使免疫抑制性调节 T 细胞的种群与刺激性组合物相接触，从而扩展免疫抑制性调节CD8+CXCR3+IL-10+T 细胞种群。
进一步的，筛选步骤进一步包括 ：筛选包含 CD8+CXCR3+IL-10+T 细胞种群的样品，以便检测 CD8+CXCR3+IL-10+ 生物标志物的细胞表达水平，其中包含表达模式的T 细胞亚群的检测可识别样品中免疫抑制性调节 CD8+CXCR3+IL-10+细胞种群。
进一步的，其中所述样品选自全部或部分纯化的血液或造血细胞，所述全部或部分纯化的血液或造血细胞选自：外周血液单核细胞；外周血液淋巴细胞；脾细胞；肿瘤浸润性淋巴细胞和淋巴结细胞和骨髓和外周骨髓细胞。
进一步的，生成的培养增殖的抑制 CD8+CXCR3+IL-10+ T细胞群，其中抑制功能被长期保留并且增殖的细胞数目足够用于人体中的有效治疗。
一种抑制异体反应性T细胞增殖和细胞因子生成的抑制性T细胞，其细胞表面具有表达CD8、CXCR3抗原的亚群，这种亚群具有细胞因子IL-10的表达来抑制活化的T细胞，通过Fas、FasL、PD-1、PDL1分子接触杀死活化的T细胞。
一种抑制性T细胞在制备用于抑制异体反应性T细胞增殖和细胞因子生成的药物组合物中的应用，所述抑制异体反应性T细胞增殖和细胞因子生成是通过将所述 CD8+CXCR3+IL-10+ T 细胞与所述异体反应性T细胞相接触来实现的。
本发明技术方案，CD8+CXCR3+IL-10 T细胞介导了对自体 T 细胞繁殖的有效抑制；而来自患者肿瘤的调节性 T 细胞不能抑制同种异体 T 细胞的繁殖并显示出诱导或保持肺癌患者体内肿瘤的耐受性；CD8+CXCR3+IL-10+T细胞能够导致肿瘤免疫监视故障或增加的肿瘤生长。
本发明还有一个目的是提供促进人体移植组织植入的方法，所述移植组织包括血液或骨髓移植物的全部或选用群落，特别是通过体内注入活化的并在体外培养增殖的 CD8+CXCR3+IL-10+ T 细胞来抑制、阻碍、阻断或预防 GVHD。有利的是，这样的方法的实施带来了降低强度的疗法和很少或没有免疫抑制。因此，这样的移植物植入促进作用能够作为一种较少或不需要调节疗法而获得免用药物耐受性的方法被应用于实体组织移植患者，或者作为免疫系统重建方法被应用于具有自体或同种异体骨髓的同种异体骨髓或自体免疫患者。
本发明的其他目的、优点和新颖特点将在下述说明、实施例和附图中作部分阐述，这些内容只是为了说明性目的，而非以任何方式来限制本发明，部分内容对本领域技术人员来说将是显而易见的，或可以通过本发明实践而获知的。
附图说明
图1-A为CD8和CXCR3的点图分析，以及CD8和CD122开发的点图分析。
图1-B为对CD8hi门控细胞(等于CD8+)和CD8dim门控细胞进行CXCR3和CD122表达谱点图分析。
图1-C为CD45RA和CD62L在门控CD8+CXCR3—细胞和CD8+CXCR3+细胞的表达谱点图分析。
图1-D为从不同年龄的健康志愿者体内获得单核细胞，检测其CD8和CXCR3的表达谱。
图2-A为人PBMC中 CD8、CXCR3表达的代表性染色模式。
图2-B为从健康供体的PB中提取CD8+CXCR3+细胞和CD8+CXCR3—细胞，测定各组细胞中IL-10、IL-2、IL-4、IL-13的产量。
图2-C为表达或不表达IL-10的细胞在总CD8+细胞中的百分比。
图2-D为三次IL-10分析的平均值用误差条和Students’ t 检验p值表示。
图2-E为表达IFN-γ的细胞占CD8+细胞总数的百分比。
图2-F为三个IFN-γ分析实验结果的均值用误差条和Students’ t 检验p值表示表示。
图2-G为通过CFSE荧光的降低来评估细胞增殖。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
参见图1-A，从人外周血中分离出单核细胞。用抗人CD8、抗人CXCR3、抗人CD122抗体染色，流式细胞术分析。图中显示了CD8和CXCR3的点图分析，以及CD8和CD122开发的点图分析。每个象限的单元格百分比显示在面板中。发现在人末梢血CD8集群中，CD122不表达，而CXCR3存在3%左右。说明CD8+CXCR3+亚基团在外周血中存在。
