CN115851610A - 产生抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人白介素‑6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明制备的细胞株所产生的单克隆抗体具有较高的特异性。利用本发明制备的细胞株所产生的单克隆抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

Description

产生抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人白介素-6单克隆抗体。

背景技术

白细胞介素-6(Interleukin-6)，简称白介素-6(IL-6)，是一种细胞因子是由免疫细胞作用于其它细胞所产生的蛋白质，白介素-6升高通常提示体内有炎症反应，在感染、外伤、手术、应激反应、肿瘤产生以及其它情况的急性炎症反应过程中，会快速生成白介素-6，它在血液中水平的高低，与炎症、病毒感染以及自身免疫性疾病密切相关。

白介素6有助于评价感染性疾病(如肺炎)，也有助于评价糖尿病、心血管病、风湿性疾病(如类风湿关节炎)。正常人血液当中白介素-6含量非常低，不能测出，如果白介素-6水平升高，提示有以上疾病，尤其是感染性疾病，随着炎症好转，白介素-6水平可逐渐下降。

在病理状态下白介素-6可大量分泌进入血液循环，检测白介素-6对于了解病情、判断预后都有非常重要的意义。

发明内容

本发明以真核表达系统293细胞表达的重组白介素-6作为免疫原免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，利用ELISA法克隆化筛选出能稳定分泌抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。利用已制备的抗人白介素-6单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以白介素-6作为检测抗原，进行抗体配对试验，获得能检测天然白介素-6的抗体配对，并以此建立了能检测天然白介素-6的双抗体夹心ELISA方法。

本发明首先提供了一种产生抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2022242或CCTCC NO:C2022228。

本发明还提供了上述的杂交瘤细胞株在制备抗人白介素-6单克隆抗体中的应用。

本发明还提供了上述杂交瘤细胞株的制备方法，其包括：

以重组白介素-6作为免疫原免疫小鼠；然后，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得融合细胞，对融合细胞进行筛选获得稳定分泌抗人白介素-6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

其中，所述重组白介素-6的氨基酸序列为SEQ ID NO:1

PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM。

在根据本发明的一个实施方案中，所述小鼠为Balb/c小鼠。

在根据本发明的一个实施方案中，所述免疫小鼠包括基础免疫，所述基础免疫是通过包括下述步骤的方法实现的：将重组白介素-6与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射和腹腔注射施加于8周龄的Balb/c小鼠。

在根据本发明的一个实施方案中，所述免疫小鼠还包括追加免疫，所述追加免疫是通过包括下述步骤的方法实现的：

于基础免疫后第14天，将所述重组白介素-6与等量的弗氏不完全佐剂乳化后，追加免疫一次；

和/或，于基础免疫后第28天，将所述重组白介素-6与等量的弗氏不完全佐剂乳化后，追加免疫一次。

在根据本发明的一个实施方案中，所述细胞融合是通过包括下述步骤的方法实现的：

将脾细胞与骨髓瘤细胞以2：1混合，以电融合方法融合细胞，将融合细胞悬于含胎牛血清的HAT培养液中，均匀铺于数块细胞培养板中，并置于CO₂中在37℃培养。

在根据本发明的一个实施方案中，所述融合细胞是通过包括下述的方法进行筛选的：

将重组白介素-6包被于细胞培养板的微孔中，以间接ELISA法对各孔细胞上清进行筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。

本发明还提供了利用上述的杂交瘤细胞株制备的抗人白介素-6单克隆抗体。

本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备检测抗人白介素-6的制剂中的应用。

本发明所述保藏号为CCTCC NO:C2022242和CCTCC NO:C2022228的杂交瘤细胞株，于2022年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：杂交瘤细胞株4-IL6-2-F7和杂交瘤细胞株4-IL6-7-E5，地址：中国武汉大学。

本发明通过杂交瘤细胞融合技术，制备了抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和7E5。利用杂交瘤细胞株2F7和7E5分泌相应的抗人白介素-6单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以白介素-6作为检测抗原，进行抗体配对试验，成功建立了检测天然血清白介素-6的双抗体夹心ELISA方法。

