WO2011027810A1 - アレルゲン特異的リンパ球の検出方法 - Google Patents

アレルゲン特異的リンパ球の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011027810A1
WO2011027810A1 PCT/JP2010/065001 JP2010065001W WO2011027810A1 WO 2011027810 A1 WO2011027810 A1 WO 2011027810A1 JP 2010065001 W JP2010065001 W JP 2010065001W WO 2011027810 A1 WO2011027810 A1 WO 2011027810A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
allergen
cells
cell
food
positive
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/065001
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健一 増田
保之 石井
圭吾 蔵田
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
動物アレルギー検査株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人理化学研究所, 動物アレルギー検査株式会社 filed Critical 独立行政法人理化学研究所
Priority to JP2011529930A priority Critical patent/JPWO2011027810A1/ja
Publication of WO2011027810A1 publication Critical patent/WO2011027810A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/55—IL-2

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting allergen-specific lymphocytes. More specifically, the present invention relates to a method for detecting an allergen-specific lymphocyte using an antibody that recognizes allergen-specific proliferating lymphocytes and a flow cytometry method, and an allergen identification method using the method. About.
  • Non-patent Document 1 There was no general system for that.
  • food allergen-specific lymphocyte proliferative reactions using radioisotopes have been used, but because they handle radioisotopes, they are limited to use in specialized facilities and abandon large-scale tests. Since the object hits radioactive waste, it could not be used as a general inspection system.
  • CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • Non-Patent Document a test system for detecting CD4 / CD25 positive T cells by flow cytometry
  • An object of the present invention is to provide a quick, simple, highly sensitive and highly accurate general-purpose technique for detecting a lymphocyte proliferative response to a food allergen, and thus a useful means for identifying a causative food allergen in food allergy. Is to provide.
  • the present inventors have determined that the population of CD4 / CD25 positive T cells includes regulatory T cells involved in allergy suppression in addition to activated lymphocytes involved in allergic pathology.
  • the present inventors used CD4 positive T cell populations in allergen-stimulated canine peripheral blood lymphocytes, using a magnetic cell separation (MACS), a CD25 high expression cell fraction and a CD25 low expression / negative cell fraction.
  • the lymphocyte proliferation-inhibiting ability of both cell fractions was compared.
  • a growth inhibitory effect was observed only on CD25 high-expressing lymphocytes.
  • regulatory T cells can be excluded by excluding the CD25 / expressing cell fraction from the CD4 / CD25 positive T cell population, and only activated T cells that proliferated in response to allergens can be analyzed. It was.
  • the present inventors used mononuclear cells collected from normal dogs in a culture method supplemented with human IL-2 in the presence of various food allergens. After culturing, the proportion of CD25 low-expressing CD4 positive T cells in the total CD4 positive cells was examined, and the normal reference value of the proportion of T cells proliferating allergen-specifically was calculated. Next, the same test was performed on dogs showing clinical signs of allergic dermatitis, the ratio of CD25 low-expressing CD4 positive T cells in total CD4 positive cells was calculated, and food allergens higher than normal reference values Identified as the allergen causing allergy. In addition, when each case dog was fed a diet that did not contain food identified as the causative allergen, symptoms improved in all cases and the proportion of allergen-specific proliferating T cells also decreased.
  • the present inventors confirmed that it is possible to identify food allergy causative allergens using the ratio of CD25 low-expressing CD4 positive T cells in all CD4 positive cells as an index, and It came to be completed.
  • the present invention is as follows: (1) A method for detecting allergen-specific activated T cells, comprising the following steps. (a) A step of providing a T cell-containing sample derived from a test animal that is cultured in the presence of interleukin-2 (IL-2) with or without contact with the allergen (b) In each sample, measure the proportion of CD25 low-expressing CD4 positive cells in the total CD4 positive cells, and subtract the measurement value when no allergen is contacted from the measurement value when allergen is contacted, The step of calculating as a ratio of allergen-specific activated T cells (2) The method according to (1) above, wherein the test animal determines whether or not the test animal exhibits an allergic reaction to the allergen, The ratio of allergen-specific activated T cells calculated in (1) is compared with the value in normal animals, and if the value is significantly higher than that in normal animals, it is determined that there is a high possibility of showing an allergic reaction to the allergen A method, characterized by: (3) The method according to (1) or (2) above, wherein the allergen
  • a food allergy in the animal characterized by causing the animal to ingest a diet excluding food allergens determined by the method described in (3) above to be highly likely to exhibit an allergic reaction. Prophylactic and / or therapeutic methods. (5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the test animal is a dog.
  • regulatory T cells can be excluded and only activated T cells can be easily detected, the presence or absence of food allergy can be diagnosed easily and accurately, and appropriate diet therapy can be performed.
  • no radioisotope is used, special facilities for measurement and treatment of radioactive waste are unnecessary, and the versatility is high.
  • it can be measured with a relatively small amount of cells (eg, the number of cultured cells in one well of a 96-well cell culture plate) compared to the method using CFSE uptake as an indicator, various food allergens can be collected simultaneously. You can investigate.
  • the method for detecting allergen-specific activated T cells of the present invention includes the following steps.
  • test animal in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as the molecule (eg, antibody) capable of recognizing CD4 and CD25 is available, and is, for example, a mammal, specifically a dog, a human Non-human primates, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice and the like are exemplified, and dogs are preferred.
  • the molecule eg, antibody
  • T cell-containing sample in the detection method of the present invention examples include peripheral blood, bone marrow, mononuclear cell population obtained by specific gravity centrifugation, lymph node suspension, etc., but peripheral blood or bone marrow derived mononuclear cells Is preferred.
