CN108828226A - 一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，包括以下步骤：S1、取全血加培养液稀释；S2、加佛波醇脂和钙离子酶素，培养6h，且在培养的后4h加入莫能酶素，得待检测细胞；S3、取待检测细胞加细胞表面标记抗体染色，用全血标本溶解红细胞，染色缓冲液洗，加多聚甲醛避光固定，加透膜缓冲液透膜，加牛血清白蛋白和小鼠血清封闭,加细胞因子抗体染色，加透膜缓冲液洗，加染色缓冲液洗，得染色后的细胞；S4、在流式细胞仪上进行检测。本发明提出的方法，适用范围广，细胞因子分泌细胞的比率高，且实验数据与对照组数据具有统计学意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。
背景技术
流式细胞仪法是目前大多数研究者检测外周血标本中分泌细胞因子的常用方法。实验中，大家往往习惯上将外周血标本中的单个核细胞(PBMC)分离或直接将T细胞亚群分选后进行检测。然而对于一些分泌量比较少的细胞因子，如IL-17、IL-4、IL-22等，因为最后得到的数据都比较低，所以很多实验数据在与对照组比较时没有统计学意义。因为一种细胞因子的分泌需要其它细胞因子的辅助作用，而血清中存在多种细胞因子，如Manel N等人报道，在无血清存在时，初始CD4+T细胞分泌IL-17依赖于TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21或IL-23的存在(Nat Immunol.2008Jun；9(6):641-9)。基于此，本发明提出了一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法。
一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，包括以下步骤：
S1、取500μl全血加500μl不完全rpmi-1640培养液稀释，得混合物A；
S2、向混合物A中加入终浓度为15～25ng/ml的佛波醇脂和终浓度为0.5～1.5μg/ml的钙离子酶素，得混合物B，然后将混合物B在24孔培养板内培养6h，且在培养的后4h加入终浓度为2～3μmol/L的莫能酶素阻断细胞因子分泌，培养后即为待检测细胞；
S3、取步骤S2培养后的待检测细胞100μl，加入细胞表面标记抗体，在4℃条件下避光染色30min，再用全血标本溶解红细胞，然后用1ml染色缓冲液洗2次，加入500μl质量浓度为2％的多聚甲醛，在4℃条件下避光固定30min，加500μl透膜缓冲液，在4℃条件下避光透膜15min，加入20μl质量浓度为5％的牛血清白蛋白和5μl小鼠血清，在4℃条件下避光封闭30min,加入细胞因子抗体，在4℃条件下避光染色30min，加入1ml透膜缓冲液洗2次，最后加入1ml染色缓冲液洗1次，得染色后的细胞；
S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。
优选的，所述培养的温度为37℃，培养环境中CO2的浓度为5％。
优选的，所述佛波醇脂的终浓度为20ng/ml，钙离子酶素的终浓度为1μg/ml，莫能酶素的终浓度为2.5μmol/L。
优选的，所述细胞表面标记抗体为CD3-PeCy5.5、CD4、TCRγδ-PE中的任意几种。
优选的，所述染色缓冲液为5％胎牛血清、0.1％叠氮钠和余量的磷酸缓冲液的混合物。
优选的，所述透膜缓冲液为质量浓度为0.1％的皂素。
优选的，所述细胞因子抗体为IL-17A、IFN-γ、IL-4或IL-22中的任意几种。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提出的方法，适用范围广，对于分泌量比较少的细胞因子也适用，因为一种细胞因子的分泌需要其它细胞因子的辅助作用，而血清中存在多种细胞因子，选用全血标本可以提高细胞分泌细胞因子的能力，另外我们同时在全血标本中加入合适浓度的佛波醇脂、钙离子酶素和莫能酶素，可以将细胞分泌细胞因子的能力最大程度地放大，并经实验证明，与分离出的PBMC相比，全血标本检测到的各细胞因子分泌细胞的比率均明显升高，且实验数据与对照组数据具有统计学意义。
附图说明
图1为本发明中实施例的检测结果；
图2为本发明中采用PBMC法的检测结果；
图3为本发明中全血法和PBMC法的标本中检测到的CD3+T细胞、γδT细胞、CD3+γδ-CD8+T细胞和CD3+γδ-CD8-T细胞中分泌IL-17细胞的含量图；
图4为本发明中全血法和PBMC法的标本中检测到的CD3+T细胞、γδT细胞、CD3+γδ-CD8+T细胞和CD3+γδ-CD8-T细胞中分泌IFN-γ细胞的含量图。
图中，Whole Blood为全血法，PBMC为PBMC法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
本发明提出的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，包括以下步骤：
S1、取500μl全血加500μl不完全rpmi-1640培养液稀释，得混合物A；
S2、向混合物A中加入终浓度为15～25ng/ml的佛波醇脂和终浓度为0.5～1.5μg/ml的钙离子酶素，得混合物B，然后将混合物B在24孔培养板内培养6h，且在培养的后4h加入终浓度为2～3μmol/L的莫能酶素阻断细胞因子分泌，培养后即为待检测细胞；
S3、取步骤S2培养后的待检测细胞100μl，加入CD3-PeCy5.5和TCRγδ-PE，在4℃条件下避光染色30min，再用全血标本溶解红细胞，然后用1ml染色缓冲液洗2次，加入500μl质量浓度为2％的多聚甲醛，在4℃条件下避光固定30min，加500μl透膜缓冲液，在4℃条件下避光透膜15min，加入20μl质量浓度为5％的牛血清白蛋白和5μl小鼠血清，在4℃条件下避光封闭30min,加入IL-17A-FITC和IFN-γ-FITC，在4℃条件下避光染色30min，加入1ml透膜缓冲液洗2次，最后加入1ml染色缓冲液洗1次，得染色后的细胞；
