CN116731163A - 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents

抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116731163A
CN116731163A CN202310714896.9A CN202310714896A CN116731163A CN 116731163 A CN116731163 A CN 116731163A CN 202310714896 A CN202310714896 A CN 202310714896A CN 116731163 A CN116731163 A CN 116731163A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
asfv
pk205r
protein
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310714896.9A
Other languages
English (en)
Inventor
王爱萍
张改平
周景明
陈玉梅
刘燕凯
刘红亮
丁培阳
梁超
朱习芳
刘恩平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Longfor Modern Immunology Laboratory
Zhengzhou University
Original Assignee
Longfor Modern Immunology Laboratory
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Longfor Modern Immunology Laboratory, Zhengzhou University filed Critical Longfor Modern Immunology Laboratory
Priority to CN202310714896.9A priority Critical patent/CN116731163A/zh
Publication of CN116731163A publication Critical patent/CN116731163A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开了一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用，旨在为ASF的检测方法的开发提供生物材料。所述抗体重链可变区含如SEQ ID NO.1所示的DNA序列、如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，轻链可变区含如SEQ ID NO.3所示的DNA序列、如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；该抗体可应用于免疫学检测或抗体检测试剂盒中。本申请通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备获得抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，该抗体特异性强，效价高，亲和力高。本申请为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体和进行ASF的临床检测研究奠定了良好的基础。

Description

抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用
技术领域
本发明申请涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）属于非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfarvirus），且是该病毒科的唯一成员，主要感染家猪和野猪，病死率高达100%，可通过多途径传播，给全球养猪业造成了巨大损害。
ASFV粒子呈二十面体结构，平均直径约为200 nm，由内到外依次为内核、核壳、内囊膜、衣壳和包膜，共5层。ASFV基因组是一种线性双链DNA分子，基因组大小在170～190Kbp之间，编码151～167个开放阅读框（open reading frame, ORF），ASFV基因组编码68种结构蛋白，100多种非结构蛋白。ASFV结构蛋白包括包膜蛋白p24、pE402R、p12；衣壳蛋白p72、pE120R、pB438L；内囊膜蛋白p17、p54、pE248R、p12；核壳蛋白pp220四聚体（包括p150、p37、p34、p14）、pp62二聚体（包括p35、p15）、pS273R；内核蛋白p10、pA104L。结构蛋白是病毒粒子的重要组成成分，在病毒吸附、侵入和复制过程中都起到关键作用。ASFV基因组编码的众多非结构蛋白在病毒DNA复制与修复、核苷酸代谢、免疫逃逸等方面也发挥着重要作用。由于ASFV基因组庞大，绝大多数ASFV蛋白仍有待探索。pK205R蛋白是ASFV病毒的非结构蛋白，由K205R基因编码，该序列高度保守。分子量约为32kD，是病毒感染早期表达的蛋白，在病毒感染4h后就已出现，在细胞质中呈弥散型表达，定位于ASFV“病毒工厂”。pK205R蛋白是ASFV的主要抗原之一，可在猪体内诱导强烈的免疫反应。最新的研究表明，pK205R蛋白具有激活细胞自噬和炎症反应的功能。
研究显示ASFV抗体检测主要针对能够诱导猪产生强烈免疫应答反应的蛋白，目前已被鉴定出具有ASFV抗体检测潜力的蛋白有p30、p54、p72、pK205R、pB602L、p104R和pK145R。因此，基于pK205R蛋白是研究ASFV抗体检测方法的关键，快速、特异、敏感的ASFV抗体检测方法对ASF的防控具有重要的意义，制备出抗ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体可以有助于建议新型ASF检测方法，助力ASF防控。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明申请总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本申请的目的在于提供一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，以为ASF检测方法的建立提供生物学材料；该抗体能够应用于免疫学检测，也可为基于ASFV pK205R蛋白的表位研究提供便利；同时公开了一种简单便捷的制备抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体的方法。