附图说明

图1表示单克隆抗体2F7和7E5的SDS-PAGE电泳图，其中M为标准蛋白，1为单克隆抗体2F7，2为单克隆抗体7E5。

图2表示白介素-6的双抗体夹心ELISA体系检测白介素-6与Roche公司的

IL-6试剂测定结果的相关性，其中，横坐标表示Roche公司检测白介素-6的浓度，纵坐标表示本发明提供的单克隆抗体检测白介素-6的浓度，单位均为pg/ml。

图3表示免疫层析卡装置，其中1为上样垫，2为标记物垫，3为检测线，4为质控线，5为硝酸纤维膜，6为吸水纸、7为衬板。

图4表示本发明提供的单克隆抗体应用于荧光免疫层析双抗体夹心体系检测白介素-6，其中，横坐标表示白介素-6的浓度，单位为pg/ml，纵坐标表示T值与C值的比值。

图5表示白介素-6的荧光免疫层析双抗体夹心体系检测白介素-6与Roche公司的

IL-6试剂测定结果的相关性，其中，横坐标表示Roche公司荧光免疫层析检测白介素-6的T/C比值，纵坐标表示本发明提供的单克隆抗体荧光免疫层析检测白介素-6的T/C比值。

本发明提供的杂交瘤细胞株的保藏号分别为CCTCC NO:C2022242和CCTCC NO:C2022228，保存于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072)。

具体实施方式

本发明以真核表达系统293细胞表达的重组白介素-6作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，杂交瘤细胞通过电融合技术融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化，所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌抗人白介素-6特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和7E5，ELISA和荧光免疫层析结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。

本发明建立了人白介素-6的ELISA检测体系：应用抗人白介素-6抗体2F7为捕获抗体，抗人白介素-6抗体7E5为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，能够准确检测血清中的天然白介素-6，以此成功建立检测天然白介素-6的双抗体夹心ELISA方法。

材料和来源

实验动物Balb/C小鼠购自重庆腾鑫生物技术有限公司。

细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

生工生物工程股份公司合成重组白介素-6。

HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。

纯化柱和填料购自美国GE公司。

其余试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1抗人白介素-6单克隆抗体的制备

1.抗人白介素-6单克隆抗体的制备

利用真核表达系统293细胞表达的重组白介素-6抗原，重组白介素-6的氨基酸序列为SEQ ID NO:1

PVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100μg/ml)。第14天，将真核表达系统293细胞表达的重组白介素-6与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100μg/ml)；第28天，再采用同样方式追加免疫一次，第35天，处死小鼠后取出小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以2:1混合，使用电融合方法融合细胞。将融合细胞悬于含胎牛血清的HAT培养液中，均匀铺于数块96孔细胞培养板中，并置于5％ CO₂中在37℃培养。用间接ELISA法进行筛选。筛选时，用白介素-6包被，对各孔细胞上清进行筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于5％ CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。

采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡0.5mL，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。

2、白介素-6单克隆抗体的纯化

将新鲜收集的腹水，在4℃，10000rpm条件下，离心15min，去除腹水表面油脂层，保留上清。将上清倒入量筒中，测量体积后倒入圆底高速离心管中，再加入等体积的VBS缓冲液稀释(VBS缓冲液(1000ml)：巴比妥0.737g，氯化钠8.766g，七水合硫酸镁0.197g，无水氯化钙0.033g，pH7.2)，混匀。按照每10mL稀释腹水/150mg二氧化硅粉末，称取二氧化硅，缓慢加入稀释腹水中，混匀，室温孵育30min，不时摇动。在4℃，10000rpm条件下，离心15min，离心结束后上清用0.45μm以下滤膜过滤。用B液(0.1M盐酸甘氨酸，pH2.7)冲洗层析柱，清洗5-10体积。用A液(A液(1000ml)：二水合磷酸二氢钠1.22g，十二水合磷酸氢二钠4.37g，pH7.0)平衡层析柱5-10体积，充分平衡后紫外基线调零。上样处理后的腹水，上样完毕后，继续A液平衡至紫外基线平稳。用B液洗脱层析柱，当紫外变化时收集洗脱峰于已经预加入并加入C液(1mol/L Tris-HCl，pH9.0)的收集管。收集结束后调节pH范围7-8。将洗脱样品装入已经处理过的透析袋中，对20倍以上的PBS溶液(PBS溶液(1000ml)：氯化钠8.00g，十二水合磷酸氢二钠4.50g，磷酸二氢钾0.135g，氯化钾0.201g，pH7.4)透析(2～8℃)6小时以上，更换3次透析液，将样品取出，用0.22μm滤器过滤，分装，放于-20℃保存。

