KR101361887B1 - Ｔ 세포 검사 - Google Patents

Ｔ 세포 검사 Download PDF

Info

Publication number
KR101361887B1
KR101361887B1 KR1020087024124A KR20087024124A KR101361887B1 KR 101361887 B1 KR101361887 B1 KR 101361887B1 KR 1020087024124 A KR1020087024124 A KR 1020087024124A KR 20087024124 A KR20087024124 A KR 20087024124A KR 101361887 B1 KR101361887 B1 KR 101361887B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
test substance
test
apcs
Prior art date
Application number
KR1020087024124A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080109008A (ko
Inventor
매튜 베이커
프랜씨스 제이. 칼
엘리슨 러스트
로라 데이비스
Original Assignee
안티토페 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0604170A external-priority patent/GB0604170D0/en
Priority claimed from GB0619374A external-priority patent/GB0619374D0/en
Priority claimed from GB0620123A external-priority patent/GB0620123D0/en
Application filed by 안티토페 리미티드 filed Critical 안티토페 리미티드
Publication of KR20080109008A publication Critical patent/KR20080109008A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101361887B1 publication Critical patent/KR101361887B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70517—CD8
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

본 발명은 새로운 T 세포 검사 방법들에 관한 것으로서, 특히 테스트 항원들에 대한 T 세포 반응들이 조절성 T 세포들의 제거에 의하여 증가되는 새로운 T 세포 검사 방법들에 관한 것이다. T 세포 반응들의 검출을 최적화하기 위하여 항원들 또는 다른 샘플들로서 배양 시점이 변화하는 새로운 검사들에 설명된다. 본 발명은 의약제들, 알레르기 항원들, 자극제들 또는 사람과 접촉된 기타 물질들에 대한 인간 T 세포 반응들의 측정을 위한 특별한 응용을 가진다.
T 세포, 분석