  • Peripheral blood and bone marrow samples can be collected from test animals by EDTA or heparin blood collection, and mononuclear cell populations can be separated by subjecting them to specific gravity centrifugation according to a conventional method.
  • the allergen to be brought into contact with the T cell-containing sample is not particularly limited, but is preferably a food allergen that causes food allergy.
  • food allergens include allergens such as beef, pork, chicken, eggs, milk, wheat, soy, corn, lamb, turkey, duck, salmon, cod, catfish, potato, rice, etc., which are commercially available preparations Or can be prepared by treating these dietary ingredients by conventional methods.
  • Commercially available fresh / frozen / freeze-dried products or powdered materials thereof can be used as the raw material ingredients.
  • extraction is preferable.
  • Extraction can be performed, for example, by treating the raw material physically (ultrasonic wave, French press, mortar, homogenizer, glass beads, freeze-thaw, etc.) or a surfactant in water, buffer solution, or glycerol. Extraction efficiency can be increased by adding salt or heating. Food allergen extracts are also commercially available (such as Greer).
  • Examples of the method of bringing the T cell-containing sample into contact with the allergen include a method of incubating the T cell-containing sample in a medium to which allergen is added.
  • the medium to be used is not particularly limited as long as it is conventionally used for culturing T cells.
  • minimal essential medium MEM containing 5-20% fetal bovine serum (FBS), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Iskov modified Dulbecco medium (IMDM), RPI1640 medium, Ham F12 medium, AIM-V medium, and the like.
  • an antibiotic such as streptomycin, penicillin, or puromycin, a cytokine such as IL-7, SCF, or Flt3 ligand, or an antibody such as an anti-CD3 antibody can be further added to the medium.
  • the T cell-containing sample can be seeded in a medium such that the cell density is about 10 6 to about 10 7 cells / ml, for example.
  • the concentration of allergen added to the medium is, for example, 0.1 to 50 ⁇ g / ml, preferably 1 to 10 ⁇ g / ml.
  • the incubation period is not particularly limited, but is preferably 5 to 10 days, for example.
  • the culture temperature is preferably about 30 to about 40 ° C, particularly about 37 ° C.
  • the carbon dioxide content is preferably about 5 to about 10%, particularly about 5%.
  • the T cell-containing sample subjected to the detection method of the present invention is incubated in the presence of IL-2 before being subjected to the following cell sorting step.
  • the IL-2 used need not be derived from the test animal so long as the T cells in the sample can express CD25 (IL-2 receptor) in response to the stimulation.
  • human IL-2 can be used as the heterologous IL-2.
  • a commercially available recombinant protein can be used as human IL-2.
  • a cytokine having an action of inducing cell proliferation or cell activation such as IL-4 or IFN-gamma, may be used.
  • the concentration of IL-2 added to the medium is, for example, 10 to 100 U / ml.
  • IL-2 stimulation is preferably performed for 24 hours or longer.
  • IL-2 can be added to the medium on the fourth day from the start of incubation (allergen stimulation).
  • the CD4 positive / CD25 positive cells in each sample are fractionated into CD25 high expressing cells and CD25 low expressing cells.
  • the anti-CD4 antibody and the anti-CD25 antibody may be those produced against heterologous CD4 and CD25 as long as they show cross-reactivity with CD4 and CD25 molecules derived from a test animal, respectively.
  • an anti-human CD25 antibody eg, ACT-1; DAKO
  • ACT-1 ACT-1
  • DAKO anti-human CD25 antibody
  • Each antibody can be labeled with a different fluorescent dye (eg, FITC, PE, PI, 7-AAD, etc.), and when separated by MACS, there are additional secondary antibodies for each antibody labeled with magnetic beads. used.
  • the CD4-positive cell means a cell in which the fluorescence intensity of the fluorescent dye that labels the anti-CD4 antibody is higher than the fluorescence intensity of the isotype control antibody of the anti-CD4 antibody.
  • a CD25 highly expressing cell refers to a cell in which the fluorescence intensity of the fluorescent dye that labels the anti-CD25 antibody is 5 to 7 times or more the fluorescence intensity of the isotype control antibody of the anti-CD25 antibody.
  • a person skilled in the art can easily determine the threshold value of the CD25 low-expressing cells and the CD25 high-expressing cells within the above range from the relationship between the fluorescence intensity of the fluorescent dye that labels the anti-CD25 antibody and the number of cells.
  • a CD25 low-expressing cell refers to a cell in which the fluorescence intensity of a fluorescent dye that labels the anti-CD25 antibody is a value that exceeds the fluorescence intensity of the isotype control antibody of the anti-CD25 antibody and less than the above threshold value (5 to 7 times).
  • the CD25 negative cell means a cell in which the fluorescence intensity of the fluorescent dye that labels the anti-CD25 antibody is lower than the fluorescence intensity of the isotype control antibody of the anti-CD25 antibody.
  • CD25 low expressing CD4 positive cells in the total CD4 positive cells can be measured.
  • CD25 high-expressing CD4 positive cells have a lymphocyte proliferation inhibitory activity, and are a fraction containing regulatory T cells, and CD25 low expression excluding the fraction from CD4 positive / CD25 positive cells CD4-positive cells are fractions containing only activated T cells.
  • CD4 low-expressing CD4 positive cells in T cell-containing samples that are not contacted with allergens are non-specific for allergens. Therefore, the measured values when allergen is not contacted from the measured values when allergen is contacted (background) The value obtained by subtracting (value) is defined as the ratio of activated T cells proliferating in an allergen-specific manner.
