CN112795539B - 一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法 - Google Patents

一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，本发明提供了一种通过合适的培养以及刺激条件，真实的模拟造血干细胞应激造血的体内条件，并通过固定破膜流式分析技术，检测出准确的造血干细胞胞内的细胞因子表达情况的染色技术。本发明操作较为简便，对细胞悬液制备操作的要求较低，只需要熟练掌握细胞培养的技术并按照本技术设计的条件培养就能获得与体内感染真实情况相符的应激造血的造血干细胞。且不需要制备芯片等操作，成本较低。本发明通过化合物将会分泌出胞外的细胞因子滞留在细胞内，可以有效准确地测量细胞胞内及胞外的细胞因子表达情况。为进一步地深入探讨造血干前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。

Description

一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法
技术领域
本发明涉及流式细胞技术领域，具体地，涉及一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法。
背景技术
流式分析技术是一种功能强大的技术，在免疫学，分子生物学，细菌学，病毒学，肿瘤生物学和传染病监测中有广泛且深入的应用，可以高精度地研究细胞群体。流式分析技术能够同时分析单个细胞的多个参数，比如：细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积等。
流式分析技术是一项可以通过对应的可见光散射和荧光参数快速分析包裹在缓冲盐溶液中流经单个或多个激光的单个细胞或颗粒的技术。通过可见光散射在前侧向角的测量指示细胞的相对大小与颗粒度。通过使细胞表达荧光蛋白(如：绿色荧光蛋白GFP)，或通过荧光耦联抗体(如：CD3-FITC)和荧光染料染色(如：碘化丙锭)，使样品细胞带上相应的荧光信息。
在进行检测的时候，将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的鞘液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过激光检测区域，检测器会检测细胞或颗粒的散射光。前面的检测器检测前向散射光(FS)，放置在侧面的多个检测器检测侧向散射光(SS)，FS与细胞的大小相关，SS则与细胞颗粒度成比例。因此，通常可根据细胞大小和颗粒度差异区分细胞群。荧光检测器则检测被染色的细胞或颗粒发射的荧光。不同样品细胞上带有的荧光受到激发而发出不同的信号，被仪器检测，从而能得到所需信息。
由于在细胞内，蛋白的表达与分泌不是同样的机制，有些细胞因子表达但不分泌，有些细胞因子表达就会分泌。由于目前由于缺少检测造血干细胞胞内细胞因子的方法，严重阻碍了深入了解造血干细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制。
虽然，微流体单细胞蛋白质组学分析能够在单细胞水平上同时检测造血干细胞中多达15种的分泌蛋白。这一技术需要用到一种单细胞条形码芯片，该芯片由1040微室组成，每个微室装载单个细胞，且每个微室装载着条形码，每条条纹涂着一种独特的抗体。通过这种装置，能在单细胞水平上同时检测细胞的十多种分泌蛋白的水平。
但是，微流体单细胞蛋白质组学技术通量仍然较低，通常一次只能检测几千个细胞；微流体单细胞蛋白质组学技术需要制备芯片成本较高；微流体单细胞蛋白质组学技术操作繁琐，对操作者技术有一定要求，同时也更为耗时。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供了一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，以适用于检测造血干细胞与祖细胞(Hematopoietic stem andprogenitor cell，HSPC)。该方法基于流式分析技术，通过合适的活化刺激剂与培养条件以模拟细胞在体内的真实情况。该方法能够更大程度地在体外检测到细胞胞内的细胞因子的表达情况，为进一步地深入探讨造血前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。
