CN118085070A

CN118085070A - 识别cva6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN118085070A
Application number: CN202410109198.0A
Authority: CN
Inventors: 申硕; 王文辉; 吴嘉慧; 王凯文; 李伟; 杨安纳; 杨洁; 杨东升; 郭靖; 孟胜利; 王泽鋆
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2024-01-25
Filing date: 2024-01-25
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明提供可同时识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用。本发明单克隆抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明单克隆抗体靶向构象表位、具有中和活性且能够同时识别CVA6空心颗粒和实心颗粒，可以作为CVA6抗原检测抗体，有利于加速含CVA6病原体的手足口多价疫苗的研发进程。

Description

识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及能够识别柯萨奇病毒A组6型(CVA6)空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用。

背景技术

引起手足口病(HFMD)的病毒属于小RNA病毒科(Picornavirus)肠道病毒属(Enteroviruse)，包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型等和B组的1、2、3、4、5、6、13型等以及肠道病毒71型(Human enterovirus71,EV71)、埃可病毒(Echoviruses)等。

近几年的流行病学资料显示，CVA6和CVA10引起的HFMD发病率正逐年持续升高，特别是2012年后，CVA6在我国北京、广东、福建等多个城市或地区成为引起HFMD暴发的主要病原体。因此，CVA6已成为继EV71和CVA16后，最值得人们关注的引起HFMD的肠道病毒病原体。

构象中和抗体更能反应病毒的含量和功能，因此开发靶向构象表位、特异性识别CVA6的中和活性单克隆抗体对疫苗研发的质控、临床样本的检测和实验室病毒鉴别、CVA6基础功能的研究具有重要意义。

发明内容

基于此，有必要提供可同时识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用。

本发明提供能够识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有如SEQ ID NO.1～3所示的重链互补决定区CDR1～CDR3，以及如SEQ IDNO.4～6所示的轻链互补决定区CDR1～CDR3。

本发明单克隆抗体能够靶向构象表位、能够识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性，可用于CVA6病毒定量，且反应病毒的含量和功能，与免疫原性相关，对疫苗研发的质控至关重要。

优选的，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；和/或，所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步，所述单克隆抗体为IgG2a型抗体。

本发明提供一种编码单克隆抗体的核酸分子。

进一步，编码所述重链可变区的核酸分子为以下几种中的任一种：

a、具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列互补核苷酸序列；

c、与a和b的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与其不同的核苷酸序列；

和/或

编码所述轻链可变区的核酸分子为以下几种中的任一种：

e、具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

f、与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

g、与e和f的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与其不同的核苷酸序列。

本发明提供一种表达载体，该表达载体含有编码单克隆抗体的核酸分子。

本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的核酸分子，或含有上述的表达载体。

本发明提供一种抗体偶联物，该抗体偶联物包含上述的单克隆抗体或其抗原结合片段及标记物，所述标记物选自酶标记、生物素标记、化学发光染料标记中的一种或多种。

本发明提供单克隆抗体在制备检测CVA6试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供一种检测CVA6试剂或试剂盒，包含上述单克隆抗体。

本发明提供上述单克隆抗体在制备抑制、预防和治疗CVA6药物中的应用。

本发明所提供的单克隆抗体是以纯化后的柯萨奇病毒A组6型(CVA6)病毒免疫小鼠，制备筛选杂交瘤细胞，从而制备得到的，其为IgG2a亚型非中和抗体，可以特异性识别CVA6，不识别其他的肠道病毒。

本发明开发的单克隆抗体可与偶联物(辣根过氧化酶或异硫氰酸荧光素等)结合用于直接或间接检测、快速诊断，如可用于开发检测由CVA6感染引起的临床样品的检测试剂或试剂盒，也可用于临床病毒分离株实验室鉴定抗体，同时还可用于制备预防性疫苗生产中间品及产品含CVA6抗原的定量检测试剂。

附图说明

图1为5A6单克隆抗体的IgG轻链、重链SDS-PAGE图。

图2为5A6单克隆抗体识别CVA6病毒颗粒的鉴定图；其中，1.非还原条件，2.还原性条件；一抗：5A6单克隆抗体(1：10000)，二抗：羊抗鼠IgG(1：10000)。