  • the cut-off value can be, for example, the average of measured values of allergen-specific activated T cells in normal animals + SD (standard deviation), average + 2SD, average + 3SD, etc. Is higher than the cut-off value, it can be determined that the animal is likely to show an allergic reaction to the allergen.
  • the present invention also allows the animal to ingest a diet excluding the food allergen when it is determined by the above method that the test animal is highly likely to exhibit an allergic reaction to the food allergen.
  • Methods of preventing and / or treating food allergies in the animals are provided.
  • the effectiveness of the treatment is predicted by monitoring over time the proportion of activated T cells specific for the causative allergen before and after treatment. be able to. That is, when the proportion of allergen-specific activated T cells is significantly reduced after treatment as compared to before treatment, the treatment can be predicted to be effective.
  • Reference Example 1 Identification of regulatory T cell-containing fractions (1) Isolation of canine peripheral blood lymphocytes 4 mL of peripheral blood from normal dogs (beagle female, 1 year old, 5 animals) and food allergy dogs (3 animals) in EDTA tubes After collection, the mononuclear cell population was separated by Ficoll multi-layer centrifugation according to a conventional method. The separated cells were suspended in a culture solution (RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, containing antibiotics), and the number of cells was adjusted to 1.0-1.5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • a culture solution RPMI-1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, containing antibiotics
  • the canine peripheral blood lymphocytes obtained in (1) were mixed with plant hemagglutinin in a 96-well plate at 37 ° C, 5 ° C. The cells were cultured for 1 week in a% CO 2 environment. On the 4th day after the start of culture, the human IL-2 preparation was added to a final concentration of 50 U / mL.
  • CD25-expressing CD4-positive T cells have a cytostatic effect. To capture activated T cells that proliferate in response to allergen stimulation, exclude the CD25-expressing T cell fraction. I found it necessary.
  • Example 1 Detection Test System for Proliferating Lymphocytes Responding to Food Allergens
  • Food allergen extracts were purchased from Greer, USA. There are 16 food allergens purchased: beef, pork, chicken, eggs, milk, wheat, soy, corn, lamb, turkey, duck, salmon, cod, catfish, potato, and rice.
  • Canine peripheral blood lymphocytes prepared in Reference Example 1 (1) were cultured for 1 week in a 96-well plate at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment together with the 16 types of food allergens (final concentration 5 ⁇ g / mL). On the 4th day after the start of the culture, the human IL-2 preparation was added to a final concentration of 50 U / mL.
  • the cultured cells were double-stained with an anti-canine CD4 antibody (CA13 1E4, manufactured by AbD Serotec) and an anti-human CD25 antibody (ACT-1, DAKO). Stained cells were removed from dead cells with Propidium iodide, then measured with FACS CantoII (Becton Dickinson), and activated T cells (CD25), excluding regulatory T cell fractions (CD25-expressing CD4-positive cells). Only low expression CD4 positive cells) were counted, and the ratio (%) of activated T cells in the total CD4 positive T cells was calculated using FACS Diva Software (Becton Dickinson). Furthermore, the ratio of activated T cells in cells not stimulated with allergen was calculated in the same manner (background value). The value obtained by subtracting this background value from the ratio of activated T cells stimulated with allergen was used as the ratio of activated T cells proliferating specifically for allergen.