S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。
本发明中，培养的温度为37℃，培养环境中CO2的浓度为5；染色缓冲液为5％胎牛血清、0.1％叠氮钠和余量的磷酸缓冲液的混合物。
实验
外周血标本：采集健康测试者的外周静脉血5ml，共10例。
实验过程：
实验一组：采用实施例的方法进行检测，即全血法；
实验二组：采用PBMC法进行检测，具体操作如下：S1、外周静脉血3ml，肝素抗凝，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，收集中性粒细胞，红细胞用0.83％氯化氨溶解；S2、1×106外周血单个核细胞加入500μl不完全rpmi-1640培养液和500μl新生小牛血清重悬，再按照与实施例相同的培养方法进行培养，即得1-2×106细胞；S3、取1-2×106细胞使用与实施例相同染色方法进行染色，得染色后的细胞；S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。
对照一组为实验一组的对照组，即在培养过程中单加莫能酶素，其他条件同实施例。
对照二组为实验二组的对照组，即在培养过程中单加莫能酶素，其他条件同实验二组。
实验组和对照组获取数据应用CellQuest software(BD Biosciences)和WinMDI2.8软件分析。
实验结果表明：全血标本中分别检测到的CD3+T细胞、γδT细胞、CD3+γδ-CD8+T细胞和CD3+γδ-CD8-T细胞中分泌IL-17细胞的比例均明显的高于其分别在PBMC中检测到的比例(1.25％、7.28％、0.93％、2.63％vs 0.1％、0.44％、0.14％、0.19％，p<0.05)。同样地，全血标本中检测到的各T细胞亚群分泌IFN-γ的细胞的比例也均明显的高于其分别在PBMC中检测到的结果(9.52％、48.38％、14.21％、10.9％vs 2.47％、26.15％、4.22％、1.72％，p<0.05)。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取500μl全血加500μl不完全rpmi-1640培养液稀释，得混合物A；
S2、培养：向混合物A中加入终浓度为15～25ng/ml的佛波醇脂和终浓度为0.5～1.5μg/ml的钙离子酶素，得混合物B，然后将混合物B在24孔培养板内培养6h，且在培养的后4h加入终浓度为2～3μmol/L的莫能酶素阻断细胞因子分泌，培养后即为待检测细胞；
S3、染色：取步骤S2培养后的待检测细胞100μl，加入细胞表面标记抗体，在4℃条件下避光染色30min，再用全血标本溶解红细胞，然后用1ml染色缓冲液洗2次，加入500μl质量浓度为2％的多聚甲醛，在4℃条件下避光固定30min，加500μl透膜缓冲液，在4℃条件下避光透膜15min，加入20μl质量浓度为5％的牛血清白蛋白和5μl小鼠血清，在4℃条件下避光封闭30min,加入细胞因子抗体，在4℃条件下避光染色30min，加入1ml透膜缓冲液洗2次，最后加入1ml染色缓冲液洗1次，得染色后的细胞；
S4、将步骤S3得到的染色后的细胞在流式细胞仪FACSCalibur上进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃，培养环境中CO2的浓度为5％。
3.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述佛波醇脂的终浓度为20ng/ml，钙离子酶素的终浓度为1μg/ml，莫能酶素的终浓度为2.5μmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述细胞表面标记抗体为CD3-PeCy5.5、CD4、TCRγδ-PE中的任意几种。
5.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述染色缓冲液为5％胎牛血清、0.1％叠氮钠和余量的磷酸缓冲液的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述透膜缓冲液为质量浓度为0.1％的皂素。
7.根据权利要求1所述的一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法，其特征在于，所述细胞因子抗体为IL-17A、IFN-γ、IL-4或IL-22中的任意几种。
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| CN201810408419.9A CN108828226A (zh) | 2018-05-02 | 2018-05-02 | 一种提高外周血白细胞分泌细胞因子检测率的方法 |
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2018
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| CN110672500B (zh) * | 2019-09-29 | 2021-11-26 | 杭州联科生物技术股份有限公司 | 一种非肝素抗凝血液样本的Th检测方法 |
| CN112795539A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 中山大学 | 一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法 |
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