图3为5A6单克隆抗体检测CVA6感染RD细胞后的抗原间接免疫荧光结果图。

图4为5A6单克隆抗体识别CVA6 EP和FP的双抗体夹心ELISA结果图。

图5为5A6单克隆抗体与CVA6体外微量中和试验结果图。

具体实施方式

本发明的技术构思在于提供一种可同时识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体。

单克隆抗体重链互补决定区VHCDR1的氨基酸序列：

GYTFTGYY(SEQ ID NO.1)；

单克隆抗体重链互补决定区VHCDR2的氨基酸序列：

INPSNGGT(SEQ ID NO.2)；

单克隆抗体重链互补决定区VHCDR3的氨基酸序列：

TRYGNYAY(SEQ ID NO.3)；

单克隆抗体轻链互补决定区VLCDR1的氨基酸序列：

ENIYSN(SEQ ID NO.4)；

单克隆抗体轻链互补决定区VLCDR2的氨基酸序列：

AAR(SEQ ID NO.5)；

单克隆抗体轻链互补决定区VLCDR3的氨基酸序列：

QHFWGTPWT(SEQ ID NO.6)。

单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示：

SEQ ID NO:7的序列信息为：

QVQLQQSGAELVKPGGSVKLSCKASGYTFTGYYMYWVKQRPGQGL EWIGEINPSNGGTNFNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TRYGNYAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.7)；

SEQ ID NO:8的序列信息为：

CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGGTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATATGGTAACTACGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO.8)

单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示：

SEQ ID NO:9的序列信息为：

DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLL VYAARNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPW TFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.9)；

SEQ ID NO:10的序列信息为：

GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAAGAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO.10)。

本发明开发的单克隆抗体能够靶向构象表位、能够识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性，可用于CVA6病毒定量，且反应病毒的含量和功能，与免疫原性相关，对疫苗研发的质控至关重要。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试剂来源：

弗氏完全和不完全佐剂：采购自Sigma公司；

雌性Balb/c小鼠：采购自武汉生物制品研究所有限责任公司；

Isotyping Kit for Mouse Monoclonal Antibody：采购自北京义翘神州科技股份有限公司；

RD细胞：由武汉生物制品研究所有限责任公司提供；

山羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488荧光二抗：赛默飞；

HRP标记羊抗小鼠IgG：采购自武汉博士德生物工程有限公司。

实施例1CVA6病毒实心颗粒(Full particle，FP)和空心颗粒(Empty particle，EP)的制备

CVA6为现有技术中已公开的毒株，记载于NCBI数据库中，登录号为：MW410845。

CVA6病毒实心颗粒(Full particle，FP)和空心颗粒(Empty particle，EP)的获得方法为：

采用发酵罐微载体的模式培养CVA6病毒液(武汉生物制品研究生有限公司)，通过澄清超滤的方式进行初步纯化，并通过20％(W/V)蔗糖垫底，141000×g离心3h，沉淀用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)于4℃重悬过夜，重悬的样品用PBS缓冲液和CsCl配成浓度为1.34g/mL CsCl溶液，288000×g离心20～22h。离心结束后，将离心管小心平移至暗室中并固定，用直射光源照射整管，根据蛋白浊光确定,分别取出两条病毒条带,用电镜鉴定空实心分离结果，获得CVA6 FP和EP。

实施例2单克隆抗体的制备

本实施例提供针对CVA6的单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)免疫：

将CVA6灭活抗原(来自武汉生物制品研究所有限责任公司)免疫小鼠，将50μgCVA6灭活抗原与弗氏完全佐剂混合(V/V＝1:1)，后续使用弗氏不完全佐剂混合抗原进行加强免疫，以背部皮下及腹腔注射免疫雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)，注射量体积为500μL/次，分别于0天、14天、28天、42天免疫小鼠。免疫四针后，检测血清抗体效价。融合前，尾静脉注射50μg CVA6灭活抗原作为冲击免疫，冲击免疫后第3天采集小鼠脾细胞，使用聚乙二醇-1500诱导小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合比例控制为(1:5)～(1:10)；通过HAT培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞。

(2)筛选：

使用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，具体步骤为：

用0.05M碳酸盐缓冲液(pH为9.6)稀释CVA6灭活抗原(来自武汉生物制品研究所有限责任公司)，包被96孔微孔板，包被浓度为2μg/mL，4℃过夜，使用封闭液(PBST-1％ BSA)于37℃封闭1h；