  • the ratio of allergen-specific activated T cells to total CD4-positive T cells was examined for 18 types of allergens at the time of clinical manifestation. That is, the ratio of the CD25 low-expressing CD4 positive cell fraction (the fraction indicated by CD4 / CD25low in FIG. 4) excluding CD25 high expressing CD4 positive cells considered to be regulatory T cells to the total CD4 positive T cells is measured. did. As a result, food allergens exceeding the normal reference value of 3 in case 1, 1 in case 2 and 7 in case 3 could be detected (Table 2).
  • test system according to the present invention is useful for detecting a food allergen that causes food allergy in dogs.
  • the method for detecting allergen-specific activated T cells of the present invention can easily and accurately identify the causative allergen of food allergies in various animals including dogs. It is very useful.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、以下の工程を含む、アレルゲン特異的活性化T細胞の検出方法を提供する。 (a) アレルゲンを接触させ、あるいは接触させずに、インターロイキン-2（IL-2）存在下で培養した被験動物由来のT細胞含有試料をそれぞれ提供する工程 (b) 各試料において、総CD4陽性細胞中に占めるCD25低発現CD4陽性細胞の割合を測定し、アレルゲンを接触させた場合の測定値からアレルゲンを接触させない場合の測定値を差し引いた値を、アレルゲン特異的活性化T細胞の割合として算出する工程

Description

アレルゲン特異的リンパ球の検出方法
　本発明は、アレルゲン特異的リンパ球の検出方法に関する。より詳細には、本発明は、アレルゲン特異的な増殖リンパ球を認識する抗体とフローサイトメトリー法とを用いて、該アレルゲン特異的リンパ球を検出する方法、当該方法を用いたアレルゲンの同定方法に関する。
　食物アレルギーのイヌの多くで、食物アレルゲンに対するリンパ球増殖反応がその病態に関わっていると報告されているにもかかわらず（非特許文献１）、これまで食物アレルゲンに対するリンパ球増殖反応を検出するための一般的なシステムは存在しなかった。研究レベルでは、放射性同位元素を用いた食物アレルゲン特異的リンパ球増殖反応が用いられてきたが、放射性同位元素を扱うため、特殊施設での使用に限られ、また、大量に発生する検査の廃棄物が放射性廃棄物にあたるため、一般的な検査システムとして用いることはできなかった。
　放射性同位元素を用いる方法の代替として、carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) を用いる方法がある。この方法は、増殖細胞がCFSEを取り込む性質を利用して、CFSEを取り込んだ細胞をフローサイトメトリー法によって検出するというものであるが、ヒトの食物アレルギー患者において、食物アレルゲンに対するリンパ球の増殖反応を検出するために用いられた報告がある(非特許文献２)。イヌにおいても健常犬で使用された報告はあるが（非特許文献３）、食物アレルギーのイヌにおいて原因アレルゲンの診断に用いられた報告はない。本発明者らも、この方法で予備的に実験を行ったが、CFSEを取り込んだ細胞を解析するためには比較的多くの細胞数が必要であることから、多種のアレルゲンを一度に解析する目的の臨床検査として一般化することは困難であると考えられた。
　少ない細胞数で高感度に解析する検査方法としては、抗体を用いて増殖したリンパ球を染色し、フローサイトメトリーで捉える方法が適していると考えられた。そこで本発明の前段階において、フローサイトメトリー法でCD4/CD25陽性T細胞を検出する検査システムを用い、トウモロコシアレルギーの実験犬においてトウモロコシアレルゲンに対して増殖するリンパ球を検出したが（非特許文献４）、症状発症時と未発症時での検査値に差は見られず、イヌの食物アレルギーの原因アレルゲンを検出するためには、さらなる改良が必要であることがわかった。
Ishida, R. et al., J. Vet. Intern. Med., 18: 25-30 (2004) Tav, S.S. et al., Clin. Exp. Allergy, 37: 1519-1527 (2007) LeBlanc, C.J. et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 119: 180-188 (2007) Olivry, T. et al., J. Vet. Med. Sci., 69: 1025-1031 (2007)
　本発明の目的は、食物アレルゲンに対するリンパ球増殖反応を検出するための、迅速、簡便かつ高感度・高精度な汎用的な手法を提供し、もって食物アレルギーにおける原因食物アレルゲンを同定する有用な手段を提供することである。
　本発明者らは、CD4/CD25陽性T細胞の集団の中には、アレルギーの病態に関与する活性化リンパ球以外に、アレルギーの抑制に関与する制御性T細胞も含まれていることを究明し、食物アレルギーの原因アレルゲンを検出するためには、制御性T細胞を除いた活性化T細胞のみを測定する必要があることを見出した。そこで、本発明者らは、アレルゲン刺激したイヌ末梢血リンパ球中のCD4陽性T細胞集団を、磁気細胞分離（MACS）を用いて、CD25高発現細胞画分とCD25低発現/陰性細胞画分とに分離し、両細胞画分のリンパ球増殖抑制能を比較した。その結果、CD25高発現リンパ球にのみ増殖抑制効果が認められた。即ち、CD4/CD25陽性T細胞集団からCD25高発現細胞画分を除外することにより制御性T細胞を排除することができ、アレルゲンに反応して増殖した活性化T細胞のみを解析できると考えられた。