本发明的第一个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。
本发明的第二个目的提供一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物。
本发明的第二个目的提供一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法。
本发明的第三个目的提供一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过用两个模型，分别是LPS+Pam3CSK4(脂多糖和三酰酯肽)诱导造血干细胞应激造血的感染模型，以及Hepa1-6成瘤小鼠模型的脾脏基质细胞上清诱导造血干细胞的应激造血的模型，在特定的培养条件(IMDM+10％FBS)下，加入干细胞生长因子(StemCell Factor,SCF)、促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)、Flt3 Ligand蛋白(Flt3L)以维持造血干细胞的活性，并使其在体外扩增。最后通过PMA(豆蔻酰佛波醇乙酯)和ION(离子霉素)的使用，加快蛋白质合成；并通过BFA(布雷菲德菌素a)使细胞因子存储在细胞内。
由于造血干细胞在体外的培养条件较为苛刻，需要加入细胞因子以维持其活性与功能，因此对于造血干细胞的体外培养条件的摸索是很有必要的。此外，活化刺激剂的组合及浓度对于能否更大程度检测到造血干细胞胞内表达因子的水平也是至关重要的。
从而发明人发现了最合适的培养条件和活化刺激剂的种类及浓度，培养条件为IMDM+10％FBS，细胞因子组合为SCF+TPO+Flt3L，活化刺激剂组合为PMA+ION+BFA或PMA+Monensin，每个刺激的浓度为PMA 25ng/mL、ION 1μg/mL、BFA 5μg/mL、Monensin 2μM。进而通过BD公司的固定破膜试剂盒，检测造血干细胞胞内细胞因子的表达。
因此本发明要求保护一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，含有PMA、ION和BFA。
在流式细胞分析技术中使用活化刺激剂诱导细胞活化，进一步刺激细胞分泌细胞因子，从而达到放大但是仍能反应原有细胞分子分泌情况的目的。
优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
优选地，所述ION的工作浓度为1～10μg/mL。
更优选地，所述ION的工作浓度为1μg/mL。
优选地，所述BFA的工作浓度为1～50μg/mL。
更优选地，所述BFA的工作浓度为5μg/mL。
因此本发明要求保护一种用于细胞流式分析的活化刺激剂的组合物，含有PMA和Monensin。
优选地，所述Monensin的工作浓度为1～20μM。
更优选地，所述Monensin的工作浓度为2μM。
优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法，利用所述的组合物。
优选地，所述PMA的工作浓度为10～100ng/mL。
更优选地，所述PMA的工作浓度为25ng/mL。
优选地，所述ION的工作浓度为1～10μg/mL。
更优选地，所述ION的工作浓度为1μg/mL。
优选地，所述BFA的工作浓度为1～50μg/mL。
更优选地，所述BFA的工作浓度为5μg/mL。
优选地，所述Monensin的工作浓度为1～20μM。
更优选地，所述Monensin的工作浓度为2μM。
优选地，用含有所述组合物的及细胞因子的培养基培养待测干细胞，共培养，所述细胞因子为SCF、TPO和Flt3L。
更优选地，共培养4～6小时。
进一步优选地，共培养6小时。
优选地，所述细胞因子为SCF、TPO和Flt3L的组合。
更优选地，所述SCF的工作浓度为20～50ng/mL。
进一步优选地，所述SCF的工作浓度为50ng/mL。
更优选地，所述TPO的工作浓度为20～50ng/mL。
进一步优选地，所述TPO的工作浓度为20ng/mL。
更优选地，所述Flt3L的工作浓度为50～200ng/mL。
进一步优选地，所述Flt3L的工作浓度为100ng/mL。
优选地，所述培养基为IMDM+10％FBS。