Description

Ｔ 세포 검사{T CELL ASSAYS}
본 발명은 새로운 T 세포 검사 방법들에 관한 것으로서, 특히 테스트 항원들에 대한 T 세포 반응들이 조절 T 세포들의 제거에 의하여 증가되는 새로운 T 세포 검사 방법들에 관한 것이다. 또한 본 발명은 T 세포 반응들의 검출을 최적화하기 위하여 항원들 또는 다른 샘플들로서 배양 시점이 변화하는 새로운 검사들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 T 세포 에피토프들(epitopes)의 최적 검출이 T 세포 증식 또는 사이토킨 분비의 시점을 다수 측정하므로써 달성되는 단백질성 샘플들과의 T 세포 검사들에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 항원 제시 세포들(APCs) 또는 T 세포들 중 어느 하나 또는 APC들과 T 세포들 모두를 가진 항원을 갖고서 T 세포 에피토프들의 검출을 최적화하기 위하여 배양 시점이 변화하는 T 세포 검사들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 APC들 또는 T 세포들 중 하나 또는 APC들과 T 세포들 모두에 직접 영향을 미치는 면역조절 또는 독성 샘플들을 이용한 T 세포 검사들에 관한 것이다. 본 발명은 의약제들, 알레르기 항원들, 자극제들 또는 사람과 접촉된 기타 물질들에 대한 인간 T 세포 반응들의 측정을 위한 특별한 응용을 가진다.
T 세포 검사는 특히 인간들에서의 항원들 및 기타 샘플들에 대한 T 세포 반응들을 측정하기 위한 효과적인 방법을 제공한다. 그러한 검사들은 혈액 샘플들이 제공자들로부터 얻어져서 혈액 샘플들의 1차 배양들이 그러한 검사들에서 직접 사용되도록 처리되는 "생체 밖(ex vivo)" 검사로 간주된다. 펩티드들과 단백질성 샘플들의 경우, 생체 밖(ex vivo) 인간 T 세포 검사들은 인간에게서 그러한 샘플들의 잠재적 면역원성을 평가하고(Jones 등, J. Interferon Cytokine Res., vol 24 (2004) p560-572), 백신들에 나중에 포함시킬 목적으로 단백질 서열 내에 T 세포 에피토프들을 정의하고, 그리고 면역원성을 피하기 위하여 나중에 제거할 목적으로 단백질 서열 내에 T 세포 에피토프들을 정의하는 것(Jones 등, J. Interferon Cytokine Res., vol 24 (2004) p560-572, 그리고 Jones 등, J. Thromb. Haemost., vol 3(2005) p1-10)을 포함하는 여러가지 목적들들에 대하여 인간 T 세포 에피토프들을 검출하기 위하여 사용되어왔다. 현재의 T 세포 검사 방법들은 광범위하게는 T 세포 반응들의 측정에 앞서 APC들과 T 세포들의 혼합물로서 펩티드 또는 단백질성 샘플들을 배양하는 것 또는 T 세포 반응들의 측정에 앞서 APC들로서 단백질성 샘플들을 배양하고 이후 T 세포들을 첨가하는 것 중 어느 하나를 포함한다. 두 가지 검사 유형들에서, 다수의 혈액 샘플들은 각 개별 펩티드 또는 단백질성 샘플의 병렬 테스팅을 위하여 개별적으로 사용되고, 이후 T 세포 반응들이 하나의 시점에서 통상적으로 측정된다. T 세포 반응들은 전형적으로는 트리티에이티드 티아민(tritiated thymidine (3HTdR))과 같은 방사성 표지의 펄스를 증식한 T 세포들에 결합하는 것("T 세포 증식")에 의하여 또는 활성화된 T 세포들로부터 IL-2와 같은 사이토킨들의 분비("사이토킨 분비")에 의하여 측정된다.
T 세포 에피토프들을 검출하기 위한 현재의 T 세포 검사 방법들은 APC들 또 는 T 세포들 중 하나 또는 APC들과 T 세포들 양자를 억제, 자극하거나 그렇지 않으면 변형하는 면역조절성이거나 혹은 독성의 샘플들로 인한 열악한 민감도 및/또는 간섭 중 하나 또는 양자에 의하여 제한된다. 그것 만으로, 현재의 T 세포 검사 방법들은 어떤 펩티드 및 단백질성 샘플들에서 T 세포 에피토프들의 일부 또는 전부를 검출하지 못할 수도 있고, 펩티드 및 단백질성 샘플들을 포함하는 면역조절성 또는 독성의 샘플들, 유기 분자들을 포함하는 비단백질성의 샘플들, 그리고 제형 자체가 면역조절성 또는 독성일 수 있는 곳에서 단백질성 및 비단백질성의 샘플들의 제형들에 대한 T 세포 반응들의 측정에 적용되지 않을 수도 있다.
민감도와 관련하여, 생체 밖(ex vivo) T 세포 검사들에서 빈약한 민감도의 주요인은 검사 혼합물 내의 인자들과 관련될 수도 있는데, 이 인자들은 검사 배양물 내 세포 유형들 또는 인자들을 포함하는 테스트 항원들에 대한 T 세포 반응들 또는 테스트 항원 또는 테스트 샘플들 자체에 의한 T 세포 반응들을 감소시킨다. 생체 밖(ex vivo) T 세포 검사들에서 빈약한 민감도의 추가적인 요인은 펩티드 또는 단백질성 샘플들 내에서 T 세포 에피토프들에 대한 T 세포 반응들의 운동학에 관련될 수 있는데, 이에 의하여 개개의 T 세포 에피토프들은 다른 시간들에 T 세포 반응들을 유도할 수 있다. 반면에, 하나의 시점이 사용되는 T 세포 증식의 경우, 어떤 샘플들의 추가시 T 세포 증식은 초기에는 빠르지만 이후 상당한 증식 반응이 검출되지 않도록 방사선 표지의 펄스가 추가되는 시점에 감소한다. 반면에, 어떤 다른 샘플들의 추가시 T 세포 증식은 비록 이후의 증식이 상당하더라도 상당한 증식 반응이 검출되지 않도록 방사선 표지의 펄스가 추가되는 시점에서 초기에는 느릴 수도 있다. 반면에, 단일 시점이 사용되는 사이토킨 분비의 경우, 소정 샘플들의 추가시 사이토킨 생성은 초기에 빠를 수도 있지만, 하나의 검사 시점에서 상당한 사이토킨이 검출되지 않도록 이들 사이토킨들은 이후 검사 혼합물 내에서 세포들에 의하여 소비될 수 있다. 반면에, 나중의 사이토킨 분비가 의미있게 되더라도 상당한 증식 반응이 하나의 검사 시점에서 검출되지 않도록 사이토킨 분비는 초기에는 느릴 수도 있다. 증식 또는 사이토킨 분비의 운동학은 다른 혈액 샘플들 간 T 세포 반응들에서의 동종 이인자형 변화, APC들에 의한 흡수와 처리의 효율 및 운동학, 펩티드 또는 단백질성 샘플 내에서 T 세포 에피토프들의 강도 및 주파수, 특정 MHC 클래스 II 동종 이인자형들(allotypes)에 대한 T 세포 에피토프들의 결합 친화성, T 세포 수용체들에 의한 펩티드-MHC 클래스 II 착물들의 인식 효율, 공동자극 세포 표면 분자들의 주파수 및 농도, 공동자극 사이토킨들의 농도, CD8+T 세포들 또는 억제 T 세포들과 같은 검사 혼합물에서 다른 세포들의 자극, 기억 T 세포들의 존재, 그리고 APC들의 표면에 발현된 MHC 클래스 II 분자들 위로 직접 로드(load)하는, 작은 펩티드들과 같은 일부 샘플들의 능력과 같은 인자들의 범위에 의하여 영향을 받을 수도 있다.
면역조절성 또는 독성의 샘플들에 의한 T 세포 검사 간섭과 관련하여, 그러한 샘플들은 APC들, T 세포들, 또는 APC들 및 T 세포들 둘 모두에 의하여 직접 결합되거나 구속될 수 있다. 샘플들에 대한 T 세포 에피토프들 또는 T 세포 반응들이 검출되지 않도록 그러한 샘플들은 APC들 및/또는 T 세포들의 정상적인 면역 기능을 하향 또는 상향 조절할 수 있다. 면역조절 샘플들에 의한 T 세포 검사 간섭의 또 다른 요인은 APC들, T 세포들 또는 APC들과 T 세포들 양자에 대한 독성을 통한다. 면역조절 샘플들에 의한 T 세포 검사 간섭의 다른 요인들은 CD8+T 세포들 또는 억제 T 세포들의 상향 조절과 같은 APC들 또는 T 세포들의 부분집합들의 상향 또는 하향 조절을 포함한다.
특히 인간 의약들과 관련한 응용들의 범위에 대하여 T 세포 검사들을 유용하게 이용하기 위하여, T 세포 에피토프들의 최적 검출을 위하여 더욱 민감한 T 세포 검사 방법들이 필요하고, 또한 면역조절성 또는 독성 샘플들을 갖고서 사용될 수 있는 T 세포 검사들이 필요하다.
본 발명은 부분적으로는 T 세포 검사 혼합물들로부터 조절용 T 세포들의 제거가 테스트 항원들에 대한 헬퍼 T 세포 반응들의 실질적인 증가로 귀결되는 발견에 근거를 두고 있다. 이처럼, 본 발명은 억제 T 세포가 배양물들로부터 제거되어 결국 검사 항원들에 대한 T 세포 반응들의 증가로 귀결되는 곳에서 T 세포 에피토프들의 최적 검출을 위한 새로운 T 세포 검사 방법들을 제공한다. 아울러, 본 발명은 T 세포들 및/또는 APC들을 조절하는 단백질들, 또는 T 세포들 및/또는 APC에 대한 독성 효과를 가지는 단백질들에서 면역원성의 최적 검출을 위한 새로운 T 세포 검사 방법들을 제공한다. 본 발명은 또한 T 세포 수용체를 통하여 직접 하거나 단백질들에게 공유적으로 결합되거나, 혹은 MHC 클래스 II 분자들에 의하여 결속된 펩티드들에게 직접 결합되거나, 혹은 MHC 클래스 II 분자들에게 직접 결합되는 것에 의하여 T 세포들을 자극할 수 있는 비단백질성의 화합물들의 검출에도 적용될 수 있다. 특히, 본 발명은 정상적으로는 효과(effector) T 세포 반응들을 하향 조절하려고 하는 조절 T 세포들이 검사 항원들에 대한 반응들의 측정에 앞서 배양물들로부터 제거되는 방법들을 제공한다. 아울러, 본 발명은 또한 항원들 또는 다른 샘플들을 이용한 배양후 T 세포 반응들의 검출을 위하여 시점들이 최적화되는 다수의 측정 시점들을 가진 방법들을 제공한다.
일측면에서, 본 발명은 테스트 물질에 대한 헬퍼 T 세포 반응을 측정하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
(a) 유기체로부터 얻어진 샘플로부터 항원 제시 세포들 (APCs)과 T 세포들을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 세포들로부터 조절성 T 세포들을 제거(depleting)하는 단계;
(c) 상기 APC들 및 (b) 단계에서 얻어진 조절성 T 세포가 제거된 세포들을 상기 테스트 물질을 이용하여 배양하는 단계; 및
(d) 상기 테스트 물질에 대한 T 세포 반응들을 검사하는 단계를 포함한다.