　上記手法により食物アレルギーの原因アレルゲンの同定が可能かどうかを調べるために、本発明者らは、正常犬から採取した単核細胞を、種々の食物アレルゲンの存在下ヒトIL-2添加培養法で培養した後、総CD4陽性細胞中のCD25低発現CD4陽性T細胞の割合を調べ、アレルゲン特異的に増殖するT細胞の割合の正常参考値を算出した。次に、アレルギー性皮膚炎の臨床徴候を示すイヌについて同様の試験を行い、総CD4陽性細胞中のCD25低発現CD4陽性T細胞の割合を算出し、正常参考値より高値を示す食物アレルゲンを食物アレルギーの原因アレルゲンとして同定した。さらに、原因アレルゲンとして同定された食物を含まない食餌を各症例犬に給与したところ、すべての症例で症状の改善が認められ、アレルゲン特異的に増殖するT細胞の割合も低下した。
　以上のことから、本発明者らは、全CD4陽性細胞中のCD25低発現CD4陽性T細胞の割合を指標として、食物アレルギーの原因アレルゲンの同定が可能であることを確認して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである：
（１）以下の工程を含む、アレルゲン特異的活性化T細胞の検出方法。
(a) アレルゲンを接触させ、あるいは接触させずに、インターロイキン-2（IL-2）存在下で培養した被験動物由来のT細胞含有試料をそれぞれ提供する工程
(b) 各試料において、総CD4陽性細胞中に占めるCD25低発現CD4陽性細胞の割合を測定し、アレルゲンを接触させた場合の測定値からアレルゲンを接触させない場合の測定値を差し引いた値を、アレルゲン特異的活性化T細胞の割合として算出する工程
（２）被験動物がアレルゲンに対してアレルギー反応を示すか否かを判定するための、上記（１）記載の方法であって、前記(b)で算出されるアレルゲン特異的活性化T細胞の割合を正常動物における値と比較し、正常動物における値より有意に高値である場合に該アレルゲンに対してアレルギー反応を示す可能性が高いと判定することを特徴とする、方法。
（３）アレルゲンが食物アレルゲンである、上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）上記（３）記載の方法により、被験動物がアレルギー反応を示す可能性が高いと判定された食物アレルゲンを除外した食餌を該動物に摂取させることを特徴とする、該動物における食物アレルギーの予防及び/又は治療方法。
（５）被験動物がイヌである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、制御性T細胞を排除して活性化T細胞のみを簡便に検出できるので、食物アレルギーの有無を容易かつ精度よく診断することができ、適切な食餌療法を施すことができる。また、放射性同位元素を用いないので、測定のための特殊施設や放射性廃棄物の処理が不要であり、汎用性が高い。さらに、CFSEの取り込みを指標とする方法に比べ、比較的少ない細胞量（例、96穴細胞培養プレートの１穴中の培養細胞数）で測定ができるので、多種の食物アレルゲンを同時に一括して調べることができる。
抗イヌCD4抗体及び抗ヒトCD25抗体とMACSとを組み合わせたイヌT細胞集団の分離を示す図である。CD25高発現CD4陽性T細胞（左）とCD25低発現・陰性T細胞（右）とに分けることができた。 CD25高発現CD4陽性T細胞のリンパ球増殖抑制能を示す図である。灰色バーはCD25高発現CD4陽性T細胞を、白色バーはCD25低発現・陰性CD4陽性T細胞をそれぞれ示す。 健常犬における、総CD4陽性T細胞中に占める種々の食物アレルゲン特異的活性化T細胞の割合を示す図である。 CD4陽性T細胞中のCD25陽性（PE-A）細胞の分画を示す図である。CD25低発現CD4陽性T細胞画分（CD4/CD25lowで示される画分）の代表的なデータを示す。 食物アレルギーのイヌ３症例における、原因食物アレルゲン候補の除外による該アレルゲン特異的活性化T細胞の割合の推移を示す図である（単位は％）。症例番号１：四角、症例番号２：三角、症例番号３：丸
　本発明のアレルゲン特異的活性化T細胞の検出方法は、以下の工程を含む。
(a) アレルゲンを接触させ、あるいは接触させずに、インターロイキン-2（IL-2）存在下で培養した被験動物由来のT細胞含有試料をそれぞれ提供する工程
(b) 各試料において、総CD4陽性細胞中に占めるCD25低発現CD4陽性細胞の割合を測定し、アレルゲンを接触させた場合の測定値からアレルゲンを接触させない場合の測定値を差し引いた値を、アレルゲン特異的活性化T細胞の割合として算出する工程
　本発明の検出方法における被験動物は、そのCD4及びCD25を認識しうる分子（例、抗体）が入手可能な動物であれば特に制限はなく、例えば哺乳動物であり、具体的にはイヌ、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、及びマウスなどが例示されるが、好ましくはイヌである。
　本発明の検出方法におけるT細胞含有試料としては、例えば、末梢血、骨髄、それらを比重遠心して得られる単核細胞集団、リンパ節浮遊液等が挙げられるが、末梢血もしくは骨髄由来単核細胞が好ましい。末梢血や骨髄サンプルは、被験動物からEDTAもしくはヘパリン採血により採取することができ、それらを常法にしたがって比重遠心することにより、単核細胞集団を分離することができる。
　T細胞含有試料に接触させるアレルゲンは特に制限されないが、好ましくは食物アレルギーの原因物質となる食物アレルゲンである。例えば、食物アレルゲンとして、牛肉、豚肉、鶏肉、鶏卵、牛乳、小麦、大豆、トウモロコシ、羊肉、七面鳥、アヒル、鮭、タラ、ナマズ、ジャガイモ、米などのアレルゲンが挙げられ、これらは市販の調製物を用いてもよいし、慣用の方法によりこれらの食餌成分を処理することによって調製できる。原料となる食餌成分は、市販の生鮮・冷凍・凍結乾燥品、又はその粉末材料（Allergon社など）等を使用することができる。食餌成分の処理方法としては、好ましくは抽出が挙げられる。抽出は、例えば原料を、水、緩衝液、又はグリセロール中で物理的に（超音波、フレンチプレス、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ、凍結融解など）又は界面活性剤で処理することによって行える。塩の添加や、加温することにより抽出効率を上げることが可能である。食物アレルゲン抽出液も市販されている（Greer社など）。
　T細胞含有試料をアレルゲンに接触させる方法としては、例えば、アレルゲンを添加した培地中でT細胞含有試料をインキュベートする方法が挙げられる。用いる培地としては、T細胞の培養用に従来用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、5～20%のウシ胎児血清（FBS）を含有する最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、イスコヴ改変ダルベッコ培地（IMDM）、RPI1640培地、ハムF12培地、AIM-V培地等が挙げられる。培地には、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシンなどの抗生物質やIL-7、SCF、Flt3リガンドなどのサイトカイン、あるいは抗CD3抗体などの抗体をさらに添加することもできる。T細胞含有試料は、例えば細胞密度が約106～約107個/mlとなるように、培地中に播種することができる。培地に添加されるアレルゲンの濃度としては、例えば0.1～50μg/ml、好ましくは1～10μg/mlが挙げられる。インキュベーション期間は特に限定されないが、例えば5～10日が好ましい。培養温度は約30～約40℃、特に約37℃が好ましい。二酸化炭素含有量は、約5～約10%、特に約5%が好ましい。
　本発明の検出方法に供されるT細胞含有試料は、以下のセルソーティング工程に付す前に、IL-2存在下でインキュベートされる。用いられるIL-2は、試料中のT細胞がその刺激に応じてCD25（IL-2受容体）を発現しうる限り、被験動物由来である必要はない。例えば、被験動物がイヌである場合、異種IL-2として、例えばヒトIL-2を使用することができる。ヒトIL-2としては、市販の組換えタンパク質を使用することができる。また、IL-2の代わりに細胞増殖や細胞の活性化を誘導する作用を持つサイトカイン、たとえばIL-4やIFN-gammaなどを用いても良い。IL-2の培地への添加濃度は、例えば10～100U/mlである。IL-2刺激は24時間以上行うことが好ましく、例えば、インキュベート（アレルゲン刺激）開始から4日目にIL-2を培地に添加することができる。