加入待测细胞上清样本，100μL/孔，37℃孵育1h。加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后，加入底物溶液A和B液(市售)，均为50μL/孔，37℃避光显色15min；加入终止液，50μL/孔，置于酶标仪处450nm波长下读取A_450nm值。

通过本步骤筛选获得杂交瘤细胞5A6。

(3)亚克隆：

采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，用ELISA方法进行亚克隆筛选,并扩大培养制备腹水。

(4)抗体生产与纯化：

选取6-8周龄雌性的BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，每只0.5mL。注射液体石蜡7-10天后，腹腔注射杂交瘤细胞5A6。待小鼠腹部膨大且濒临死亡颈椎脱臼法处死小鼠，于超净工作台中无菌抽取腹水。

采用Protein A亲和层析纯化腹水单抗。具体步骤如下

1)平衡：用5～10倍柱床体积的上样PBS缓冲液(pH 7.0)平衡层析柱，流速为5mL/min。

2)上样：取预处理过的腹水2mL,上样，流速为5mL/min。

3)流穿：上样缓冲液共洗脱5倍柱体积，将腹水中的杂蛋白洗脱下来。

4)洗脱：用甘氨酸缓冲液(pH 3.0)进行流洗，10倍柱床体积，流速为5mL/min。甘氨酸缓冲液洗脱抗体，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取15ml离心管收集，用1MTris缓冲液(pH 9.2)调整pH至7.0。

5)清洗：收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用0.5M氢氧化钠10倍柱床体积，流速10ml/min。最后用20％乙醇平衡保存层析柱，流速10mL/min洗脱10倍柱床体积。

本实施例制备纯化获得5A6单克隆抗体。

实施例3筛选出的单克隆抗体的序列分析

将实施例2中筛选出来的杂交瘤细胞(能够分泌单克隆抗体5A6)接种于含20％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)，37℃培养。

使用Vazyme FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit提取杂交瘤细胞RNA，然后用TaKaRa RimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit中的Oligo dT引物逆转录获得cDNA。通过与克隆载体pUC-Kan有同源序列的轻链和重链通用引物扩增单克隆抗体5A6的重链和轻链可变区基因，并分别将纯化后的PCR产物克隆至pUC-Kan载体(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)。转化筛选获得阳性克隆并进行测序，将测序序列在Kabat数据库中序列分析，获得正确的轻链和重链可变区氨基酸序列。

其中，重链通用正向引物VH-F的序列acggccagtgaattcmarctgcagsagtcwgg，反向引物VH-R的序列gattacgccaagctttgaggagacggtgaccg、轻链通用正向引物VL-F的序列acggccagtgaattccgattgtkctsacycartctcca，反向引物VL-R的序列gattacgccaagcttcgttggatctccagcttg。通过筛选获得阳性克隆并进行测序，将测序序列在Kabat数据库中序列分析，获得正确的轻链和重链可变区氨基酸序列。

单克隆抗体5A6测序结果分析出的序列如SEQ ID NO:1～10所示。

实施例4纯度和亚型鉴定

取实施例2中纯化后的单克隆抗体5A6，通过SDS-PAGE分析抗体纯度，小鼠抗体亚型检测试剂盒鉴定单抗亚型。微量细胞病变抑制法测试中和抗体的效价。

SDS-PAGE结果见图1，显示：在还原条件下呈现分子量约为50kDa和25kDa的两条带，分别对应抗体的重链和轻链。纯度大于95％。

单克隆抗体5A6亚型鉴定结果显示，亚型为IgG2a。

微量细胞病变抑制法测定单克隆抗体5A6中和抗体效价显示为1：4096。

实施例5功能分析

分别采用间接免疫荧光实验和免疫印迹实验对筛选出的单克隆抗体5A6的功能进行分析，具体如下：

(1)免疫印迹实验

通过免疫印迹实验对筛选出的单克隆抗体5A6识别的CVA6的结构蛋白区域进行鉴定，步骤如下：

CVA6原液加入还原上样缓冲液(5X蛋白质加样缓冲液货号C508320-0010，生工)和非还原上样缓冲液(Takara 4×Protein Native PAGE Loading Buffer货号：9175，Takara)，加热10min进行4-20％的SDS-PAGE；电泳结束后使用快速湿转仪(金斯瑞)转膜至0.45μm的硝酸纤维素膜；转膜结束后，加入2％ BSA(W/V)的PBST封闭液，封闭30min；分别加入单克隆抗体5A6(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗涤5次；加入HRP标记羊抗小鼠IgG，稀释度为1：10000,37℃孵育1h；PBST洗涤5次；使用化学曝光显色液进行成像。