상기 APC들과 T 세포들은 보통 혈액 샘플로부터 얻어진다. 그러나, 본 발명에서는 편도선, 파이어 판(Peyer's patch), 종양 및 셀 라인(cell lines)로부터 유래된 것들을 포함하는, T 세포들 및/또는 APC들의 다른 소스들이 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 방법은 인간말초혈액단핵세포들(PBMCs)을 이용하여 수행된다.
여기에서 사용된 "제거"라는 용어는 상기 조절성 T 세포들의 일부의 제거를 의미한다. 이는 상기 세포들을 물리적으로 제거하거나 상기 T 세포들의 작용을 억제하거나 조절하므로써 이행될 수 있다. 그리하여, 표적 T 세포들의 활성도가 감소된다. 바람직하게는, 표적 T 세포 활성도의 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%가 상기 제거 공정에 의하여 제거된다.
본 발명의 일부로서, 조절성 T 세포들의 제거 또는 표적화를 위한 방법들의 범위는 CD25 hi에 의한 조절 T 세포들의 제거에 대한 대안들로서 사용될 수도 있다는 사실이 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자에게 이해될 것이다. 또한, 본 발명은 T 세포 검사들에서 조절 T 세포들의 효과들의 조절을 위한 방법들도 포함할 것이라는 사실이 이해될 것이다. 제거 또는 표적화를 위하여, 조절 T 세포들의 표면에 발현된 분자들은 이들 세포들의 제거를 위하여 CD25와 관련하여 혹은 대안들로서 사용될 수도 있다. 그러한 분자들은, 이들에 제한되지는 않지만, GITR, CTLA-4, CD103, CC 케모킨 수용체(chemokine receptor) 4, CD62L, 그리고 CD45RA를 포함할 수 있고, 또한 표면관련 사이토킨들 또는 IL-10과 TGFβ와 같은 표면 형태들을 포함할 수도 있다. 제거는 조절 T 세포들을 고상 위로 흡착하기 위하여, 혹은 그러한 조절 T 세포들의 파괴 또는 억제를 일으키거나, 그렇지 않으면 조절 T 세포들을 T 세포 검사들을 위하여 다른 T 세포들로부터 분리하도록 특정 항체들에게 결합하는 것을 포함하는 몇몇 방법들에 의하여 달성될 수도 있다. 조절을 위하여, 조절 T 세포들에 의하여 분비된 분자들은 그러한 분비가 방지되거나 분비후 차단/저해/파괴될 수 있다. 그러한 분자들은 IL-10, IL-4, IL-5 그리고 TGFβ와 같은 사이토킨들을 포함할 수 있고 그러한 분자들은, 예를 들어, 항체들 또는 가용성 수용체들과 같은 분자들에게 결합되는 유기 또는 무기 분자들을 이용하거나, 혹은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 또는 조절 T 세포들로 전달되거나 그러한 세포들 내에서 유도된 다른 핵산들과 같은 저해성 핵산들에 의하여 차단될 수도 있다. 조절성 T 세포 활성도의 조절은 이들 세포들의 억제 기능을 깨뜨리는 그러한 방법으로 이들에 제한되지는 않지만, GITR, CTLA-4, CD103, CC 케모킨 수용체 4, CD62L 그리고 CD45RA를 포함하는 조절 T 세포들 위의 표적 수용체들 또는 다른 표면 분자들에 의하여 달성될 수도 있다. 그러한 기능 저해는 예를 들어, 작용제 기능을 가진 특정 항체들 또는 조절 T 세포들이 제거되지 않지만 비기능성이 되도록 리간드-표적 상호작용들을 차단할 수 있는 특정 항체들에 의하여 달성될 수 있다.
조절 T 세포 활성도의 조절은 조절 T 세포들에 의하여 분비된 분자들의 표적 수용체들을 차단하거나 분비된 분자들에 의하여 활성화되거나 하향 조절된 경로들을 차단하므로써 달성될 수도 있다. 조절을 위하여, 조절 T 세포들은 직접, 예를 들어, foxp3과 같은 전사 인자들을 차단하거나 조절 T 세포들과 관련된 다른 기능들 또는 경로들을 차단하므로써 달성될 수 있다. 그러한 저해 또는 차단은 유기 또는 무기 분자들에 의하여, 또는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 조절 T 세포들로 전달되거나 그러한 세포들 내에서 유도된 다른 핵산들과 같은 저해성 핵산들에 의하여 차단될 수도 있다. 조절 T 세포들의 작용을 저해하거나 그렇지 않으면 조절하기 위하여 유기, 무기 또는 핵산 분자들이 사용되는 경우, 그러한 분자들 자체들이 T 세포 검사들과 간섭하는 모든 경우들에 있어서, 그러한 분자들은 바람직하게는 그러한 검사들로부터 제거되거나 그러한 검사들과 간섭하지 않는 형태로 변형될 것이다. 예를 들어, 조절 T 세포들에 의하여 분비된 분자들을 제거하기 위하여 사용된 특정 항체들 또는 단백질들은 T 세포 검사들에 앞서 선택적으로 제거되거나 T 세포 검사들과 간섭하지 않는 특정 형태로 사용될 것이다. 예를 들어, 인간 T 세포 검사들을 위하여, 항체 또는 단백질의 인간 형태는 항체 또는 단백질 자체에 대한 T 세포 반응들을 피하기 위하여 사용될 것이다.
T 세포들 및/또는 APC들(전형적으로는 단백질들 또는 펩티드들이지만 또한 비단백질성 화합물들)을 조절하지 않는 테스트 항체들로 하는 본 발명의 T 세포 검사들에서, 주요한 단계들은 다음과 같다:
(1) PBMC들이 인간 혈액 샘플들로부터 분리된다
(2) 선택적으로 CD8+ T 세포들이 제거된다
(3) CD25hi+ T 세포들이 제거된다
(4) 하나 이상의 농도에서 시험 항원들을 이용하여 배양체들이 배양되고 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 분비를 위하여 하나 이상의 시점들에서 시험된다.
테스트 항원들이 T 세포들 및/또는 APC들을 조절하는 본 발명의 T 세포 검사들에서 주요한 단계들은 다음과 같다;
(1) PBMC들이 인간 혈액 샘플들로부터 분리된다
(2) 전형적으로는, 플라스틱(plastic)에게 점착하는 것에 의하여 APC들이 분리되고, APC들은 사이토킨들을 이용하여 분화하도록 유도되고, 상기 테스트 항원이 상기 APC들에게 첨가된다
(3) CD25hi+ T 세포들 그리고 선택적으로는 CD8+ T 세포들의 이전 제거에 의하여 처리된 자가 PBMC들이 상기 APC들과 혼합된다
(4) 하나 이상의 농도에서 시험 항원들을 이용하여 배양체들이 배양되고 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 분비를 위하여 하나 이상의 시점들에서 시험된다.
상기 시험 물질들이 펩티드들 또는 단백질성 샘플들이거나 APC들 또는 T 세포들에 대하여 면역조절성이 아니거나 독성이 아닌 비단백질성 샘플들이면, 혈액은 (단핵세포들 및 수지상 세포들의 형태로) CD4+ T 세포 및 APC들의 소스로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 공여자(donor)들의 코호트(cohort)는 전세상 인구 또는 연구 대상인 인구에서 발현되는 HLA-DR 동종 이인자형들의 수와 횟수를 가장 잘 나타내기 위하여 선택된다. 코호트(cohort)에서 발현되는 동종 이인자형들은 전형적으로는 주요 HLA-DR 대립형질들(전세계 인구에서 발현되는 >5% 횟수를 가진 개별적 동종 이인자형들)이 잘 나타나는 인구에서 발현되는 대상들의 >80%이다. 대안적으로, 코호트에서 발현되는 동종 이인자형들은 연구중인 특별한 질병과 관련되는 것으로 생각되는 HLA 동종 이인자형들을 과도하게 나타내거나 포함하도록 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, PBMC들은 밀도 기울기들에 대한 단편화에 의하여 혈액 샘플들로부터 준비되고 이후 나머지 PBMC가 주로 CD4+ T 세포들(~70%)과 APC들(단핵세포 10-20%와 수지상 세포 1-3%)을 포함하도록 CD8+ T 세포들과 CD25hi T 세포들이 감소되었다. CD8+ 그리고 CD25hi T 세포들이 감소된 PBMC가 세포 배양체에 구축되고 하나 이상의 펩티드들 또는 단백질성 샘플들 또는 비단백질성 샘플들이 첨가되고 배양체들이 배양된다.
이후 T 세포 반응들의 측정이 하나의 고정 시점 또는 다수 시점들에서 이행될 수 있다. 이들 시점들은 유사 샘플들 또는 최적화 물질에 대한 T 세포 반응들의 운동학을 측정하므로써 미리 결정될 수 있다.
검사를 위한 최적 조건들은 최적화 물질을 이용하므로써 판단될 수 있다. 여기에서 사용된 "최적화 물질"은 시험될 샘플들과 유사한 크기 및 구조로 이루어지거나 시험 물질과 유사한 성질들을 가진, 개별적 면역조절성/독성의 펩티드들/전체 단백질들과 같이, T 세포 반응들을 유도하는 것으로 알려진 화합물이다. 펩티드들 또는 단백질성 샘플들 또는 비단백질성 샘플들의 경우, 시험될 샘플들과 유사한 크기 및 구조로 된 하나 이상의 펩티드들(전형적으로는 길이가 9-40 아미노 산들) 또는 전체 단백질들 또는 비단백질성 화합물들이 최적화 물질로서 사용될 수 있다. 최적화 물질들은 검사되고 결과들은 전형적인 T 세포 반응들의 운동학을 정의하기 위하여 사용된다. 예를 들어, T 세포 반응들은 다양한 시점들, 가장 일반적으로는 하나 이상의 다른 선택적 검사들의 범위를 이용하여 샘플을 첨가한 후 4일과 9일 사이에 측정된다. 최적화 물질에 대한 T 세포 반응들의 운동학들이 구축되면, 임의 집합의 검사 시점들이 후속의 샘플 테스팅을 위하여 정의될 수 있다. 이러한 방법으로, 테스트 샘플들에 대한 T 세포 반응들은 하나 이상의 적절한 시점들에서 검사될 수 있다. 선택적으로, 또는 아울러, 둘 이상의 농도들이 최적화 물질에 대한 T 세포 반응들의 운동학들을 구축하기 위하여 사용될 수 있고, 이후 샘플들은 이들 농도들에서 시험될 수 있다.