　インキュベート終了後、アレルゲンに接触させたT細胞含有試料と、接触させていないT細胞含有試料とをそれぞれ回収し、抗CD4抗体および抗CD25抗体と、フローサイトメトリー（FACS）や磁気細胞分離（MACS）などのセルソーティング手段とを組み合わせることにより、各試料中のCD4陽性/CD25陽性細胞をCD25高発現細胞とCD25低発現細胞とに分画する。抗CD4抗体および抗CD25抗体は、被験動物由来のCD4およびCD25分子とそれぞれ交差反応性を示す限り、異種CD4及びCD25に対して作製されたものでもよい。例えば、被験動物がイヌである場合、抗CD25抗体としては、抗ヒトCD25抗体（例、ACT-1； DAKO社）などを用いることができる。各抗体は、異なる蛍光色素（例、FITC、PE、PI、7-AADなど）で標識することができ、MACSで分離する場合には、磁気ビーズで標識した、各抗体に対する二次抗体がさらに使用される。
　本発明において、CD4陽性細胞とは、抗CD4抗体を標識する蛍光色素の蛍光強度が抗CD4抗体のアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度以上である細胞をいう。一方、CD25高発現細胞とは、抗CD25抗体を標識する蛍光色素の蛍光強度が、抗CD25抗体のアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度の5～7倍以上である細胞をいう。当業者は、抗CD25抗体を標識する蛍光色素の蛍光強度と細胞数の関係から、上記範囲内でCD25低発現細胞とCD25高発現細胞との閾値を容易に決定することができる。CD25低発現細胞とは、抗CD25抗体を標識する蛍光色素の蛍光強度が、抗CD25抗体のアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度を超える値でかつ上記閾値（5～7倍）未満である細胞をいう。CD25陰性細胞とは、抗CD25抗体を標識する蛍光色素の蛍光強度が、抗CD25抗体のアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度以下である細胞をいう。
　上記の基準にしたがって、総CD4陽性細胞中に占めるCD25低発現CD4陽性細胞の割合を測定することができる。後記実施例に示すとおり、CD25高発現CD4陽性細胞はリンパ球増殖抑制活性を有するので、制御性T細胞を含む画分であり、CD4陽性/CD25陽性細胞から該画分を除外したCD25低発現CD4陽性細胞が、活性化T細胞のみを含む画分である。アレルゲンを接触させないT細胞含有試料中のCD25低発現CD4陽性細胞は、アレルゲンに対して非特異的であるので、アレルゲンを接触させた場合の測定値からアレルゲンを接触させない場合の測定値（バックグラウンド値）を差し引いた値を、アレルゲン特異的に増殖した活性化T細胞の割合とする。
　上記のようにして得られる、被験動物におけるアレルゲン特異的活性化T細胞の割合を、正常動物における値（カットオフ値）と比較することにより、該動物がアレルゲンに対してアレルギー反応を示すか否かを判定することができる。カットオフ値は、例えば、正常動物におけるアレルゲン特異的活性化T細胞の割合の測定値の平均+SD（標準偏差）、平均+2SD、平均+3SDなどとすることができ、被験動物における測定値が該カットオフ値より高値である場合に、該動物は、アレルゲンに対してアレルギー反応を示す可能性が高いと判定することができる。
　本発明はまた、上記の方法により、被験動物がある食物アレルゲンに対してアレルギー反応を示す可能性が高いと判定された場合に、該食物アレルゲンを除外した食餌を該動物に摂取させることにより、該動物における食物アレルギーを予防及び/又は治療する方法を提供する。
　さらに、アレルギーを発症している動物において、治療前と治療後とで、原因アレルゲンに対して特異的な活性化T細胞の割合を経時的にモニタリングすることにより、当該治療の有効性を予測することができる。即ち、治療前と比較して、治療後にアレルゲン特異的活性化T細胞の割合が有意に減少した場合、該治療は有効であると予測することができる。
　以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
参考例１　制御性T細胞含有画分の同定
（１）イヌ末梢血リンパ球の分離
　正常犬（ビーグル　雌　1歳齢、5頭）および食物アレルギー犬（3頭）の末梢血4mLをEDTA管に採取した後、定法に従ってフィコール重層遠心法で単核細胞集団を分離した。分離した細胞は培養液（10%ウシ胎児血清添加RPMI-1640、抗生物質入り）に浮遊し、細胞数を1.0 - 1.5 x 106個/mLに調整した。
（２）CD4陽性T細胞のCD25高発現T細胞とCD25低発現・陰性T細胞への分離
　（１）で得られたイヌ末梢血リンパ球を、植物性ヘマグルチニンとともに96穴プレートで37℃、5% CO2環境下で1週間培養した。培養開始後4日目にヒトIL-2製剤を最終濃度50U/mLとなるように添加した。抗イヌCD4抗体（CA13 1E4, AbD Serotec社製）および抗ヒトCD25抗体（ACT-1, DAKO社製）で細胞を染色後、それぞれの抗体に対する二次抗体を用いた磁気細胞分離（MACS）によりソーティングし、CD4陽性T細胞を、CD25を高発現する細胞集団とCD25低発現あるいは無発現の細胞集団とに分離した。各細胞集団におけるCD4およびCD25の発現をドットプロットに示す（図１）。
（３）制御性T細胞含有画分の同定
　（２）で得られた2つの細胞集団を用いてリンパ球の増殖抑制能を検討した。即ち、抗イヌCD3抗体で刺激したイヌリンパ球にこれらの細胞集団を1：1～1：64の割合で（得られた細胞集団：抗イヌCD3抗体で刺激したイヌリンパ球）、添加した後、３H-チミジンの取り込みを指標として細胞増殖の程度を測定した。結果を図２に示す。CD25高発現CD4陽性T細胞集団を加えたリンパ球の増殖能と、CD25低発現・陰性CD4陽性T細胞集団を加えたリンパ球の増殖能とを比較すると、添加した細胞集団の割合が高いところで、CD25高発現CD4陽性T細胞のみにリンパ球増殖抑制効果がみられた（図２の1：1および1：4のカラムを参照）。
　これらのことから、CD25高発現CD4陽性T細胞には細胞増殖抑制効果があるので、アレルゲン刺激に反応して増殖する活性化T細胞をとらえるためには、CD25高発現T細胞画分を除外する必要があることがわかった。
実施例１　食物アレルゲンに反応する増殖リンパ球の検出検査システム
　食物アレルゲン抽出液は米国Greer社より購入した。購入した食物アレルゲンは、牛肉、豚肉、鶏肉、鶏卵、牛乳、小麦、大豆、トウモロコシ、羊肉、七面鳥、アヒル、鮭、タラ、ナマズ、ジャガイモ、米の16種類である。参考例１（１）で調製したイヌ末梢血リンパ球を、上記16種類の食物アレルゲン（最終濃度5μg/mL）とともに、96穴プレート中37℃、5% CO2環境下で1週間培養した。培養開始後4日目にヒトIL-2製剤を最終濃度50U/mLとなるように添加した。
　培養した細胞を、抗イヌCD4抗体（CA13 1E4, AbD Serotec社製）および抗ヒトCD25抗体（ACT-1, DAKO社製）により二重染色した。染色した細胞は、Propidium iodideで死細胞を除去した後、FACS CantoII（ベクトン・ディッキンソン社）で測定し、制御性T細胞画分（CD25高発現CD4陽性細胞）を除いて活性化T細胞（CD25低発現CD4陽性細胞）のみをカウントし、総CD4陽性T細胞中の活性化T細胞の割合（%）をFACS Diva Software（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて算出した。さらに、アレルゲンで刺激していない細胞中の活性化T細胞の割合を同様に算出した（バックグランド値）。アレルゲンで刺激した活性化T細胞の割合より、このバックグランド値を差し引いた値をアレルゲン特異的に増殖した活性化T細胞の割合とした。