3.单克隆抗体纯度的鉴定

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度

配制10mL 12％分离胶溶液，随即将分离胶灌注至两玻璃板之间，用双蒸水液封。15min后，分离胶完全凝固后倒出液封的双蒸水，用滤纸吸干。再配制5％浓缩胶，随即灌注在分离胶上，插入梳子，排除气泡。15min后浓缩胶凝固后小心拔出梳子，将电泳槽装满电泳缓冲液。样品与6×上样缓冲液按比例混合，沸水煮10min，离心，每孔上样量20μL。先120V电泳，当样品跑完浓缩胶后，调节电压至200V，直到溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。卸下玻璃板，用刮板划开玻璃板，刮下凝胶。用考马斯亮蓝染液微波炉中加热10min染色，倒弃染液，加入清水，震荡30min脱色，拍照，如图1，SDS-PAGE电泳图显示单克隆抗体的纯度较好。

4.ELISA鉴定抗白介素-6单克隆抗体

将真核表达系统293细胞表达的重组白介素-6抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将纯化的待鉴定单克隆抗体首孔稀释至1μg/mL，后倍比稀释作1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入二抗，1:3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。单克隆抗体2F7和7E5的ELISA效价检测结果如下表所示，其中，第1孔到11孔为抗体倍比稀释，从1:10000、

1:20000、……到1:10240000，其中第12孔为空白对照。

单克隆抗体2F7对白介素-6效价达到1:1024万；单克隆抗体7E5对白介素-6效价为1:64万。

实施例2双抗体夹心ELISA法检测白介素-6

1.HRP标记抗体

本法是以NaIO 4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：

1)HRP酶的准备：称取10mg HRP酶，加2mL纯水配置为5mg/ml的HRP液体，按照每mgHRP酶加入34μL计算，加340μLNaIO4，4℃避光放置，1h后，按照每mg HRP酶加入250μL的量加入乙二醇250μL，避光放置4℃，30min后转入透析袋中，用1mM醋酸缓冲液(pH 4.0～4.4)透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。

2)抗体的准备：0.01M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜，并测定蛋白浓度。

3)标记：抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合，加入1mol/LNa2CO3缓冲液(1:80)，调解反应的pH为9.5，25℃反应2～3h。

4)终止：新鲜配制0.1mol/L NaH4B(4mg/mL)，按照每mg HRP酶加入47μL。4℃放置2h后，转入透析袋。用0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.0～7.2)透析过夜，期间至少换液两次，避光。

5)HRP标记抗体的效价检测：将纯化的白介素-6抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板，加入350μl/孔的1％BSA进行封闭，37℃，2h。洗板后将HRP标记好的待鉴定单克隆抗体首孔稀释至1μg/ml，后倍比稀释作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白对照孔。37℃孵育40min，弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。HRP酶标记单克隆抗体2F7和7E5的效价检测结果如下表所示，其中，第1孔到11孔为抗体倍比稀释，从1:1000、1:2000、……到1:1024000，其中第12孔为空白对照。

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结果显示，2F7和7E5酶标抗体的效价均＞1:256000，满足应用要求。

6)分装保存：标记好的抗体用棕色EP管分装，并测定浓度，-20℃避光保存。

2.抗体配对及临床样本的检测

1)标本收集：

从第三军医大学第一附属医院收集临床血清标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5ml Ep管中，-80℃保存，并将医院罗氏试剂赋值结果录入电脑，做好编号。

2)标本检测：

选取单克隆抗体2F7作为捕获抗体，酶标单克隆抗体7E5作为检测抗体，白介素-6校准品为测定对象，检测方法如下：a.包被酶标板：用包被液将捕获抗体2F7稀释为5μg/ml，每孔加100μl，4℃包被过夜。b.将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。c.封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1h，洗涤3遍，甩干。d.用抗体稀释液将白介素-6校准品从500pg/ml开始倍比稀释，每孔加100μl，最后一孔为空白对照，做标准曲线。检测临床标本时，每个样本做3个梯度，原液，1：10稀释，1：100稀释，每孔加标本100μl，37℃孵育1h。e.洗板3遍，甩干。f.将相对应的酶标二抗以1：5000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育30min。g.洗板5遍，甩干。h.每孔加入100μl底物显色液，室温避光显色5min。i.每孔加入50μl终止液，450nm处读取吸光度值，同时制作标准曲线，根据标准曲线确定临床样本中白介素-6的含量，每个样本计算时选取OD值在标准曲线线性范围内的值进行计算。