T 세포 반응들은 3HTdR(또는 T 세포들을 증식하므로써 흡수된 다른 방사선의, 형광성 또는 화학발광 화합물들)의 펄스의 결합, IL-2 또는 IFNγ와 같은 사이토킨들의 분비, 활성화 마커 mRNA의 전사를 증가시킨 mRNA 전사 변화들, Ca2+ 플럭스, 그리고 표현형 마커, 특히 활성화된 T 세포들을 위한 마커들의 변화와 같은 수많은 다른 검사들을 이용하여 측정될 수 있다. 전형적으로, 펩티드들 또는 단백질성 샘플들의 경우, T 세포 반응들은 샘플의 첨가후 5, 6, 7, 그리고 8일째에 3HTdR의 펄스의 결합에 의하여 또는 샘플의 첨가후 8일째에 사이토킨(특히 IL-2) 분비의 측정에 의하여(또는 3HTdR 결합 및 사이토킨 분비 측정 양자에 의하여) 측정될 것이다. 대안적으로, 높은 중첩 서열들(예를 들어, 12 아미노산 중첩들을 가진 단백질 서열로부터 15 mers)을 가진 펩티드들의 경우, 3HTdR의 펄스의 결합 및/또는 테스트 펩티드의 첨가후 단일 시점, 전형적으로는 7일째에 사이토킨 분비의 측정이 사용될 수 있다. 인접한 중첩 펩티드들은 T 세포 에피토프 검출을 위한 민감도를 함께 향상시키는 T 세포 에피토프들을 포함할 것 같다.
펩티드 또는 단백질성 샘플들이 APC들 또는 T 세포들에 대하여 면역조절성이거나 독성이면, 유기체로부터 얻어진 샘플은 처리되고 상기 APC들은 다른 세포들로부터 분리된다. 이는 전형적으로는 플라스틱에 대한 점착에 의하여 수행되고, 펩티드 또는 단백질성 샘플은 이후 이들 APC들을 이용하여 배양된다. APC들은 인터루킨(interleukin) 4, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨 1 알파와 같은 사이토킨들에 의하여 배양되어 성체의 APC 표현형(phenotype)을 유도할 수 있다. 사전 분류된 APC들을 이용한 표준 T 세포 검사들에서 샘플들은 보통 48 시간에 이르는 APC 배양 시간을 갖는 샘플을 요구할 것이다. 바람직하게는, 반성숙된 APC는 4일에 이르는 동안 인터루킨 4와 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함하는 성장 배지에서 배양에 의하여 생성된다. 면역조절성 또는 독성 샘플들을 포함하는 샘플들은 이후 반성숙된 APC에 첨가되어 단시간 동안 배양된다. 샘플의 독성 또는 면역조절 기능에 따라서, 반성숙 APC를 이용한 배양 시간들은 3 내지 10시간의 범위일 수 있다. 다음 샘플: APC 배양, 외인성 샘플은 반성숙 APC의 반복된 세정에 의하여 제거된다. 성숙 샘플이 펄스화된 APC들은 이후 종양 괴사 인자 또는 인터루킨 1 또는 CD40 리간드 또는 지질다당류(lipopolysaccharide)와 같은 전구성 염증(pro-inflammatory) 자극을 이용한 배양에 의하여 생성된다. 자가이식 T 세포들이 첨가되는데, 전형적으로는, CD4+ CD8- CD25 hi 제거된 T 세포들이 위에서처럼 PBMC들로부터 성숙한 샘플이 펄스화된 APC로 조제된다. CD4+ CD8- CD25 hi 제거된 T 세포들은 추가적인 배양 시점들의 범위 동안 성숙한 샘플이 펄스화된 APC들을 이용하여 배양된다. 위에서 설명된 것과 같은 최적화 물질은 다른 APC 배양 시점들 및/또는 다른 T 세포 배양 시점들을 이용하여 반응들의 운동학들을 구축하기 위하여 사용될 수 있다. 최적화 물질을 이용하여 얻어진 결과들은 샘플들의 차후 테스팅을 위하여 APC 배양 및/또는 T 세포 배양 시점들의 임의 집합을 정의하기 위하여 사용될 수 있다. 이런 식으로, 테스트 샘플들에 대한 T 세포 반응들은 하나 이상의 검사 시점들에서 검출된다. 선택적으로, 혹은 아울러, 둘 이상의 농도들이 최적화 물질에 대한 T 세포 반응들의 운동학들을 구축하기 위하여 사용될 수 있고 샘플들은 이후 이들 농도들에서 시험될 수 있다.
시험될 샘플이 비단백질성이면, 위의 방법들(즉, 면역조절성 또는 독성을 갖거나 갖지 않는 펩티드 또는 단백질성 샘플들에 대한 방법들) 중 어느 하나는 APC들, T 세포들 또는 양자에 대하여 비단백질성 샘플이 면역조절성인지 독성인지 여부에 따라서 사용될 수 있다.
APC들, T 세포들 또는 양자에 대하여 면역조절성인 단백질성 또는 비단백질성의 샘플들의 경우, 선택적인 추가적 단계는, 예를 들어, T 세포 활성화 또는 APC 분화의 표현형 마커들의 상향 또는 하향 조절을 직접 시험하기 위한 것이다. T 세포 활성화의 전형적인 마커들은 CD69, CD25, CTLA4, GITR의 발현 그리고 세포내 Ca2+ 플럭스에서의 변화들을 포함한다. APC 분화를 평가하기 위하여 사용되는 일반적인 표현형 마커들은 MHC 클래스 II, CD80 그리고 CD86을 포함하는데, 이들 모두는 성숙한 APC들에서 잘 발현된다. 이들 추가적 단계들은 테스트 샘플들에 대한 T 세포 반응들을 선택적으로 테스트하기 위한 검사 시점들을 정의하는 것을 돕는 테스트 샘플들에 대한 T 세포 반응들의 운동학들에 대한 정보를 제공한다.
본 발명의 새로운 생체 밖(ex vivo) T 세포 검사 방법들은 특히 인간에게 사용하기 위한 의료제들과 관련한 응용 범위를 가진다. 의료제들로서의 장래의 사용을 위한 단백질들의 경우, 본 발명의 T 세포 검사들은 단백질 서열로부터 중첩 펩티드들을 테스트하므로써 단백질 서열 내에서 T 세포 에피토프들을 식별하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 T 세포 에피토프들의 위치와 세기는 이후 인간에게서 단백질의 잠재적인 면역성의 평가를 위하여 사용될 수 있다. 선택적으로, 단백질 내에서 T 세포 에피토프들은 인간에게 사용하기에 앞서 나중에 단백질 서열의 변형에 의하여 제거될 수 있다. 소정 단백질들 내 T 세포 에피토프들은 또한 본 발명의 방법들에 의하여 식별될 수 있고 이후 단백질 백신 내 T 세포 에피토프 서열(또는 그의 변형체)을 포함하는 것에 의하거나 또는 백신의 일부로서 다른 성분들에게 첨가를 위하여 백신들에게 결합될 수도 있다.
본 발명의 새로운 T 세포 검사들은 펩티드들, 단백질들, 그리고 유기 분자들, 지질들, 탄수화물들을 포함하는 비단백질들을 포함하는 분자들 또는 콘쥬게이트들(conjugates), 혼합물들 및 제제들을 포함하는 둘 이상의 다른 모이어티들(moieties)로 구성되는 분자들의 유형들의 범위의 잠재적 면역성의 평가를 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 검사들은 의료제들의 연구, 개발, 제조 및 임상 실험들에서 광범위한 응용들을 가진다. 예를 들어, 연구에서, 활성 분자들의 다른 유사체들에 대한 T 세포 반응들이 인간에게서 이들 유사체들의 잠재적 면역성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이처럼, 그러한 T 세포 반응들은 추가적인 개발을 위한 리드 의료제들의 선택을 위한 기준들로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 개발에 있어서, 동일 분자의 다른 제제들에 대한 T 세포 반응들은 인간에게서 이들 제제들의 잠재적 면역성을 평가하기 위하여 판단될 수 있다. 그러므로, 그러한 T 세포 반응들은 임상 시험들을 위한 최적의 제제의 선택을 위한 기준으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제조에서, 동일한 분자의 제조 배치들(batches)에 대한 T 세포 반응들은 이들 배치들의 잠재적인 면역성을 평가하고 또한 배치들 간 분자의 임의 변화들을 평가하기 위하여 판단될 수 있다. 예를 들어, 임상 시험에서, T 세포 반응들은, 예를 들어, 의료적으로 겪는 시험에 대한 면역성을 평가하기 위하여 환자의 혈액을 이용하여 판단될 수 있다. 본 발명의 T 세포 평가들은 또한 임상 시험들에서 의료제에 대한 T 세포 반응들의 어떤 MHC 제한을 판단하기 위하여 사용될 수 있다.
T 세포 에피토프들의 검출에서 사용하기 위한 대안으로서, 본 발명의 T 세포 검사 방법들은, 바람직하게는 인간에게 사용하기 위한 의료제들에 대한 잠재적인 부작용들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 부작용들은 과민반응, 알러지, 짜증, 면역억제, 과면역 자극 그리고 주사부위 반응들을 포함한다. 본 발명의 T 세포 평가 방법들은 또한 이식과 같은 비약물적인 치료들, 꽃가루 알러지 항원들과 같은 환경적 물질들, 식료품들, 화장품들, 그리고 세제 및 효소들과 같이 산업 생산된 범위의 제제들에 대한 잠재적인 부작용들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 T 세포 검사 방법들에서 소정 범위의 변화들이 이용될 수 있지만, 이들 변화들은, 예를 들어, T 세포 반응들의 분석에서 다수의 평가 시점들을 이용하므로써 본 발명의 범주 내에 해당할 것이라는 사실을 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 이해할 것이다. 예를 들어, 이러한 범주 내에서 T 세포 반응을 향한 개별적인 단계들을 판단하는 MHC-펩티드 결합과 같은 방법들을 포함하는 T 세포 반응들의 분석을 위하여 이 기술에서 공지된 소정 범위의 다른 방법들이 있다는 사실을 이해할 것이다. 위에서 설명된 것처럼, T 세포들 및 APC들을 단편화하기 위한 대안으로서, 본 발명의 T 세포 검사들에서의 사용을 위하여 다른 세포들이 단편화될 수도 있다. T 세포 검사들은 랑게르한(Langerhan) 세포들, 다른 대식세포 하부집합들 또는 APC들의 다른 하부 집합들에 대하여 풍부하게 된 APC들을 이용하여, 그리고/또는 T 세포들의 다른 하부집합들을 이용하거나 풍부하게 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 민감도를 향상시키거나 특정 APC들 또는 T 세포들을 하향 또는 상향 조절하기 위하여 사이토킨들이 본 발명의 T 세포 검사들의 검사 혼합물들에게 첨가(또는 검사 혼합물들로부터 제거)될 수 있었을 것이라는 사실도 이해될 것이다. T 세포 검사들의 다른 포맷들, 예를 들어, T 세포들이 단백질 또는 펩티드의 APC 제공에 의하여 준비되고 이후 동일 또는 관련 단백질 또는 펩티드에 의하여 다시 도전받는 리콜(recall) 검사 포맷들이 사용될 수 있다.