（１）正常犬におけるアレルゲン特異的活性化T細胞の割合
　正常犬5頭について、上記のようにして16種類のアレルゲン特異的活性化T細胞の割合を算出した（図３）。その結果、正常犬では、アレルゲン特異的活性化T細胞の割合は－1.3%～1.7%の範囲であり、平均値－0.2%、標準偏差0.7%であることがわかった。そこで、正常参考値を平均値+2SDの1.2%未満に設定した。
（２）食物アレルギー犬における臨床データの取得
　一般の動物病院で食物アレルギーを疑う皮膚疾患を持つイヌ3頭（表１参照）を用いて、上記検査を行い、原因食物アレルゲンを同定できるかどうか検討した。さらに、それら同定した食物を除外した食餌を3週間～22週間給与した後、症状の改善が見られた段階で再度検査を行い、検査値が低下するかどうかを検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　臨床症状の発現時に18種類のアレルゲンについて、総CD4陽性T細胞に対するアレルゲン特異的活性化T細胞の割合を検討した。即ち、制御性T細胞と考えられるCD25高発現CD4陽性細胞を除くCD25低発現CD4陽性細胞画分（図４のCD4/CD25lowで示される画分）の、総CD4陽性T細胞に占める割合を測定した。その結果、症例1で３個、症例2で1個、症例3で7個の正常参考値を超える食物アレルゲンを検出することができた（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次いで、原因食物アレルゲンとして同定された食物を除外した食餌をこれら食物アレルギーの症例犬に給与したところ、すべての犬で症状の改善が認められたと同時に食物アレルゲン特異的活性化T細胞の割合も低下した（図５）。これらのことから、本発明による検査システムは、イヌの食物アレルギーの原因食物アレルゲンを検出するために有用であることが、臨床例を用いて示された。
　本発明のアレルゲン特異的活性化T細胞の検出方法は、イヌをはじめとする各種動物の食物アレルギーの原因アレルゲンを簡便かつ精度よく同定することができるので、これら動物における食物アレルギーの予防・治療に大いに有用である。
　本出願は、2009年9月3日付で日本国に出願された特願2009-203986を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims (5)

  1. 　以下の工程を含む、アレルゲン特異的活性化T細胞の検出方法。
    (a) アレルゲンを接触させ、あるいは接触させずに、インターロイキン-2（IL-2）存在下で培養した被験動物由来のT細胞含有試料をそれぞれ提供する工程
    (b) 各試料において、総CD4陽性細胞中に占めるCD25低発現CD4陽性細胞の割合を測定し、アレルゲンを接触させた場合の測定値からアレルゲンを接触させない場合の測定値を差し引いた値を、アレルゲン特異的活性化T細胞の割合として算出する工程
  2. 　被験動物がアレルゲンに対してアレルギー反応を示すか否かを判定するための、請求項１記載の方法であって、前記(b)で算出されるアレルゲン特異的活性化T細胞の割合を正常動物における値と比較し、正常動物における値より有意に高値である場合に該アレルゲンに対してアレルギー反応を示す可能性が高いと判定することを特徴とする、方法。
  3. 　アレルゲンが食物アレルゲンである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　請求項３記載の方法により、被験動物がアレルギー反応を示す可能性が高いと判定された食物アレルゲンを除外した食餌を該動物に摂取させることを特徴とする、該動物における食物アレルギーの予防及び/又は治療方法。
  5. 　被験動物がイヌである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
PCT/JP2010/065001 2009-09-03 2010-09-02 アレルゲン特異的リンパ球の検出方法 WO2011027810A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011529930A JPWO2011027810A1 (ja) 2009-09-03 2010-09-02 アレルゲン特異的リンパ球の検出方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-203986 2009-09-03
JP2009203986 2009-09-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011027810A1 true WO2011027810A1 (ja) 2011-03-10

Family

ID=43649344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/065001 WO2011027810A1 (ja) 2009-09-03 2010-09-02 アレルゲン特異的リンパ球の検出方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2011027810A1 (ja)
WO (1) WO2011027810A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006304740A (ja) * 2005-05-02 2006-11-09 Kyoto Univ ４型葉酸受容体の発現を指標とした制御性ｔ細胞の検出方法、及び免疫賦活剤
JP2009528044A (ja) * 2006-03-02 2009-08-06 アンチトープ リミテッド Ｔ細胞アッセイ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006304740A (ja) * 2005-05-02 2006-11-09 Kyoto Univ ４型葉酸受容体の発現を指標とした制御性ｔ細胞の検出方法、及び免疫賦活剤
JP2009528044A (ja) * 2006-03-02 2009-08-06 アンチトープ リミテッド Ｔ細胞アッセイ

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEN'ICHI MASUDA: "Kainushi ni Ko Kikareta Toki Dai 7 Kai Shokumotsu Allergy no Shindan 3", CLINIC. NOTE, vol. 4, no. 8, August 2008 (2008-08-01), pages 38 - 45 *
LEBLANC, C. J. ET AL.: "Effects of dietary fish oil and vitamin E supplementation on canine lymphocyte proliferation evaluated using a flow cytometric technique", VET. IMMUNOL. IMMUNOPATHOL., vol. 119, 2007, pages 180 - 188 *
MASAHIRO ONO: "Allergy o Meguru Trend Seigyosei T-Saibo", HIFU ALLERGY FRONTIER, vol. 3, no. 4, 20 December 2005 (2005-12-20), pages 254 - 255 *