抗体识别结果如图2所示。显示：在非还原条件下，出现条带；在还原条件下无条带，表明微量细胞病变抑制法5A6靶向构象表位。

(2)间接免疫荧光实验

将CVA6接种于RD细胞汇合度为95％的6孔板，未接种病毒的RD细胞为阴性对照，进行培养；将6孔板培养24h后弃掉细胞上清，0.01M PBS缓冲液(pH为7.2)轻容洗涤3次，加入2mL/孔4％多聚甲醛室温固定1h，0.01M PBS缓冲液洗涤5次/5min；加入2mL/孔的2％ BSA-PBST(W/V)溶液(含0.5％ Triton-X 100，V/V)，室温通透30min，0.01M PBS缓冲液洗涤5次/5min；用2％ BSA-PBST溶液于室温封闭1h，弃封闭液；分别加入1mL/孔2μg/mL的单克隆抗体5A6于室温孵育1h，0.01M PBS缓冲液洗涤5次/5min；加入1mL/孔，2μg/mL山羊抗小鼠荧光抗体IgG(H+L)(赛默飞)，避光室温孵育1h，PBS缓冲液洗涤后,并加入1ml/孔5μg/ml DAPI溶液(碧云天)；用荧光显微镜观察并拍照，阴性对照组为细胞未被CVA6感染，并加入相应抗体。

结果如图3所示。从图3中可以看出：5A6单克隆抗体均可用于间接免疫荧光实验，识别CVA6抗原，可用于鉴别抗原实验。

实施例6构象表位研究

本实施例提供一种构象表位研究的方法，并对单克隆抗体5A6识别CVA6的构象中和表位进行了初步鉴定，单克隆抗体5A6识别CVA6的VP1蛋白C末端，具体包括如下步骤：

(1)逃逸5A6的CVA6毒株筛选及空斑纯化

准备RD细胞汇合度为95％的24孔板，将CVA6病毒液稀释至100CCID₅₀/50μL并置于1.5mL离心管中；将单克隆抗体5A6从200μg/mL向下2倍梯度稀释至6.25μg/mL，将梯度稀释的抗体分别与100CCID₅₀/50μL的CVA6毒200μL等体积混合，置于37℃、5％ CO₂孵箱中中和2h，中和结束后加入24孔板，并设置细胞对照孔、抗体对照孔、病毒对照孔，3～5天观察病毒CPE。若无病变，将收获液反复冻融3次，4℃4000g离心10min，取上清分装于1.5mL离心管中，并将上清替换病毒液重复以上步骤。若有病变出现，则将收获的病毒液进行空斑纯化。

空板纯化后获得单一基因型CVA6毒株共14株，将其结构蛋白区进行氨基酸序列比对，其中3株结构蛋白区有差异见下表1：

表1单克隆毒株结构蛋白区氨基酸序列比对差异部分

注：“·”表示与CVA6-WT氨基酸一致。

进一步对这三株CVA6单克隆毒株进行中和效价测定。

(2)中和抗体效价检测(体外微量中和试验)

纯化后单克隆抗体5A6稀释至800μg/mL，后以1:8比例用稀释液(如MEM维持液)进行稀释，加入96孔板第1列，100μL/孔，设置2个复孔，2～12列每孔加入50μL稀释液。将第1列中的单克隆抗体2倍连续稀释至12列，最后一列稀释混匀后弃50μL。将中和毒(单克隆毒株CVA6-mono[1]～[3])稀释至100CCID₅₀/50μL，吸取50μL垂直悬空加入稀释好抗体的96孔板中。将96孔板放置37℃培养箱中和2h。将稀释的中和毒以10倍梯度稀释至10CCID₅₀/50μL、1CCID₅₀/50μl、0.1CCID₅₀/50μL。每孔加入50μL维持液和50μL病毒液(共4个稀释度，分别为100、10、1、0.1CCID₅₀/50μL)，每个稀释度8个复孔，作为回滴板，4℃放置。中和结束后，将消化好的RD细胞按1×10⁵个/mL密度铺至中和板和回滴板中。于37℃、5％ CO₂培养5～7天判定中和结果。