根据本公开的一个方面，筛选得到一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或
编码其重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码其轻链可变区的DNA序列如SEQID NO.4所示。
在本公开的一些实施例中，所述重链可变区氨基酸排列结构如下：
名称 序列
FR-H1 VKLQESGAELVRSGASVKLSCTAS
CDR-H1 GFNIKDCY
FR-H2 VHWVKQRPGQGLEWIGW
CDR-H2 IDPENGKT
FR-H3 IYDPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSLASEDTAVYYC
CDR-H3 NAWEAFD
FR-H4 WGQGTTVTVSS
在本公开的一些实施例中，所述轻链可变区氨基酸排列结构如下：
名称 序列
FR-L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS
CDR-L1 KSVSTSGYSY
FR-L2 MHWNQQKPGQPPRLLIY
CDR-L2 LVS
FR-L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
CDR-L3 QHIRELTR
在本公开的一些实施例中，所述单克隆抗体的ELISA效价≥1:1.024×106。
在本公开的一些实施例中，所述单克隆抗体的亲和力≥1×10-9mol/L。
根据本公开的另一个方面，将所述抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体应用在ASFV检测试剂的制备当中。
根据本公开的再一个方面，提供一种抗原或抗体检测试剂盒，含所述抗ASFVpK205R蛋白单克隆抗体。
根据本公开的又一个方面，提供一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）以纯化后的ASFV pK205R蛋白做抗原免疫小鼠；
（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（3）采用多次ELISA检测结合及亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；
（4）提取阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；
（5）对阳性克隆进行多次克隆化培养，得ASFV pK205R单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1. 本申请抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体能快速特异的识别ASFV pK205R蛋白，为ASFV pK205R蛋白快速检测技术的解决奠定基础，在ASF相关的免疫检测中具有广泛的研究应用价值和商业使用价值。
2. 本申请抗体制备方法是利用从大肠杆菌获得的ASFV pK205R蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，能为基于抗ASFV pK205R抗体的研究提供便利。
3. 本申请所公开的单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列的基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，但仍能够与ASFV pK205R蛋白特异性结合，为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体打下基础，以进一步提升抗体的特异性和亲和力。
附图说明
图1为本申请一实施例中ASFV pK205R蛋白的纯化结果图；其中，泳道M为蛋白标准分子量Marker；泳道1为原核表达的ASFV pK205R蛋白；泳道2为纯化后的ASFV pK205R蛋白。
图2为本申请一实施例中ELISA测定免疫小鼠血清效价结果图。
图3为本申请一实施例中单抗3G9的腹水纯化结果图；其中，泳道M为蛋白标准分子量Marker；泳道1为纯化前腹水；泳道2为纯化后腹水。
图4为本申请一实施例中单抗3G9的效价测定结果图。
图5为本申请一实施例中Western Blot检测单抗3G9的特异性结果图；其中，泳道M为蛋白标准分子量Marker；泳道1为pET-28a-BL21阴性对照；泳道2为原核表达的ASFVpK205R蛋白。
图6为本申请一实施例中单抗3G9亲和力常数回归曲线结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本申请的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本申请，并不以任何方式限制本申请的请求保护范围。
需要说明的是，对于本申请中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述了优选的方法和材料，但是在本申请的实施或测试中也可以使用与本说明书所述相似或等同的任何方法和材料。本申请说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
实施例一：分泌抗ASFV pK205R蛋白单抗的杂交瘤细胞株的制备
1. 主要试剂和材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG-1500、RPMl-1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司，液体AEC酶底物试剂盒购自中杉金桥公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio公司；BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心。
2. 免疫原及包被原的制备：免疫原为重组原核表达载体pET-28a-pK205R-BL21（DE3）经大肠杆菌诱导表达获得的超声上清，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后获得的pK205R重组蛋白纯度大于95%，结果如图1所示。
3. 免疫BALB/c小鼠