本发明还要求保护一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，利用任一所述的细胞培养方法培养待测细胞。
优选地，与细胞表面抗体反应；洗涤细胞，离心，去上清，打散细胞；进行固定破膜，与细胞内部抗体；进行流式分析。
通过与细胞表面(胞外)抗体和细胞内部(胞内)抗体进行反应，标记出待测细胞，并对待测分子标记进行标记。
优选地，所述干细胞为造血干细胞或祖细胞。
优选地，所述干细胞为小鼠造血干和/或祖细胞：待测细胞为造血干细胞即Linlow/-Sca1+c-Kithigh造血干细胞、多潜能干细胞；待测细胞为造血祖细胞即Linlow/-Sca1-c-Kithigh定向祖细胞；
优选地，所述干细胞为人造血干和/或祖细胞：待测细胞为造血干细胞即Lin-CD34+CD38-造血干细胞、多潜能干细胞；待测细胞为造血祖细胞为Lin-CD34+CD38-定向祖细胞。
发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种通过合适的培养以及刺激条件，真实地模拟造血干细胞应激造血的体内条件，并通过固定破膜流式分析技术，检测出准确的造血干细胞胞内的细胞因子表达情况的染色技术。与微流体单细胞蛋白质组学分析相比，本发明操作较为简便，对细胞悬液制备操作的要求较低，只需要熟练掌握细胞培养的技术并按照本技术设计的条件培养就能获得与体内感染真实情况相符的应激造血的造血干细胞。且不需要制备芯片等操作，成本较低。
本发明首次优化检测造血干细胞胞内细胞因子表达，通过化合物将会分泌出胞外的细胞因子滞留在细胞内，可以有效准确地测量细胞胞内及胞外的细胞因子表达情况。为进一步地深入探讨造血干前体细胞的细胞因子表达与分泌的调控机制奠定技术基础。
附图说明
图1为在感染模型中优化化合物的组合。
图2为在荷瘤小鼠脾脏基质上清模型中优化化合物的组合。
图3为在感染模型中优化培养条件。
图4为在荷瘤小鼠脾脏基质上清模型中优化培养条件。
图5为优化的化合物组合及培养条件适用于检测小鼠造血干细胞细胞因子。
图6为优化的化合物组合及培养条件适用于检测人造血干细胞细胞因子。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
细胞因子 细胞因子来源 工作浓度
LPS Sigma，货号：L2630 100ng/mL
Pam3CSK4 Invivo Gene，货号：tlrl-pms 1μg/mL
SFEM STEM CELL，货号：09600  
实施例1流式细胞分析LPS+Pam3Csk4刺激细胞模型的干细胞的细胞因子
一、实验方法
(一)LPS+Pam3Csk4刺激细胞模型的小鼠造血干细胞(Linlow/-Sca1+c-Kithigh LSK细胞)的培养
在感染模型下，用LPS+Pam3Csk4刺激细胞，该模型的培养体系是：
(1)将小鼠造血干细胞(Linlow/-Sca1+c-Kithigh LSK细胞)培养在SFEM培养基中，用LPS+Pam3Csk4刺激细胞，按照工作浓度加入SCF(干细胞生长因子PEPEOTECH，货号：250-0350ng/mL)培养12小时；
(2)仍然将细胞处于LPS+PamCsk43的刺激下，用活化刺激剂刺激细胞加快蛋白质合成并使细胞因子存储在细胞内；
(3)刺激6个小时后，以进行固定破膜以进行流式分析检测细胞内的细胞因子的表达水平。
使用的细胞因子及用量见表1。
表1培养造血干细胞添加的活化刺激剂与工作浓度：
细胞因子 细胞因子来源 工作浓度
PMA Sigma，货号：D8139 25ng/mL
ION Merck millipore，货号：407951-1MG 1μg/mL
BFA Biolegend，货号：420601 5μg/mL
ConA Sigma，货号：C5275-5MG 5μg/mL
Monensin ebioscience，货号：00-4505-51 2μM
(二)固定破膜及流式分析
1、在加入化合物刺激培养6小时后，加入胞外抗体在96孔板内进行染色，胞外抗体的来源和具体实验条件见表2。
表2胞外抗体的来源和具体实验条件：
抗体名称 抗体来源 染色条件与时间
Lin-Pc5.5 BD，货号：561317 4℃，30分钟，1μL/孔
Sca1-AF700 Invitrogen，货号：56-5981-82 4℃，30分钟，1μL/孔