图2表示双抗体夹心ELISA检测体系测定白介素-6与Roche公司的

IL-6试剂测定结果比较，纵坐标为本发明中涉及方法的检测结果，横坐标为Roche公司的

IL-6试剂测定结果，单位均为pg/mL。提示该检测体系与公认方法检测结果相关性良好，R平方0.9956，具有很好的检测准确度。

同时请参照表1，其中对白介素-6ELISA检测体系测定白介素-6与Roche公司的

IL-6试剂测定结果进行了比较，结果表明，对于阴性标本，二者之间的符合率为100％，对于阳性标本，二者之间的符合率为96.5％，总体符合率为96.7％。

表1新建ELISA体系与公认试剂检测结果比较

实施例3荧光免疫层析双抗体夹心检测白介素-6

1.荧光微球活化

取450ul MES缓冲液(PH6.0)，加入50ul荧光微球，混匀，在4℃，14000rpm条件下，离心15min，弃上清，加入MES缓冲液补齐至500ul体积，使用超声仪(宁波新芝生物科技，型号JY92-IIN)超声，使微球分散均匀，后加入EDC活化剂，室温孵育活化15min，活化结束后在4℃，14000rpm条件下，离心15min，弃上清，加入MES缓冲液补齐至500ul体积，用超声仪重悬微球清洗1次，在4℃，14000rpm条件下，离心15min，弃上清，加入MES缓冲液补齐至500ul体积。

2.荧光微球标记7E5抗体

活化微球500ul按0.1mg/ml加入2F7抗体50ug，混匀，室温孵育2.5h，加入甘氨酸-BSA封闭液封闭过夜。将封闭过夜的荧光微球标记抗体在4℃，14000rpm条件下，离心15min，弃上清，加储存液至500ul，超声混匀，避光保存于2-8℃冰箱。

3.荧光免疫层析卡制备

标记物垫喷金：按50ul荧光微球标记抗体/稀释液250ul，加入稀释液2500ul，混匀，采用喷金的形式将荧光微球标记抗体溶液均匀的喷在标记物垫上，在干燥房中平铺放置过夜，次日，将其裁剪成300mm×8.5mm小条。上样垫封闭：采用辊压式工艺将上样垫浸透上样垫封闭液，在干燥房中平铺放置过夜，次日，将其裁剪成300mm×18mm小条。硝酸纤维膜划线：T线为捕获抗体2F7，浓度为1.5mg/ml，以1ul/cm划线，C线为羊抗鼠IgG抗体，浓度为0.6mg/ml，以1ul/cm划线，放于55℃烤箱中过夜，次日，将其切成适合尺寸小条，按图3所示装置顺序组装成荧光免疫层析卡。

用组装好的荧光免疫层析卡检测罗氏试剂赋值后的白介素-6标本血清，图4结果显示，本发明提供的单克隆抗体2F7和7E5在荧光免疫层析双抗体夹心体系检测白介素-6中灵敏度高，特异性好。图5表示白介素-6的荧光免疫层析双抗体夹心体系检测白介素-6与Roche公司的

IL-6试剂检测结果的相关性，其中，纵坐标为本发明中涉及方法的检测结果，横坐标为Roche公司的/>

IL-6试剂测定结果。提示该检测体系与公认方法检测结果相关良好，R平方0.9703，具有很好的检测准确度。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

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Claims (10)

1.一种产生抗人白介素-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2022242或CCTCC NO:C2022228。

2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备抗人白介素-6单克隆抗体中的应用。

3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括：

以重组白介素-6作为免疫原免疫小鼠；然后，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得融合细胞，对融合细胞进行筛选获得稳定分泌抗人白介素-6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

其中，所述重组白介素-6的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述小鼠为Balb/c小鼠。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，

所述免疫小鼠包括基础免疫，所述基础免疫是通过包括下述步骤的方法实现的：将重组白介素-6与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射和腹腔注射施加于8周龄的Balb/c小鼠。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，

所述免疫小鼠还包括追加免疫，所述追加免疫是通过包括下述步骤的方法实现的：

于基础免疫后第14天，将所述重组白介素-6与等量的弗氏不完全佐剂乳化后，追加免疫一次；

和/或，于基础免疫后第28天，将所述重组白介素-6与等量的弗氏不完全佐剂乳化后，追加免疫一次。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述细胞融合是通过包括下述步骤的方法实现的：

将脾细胞与骨髓瘤细胞以2：1混合，以电融合方法融合细胞，将融合细胞悬于含胎牛血清的HAT培养液中，均匀铺于数块细胞培养板中，并置于CO2中在37℃培养。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述融合细胞是通过包括下述的方法进行筛选的：

将重组白介素-6包被于细胞培养板的微孔中，以间接ELISA法对各孔细胞上清进行筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于CO2中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。

9.利用如权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备的抗人白介素-6单克隆抗体。

10.如权利要求9所述的单克隆抗体在制备检测抗人白介素-6的制剂中的应用。

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