①将成分为ASFV pK205R蛋白的抗原分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，其中ASFV pK205R（20μg/只）与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1：1；
②通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，约100μl/只；
③在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；
④免疫14 d，尾部采血，测小鼠血清效价；
⑤细胞融合前3～5天，选取血清效价最高的小鼠通过腹腔注射的方法，用不含佐剂的ASFV pK205R蛋白对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是40μg/只。
4. 免疫小鼠血清抗体效价测定
ELISA测效价：
①用包被液稀释纯化的ASFV pK205R蛋白至2 µg/mL，每孔加入50µl包被液，37℃孵育2h，弃包被液，用PBST洗涤3次；
②用200µl封闭液（5％脱脂奶粉+PBST）4℃过夜封闭；
③每孔加入用稀释缓冲液（PBST）以2倍倍比稀释的待检血清各50µl（初始稀释倍数为1: 400），于37℃孵育1h，弃上清，用PBST洗涤6次；
④向每孔加入用稀释缓冲液以1: 5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各50µl，37℃保温1 h后弃上清，用PBST洗涤液洗涤6次；
⑤向凹孔中加入50µl TMB 显色液，室温避光作用6～8min后加2M H2SO450µl终止液终止反应；
⑥用酶标仪测定OD450值。
测定结果如图2所示；ELISA结果显示1号小鼠ELISA效价为最高可达到1：204800，选取1号小鼠用于细胞融合制备单克隆抗体。
5. 细胞融合
①脾细胞的制备：取经过超免5d后的1号BALB/c小鼠引颈致死，用75%酒精体表消毒。无菌操作取出小鼠脾脏，用37℃预热的GNK溶液洗2次，加少许HAT培养基在无菌的120目尼龙纱布上用小剪刀剪碎脾脏，将脾细胞滤至无菌烧杯并转至无菌细胞离心管中，1000 r/min离心10 min，用GNK溶液洗涤细胞1～2次备用。
②细胞融合及融合细胞的培养：采用聚乙二醇法进行细胞融合，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，220μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，融合后7d 改用HT培养基半量换液，第10d吸取25 µl细胞培养上清，用ELISA进行初筛。
实施例二：分泌抗ASFV pK205R蛋白单抗的杂交瘤细胞株的鉴定
1. 杂交瘤细胞的筛选鉴定与亚克隆
①ELISA筛选
第一轮ELISA筛选选用ASFV pK205R纯化蛋白（用CBS 1：100稀释）作为包被原，包被22个ELISA板对杂交瘤细胞培养上清进行初筛；将初步筛选到的6株杂交瘤细胞株转移至1个24孔细胞板继续培养。
第二轮ELISA筛选分别选用ASFV pK205R纯化蛋白（用CBS 1：100稀释）及pET-28a-BL21超声破碎上清（用CBS 1：1000稀释）作为包被原，经His-tag重组蛋白检测排除假阳性后共筛出4株阳性杂交瘤细胞株。
第三轮ELISA筛选同第二轮筛选方法相同，对上述阳性杂交瘤细胞进行第三轮ELISA筛选，结果共筛出1株阳性杂交瘤细胞株。
②阳性细胞的亚克隆和进一步筛选鉴定
通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。
用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约3 cells/ml，每孔100 µl加入到预铺有100µl饲养细胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养6～8d后对开始进行ELISA筛选鉴定，随后将阳性单克隆细胞株转入24孔细胞培养板进行扩大培养，如有必要需进行2～3次亚克隆，直到获得稳定分泌抗ASFV pK205R单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞3G9，将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×106/管进行冻存。
2. 单克隆杂交瘤细胞稳定性鉴定
将获得的阳性单克隆杂交瘤细胞3G9进行连续传代至35次，分别取不同代次的培养上清用ELISA进行稳定性测定。检测结果如表1所示。
表1 不同代次的杂交瘤细胞分泌抗体的效价
。
ELISA结果表明，细胞传至20代相应的杂交瘤细胞株3G9均能够稳定地分泌特异性单克隆抗体，说明这一株杂交瘤细胞株的单克隆化程度都比较高，性状稳定，可以用做种子长期保存和大量制备单克隆抗体。
实施例三：抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体腹水的制备及纯化
1.抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体腹水的制备
将实施例二中单克隆杂交瘤细胞株3G9扩大培养，ELISA法测培养上清效价，确保单克隆细胞株性状稳定，收集细胞用于大量制备当克隆抗体，具体步骤如下：
①选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500 μl灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖。
②观察小鼠状态，7～10 d后按照每只约1×107个细胞的量注入提前准备好的单克隆阳性细胞，及时观察小鼠状态；
③10 d后抽取腹水，8000 r/min，4℃离心20min去除油脂及细胞沉淀，收集腹水上清-80℃保存备用；
④一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞；
⑤一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，使用辛酸硫酸铵法粗提腹水IgG；
⑥用protein A柱纯化小鼠IgG，结果如图3所示，纯化获得高纯度的3G9IgG；
⑦用ELISA对腹水效价进行测定。
2. 单克隆抗体腹水ELISA效价测定
①用CBS液将ASFV pK205R稀释成浓度2 µg/mL包被液包被酶标板，50µl/孔，4℃封闭过夜；
②将3G9单抗用5%的脱脂奶进行倍比稀释，依次加入酶标板中，50µl/孔，37℃孵育30min；
③弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；