2、将细胞从96孔板收到流式管中，每个孔用PBS洗两次。加入2mL的PBS进行终止，并离心(4℃，450g，7mins)。倒干上清，并震散细胞。
3、加入固定破膜试剂盒的固定破膜液(BD，货号554714)，进行固定破膜(每管100μL，在加的同时震荡细胞，将细胞置于4℃固定30mins)。
4、加入500μL的固定破膜试剂盒的Washing Buffer进行终止，离心(4℃，400g，8mins)。倒干上清，并震散细胞。此步操作进行两次。
5、用50μL的Washing Buffer重悬，加入胞内抗体进行染色，对细胞进行染色标记，胞内抗体的来源和具体实验条件见表3。
表3胞内抗体的来源和具体实验条件：
抗体名称 抗体来源 染色条件与时间
CD117-Pc7 BD，货号：558163 4℃，30分钟，1mL/孔
GM-CSF-BV421 BD，货号：564747 4℃，30分钟，1mL/孔
IL-6-PE BD，货号：554401 4℃，30分钟，0.5mL/孔
TNFα-PE-CF594 Biolegend，货号：506346 4℃，30分钟，1mL/孔
6、加500μL的Washing Buffer终止，离心(4℃，400g，8mins)。倒干上清，并震散细胞。此步操作进行两次。
7、用100μL的PBS重悬，上流式分析。
二、实验结果
结果图1所示，左图为统计图，右图分别是筛选到的比较好的两种活化刺激剂的组合方式(Ⅰ：PMA+Monensin，Ⅱ：PMA+ION+BFA)的流式代表图。其中，Ⅱ这种组合方式检测胞内细胞因子的效率更为突出。
实施例2流式细胞分析荷瘤小鼠脾脏基质上清诱导造血干细胞应激造血的干细胞的细胞因子
一、实验方法
(一)荷瘤小鼠脾脏基质上清诱导造血干细胞应激造血模型的小鼠造血干细胞(Linlow/-Sca1+c-Kithigh LSK细胞)的培养
该模型的培养体系是：
(1)将小鼠造血干细胞(Linlow/-Sca1+c-Kithigh LSK细胞)培养在SFEM培养基中，用荷瘤小鼠脾脏基质上清刺激细胞，按照工作浓度加入SCF(干细胞生长因子)培养4天；
(2)仍然将细胞处于脾脏基质上清的刺激下，用活化刺激剂刺激细胞加快蛋白质合成并使细胞因子存储在细胞内(活化刺激剂用量见实施例1表1)。
(3)刺激6个小时后，以进行固定破膜以进行流式分析检测细胞内的细胞因子的表达水平。
(二)固定破膜及流式分析
同实施例1。
二、实验结果
结果图2所示，左图为统计图，右图分别是筛选到的比较好的两种活化刺激剂的组合方式(Ⅰ：PMA+Monensin，Ⅱ：PMA+ION+BFA)的流式代表图。其中，Ⅱ这种组合方式检测胞内细胞因子的效率更为突出。
实施例3培养基和细胞因子流式细胞分析对LPS+Pam3Csk4刺激细胞模型的干细胞的细胞因子
一、实验方法
按照实施例1的实验方法(一)中(1)进行处理(在SFEM培养基中，用LPS+Pam3Csk4刺激细胞，按照工作浓度加入SCF培养12小时)，后续将细胞转移到培养基中：IMDM+10％FBS中，按工作浓度加入细胞因子SCF、TPO和Flt3L中的一种或几种，同时加入活化刺激剂刺激6小时(活化刺激剂用量见实施例1表1)。
表4细胞因子的用量：
细胞因子 细胞因子来源 工作浓度
Stem Cell Factor(SCF) PEPEOTECH，货号：250-03 50ng/mL
TPO PEPEOTECH，货号：315-14 20ng/mL
FLT3 PEPEOTECH，货号：250-31L 100ng/mL
然后按照实施例1的方法进行的后续固定破膜及流式分析。
二、实验结果
结果图3所示，左图为统计图，右图为培养方式的代表图。两种活化刺激剂的组合方式(Ⅰ：PMA+Monensin，Ⅱ：PMA+ION+BFA)的活化刺激剂下，均发现IMDM+FBS培养条件下，加入这三种细胞因子SCF+TPO+Flt3L的组合，能够更大程度检测到造血干细胞胞内因子的表达情况。
实施例4培养基和细胞因子流式细胞分析对荷瘤小鼠脾脏基质上清诱导造血干细胞应激造血的干细胞的细胞因子
一、实验方法
按照实施例2的实验方法(一)中(1)进行处理(在SFEM培养基中，用荷瘤小鼠脾脏基质细胞上清刺激细胞，按照工作浓度加入SCF培养4天)，后续将细胞转移到培养基中：IMDM+10％FBS中，按工作浓度加入细胞因子SCF、TPO和Flt3L(细胞因子的用量见实施例3的表4)的一种或几种，同时加入活化刺激剂刺激6小时(活化刺激剂用量见实施例1表1)。