结果如图5和下表2所示。

表2中和效价下对应单抗5A6的中和浓度

CVA6-mono[1]对单抗5A6显示逃逸(抗体浓度高于50μg/mL的孔不中和即为逃逸)，依据中和结果分析单克隆毒株结构蛋白区氨基酸序列，推测5A6对该病毒中和能力显著下降与结构蛋白VP1上90位、286位氨基酸有关。在单克隆毒株基础上对这两个氨基酸位点进行突变获得重组毒株rCVA6、rCVA6-K90R、rCVA6-A286V、rCVA6-K90R+A286V。

将重组毒株进行本实施例(2)的中和抗体效价测定，结果如图5、表2所示，结果证明A286V的突变可显著影响单抗5A6对CVA6的中和能力，单抗5A6识别的中和位点可能是CVA6病毒颗粒VP1 C末端286位氨基酸在内的空间构象表位。

实施例7单克隆抗体5A6的应用

本实施例提供一种双抗体夹心ELISA检测CVA6的方法，具体如下：

(1)将纯化的CVA6兔多克隆抗体(由灭活的CVA6作为抗原在常规方法下免疫日本大耳白兔得到：将灭活的CVA6纯化抗原与弗式完全佐剂混合后，皮下注射免疫日本大耳白兔，首次免疫2周后，将纯化抗原与弗式不完全佐剂混合后进行加强免疫，随后进行多针次加强免疫，免疫剂量均为100μg/剂，于4次免疫后7d，经兔颈动脉采血，分离血清，得到CVA6兔多克隆抗体)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1∶2000，包被微孔板，100μL/孔，4℃包被过夜。

(2)PBST洗板3次后，加入封闭液(含1％BSA的PBST)，200μL/孔，37℃封闭1h。

(3)弃封闭液，37℃干燥2h制成包被微孔板。

(4)加入待测抗原(CVA6 EP/FP)，100μL/孔，37℃孵育1h；洗板5次，加入5A6-HRP(1∶4 000稀释)(采用过碘酸钠氧化法对单抗5A6进行标记，偶联HRP分子制备5A6-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h；加入底物溶液A(来自武汉生物制品研究所有限责任公司)和B液(来自武汉生物制品研究所有限责任公司)，均为50μL/孔，37℃避光显色15min；加入终止液，50μL/孔。

(5)置于酶标仪处450nm波长下读取A_450nm值。

统计结果如图4所示。

对空实心颗粒结合能力的评价按照已确定的抗原检测方法，分别将EP和FP从5μg/mL起，连10倍稀释4个稀释度到5ng/mL。当空心、实心病毒蛋白的浓度在50ng/mL时，空心病毒颗粒A₄₅₀ _nm为0.5356，实心病毒颗粒A₄₅₀ _nm为0.5694，因此EP/FP的A₄₅₀ _nm比值为0.94，故该方法对空心病毒颗粒和实心病毒颗粒的反应能力的比值接近于1∶1，可知该方法可以很好地对CVA6空、实心颗粒进行检测。

表明双抗体夹心ELISA可以对CVA6疫苗或含CVA6的手足口多价疫苗中CVA6抗原含量进行定量检测。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.根据权利要求1所述的识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

4.根据权利要求2或3所述的识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG2a型抗体。

5.编码权利要求1至4任一项所述的识别CVA6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸分子为以下几种中的任一种：

a、具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列互补核苷酸序列；

和/或

编码所述轻链可变区的核酸分子为以下几种中的任一种：

e、具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

f、与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

7.一种表达载体，其特征在于，含有编码权利要求1～4任一项所述的单克隆抗体的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5或6所述的核酸分子，或含有权利要求7所述的表达载体。

9.权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体在制备检测CVA6试剂或试剂盒中的应用。

10.权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体在制备抑制、预防和治疗CVA6药物中的应用。