다음의 예들은 본 발명을 설명하기 위하여 제공되지만 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
예 1: T 세포 반응들에 대한 CD25 + T 세포 제거의 효과
건강한 공동체 사회에서 살고있는 공여자의 담황막-국립 수혈 서비스(National Blood Transfusion Service) (영국 케임브리지의 아덴브룩(Addenbrooke) 병원)로부터 얻었고 아덴브룩의 병원 지역 연구 윤리 위원회(Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee)가 허가한 승인에 따라서 얻은-으로부터(24시간 이내에 추출된 혈액으로부터) 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 분리하였다. 피콜(Ficoll) (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK) 밀도 원심분리를 이용하여 PBMC를 담황막들로부터 분리하였고 CD8+ RossetteSepTM (캐나다, 뱅쿠버에 있는 줄기세포 기술)을 이용하여 CD8+ T 세포들을 제거하였다. 공여자들은 AllsetTM SSP-PCR을 기본으로 하는 티슈-타이핑 키트(tissue-typing kit)(Dynal, Wirral, UK)를 이용하여 HLA-DR 할로타입(halotypes)을 식별하고 인플루엔자 HA(C32, aa307-319)로부터 대조 항원 키이홀 림펫 해모시아닌(Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH)) (Pierce, Cramlington, UK), 파산풍 변독소(Tetanus Toxoid) (Aventis Pasteur, Lyon, France) 그리고 대조 펩티드 에피토프에 대한 T 세포 반응들을 판단하는 것을 특징으로 한다.
공급자의 표준 프로토콜과 자석을 이용한 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech) (Guildford, UK)사의 안티-CD25 미소구들을 이용하여 CD25 hi T 세포 제거를 수행하였다. 공여자 마다 10개의 비알들(vials)을 해동하였고 30mls 2% 불활성화된 인간 혈청/PBS (Autogen Bioclear, Calne, Wiltshire, UK)에서 재부유하였다. 나머지 세포들을 전체 PBMC들로서 유지되도록 하면서 5×107개의 세포들을 3×15 ml 튜브들에 옮겼다. 300 ㎕의 비드(beads) + 4200 ㎕의 분리 완충액 (0.5% 인간 혈청/2mM EDTA/PBS)를 이용하여 안티-CD25 미소구 희석 혼합물을 만들었다. 15 ml 튜브들을 원심분리하였고 500 ㎕의 미소구 희석 혼합물에서 재부유하였다. 이후 컬럼 위에 분리하기에 앞서 튜브들을 4 ℃에서 5, 10 또는 20분 동안 유지하였다. 스탠드 위에 지지되는 자석에 컬럼을 두고서, 2 mls 분리 완충액을 컬럼에 첨가하고 이 완충액을 구멍을 통하여 떨어지도록 하여 컬럼들을 설치하였다. 비드들을 이용한 배양후 10 ml 분리 완충액을 첨가하였고 튜브들을 1500 rpm으로 7분 동안 원심분리하였다. 이후 세포들을 500 ㎕의 분리 완충액에 재부유하였고 컬럼에 첨가한 다음 분리 완충액을 이용하여 2×1 ml 세정하였다. 컬럼을 통하여 흘러 나온 액을 15 ml 튜브들에 모았는데, 이 액은 CD25 hi T 세포가 제거된 단편을 포함하였다. 이들 세포들을 1500 rpm에서 7분 동안 스핀다운하였고 카운팅에 앞서 3 ml AIMV 배지(Invitrogen, Paisley, UK)에서 재부유하였다.
CD4와 CD25 세포들에 대한 염색을 수행하였고 FACS로 세포수를 검출하였다. 각 세포 개체수들 중 5-10×105개의 세포들을 96-웰(well)의 U자형 바닥을 가진 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) 중 하나의 웰에 두었다. 상기 플레이트를 1200 rpm에서 4분 동안 스핀 다운하였다. 상청액을 버리고 세포들을 50 ㎕ 항체 희석액에 재부유하였다. 항체 희석액은 FITC-표식의 안티-CD25 항체(R&D Systems, Minneapolis, USA)의 1/50 희석액 + FACS 완충액(1% 인간 혈청/0.01% 소듐 아지드(Sodium azid)/PBS) 내 PE-표식의 안티-CD25 항체(R&D Systems, Minneapolis, USA)의 1/25 희석액으로 구성된다. 대조 웰들은 염색되지 않거나, 아 이소타입(isotype) 대조들로 염색되거나, 하나가 표식 항체로 염색된다.
플레이트들을 어두운 곳에서 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 이후 플레이트들을 1200 rpm으로 30분 동안 스핀다운하였다. 상청액을 걷어내었고 세포들을 200 ㎕ FACS 완충액에 재부유하였다. 이 동작을 2회 반복한 후 세포들을 FACS 튜브들로 옮겼다. 세포들을 FACS 칼리부 분석기(FACS Calibur) (Becton Dickinson, Oxford, UK)에 통과시켜서 데이터를 수집하였고 크기, 과립형 및 형광태그들을 근거로 분석하였다.
증식 검사들은 다음과 같이 수행되었다. CD8+ T 세포가 제거된 PBMC와 CD8+ CD25 hi가 제거된 PBMC를 100 ㎕의 AIMV에 웰당 2×105개체수 첨가하였다. 바닥이 평평한 96 웰 플레이트들을 이용하여, 각 테스트 조건에 대하여 3중 배양들을 구축하였다. 각각에 대하여 펩티드 100 ㎕를 세포 배양체들에게 첨가하여 5 μM의 최종 농도로 만들었다. 각 웰을 18시간 동안 1mCi/ml 3HTdR (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK)로 펄스처리하기 전에, 세포들을 펩티드들과 단백질 항원들을 이용하여 7일간 배양하였다.
증식 검사를 위하여, 2 (SI≥2) 이상의 자극 지수에 해당하는 임계치를 사용하였고, 그리하여 이 임계치를 넘는 증식 반응들을 유도하는 펩티드들을 포지티브(positive)로 간주하였다. 모든 데이터를 분석하여 일원 언페어드 스튜던트(unpaired Student's) T 테스트를 이용하여 변이계수(CV), 표준편차(SD) 그리고 중요도(p<0.05)를 판단하였다. SI≥2를 갖는 모든 반응들은 처치받지 않은 배지 대조군들과는 많이 달랐다(p<0.05).
일련의 경계 또는 약한 T 세포 에피토프들 (펩티드들 1(PGQTATITCSGHALG), 2(GDKFVSWYQQGSGQS), 6(IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY), 9(QSISNWLNWYQQKPG), 13(KGLEWLVVIWSDGSS), 17(AASGFTFSSFGMSWV), 20(DTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQV), 24(HQSLVIKLMPNITLL))에 대하여, 한 쌍의 강한 T 세포 에피토프들(펩티드들 25(PKYRNMQPLNSLKIAT) 그리고 26(TVFYNIPPMPL))에 대하여, 그리고 KLH 항원에 대하여 세 명의 인간 공여자(475, 440, 462)로부터 PBMC들에서 T 세포 증식 반응을 나타내는 결과들을 도 1에 도시하였다. 이 결과들은 CD25hi T 세포들의 제거후 모든 펩티드들에 대하여 T 세포 반응들의 증가를 보여준다. CD25hi T 세포들을 10분 또는 20분간 제거한 다음 모든 펩티드들에 대하여 최대 반응들을 판단하였다. 이들 결과들은 펩티드 1과 2와 같은 펩티드들의 예에서, T 세포 반응들에 대하여 앞서 기록된 경계를 갖거나 네거티브(negative)인 펩티드들에서 T 세포 에피토프들의 검출을 허용하였던, CD25 hi T 세포 제거후 T 세포 반응들에서 강한 증가를 보여주었다.
예 2-시간별 펩티드 T 세포 검사들
인간 sTNFR1 서열로부터 유래된 와일드 타입(Wild type(WT))과 T 세포 에피토프가 제거된 펩티드들(HLRHCLSCSKCRKEM 및 HARHCLSCSKCRKEM)을 합성하였고(Prescan Systems, Leystad, Netherlands), 20명의 건강한 공여자들로부터 T 세포 반응들을 자극하는 능력에 대하여 sTNFR-1로부터 유도된 펩티드들을 비교하기 위하여 CD8+ CD25 hi T 세포가 제거된 PBMC가 사용되었던 예 1의 방법을 이용하여 시험하였다. AIM V 배지에 1 ml의 2-4×106/ml CD8+ CD25 hi T 세포가 제거된 PBMC를 24 웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 각 웰에 첨가하므로써 벌크 배양체를 만들었다. 1 ml 10 μM 펩티드를 각 벌크 배양체(벌크 배양체당 2ml에 대하여 5μM의 최종 농도)에 첨가하므로써 각 공여자에 대하여 분리하여 각 펩티드를 테스트하였다. 비교를 위하여, 미처리되고 포지티브(KLH) 대조군들에 대하여 추가적인 벌크 배양체들을 만들었다. (T 블래스트들의) 복제 샘플들을 6-9일들째에 벌크 배양체들로부터 제거하였고 96 라운드 플레이트들에서 증식을 평가하였다. 자극후 6, 7, 8 그리고 9일째에 각 펩티드에 대한 T 세포 반응들의 크기와 운동학을 평가하기 위하여 데이터를 사용하였다. 아울러, 배양 8일후 IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사를 이용한 TNFR1 펩티드들로서 IL-2 생성에 대하여 시간별 증식 검사에서 사용된 동일한 20명의 건강한 공여자들을 테스트하였다. 엘리스폿(Elispot) 플레이트들을 70% 에탄올로 미리 적신 다음 IL-2 캡쳐(capture) 항체 (R&D systems, Minneapolis, USA)로 4 ℃에서 밤새도록 코팅하였다. PBS(Invitrogen, Paisley, UK)로 플레이트들을 2회 세정한 후 상온에서 2시간 동안 1% BSA/PBS에서 블록(block)하였다. CD8+ CD25 hi T 세포가 제거된 PBMC의 첨가에 앞서 5 μM의 최종 농도, 웰당 4×105 세포들과 테스트 샘플들에서 상기 플레이트들을 PBS에서 세척하였다. 37 ℃/5% CO2에서 7일후, 플레이트들을 현상하였다. 처음에는 물로, 다음에는 PBS로 세척한 후, PBS/1% BSA에서 IL-2 검출 항체(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 37 ℃에서 2시간 동안 첨가하였다. PBS로 추가로 세척한 후, 스트렙타바딘(streptavadin)-AP (R&D Systems, Minneapolis, USA)를 1.5 시간 동안 첨가하고, 플레이트들을 다시 세척한 후 BCIP/NBT 크로마젠(chromagen)(R&D systems, Minneapolis, USA)을 30분 동안 첨가하였다. 플레이트들을 물로 세척하고, 건조한 후 면역점 엘리스폿 분석기(Immunospot Elispot analyzer), 소프트웨어 버젼 3 (Cleveland, Ohio, USA)을 이용하여 스폿 카운트를 분석하였다.
T 세포 증식과 IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사들 양자에 대하여, 2의 SI 임계치(점선)를 초과하고 백그라운드(*)와는 상당히 다른(p<0.05) 반응들은 포지티브로 간주하였다. 도 2에 도시된 결과들은 이 펩티드가 T 세포 에피토프를 가리키는 증식 및 IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사 양자에서 동일한 3명의 인간 공여자(3, 8, 11)에서 WT 펩티드가 반응들을 주었다는 것을 나타낸다. 이들 3명의 공여자들에 대하여, 펩티드 첨가후 7일째에 최대 증식 반응들이 검출되었고, 각 경우에 증식 반응들이 펩티드 첨가후 8 또는 9일째에 측정되었다면 WT TNFR1 펩티드는 T 세포 에피토프로서 네거티브로 기록되었을 것이라는 것을 나타낸다. 이들 결과들은 또한 증식과 IL-2 엘리스폿(Elispot)에 의하여 측정된 T 세포 반응들 사이에 강한 상호관련성을 보여준다.
예 3-시간별 전체 단백질 T 세포 검사들
에피토프가 제거된 단백질이 I10Q, T20R, H23P, L56A, L108T, L110H 및 L149D의 변형들을 갖는 WO/2004/113387에서 설명된 것처럼, 와일드 타입(WT) 및 변종 T 세포 에피토프가 제거된 인간 sTNFR1 단백질들을 인간 Fc 융합 단백질로서 준비하였다. 1 ml의 sTNFR1 단백질들이 10 μg/ml의 최종 농도에 첨가된 것을 제외하고 예 2에서처럼 증식 및 IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사들을 수행하였다. 도 3에 도시된 데이터는, 증식 검사에 대하여, WT에 대한 공여자 13과 17에서 상당한 T 세포 반응들이 검출되었지만, 변종 T 세포 에피토프가 제거된 단백질에 대해서는 검출되지 않았다는 것을 보여준다. 8일째와 9일째에 피크 반응들을 관찰하였고 6일째에는 공여자 13과 17 둘 모두 상당한 반응을 보이지 않았다. IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사의 경우, 공여자 13과 17 둘 모두는 WT에 대한 T 세포 반응들에 대하여 다시 포지티브였지만, 변종 에피토프가 제거된 단백질에 대해서는 그렇지 않았다. 아울러, 공여자 4는 이 검사에서 WT 단백질에 대한 상당한 반응을 보였다. 예 2에 있어서처럼, 이 결과들은 이 경우에서 모든 단백질들에 대하여 T 세포 반응들을 검출할 때 시간별 검사의 유용성을 추가로 보여준다. 예 2에 있어서처럼, 이 결과들은 증식과 IL-2 엘리스폿(Elispot)에 의하여 측정된 T 세포 반응들 사이에 좋은 상관관계를 보여준다.
예 4-시간별 면역조절 단백질 T 세포 검사들
본 예는 HLA-G(Mitsdoerffer M 등, J Neuroimmunol. 2005 159:155-64) 그리고 B7-1H(Schreiner B 등 J Neuroimmunol. 2004 155:172-82)와 같은 수지상 세포들에 대한 억제 분자들을 상향조절하는 것으로 알려진 면역조절 단백질, 인간 인터페론 베타에 대한 T 세포 반응들을 측정하기 위하여 사용될 때의 본 발명을 설명한다. IFN 베타의 서열에 존재하는 선형 T 세포 에피토프들이 T 세포들을 생체외 자극할 수 있는지를 테스트하기 위하여, 항원을 단핵세포 유래 수지상 세포들로 로딩하기 위한 변형된 방법이 개발되었는데, 여기서 수지상 세포들(DC)과 CD4+ T 세포들 양자에 대한 IFN 베타의 생물학적 효과들이 최소화되었다.
단핵세포들을 조직 배양 플라스틱(>90% CD14+)에 부착되어 PBMC로부터 분리하였고 웰(24 웰 플레이트)당 1×106의 근사밀도에서 AIM V 배지의 24 웰 플레이트들에서 5% 열로 불활성화한 인간 AB 혈청(Autogen Bioclear, Calne, Wiltshire, UK)으로 배양하였다. 인간 IL-4(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)와 GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)를 함유한 성장 배지에서 단핵세포들을 3일 동안 배양하였다. 3일째에 44 μg/ml의 베타페론(Schering AG, Berlin, Germany)을 0.5 ml 테스트 완충액 + 3% 열로 불활성화된 인간 AB 혈청 그리고 25 mM(최종 농도) HEPES pH 8에 첨가하였다. 50 μg/ml KLH를 함유하는 대조 웰들 또는 항원이 없는(미처치된 세포들) 대조 웰들을 1 ml PBS+0.01% Tween 20 + 3% 열로 불활성화된 인간 AB 혈청(표준 완충액)에서 배양하였다. 외인성 IFN 베타를 제거하기 위하여 DC들을 6회 세척후 항원으로 DC를 6시간동안 배양하였다. 이후 TNF 알파(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), GM-CSF 그리고 IL-4를 포함하는 성장배지에서 세포들을 밤새 재부유시켰다.
4일째에, 자가이식의 CD8+ CD25 hi가 제거된 CD4+ T 세포들을 PBMC(Dynal Human CD4+ Negative Isolation Kit, Wirral, UK)로부터 네거티브 선택으로 분리하였고 이후 증식과 엘리스폿(Elispot) 플레이트들 모두에서 웰당 1×105 개체수로 DC들에 첨가하였다. (예 2에서처럼) 현상에 앞서 엘리스폿(Elispot) 플레이트들을 6일 동안 배양하였고 3HTdR의 결합(1μCi/well로 6시간 펄스)으로 증식을 측정하기 전에 증식 플레이트들을 7일 동안 배양하였다.
예 2에 있어서처럼, 증식 및 엘리스폿(Elispot) 검사들을 위하여, 2 이상의 자극 지수의 실험적 임계치를 선택하였는데, 여기서 이 임계치 이상의 반응들은 포지티브로 간주되었다. 반응들이 미처치 대조군(*)과 상당히 다른지(p<0.05)를 판단하기 위하여 추가적인 통계 분석을 또한 수행하였다. 검사내(intra-assay) 변화 정도를 판단하는 추가적인 분석은 변이 계수(CV)를 포함하였다.
도 4에 도시된 것처럼, 이 결과들은 증식 검사에 대하여 29명의 공여자들 중 4명에서 그리고 IL-2 엘리스폿(Elispot) 검사에 대하여 29명의 공여자들 중 동일한 4명에서 상당한 T 세포 반응들을 나타낸다. 이 데이터는 T 세포 반응들이 심지어는 면역조절성 단백질을 이용하여 재현성있게 나타날 수 있다는 것을 보여준다.
예 5-시간별 작은 분자 T 세포 검사들
건강한 공여자들의 패널에서 T 세포 반응들을 자극하는 능력을 위하여 카르바마제핀(Carbamazepine (Novartis Pharmaceuticals UK))과 N-아세틸 이미노스틸벤(iminostilbene)(Ying 등에 따라서 합성된 카르바마제핀의 유사체, Journal of Allergy and Clinical Immunology 2006; 118:233-241)을 비교하였다. 예 2의 방법에 따라서 각 공여자를 위한 별도의 벌크 배양체들에서 25 μg/ml으로 양 화합물들을 테스트하였다. 간략하게, 24웰 플레이트의 각 웰에서 2-4×106 CD8+ CD25hi T 세포가 제거된 PBMC를 이용하여 벌크 배양체들을 만들었다. (T 블래스트의) 복제 샘플들을 5-8일째에 벌크 배양체들로부터 제거하였고 96 웰 플레이트들에서 증식을 평가하였다. 이 데이터는 각 화합물에 대한 T 세포 반응들의 크기 및 운동학을 평 가하기 위하여 사용되었다.
예 2에 대하여, SI≥2를 포지티브 반응들을 위한 임계치로서 사용하였고 모수 통계분석법과 비모수 통계분석법을 이용하여 변이 계수(CV), 표준 편차(SD) 그리고 중요도(p<0.05)를 판단하기 위하여 데이터를 더 분석하였다. SI≥2이면서 반응이 통계적으로 중요(p<0.05)하기만 하면 임의의 제공된 화합물은 면역성인 것으로 간주하였다.
이 결과들은 시간별 T 세포 검사 방법을 이용하여 농도 범위에 대하여 테스트를 수행할 때, 카르바마제핀 대사 N-아세틸 이미노스틸벤이 (환자들에게서 지연된 알러지 반응들의 유력한 유도물질로 알려진) 카르바마제핀보다 더 작은 수의 공여자들을 자극한다는 사실을 보여준다. 수많은 T 세포 반응들에서 단일 시점 T 세포 검사를 이용하는 것은 검출되지 않았을 것이라는 사실은 명확하다. 실제로, 카르바마제핀에 대한 대다수의 T 세포 반응들은 5일째에 유도되었고, 단지 하나의 추가적인 반응이 6일째와 7일째에 검출되었다. 6, 7, 또는 8일째에 단일 시점 T 세포 검사를 이용한 N-아세틸 및 카르바마제핀에 대한 T 세포 반응의 평가는 이들 두 화합물들 사이의 면역원성의 임의 레벨을 식별하지 못하였을 것이다.