④将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）加入反应孔中，50µl/孔，37℃孵育30min；
⑤用PBST冲洗干净，拍干；
⑥每孔加入现配的TMB显色液50µl，暗室反应6min；
⑦每孔加入50µl 2M H2SO4终止反应；
⑧酶标仪读取每孔的OD450值。
ELISA检测结果显示该单克隆抗体腹水效价为1：1.024×106（图4）。
3. 单克隆抗体腹水Western Blot鉴定
分别将原核表达的pET-28a-BL21及pET-28a-pK205R超声上清进行SDS-PAGE电泳后转印NC膜，进行Western Blot鉴定。首先用5%的脱脂奶37℃孵育2 h进行封闭，用PBST冲洗干净，拍干；将3G9单抗用5%的脱脂奶进行1:5000稀释，加入NC膜中， 37℃孵育30min；弃去一抗，用PBST洗3次；将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）加入NC膜中，37℃孵育30min；弃去二抗，用PBST洗3次；再用蒸馏水洗涤1次，AEC显色液显色，结果如图5所示，3G9单抗与pET-28a-BL21超声上清不反应，而与原核表达的ASFV pK205R蛋白发生特异性反应。
实施例四：抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体亲和力测定
用CBS液将ASFV pK205R蛋白稀释成浓度1µg/mL和2µg/mL的包被液分别包被酶标板，通过间接ELISA法测定单抗腹水效价，以单抗浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，绘出相应的2条间接ELISA反应曲线，以每条曲线上部平坦段的OD450值作为100%，在曲线上算出50% OD450值时对应的抗体浓度。
按照公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算单抗的亲和常数，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag ′]t为2个不同的包被原浓度，[Ab]t、[Ab′]t为各包被原浓度下50% OD450值对应的抗体浓度。
根据亲和力测定结果计算出3G9单克隆抗体亲和常数K值为1×109L/mol（图6）。
实施例五：单克隆抗体可变区序列的测定
提取阳性单克隆杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-CAGGAGTCAGGACCTGAGCT -3’；
P2：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGG-3’。
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-TCAGACACACTGCTGTTAT-3’；
P4：5’-GGATGGTGGGAAGATGGATACAGT-3’。
通过分子克隆技术分别做的单克隆抗体3G9的可变区序列，送河南尚亚生物技术有限公司测序。测定单克隆抗体3G9的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3所示，由其推导的3G9重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4所示，其序列结构见表2、表3。
表2重链可变区氨基酸排列结构
名称 序列
FR-H1 VKLQESGAELVRSGASVKLSCTAS
CDR-H1 GFNIKDCY
FR-H2 VHWVKQRPGQGLEWIGW
CDR-H2 IDPENGKT
FR-H3 IYDPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSLASEDTAVYYC
CDR-H3 NAWEAFD
FR-H4 WGQGTTVTVSS
表3轻链可变区氨基酸排列结构
名称 序列
FR-L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS
CDR-L1 KSVSTSGYSY
FR-L2 MHWNQQKPGQPPRLLIY
CDR-L2 LVS
FR-L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
CDR-L3 QHIRELTR
上面结合附图和实施例对本申请作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本申请发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方式，从而形成多个具体的实施例，均为本申请的常见变化范围。

Claims (9)

1.一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，编码其重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码其轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区氨基酸排列结构如下：
名称 序列 FR-H1 VKLQESGAELVRSGASVKLSCTAS CDR-H1 GFNIKDCY FR-H2 VHWVKQRPGQGLEWIGW CDR-H2 IDPENGKT FR-H3 IYDPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSLASEDTAVYYC CDR-H3 NAWEAFD FR-H4 WGQGTTVTVSS
。
4.根据权利要求1或2所述的抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸排列结构如下：
名称 序列 FR-L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS CDR-L1 KSVSTSGYSY FR-L2 MHWNQQKPGQPPRLLIY CDR-L2 LVS FR-L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC CDR-L3 QHIRELTR
。
5.根据权利要求1或2所述的抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的ELISA效价≥1：1.024×106。