参见图1-B，对CD8hi门控细胞(等于CD8+)和CD8dim门控细胞进行CXCR3和CD122表达谱点图分析。每个象限的单元格百分比显示在面板中。右侧面板还显示了CD62L和CCR7与CD8+CD45RO+细胞门控的表达谱。发现CD8+CXCR3+亚基团也表达CD62L、CCR7。
参见图1-C，CD45RA和CD62L在门控CD8+CXCR3—细胞和CD8+CXCR3+细胞的表达谱点图分析。每个象限的单元格百分比显示在面板中。说明了在CD8+、CD8+CXCR3—和CD8+CXCR3+三个基团中CD62L、CD45RA的表达情况。
图1-D，从不同年龄的健康志愿者体内获得单核细胞，检测其CD8和CXCR3的表达谱。CXCR3+细胞占CD8+细胞总数的百分比为显示在每个面板。说明了在不同年龄段的人中，CD8+CXCR3+的表达情况。
参见图2-A，人PBMC中 CD8、CXCR3表达的代表性染色模式。通过细胞流式分选器获得CD8+CXCR3+细胞和CD8+CXCR3—细胞，位置显示为矩形。
参见图2-B，从健康供体的PB中提取CD8+CXCR3+细胞和CD8+CXCR3—细胞，分别用包覆抗人CD3/CD28抗体的微球刺激培养。培养96 h后，采用ELISA法分析培养上清液，测定各组细胞中IL-10、IL-2、IL-4、IL-13的产量。两个独立实验的平均值用误差条表示。用Students’ t 检验来计算 P 值。发现IL-10 在CD8+CXCR3+亚基团大量表达，其他的没有明显表达。
参见图2-C，细胞按(B)方法培养，先用抗CD8抗体染色，然后进行细胞内IL-10染色。每个面板中显示了表达或不表达IL-10的细胞在总CD8+细胞中的百分比。
参见图2-D，三次IL-10分析的平均值用误差条和Students’ t 检验p值表示。
参见图2-E，免疫抑制实验。首先用CFSE标记CD8+CXCR3—细胞，然后单独培养(3*105/well)或用CD8+CXCR3+细胞(1X105/well)培养。经过96小时的培养下用抗CD3 /CD28抗体包被的微球刺激细胞，用抗CD8抗体染色细胞表面，用抗人IFN-γ染色细胞内。分析CFSE标记细胞(CD8+CXCR3—细胞)IFN-γ的表达。每个面板显示的是表达IFN-γ的细胞占CD8+细胞总数的百分比。发现CD8+CXCR3—细胞单独培养和与CD8+CXCR3+一起培养的时候相比，IFN-γ大量表达。
图2-F，三个IFN-γ分析实验结果的均值用误差条和Students’ t 检验p值表示表示。
参见图2-G，按(E)方法进行培养，并通过CFSE荧光的降低来评估细胞增殖。灰色填充的峰表示单独培养的CD8+CXCR3—细胞的CFSE荧光，粗体线条的峰表示与CD8+CXCR3+细胞共培养的CD8+CXCR3—细胞的CFSE荧光。发现单独培养的CD8+CXCR3—细胞具有很强的分裂现象，而与CD8+CXCR3+细胞共培养的时候分裂减少。
Claims (3)
1.一种非治疗和非诊断目的的筛选抑制免疫反应性CD8 T细胞增殖和细胞因子生成的T细胞种群的方法，其特征在于，包括：
从样品中分离出单核细胞，用抗人CD8、抗人CXCR3抗体染色，通过细胞流式分选器获得CD8+CXCR3+细胞；
用包覆抗人CD3/CD28抗体的微球刺激培养所述CD8+CXCR3+细胞，培养96h后，获得CD8+CXCR3+IL-10+T细胞种群细胞，再通过CD8、CXCR3磁珠微珠和细胞分选技术提纯；所述CD8+CXCR3+IL-10+T细胞种群细胞具有细胞因子IL-10的表达来抑制活化的T细胞，通过Fas、FasL、PD-1、PDL1分子接触杀死活化的T细胞。
2.根据权利要求1所述的非治疗和非诊断目的的筛选抑制免疫反应性CD8 T细胞增殖和细胞因子生成的T细胞种群的方法，其特征在于：所述细胞因子为IFN-γ。
3.根据权利要求1所述的非治疗和非诊断目的的筛选抑制免疫反应性CD8 T细胞增殖和细胞因子生成的T细胞种群的方法，其特征在于：还包括使免疫抑制性调节 T 细胞的种群与刺激性组合物相接触，从而扩增免疫抑制性调节CD8+CXCR3+IL-10+T 细胞种群。
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