Claims (30)

  1. 테스트 물질에 대한 헬퍼 T 세포 반응을 측정하기 위한 방법으로서,
    (a) 유기체로부터 얻어진 샘플로부터 항원 제시 세포(APC)들과 T 세포들을 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 세포들로부터 조절성 T 세포들을 제거(depleting)하는 단계;
    (c) 상기 항원 제시 세포(APC) 및 (b) 단계에서 얻어진 조절성 T 세포가 제거된 세포들을 상기 테스트 물질을 이용하여 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 테스트 물질에 대한 T 세포 반응들을 검사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은,
    (ai) 상기 항원 제시 세포(APC)들을 다른 세포들로부터 분리하는 단계를 더 포함하고; 그리고
    단계 (c)는 조절성 T 세포가 제거된 세포들의 후속 첨가에 앞서 상기 분리된 APC들을 이용하여 상기 테스트 물질을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 테스트 물질의 첨가에 앞서 상기 항원 제시 세포(APC)를 사이토킨들로서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포(APC)와 T 세포는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원 제시 세포(APC)와 T 세포는 인간으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 조절성 T 세포들은 CD25hi+ T 세포들이 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 T 세포들은 CD8+ T 세포들이 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    T 세포 증식, 사이토킨 분비(release), T 세포 전사 변화들, 및/또는 T 세포 활성화와 관련된 다른 마커들 중 하나 이상을 측정하므로써 상기 T 세포 반응들을 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    트리티에이티드 티아민(tritiated thymidine)의 업테이크(uptake)에 의하여 상기 T 세포 증식을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 사이토킨 분비를 IL-2 및/또는 IFNγ의 분비에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    배양 동안에 한 시점을 초과하는 시점들에서 상기 T 세포 반응들을 검사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 2에 있어서,
    상기 T 세포가 제거된 세포들의 첨가에 앞서 하나의 시간 경과보다 더 많은 시간 경과에 대하여 상기 테스트 물질을 이용하여 상기 항원 제시 세포(APC)를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질을 하나 초과의 농도들에서 검사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질을 검사하기 위한 최적 시간(들) 및/또는 농도(들)을 판단하기 위하여 최적화 물질을 검사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질은 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질은 비단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 테스트 물질은 유기 분자, 지질, 탄수화물 또는 콘쥬게이트들, 혼합물들 및 제제들을 포함하는 둘 이상의 모이어티들로 구성되는 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 테스트 물질은 T 세포들 및/또는 항원 제시 세포(APC)에 대하여 면역조절성이거나 독성인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 4에 있어서, 인간말초혈액단핵세포(PBMC)는 전세계 인구 또는 연구 대상 인구 중에 80%를 초과하는 발현을 보이는 HLA 알로타입(allotype)들을 발현하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 4에 있어서,
    연구중인 질병과 관련된 특정 HLA 알로타입들을 나타내기 위하여 인간말초혈액단핵세포(PBMC)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 1에 있어서,
    단백질 서열에서 T 세포 에피토프들을 식별하기 위하여 상기 단백질 서열로부터의 중첩(overlapping) 펩티드들은 테스트하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 1에 있어서,
    상대적 면역원성을 평가하기 위하여 일련의 분자들을 개별적으로 테스트하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    추가적인 개발을 위한 리드 의약제들을 선택하는 근거로서 상대적인 T 세포 반응들을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 15에 있어서,
    잠재적 면역원성을 평가하기 위하여 테스트 물질을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 15에 있어서,
    잠재적 면역원성을 평가하기 위하여 테스트 물질의 다른 제제들을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 15에 있어서,
    잠재적 면역원성을 평가하기 위하여 테스트 물질의 다른 제조 배치들(batches)을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 15에 있어서,
    상기 테스트 물질에 대한 면역원성을 평가하기 위하여 환자 혈액을 T 세포들의 소스로서 사용하여 테스트 물질을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
KR1020087024124A 2006-03-02 2007-03-02 Ｔ 세포 검사 KR101361887B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0604170.1 2006-03-02
GB0604170A GB0604170D0 (en) 2006-03-02 2006-03-02 T cell assays
GB0619374A GB0619374D0 (en) 2006-09-29 2006-09-29 T cell asays
GB0619374.2 2006-09-29
GB0620123.0 2006-10-11
GB0620123A GB0620123D0 (en) 2006-10-11 2006-10-11 T cell assays
PCT/GB2007/000736 WO2007099341A1 (en) 2006-03-02 2007-03-02 T cell assays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080109008A KR20080109008A (ko) 2008-12-16
KR101361887B1 true KR101361887B1 (ko) 2014-02-21

Family

ID=38191208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087024124A KR101361887B1 (ko) 2006-03-02 2007-03-02 Ｔ 세포 검사

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20090221024A1 (ko)
EP (1) EP1989544B1 (ko)
JP (1) JP5161798B2 (ko)
KR (1) KR101361887B1 (ko)
AT (1) ATE514081T1 (ko)
AU (1) AU2007220300A1 (ko)
CA (1) CA2644540C (ko)
DK (1) DK1989544T3 (ko)
HK (1) HK1126274A1 (ko)
PL (1) PL1989544T3 (ko)
PT (1) PT1989544E (ko)
RU (1) RU2476884C2 (ko)
SG (1) SG170051A1 (ko)
WO (1) WO2007099341A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE20090514A1 (en) 2009-07-06 2011-02-16 Opsona Therapeutics Ltd Humanised antibodies and uses therof
WO2011027810A1 (ja) * 2009-09-03 2011-03-10 独立行政法人理化学研究所 アレルゲン特異的リンパ球の検出方法
EP2475383A4 (en) 2009-09-06 2013-07-17 Protab Ltd FOR THE PEPTIDE PRODUCED FROM HSP65 6 SPECIFIC HUMANIZED ANTIBODIES AND USES THEREOF
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
MX2015008534A (es) 2012-12-26 2017-07-04 Oncosynergy Inc COMPOSICIONES DE ANTICUERPO ANTI-INTEGRINA ß1 Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS.
WO2014180490A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
US11167024B2 (en) 2015-09-18 2021-11-09 Baylor College Of Medicine Immunogenic antigen identification from a pathogen and correlation to clinical efficacy
WO2018124005A1 (ja) 2016-12-27 2018-07-05 中外製薬株式会社 被験物質の免疫原性を評価する方法
RU2722648C2 (ru) * 2018-11-16 2020-06-02 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ проверки иммуногенности вакцинных антигенов для получения высокоэффективных вакцин против опасных инфекций

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050706A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Medical Research Council Regulatory t-cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0891425A2 (en) * 1996-04-23 1999-01-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for regulating t cell subsets by modulating transcription factor activity
AU9694798A (en) * 1997-10-10 1999-05-03 Basf Aktiengesellschaft T cell receptor-associated molecules (trams) and methods of use therefor
AU761587B2 (en) * 1998-04-21 2003-06-05 Amgen Research (Munich) Gmbh CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
EP1241249A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-18 Gerold Schuler CD4+CD25+regulatory T cells from human blood
WO2003104263A2 (en) * 2002-05-01 2003-12-18 Genencor International, Inc. Cytokines and cytokine receptors with reduced immunogenicity
WO2004015070A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Baylor College Of Medicine Isolation and identification of t cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050706A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Medical Research Council Regulatory t-cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080109008A (ko) 2008-12-16
AU2007220300A1 (en) 2007-09-07
ATE514081T1 (de) 2011-07-15
WO2007099341A1 (en) 2007-09-07
CA2644540C (en) 2014-09-30
HK1126274A1 (en) 2009-08-28
EP1989544B1 (en) 2011-06-22
SG170051A1 (en) 2011-04-29
DK1989544T3 (da) 2011-09-26
US20090221024A1 (en) 2009-09-03
EP1989544A1 (en) 2008-11-12
PT1989544E (pt) 2011-09-26
CA2644540A1 (en) 2007-09-07
RU2476884C2 (ru) 2013-02-27
RU2008136561A (ru) 2010-04-10
JP2009528044A (ja) 2009-08-06
PL1989544T3 (pl) 2012-01-31
JP5161798B2 (ja) 2013-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101361887B1 (ko) Ｔ 세포 검사
KR101301923B1 (ko) 인간 혈액 유래의 ｃｄ4＋ｃｄ25＋ 조절성 ｔ 세포
Richter et al. Human T cell priming assay (hTCPA) for the identification of contact allergens based on naive T cells and DC–IFN-γ and TNF-α readout
CA2659676C (en) Co-culture lymphoid tissue equivalent (lte) for an artificial immune system (ais)
CA3068387A1 (en) T cell compositions for immunotherapy
US8975069B2 (en) Method for identifying antigen-specific regulatory T cells
Barberá et al. APL1, an altered peptide ligand derived from human heat-shock protein 60, increases the frequency of Tregs and its suppressive capacity against antigen responding effector CD4+ T cells from rheumatoid arthritis patients
Kinnunen et al. Allergen‐specific naïve and memory CD4+ T cells exhibit functional and phenotypic differences between individuals with or without allergy
Atanackovic et al. Monitoring CD4+ T cell responses against viral and tumor antigens using T cells as novel target APC
Poloni et al. T‐cell activation–induced marker assays in health and disease
Abraham Assessment of functional immune responses in lymphocytes
Kanjana et al. Autoimmunity to synovial extracellular matrix proteins in patients with postinfectious Lyme arthritis
WO2018223149A1 (en) Systems and methods for determining the risk of severe allergic reaction
ES2366971T3 (es) Ensayos de células t.
Stickler et al. A human dendritic cell-based method to identify CD4+ T-cell epitopes in potential protein allergens.
WO2016048872A1 (en) Compositions, methods and kits used to determine potency of dendritic cells in cancer immunitherpay
AU2013206786B2 (en) T cell assays
JP7277255B2 (ja) インビトロでの制御性ｔ細胞の特異性評価方法
Martin et al. Tools and methods for identification and analysis of rare antigen-specific T lymphocytes
Markovic et al. A reproducible method for the enumeration of functional (cytokine producing) versus non-functional peptide-specific cytotoxic T lymphocytes in human peripheral blood
ABRAHAM Evaluation of Lymphocyte Function
Masilamani et al. T-cell proliferation assay: determination of immunodominant T-cell epitopes of food allergens
US20090075296A1 (en) Methods and compositions for assaying regulatory t cells
Martínez-Blanco et al. Coculture of Human Dendritic and T Cells for the Study of Specific T Cell-Mediated Responses Against Food Allergens
Raju et al. Immunotoxicants, Immunotoxicity and Immunotoxicity testing: An outline of in-vitro alternatives

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161229

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171228

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181227

Year of fee payment: 6