然后按照实施例1的方法进行的后续固定破膜及流式分析。
二、实验结果
结果图4所示，左图为统计图，右图为培养方式的代表图。两种活化刺激剂的组合方式(Ⅰ：PMA+Monensin，Ⅱ：PMA+ION+BFA)的活化刺激剂下，均发现IMDM+FBS培养条件下，加入这三种细胞因子SCF+TPO+Flt3L的组合，能够更大程度检测到造血干细胞胞内因子的表达情况。
实施例5流式细胞分析小鼠造血干细胞的细胞因子
一、实验方法
取Hepa1-6荷瘤小鼠骨髓及脾脏新鲜分离的造血干细胞进行培养：IMDM+10％FBS中，按工作浓度加入细胞因子SCF、TPO和Flt3L(用量同实施例3的表4)，同时活化刺激剂刺激6小时(活化刺激剂用量见实施例1表1)，然后按照实施例1的方法进行的后续固定破膜及流式分析。
二、实验结果
结果图5所示，检测Hepa1-6荷瘤小鼠模型中的小鼠骨髓与脾脏的造血干、祖细胞的细胞因子的表达，检测效果。脾脏的LSK细胞表达GM-CSF水平并要强于我发表在JCI的文章《Spleen mediates a distinct hematopoietic progenitor response supportingtumor-promoting myelopoiesis》中的荷瘤小鼠脾脏的造血干细胞表达细胞因子的水平，表明该方法更大程度地检测到造血干细胞胞内细胞因子的表达水平。
实施例6流式细胞分析人类造血干细胞的细胞因子
一、实验方法
将人CD34+Lin-造血干细胞用SFEM培养基中，按照工作浓度加入SCF培养3天后，用LPS+Pam3Csk4刺激细胞12h，后续将细胞转移到培养基中：IMDM+10％FBS中，按工作浓度加入SCF、TPO和Flt3L(细胞因子的用量见实施例3的表4)，同时加入活化刺激剂刺激6小时(活化刺激剂用量见实施例1表1)。
然后按照实施例1的方法进行的后续固定破膜及流式分析。
其中，使用胞外抗体和胞内抗体如5和表6所示。
表5固定破膜胞内抗体来源种类与染色条件：
抗体名称 抗体来源 染色条件与时间
Lin-FITC BioLegend，货号：348801 4℃，30mins
CD34-Pc7 BioLegend，货号：343516 4℃，30mins
CD38-PE BioLegend，货号：303506 4℃，30mins
表6固定破膜胞外抗体来源种类与染色条件：
抗体名称 抗体来源 染色条件与时间
GM-CSF-PE-CF594 BD,货号：562857 4℃，30mins
IL-6-APC BioLegend，货号：501112 4℃，30mins
TNF-α-ef594 Invitrogen，货号：48-7349-42 4℃，30mins
二、实验结果
结果图6所示，本方法能够检测外周血(A图)，脐带血(B图)的造血干细胞的细胞因子的表达情况，并其具有很好的检测结果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种细胞流式分析干细胞细胞因子的细胞培养方法，其特征在于，利用组合物培养待测干细胞，所述干细胞为造血干细胞或祖细胞；所述组合物含有PMA、ION和BFA，所述PMA的工作浓度为25ng/mL；所述ION的工作浓度为1μg/mL；所述BFA的工作浓度为5μg/mL。
2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，用含有权利要求1中所述组合物及细胞因子的培养基培养待测干细胞，共培养，所述细胞因子为SCF、TPO和Flt3L。
3.根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征在于，所述培养基为IMDM+10％FBS。
4.一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一所述的细胞培养方法培养待测细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞流式分析干细胞细胞因子的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一所述的细胞培养方法培养待测细胞，与细胞表面抗体反应；洗涤细胞，离心，去上清，打散细胞；进行固定破膜，与细胞内部抗体反应；进行流式分析。
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