OLIVRY T. ET AL.: "A Blinded Randomized Controlled Trial Evaluating the Usefulness of a Novel Diet (Aminoprotect Care) in Dogs with Spontaneous Food Allergy", J. VET. MED. SCI., vol. 69, no. 10, 2007, pages 1025 - 1031 *
TAY S. S. ET AL.: "T cell proliferation and cytokine responses to ovalbumin and ovomucoid detected in children with and without egg allergy", CLIN. EXP. ALLERGY, vol. 37, 2007, pages 1519 - 1527 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2011027810A1 (ja) 2013-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duffy et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study
Rodriguez-Pena et al. Potential involvement of dendritic cells in delayed-type hypersensitivity reactions to β-lactams
Lahuerta-Marin et al. Bayesian latent class estimation of sensitivity and specificity parameters of diagnostic tests for bovine tuberculosis in chronically infected herds in Northern Ireland
Takele et al. Malnutrition in healthy individuals results in increased mixed cytokine profiles, altered neutrophil subsets and function
US9671411B2 (en) Monocyte activation test better able to detect non-endotoxin pyrogenic contaminants in medical products
US8426146B2 (en) Multiparameteric method for assessing immune system status
Raniszewska et al. Clinical immunology Recurrent respiratory tract infections in children–analysis of immunological examinations
Laso et al. Chronic alcohol consumption is associated with an increased cytotoxic profile of circulating lymphocytes that may be related with the development of liver injury
Praud et al. Assessment of the sensitivity of the gamma-interferon test and the single intradermal comparative cervical test for the diagnosis of bovine tuberculosis under field conditions
Bjerg et al. Altered frequency of T regulatory cells is associated with disability status in relapsing–remitting multiple sclerosis patients
Amu et al. Frequency and phenotype of B cell subpopulations in young and aged HIV-1 infected patients receiving ART
Hrdý et al. Impaired function of regulatory T cells in cord blood of children of allergic mothers
Lahuerta-Marin et al. Risk factors for failure to detect bovine tuberculosis in cattle from infected herds across Northern Ireland (2004–2010)
Wang et al. High frequency of activated NKp46+ natural killer cells in patients with new diagnosed of latent autoimmune diabetes in adults
Alves Silva et al. IL‐17‐expressing CD4+ and CD8+ T lymphocytes in human toxoplasmosis
Hamza et al. Regulatory T cells in early life: comparative study of CD4+ CD25high T cells from foals and adult horses
Olin et al. γδ T-lymphocyte cytotoxic activity against Mycobacterium bovis analyzed by flow cytometry
Mhatre et al. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function
Schnabel et al. Influences of age and sex on leukocytes of healthy horses and their ex vivo cytokine release
WO2014173858A1 (en) Methods for stimulating antigen-specific t cell responses
KR20170110297A (ko) 천연물 소재의 면역증강 검사법 및 상기 검사법을 활용한 맞춤형 식단 제공방법
Boggiatto et al. Enhancing the detection of Brucella-specific CD4+ T cell responses in cattle via in vitro antigenic expansion and restimulation
WO2011027810A1 (ja) アレルゲン特異的リンパ球の検出方法
RU2523418C1 (ru) Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола
Al-Khalifa Flow cytometric analysis of avian natural killer cell activity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10813758

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011529930

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10813758

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1