6.根据权利要求1或2所述的抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亲和力≥1×10-9mol/L。
7.权利要求1或2所述抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体在制备ASFV检测试剂中的应用。
8.一种抗原或抗体检测试剂盒，含有权利要求1或2所述的抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体。
9.权利要求1或2所述抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）以纯化后的ASFV pK205R蛋白做抗原免疫小鼠；
（2）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（3）采用多次ELISA检测结合及亚克隆的方法得阳性杂交瘤细胞；
（4）提取阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株RNA反转录成cDNA，经过PCR扩增出单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列；
（5）对阳性克隆进行多次克隆化培养，得ASFV pK205R单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
CN202310714896.9A 2023-06-16 2023-06-16 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用 Pending CN116731163A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310714896.9A CN116731163A (zh) 2023-06-16 2023-06-16 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310714896.9A CN116731163A (zh) 2023-06-16 2023-06-16 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116731163A true CN116731163A (zh) 2023-09-12

Family

ID=87914619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310714896.9A Pending CN116731163A (zh) 2023-06-16 2023-06-16 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116731163A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112175925A (zh) 一种pivka-ii抗原表位肽和抗pivka-ii单克隆抗体及其应用
CN102775473B (zh) 人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的b细胞表位肽段及其应用
CN113493508A (zh) 一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒
CN109180810B (zh) 特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用
CN109295002B (zh) 杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114276445A (zh) 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法
CN113740536A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN107389920B (zh) 一种检测禽白细胞介素17a含量的方法及其专用试剂盒
CN110527668B (zh) 一种抗弓形虫棒状体蛋白4（rop4）单克隆抗体及其制备方法与应用
CN116217716A (zh) 一种识别柯萨奇病毒a2、a4和a5的单克隆抗体及其应用
CN116731163A (zh) 抗ASFV pK205R蛋白单克隆抗体及其制备与应用
CN115806611A (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
CN116338193A (zh) 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
KR101080071B1 (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
CN110903359B (zh) 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
KR20210116115A (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이의 용도
CN110894235A (zh) 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用
CN115856296B (zh) 抗志贺氏菌的单克隆抗体及其检测中的应用
KR102234834B1 (ko) 전염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오단백질에 대한 항체 탐지용 단클론항체 및 이의 용도
CN114456265B (zh) 一种抗hfabp单克隆抗体及其应用
CN117659172A (zh) 抗PRV gD蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用
CN114316039B (zh) 一种快速检测病毒的试剂盒及其制备方法
CN117024595B (zh) 抗人st2的单克隆抗体及其应用
LU500299B1 (en) Detection antibody for Caprine enterovirus and double sandwich ELISA detection kit
CN118085070A (zh) 识别cva6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination