CN109295002B - 杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。一种杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C201874。上述杂交瘤细胞能够稳定分泌多种抗体3F11。3F11能够特异性地结合人3型腺病毒、7型腺病毒、55型腺病毒及14型腺病毒。上述杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛应用在制备治疗感染人腺病毒的相关疾病的药物中，也可用于制备检测人腺病毒的检测试剂或检测设备中，具有高效、准确的优点。

Description

杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
至今已发现的人腺病毒(human Adenovirus，HAdV)有7组50多种血清型，超过69种基因型。腺病毒是致病毒性肺炎的主要病原体之一，B组、C组、E组腺病毒都可以引起呼吸道感染。尤其是B组腺病毒的3型、7型、14型、55型和E组4型腺病毒是致急性呼吸道感染(ARI)和婴幼儿致死性肺炎的重要病原体。其中，在致成人急性呼吸道感染的腺病毒中，B组7型腺病毒(HAdV-B7)、14型腺病毒(HAdV-B14)和55型腺病毒(HAdV-B55)是最重要的几个型别。
值得注意的是，55型腺病毒是一种基因组重组的腺病毒，其基因组的纤毛基因主要来自14型腺病毒，只有六邻体高变区来源于人11型腺病毒，这种重组变异导致其不能被HAdV-B14抗血清中和。根据现有技术研究发现，重组是腺病毒进化的主要方式，重组可能产生生物学特性改变的新型腺病毒，出现更强致病性或更强传染性的新毒株，将会严重威胁人类健康。
但目前在世界范围内还没有针对腺病毒特异有效的治疗药物，尤其是能够同时对多种不同型别的腺病毒均有效的药物。
发明内容
基于此，有必要提供一种杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。
一种杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C201874。
在其中一个实施例中，上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体标记为3F11。
在其中一个实施例中，所述单克隆抗体的轻链包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中，编码所述单克隆抗体的轻链的基因包括如SEQ ID NO.3所示的碱基序列，编码所述单克隆抗体的重链的基因包括如SEQ ID NO.4所示的碱基序列。
一种治疗腺病毒感染的药物，包括上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。
一种检测试剂，包括上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。
一种可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤：
将Ad11FK抗原与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，得到乳化剂；
将所述乳化剂以40μg/只～80μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周后，得到初次免疫的小鼠；
将所述Ad11FK抗原与弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合后，以40μg/只～80μg/只的抗原剂量对所述初次免疫的小鼠进行加强免疫，饲养2周～3周后，得到加强免疫的小鼠；
用所述Ad11FK抗原以20μg/只～50μg/只的抗原剂量对将所述加强免疫的小鼠进行尾脾内冲击免疫，饲养2天～4天后，得到冲击免疫的小鼠；
采集所述冲击免疫的小鼠的脾细胞；
将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；及
用所述Ad11FK抗原筛选所述融合细胞，得到阳性融合细胞，并将所述阳性融合细胞克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
在其中一个实施例中，所述将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞的步骤，包括：
分别吸取所述脾细胞和所述小鼠骨髓瘤细胞于离心管中，加入不完全培养液后混匀，离心弃上清，得沉淀液，其中所述脾细胞与所述小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为5～3：1；及
在所述沉淀液中加PEG融合剂溶液，静置80s～100s后，加入不完全培养液终止融合，得到所述融合细胞，其中，所述PEG融合剂溶液与所述脾细胞的比例为1mL：108个。
在其中一个实施例中，所述用所述Ad11FK抗原筛选所述融合细胞，得到阳性融合细胞，并将所述阳性融合细胞克隆，得到稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞的步骤包括：
培养所述融合细胞，用间接酶联免疫法筛选得到所述阳性融合细胞；及
采用有限稀释法将所述阳性融合细胞单克隆化，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
上述杂交瘤细胞的制备方法简单易行，按照上述杂交瘤细胞制备的杂交瘤细胞能够分泌单克隆抗体3F11。上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有高特异性、性能稳定等优点。经证实，3F11能够特异性地结合人3型腺病毒、7型腺病毒、55型腺病毒及14p腺病毒。上述单克隆抗体可广泛应用于制备治疗多种型别的人腺病毒感染的药物中，也可用于制备检测人腺病毒的检测试剂或检测设备中，可以实现准确、快速地检测出血液中的人腺病毒。
附图说明
图1为实施例1的Ad11FK抗原的SDS-PAGE电泳图；
图2为anti-Ad11FK抗血清与Ad3、Ad4、Ad5、Ad7、Ad11、Ad14、Ad35、Ad55病毒的交叉反应结果图；
图3为间接ELISA法检测anti-Ad11FK抗血清与Ad3FK、Ad7FK、Ad11FK、Ad14p1FK、Ad55FK进行交叉反应的结果图；
图4为间接ELISA法检测anti-Ad11FK抗血清与Ad3、Ad7、Ad11、Ad14p1、Ad55进行交叉反应的结果图；
图5为anti-Ad11FK抗血清对不同型别腺病毒的中和作用结果图；
图6为间接ELISA法检测实施例3所制备的单克隆抗体的效价结果图；
图7为实施例3制备的3F11与不同型别腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域的交叉反应的结果图
图8为实施例3制备的3F11与不同型别腺病毒颗粒的交叉反应的结果图；
图9为实施例3制备的3F11与不同型别腺病毒颗粒的交叉中和作用结果图；
图10为实施例3制备的3F11与不同型别腺病毒的反应的免疫印迹检测结果图；
图11为不同腺病毒纤毛蛋白的头部结构域的氨基酸序列比对分析图；
图12为不同腺病毒纤毛蛋白的头部结构域的结构图；
图13为3F11的轻链可变区序列分析图；
图14为3F11的重链可变区序列分析图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的杂交瘤细胞于2018年6月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C201874，分类命名：杂交瘤细胞株3F11。该杂交瘤细胞可分泌出3F11。其中，3F11能同时中和腺病毒Ad7、Ad11、Ad55、Ad14p。3F11可以作为检测抗体，3F11应用于人腺病毒的检测试剂或人腺病毒的检测设备的制备领域中。也可以应用于制备治疗感染人腺病毒相关疾病的药物。
一实施方式的可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S170。
S110、制备Ad11FK抗原。
具体地，制备Ad11FK抗原的操作包括S111～S117。
S111、将人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因进行密码子优化，以适应大肠杆菌表达。
进一步地，优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因的序列SEQ ID No.5所示，优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
S113、人工合成优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因的序列，并扩增、克隆入表达载体中，得到重组表达载体。
进一步地，将在人工合成优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiberknob)的基因的序列扩增后，得到扩增产物。用BamHI和HindIII双酶切扩增产物后连接到已经用BamHI和HindIII双酶切的原核表达载体上，得到重组表达载体。
更进一步地，原核表达载体为PQE30。
S115、将重组表达载体转化至大肠杆菌中，筛选鉴定后，得到重组工程菌。
更进一步地，大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
S117、对重组工程菌进行诱导培养，得到Ad11FK抗原。
具体地，采用0.1mM～1mMIPTG，18℃～30℃低温诱导重组工程菌，培养过夜，收集细菌。然后用PBS缓冲液(1mM EDTA，10％甘油，1％Triton X100，10mM咪唑)重悬，溶菌酶裂解重组工程菌，高速离心后取上清，得到初产物。然后纯化初产物，得到纯化的Ad11FK抗原。
进一步地，纯化初产物的操作包括用镍柱进行纯化，梯度咪唑进行洗涤和洗脱，10kDa超滤管离心去咪唑，得到纯化的Ad11FK抗原。
需要说明的是，Ad11FK抗原不限于本实施方式的方法制得，还可以由本领域常规的制备方法制得，当然，也可以购买商品化的Ad11FK抗原。
S120、对小鼠初次免疫，得到初次免疫的小鼠。
具体地，将Ad11FK抗原乳化后，以40μg/只～80μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周，得到初次免疫的小鼠。
进一步地，以40μg/只～60μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周，得到初次免疫的小鼠。
进一步地，将Ad11FK抗原与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，得到乳化剂。然后将乳化剂以40μg/只～80μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周，得到初次免疫的小鼠。
更进一步地，将乳化剂以40μg/只～80μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠。
S130、对初次免疫的小鼠进行加强免疫，得到加强免疫的小鼠。
具体地，将Ad11FK抗原与弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合乳化后，以40μg/只～80μg/只的抗原剂量对所述初次免疫的小鼠进行加强免疫，饲养2周～3周后，得到加强免疫的小鼠。
进一步地，将Ad11FK抗原与弗氏不完全佐剂按照1：1的比例混合乳化后，以40μg/只～60μg/只的剂量进行加强免疫。
进一步地，加强免疫进行多次，相邻加强免疫的时间间隔为2周～3周
更进一步地，加强免疫进行两次，两次加强免疫的时间间隔为2周～3周。
S140、对加强免疫的小鼠冲击免疫，得到冲击免疫的小鼠。
具体地，用Ad11FK抗原以20μg/只～50μg/只的抗原剂量对加强免疫的小鼠进行尾脾内冲击免疫，饲养2天～4天后，得到冲击免疫的小鼠。
进一步地，用Ad11FK抗原以40μg/只～50μg/只的抗原剂量对加强免疫的小鼠进行尾脾内冲击免疫。
S150、采集冲击免疫的小鼠的脾细胞。
S160、将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞。
具体地，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞的操作包括S161～S163。
S161、分别吸取脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞于离心管中，加入不完全培养液后混匀，离心弃上清，得沉淀液。其中，脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为5～3：1。
更进一步地，脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为5：1。
进一步地，小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
进一步地，不完全培养液为不含血清的培养液。本实施方式中，不完全培养液为不含血清的RPMI-1640培养液。在其他实施方式中，不完全培养液还可以是不含血清的DMEM培养液或者不含血清的IMDM培养液。
进一步地，离心转速为1000rpm～1500rpm，离心时间为5min～10min。
更进一步度，离心转速为1000rpm～1200rpm，离心时间为8min～10min。
S163、在沉淀液中加PEG融合剂溶液，静置80s～100s后，加入不完全培养液终止融合，得到融合细胞。其中，PEG融合剂溶液与脾细胞的比例为1mL：108个。
进一步地，PEG融合剂为PEG4000融合剂。
S170、用Ad11FK抗原筛选融合细胞，得到阳性融合细胞，并将阳性融合细胞克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
具体地，用Ad11FK抗原筛选融合细胞，得到阳性融合细胞，并将阳性融合细胞克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的操作包括S171～S173。
S171、用Ad11FK抗原筛选融合细胞，得到阳性融合细胞。
具体地，培养融合细胞至适宜浓度，用间接酶联免疫法筛选得到阳性融合细胞。
进一步地，将Ad11FK抗原包被在酶标板上，用封闭液封闭后，加入融合细胞培养上清孵育0.5h～1h，洗涤、拍干之后，加入二抗孵育0.5h～1h，再次洗涤、拍干之后加入显色剂显色，酶标仪测定吸光度值，筛选得到阳性融合细胞。
更进一步地，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
S173、将阳性融合细胞克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
具体地，将融合细胞培养至适宜的细胞浓度后，通过有限稀释法将阳性融合细胞单克隆化，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本实施方式中，筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCCNo：C201874。
当然，在实际应用中，制备杂交瘤细胞不限于上述步骤S110～S170的顺序，本领域技术人员可以根据需求进行调整。
在单克隆抗体制备中，传统的方法是使用完整的腺病毒颗粒作为免疫原，并用完整的腺病毒颗粒作为检测抗原制备中和单克隆抗体。但腺病毒不同血清型间不存在交叉中和作用，因此，使用完整的腺病毒颗粒作为免疫原和检测抗原很难获得具交叉中和作用的单克隆抗体。经证实，按照上述方法制备的杂交瘤细胞能够持续、高效地分泌纤毛蛋白的中和单克隆抗体，且上述制备杂交瘤细胞的方法简便易行。
一实施方式的单克隆抗体，其轻链包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其重链包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中，编码单克隆抗体的轻链的基因包括如SEQ ID NO.3所示的碱基序列，编码单克隆抗体的重链的基因包括如SEQ ID NO.4所示的碱基序列。
在其中一个实施例中，上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体标记为6A7。
在其中一个实施例中，上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体标记为为3D8。
经证实，3F11能够特异性地结合人11型腺病毒、7型腺病毒及55型腺病毒；6A7能够特异性地结合人11型腺病毒；3D8能够特异性地结合人11型腺病毒、7型腺病毒及55型腺病毒，上述单克隆抗体可广泛应用于制备治疗多种型别的人腺病毒感染的药物中，当然，也可用于制备检测人腺病毒的检测试剂或检测设备中。
一种治疗腺病毒感染的药物，包括上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。
在其中一个种实施方式中，上述治疗腺病毒感染的药物包括上述杂交瘤细胞分泌的Ad11及3D8中的至少一种。
在其中一个实施例中，上述治疗腺病毒感染的药物还包括药学上可接受的辅料或载体。
人腺病毒是无包膜二十面体对称结构，主要衣壳蛋白包括六邻体、五邻体，五邻体包括五邻体基座(penton base)和纤毛蛋白(fiber)，均能在体内诱导特异性的中和抗体应答。传统上认为六邻体是最重要的中和作用抗原，纤毛蛋白是次要的中和抗原。上述治疗感染腺病毒的药物包括上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能够识别与多种型别的人腺病毒，并能与之特异性结合，阻止人腺病毒纤毛蛋白的头部结构域与宿主细胞表面的人腺病毒特异性受体结合，使得人腺病毒不能完成吸附，以中和多种不同型别的腺病毒，达到消除多种不同型别的腺病毒的效果。
一种检测试剂，包括上述杂交瘤细胞或上述单克隆抗体。
在其中一个实施例中，上述检测试剂还包括辅助检测剂。
上述检测试剂具有快速、高效、低成本的优点。
本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可应用于其他形式的人腺病毒检测试剂或设备中，所以上述单克隆抗体可以广泛应用于人腺病毒检测领域。
以下为具体实施例。
实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
本说明书实施例中的Ad3GZ01病毒株的GenBank登录号为DQ099432，下文简写为Ad3。Ad4GZ01病毒株的GenBank登录号为KF006344.1，下文简写为Ad4。Ad11 Slobitski病毒株的GenBank登录号为AF532578.1，下文简写为Ad11。Ad7GZ08病毒株的GenBank登录号为GQ478341.1，下文简写为Ad7。Ad14p1 GZ01病毒株的GenBank登录号为JQ824845.1，下文简写为Ad14 p1。Ad55 Shanxi-Y16病毒株的GenBank登录号为KF911353.1，下文简写为Ad55。HEp-2和AD293细胞均购自生物资源中心(ATCC)。Ad35 Holden病毒株(GenBank登录号：AY128640.2)购自生物资源中心(ATCC)，下文简写为Ad35。复制缺陷型Ad5病毒株为由pAdEASY-1载体(GenBank登录号：AY370909.2)转染AD293后包装获得，下文简写为Ad5。
实施例1
Ad11FK抗原的制备
(1)将人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因进行密码子优化，优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因的序列SEQ IDNo:5所示，优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
(2)将在人工合成优化后的人11型腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的基因的序列扩增后，得到扩增产物。用BamHI和HindIII双酶切扩增产物后连接到已经用BamHI和HindIII双酶切的原核表达载体PQE30(Qiagen公司)上，得到重组表达载体。
(3)将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kanr平板上，培养12h，观察是否有单克隆生长，若有生长，则初步判定转化成功。然后挑取转化子进行菌落PCR进一步验证，筛选得到转化成功的到重组工程菌。
(4)采用0.5mM IPTG，18℃低温诱导重组工程菌，培养过夜，收集细菌。然后用PBS缓冲液(1mM EDTA，10％甘油，1％Triton X100，10mM咪唑)重悬，溶菌酶裂解重组工程菌，高速离心后取上清，得到初产物。
(5)用镍柱进行纯化，梯度咪唑进行洗涤和洗脱，10kDa超滤管离心去咪唑，得到纯化的Ad11FK抗原，将纯化的Ad11FK抗原进行SDS-PAGE分析，具体地：将两份纯化的Ad11FK加入电泳缓冲液(含2％SDS，1％巯基乙醇)中，室温放置5分钟后，分别置冰上及98℃加热处理5分钟(Denatured)上样，在12％SDS-PAG中电泳分离，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示。图1中，M泳道(图中编号M)为蛋白分子量Maker，第一泳道(图中编号1)及第二泳道图中编号2)均为98℃加热处理5min的Ad11FK抗原，第三泳道(图中编号3)为冰上处理5min的Ad11FK抗原。
(6)按照步骤(1)～(5)制备Ad4的纤毛蛋白的头部结构域(Ad4FK)、Ad7的纤毛蛋白的头部结构域(Ad7FK)、Ad3的纤毛蛋白的头部结构域(Ad3FK)、Ad14p1的纤毛蛋白的头部结构域(Ad14p1FK)及Ad55的纤毛蛋白的头部结构域(Ad55FK)。其中，编码Ad4FK的基因序列如SEQ ID No.7所示，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。编码Ad7FK的基因序列如SEQ ID No.9所示，氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。编码Ad3FK的基因序列如SEQ ID No.11所示，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。编码Ad14p1FK的基因序列如SEQ ID No.13所示，氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。编码Ad55FK的基因序列如SEQ ID No.15所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.16所示。
(7)在Ad11FK抗原中加磷酸铝佐剂体积比(1：1)乳化后免疫BALB/c小鼠，共免疫四次，每只小鼠每次免疫40μg蛋白，末次免疫7天后采集血清，得到anti-Ad11FK抗血清。然后分别进行免疫印迹检测、间接酶联免疫检测。
免疫印迹检测具体为：将纯化的全病毒颗粒(Ad3、Ad4、Ad5、Ad7、Ad11、Ad14p1、Ad35及Ad55)分别加入电泳缓冲液室温放置5分钟后置冰上，直接上样，或将Ad11在98℃加热处理5分钟(Ad11-D)后上样，电泳后转膜，用anti-Ad11FK抗血清进行免疫印迹分析，结果如图2所示。图2中，M指宽范围3色预染蛋白marker(SMOBIO，中国台湾)。
间接酶联免疫检测具体为：1)将anti-Ad11FK抗血清(1：5000)与步骤(6)得到的Ad3FK、Ad7FK、Ad11FK、Ad14p1FK、Ad55FK进行交叉反应，PBS免疫小鼠血清(1：5000)作为阴性对照，进行ELISA检测，结果如图3所示。2)将a nti-Ad11FK抗血清(1：5000)与Ad3、Ad7、Ad11、Ad14p1及Ad55进行交叉反应，PBS免疫小鼠血清(1：5000)作为阴性对照，进行ELISA检测，结果如图4所示。
(8)进一步地，将anti-Ad11FK抗血清进行的体外细胞微量中和实验，PBS免疫小鼠血清作为阴性对照，结果如图5所示。
由图1可知，Ad11FK抗原未加热时以多聚体结构为主，而在加热后则表现为单体结构。
由图2及图4可知，anti-Ad11FK抗血清可以识别腺病毒Ad7、Ad11、Ad14p1、Ad55，对Ad11-D的反应很弱。
Ad5为C组腺病毒代表株，Ad35与Ad3、Ad7、11、Ad14pl、Ad55同为B组的腺病毒，但与这几种型别的纤毛蛋白(fiber)在进化上较远，氨基酸差别较大。图2可知anti-Ad11FK抗血清不能识别Ad5和Ad35的fiber。
由图3可知，anti-Ad11FK抗血清对腺病毒Ad11、Ad7、Ad14p1、Ad55的纤毛蛋白的头部结构域(knob)有较强的交叉反应，对Ad3FK也有相对弱的反应。
由图5可知，anti-Ad11FK抗血清对腺病毒Ad11、Ad7、Ad14p1、Ad55有交叉中和作用，对Ad3有微弱中和作用。
实施例2
可分泌抗Ad11FK单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
(1)在由实施例1得到的Ad11FK抗原中加等体积弗氏完全佐剂乳化后，按每只小鼠50μg的剂量免疫BALB/c小鼠(BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心)进行初次免疫。饲养两周后，初次免疫的小鼠。
(2)在由实施例1得到的Ad11FK抗原中加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，以每只50μg的剂量进行加强免疫。饲养两周后，以同样的剂量再加强免疫一次，饲养两周后，得到加强免疫的小鼠。
(3)以实施例1得到的Ad11FK抗原，按照每只小鼠50μg的剂量将加强免疫的小鼠进行尾脾内冲击免疫，饲养三天，得到冲击免疫的小鼠。
(4)采集免疫小鼠脾脏，分离得到脾细胞。
(5)分别吸取脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0于离心管中，加入不完全培养液至30mL后混匀，1000rpm离心10min弃上清，得沉淀液。其中，脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为1×108个：3×107个。在沉淀液中加1mL PEG4000融合剂溶液(60s内加完)，静置90s后，加入4mL不完全培养液终止融合(3min加完)，800rpm离心7min，弃上清，加入100mlHAT培养液，轻轻重悬沉淀的细胞。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞层的96孔培养板中，每孔0.1ml(相当于2滴)。然后将培养板置37℃，含5％CO2的培养箱内培养，得到融合细胞。
(6)将实施例1得到的Ad11FK抗原用包被液(pH 9.6，0.05M碳酸盐缓冲液)稀释成约2μg/mL，每孔100μL加入96孔板ELISA板(品牌为：Nunc Maxisorp)，4℃包被过夜。包被过的96孔板用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗一遍，每孔加入100μL封闭液(含3％BSA的PBS)于37℃封闭2h。用PBST洗1遍，然后每孔加入100μL融合细胞培养上清，置于37℃孵育50min。之后再用PBST洗5遍，每孔加入100μL用抗体稀释液(含2％BSA的PBST)1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(Bio-Rad，中国)37℃孵育50min。之后再用PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB显色液显色5min。最后每孔加入30μL 2M硫酸终止反应，置于酶标仪(型号为：Thermo Scientific Multiskan MK3)下读取450nm吸光值。以Ad11免疫小鼠血清和未免疫小鼠血清(阴性血清)分别用抗体稀释液1：10000稀释，按同样方法操作，作为每次实验的阳性对照和阴性对照。以OD值达到0.2或与阴性对照孔OD值比值大于2判定为阳性细胞孔。
(7)对分泌抗体的阳性细胞孔用有限稀释法单克隆化，用间接ELISA法检测单克隆细胞培养上清对实施例1的得到的Ad11FK抗原的反应性，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，扩大培养，得到单克隆化的杂交瘤细胞株。该细胞株于2018年6月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C201874，分类命名：杂交瘤细胞株3F11。
实施例3
单克隆抗体的制备
将实施例2得到杂交瘤细胞腹腔注射入弗氏不完全佐剂预免的小鼠体内，诱导并采集腹水。用小鼠抗体亚类试剂盒(美国Roche公司产品)测定腹水中单抗的抗体亚类，具体操作按试剂盒说明书进行。用间接ELISA法测定腹水对实施例1所得的Ad11FK抗原的效价，以大于或等于2.1倍阴性对照吸光度值的最高稀释度为效价终点。
间接ELISA法测定实施例1所得的Ad11FK抗原的腹水效价为106。
经间接ELISA法筛选，共得到14株抗Ad11FK的单克隆抗体，分别是6A7、1C4、1D7、7D6、7D9、5B8、3F11、1G9、3D8、5H11、8C10、1G2、2D10及4D8。间接ELISA检测14株单克隆抗体的腹水(1：10000和1：1000稀释)的结果如图6所示。
实施例4
中和单克隆抗体筛选及其特异性分析
(1)体外微量中和实验检测单克隆抗体对不同型别腺病毒的中和作用。具体为：将实施例4中的到的腹水用DMEM培养液2倍倍比稀释后，每个稀释度取50μL分别与50μL含有100 TCID50的Ad11病毒稀释液混合均匀，37℃孵育1h。之后再将抗体-病毒混合液加入96孔培养板培养的85％-95％丰度的单层AD293细胞中。48h后，倒置显微镜观察并判定中和效价，以能保护单层细胞不形成明显细胞病变效应的最高稀释度为中和效价终点。Ad11免疫小鼠血清和PBS免疫小鼠血清经56℃处理30min后，按同样方法操作，作为每次实验的阳性对照和阴性对照。结果如表1所示。
(2)用间接ELISA检测单克隆抗体3F11与不同型别腺病毒的纤毛蛋白的头部结构域的交叉反应。具体为：不同型别腺病毒重纤毛蛋白的头部结构域(knob)(实施例1制得的Ad3FK、Ad4FK、Ad7FK、Ad11FK、Ad14FK及Ad55FK)作为包被抗原，进行间接ELISA检测，检测结果如图7所示。
(3)用间接ELISA检测单克隆抗体3F11与不同型别腺病毒颗粒的交叉反应。具体为：将不同型别的全病毒颗粒(Ad11、Ad4、Ad7、Ad11、Ad14及Ad55)作为包被抗原，进行间接ELISA检测，检测结果如图8所示。
(4)用微量中和实验检测单克隆抗体3F11对不同型别腺病毒颗粒的交叉中和作用。具体为：分别将实施例3中的到的单克隆抗体3F11用DMEM培养液2倍倍比稀释后，每个稀释度取50μL分别与50μL含有100 TCID50的病毒颗粒(Ad11、Ad3、Ad4、Ad7、Ad14及Ad55)稀释液混合均匀，37℃孵育1h。之后再将抗体-病毒混合液加入96孔培养板培养的85％-95％丰度的单层AD293细胞中。48h后，倒置显微镜观察并判定中和效价，以能保护单层细胞不形成明显细胞病变效应的最高稀释度为中和效价终点。结果如图9所示。
表1
Figure GDA0001839327000000081
a腹水效价在此表示为ELISA检测的腹水效价的倒数。
b 1ml腹水用辛酸-硫酸铵沉淀纯化溶于200μLPBS中，用光度计进行测量260nm的吸光值，按照1.4mg/mL每OD换算抗体浓度。
c中和效价在此表示为腹水中和效价的倒数。
表1的结果表明，3F11对Ad11有较强的中和活性，且为IgG1/κ亚型。
由图7～9可知，3F11可以中和Ad7、Ad11、Ad55，不能中和Ad14p1，。
实施例5
单抗免疫印迹实验
(1)分别在实施例1制得的Ad7FK、Ad11FK、Ad14p1FK、Ad55FK及Ad7、Ad11、Ad14p1、Ad55中加入SDS-PAGE电泳缓冲液后在室温放置5分钟，转置冰上作为天然样品(native)，另将增加一组Ad11FK、Ad11的变性样品组，即将Ad11FK、Ad11在98℃加热处理5分钟作为变性样品(denatured)。样品上样，然后进行SDS-PAGE分离，并以实施例3制得的单克隆抗体3F11进行单抗免疫印迹实验。结果如图10所示。
由图10可知，3F11识别天然三聚体形式的Ad11的纤毛蛋白(参见图10中标记3或标记10对应的泳道)和纤毛蛋白的头部结构域(Ad11FK)(参见图10中标记4对应的泳道)，不识别变性的单体形式的Ad11的纤毛蛋白(参见图10中标记1或8对应的泳道)和纤毛蛋白的头部结构域(Ad11FK)(参见图10中标记2对应的泳道)。3F11也识别Ad55及Ad7的纤毛蛋白(参见图10中标记6、7对应的泳道)，还能识别天然的Ad55及Ad7的纤毛蛋白的头部结构域(参见图10中标记11、12对应的泳道)，不识别天然的Ad14p1的纤毛蛋白及纤毛蛋白的头部结构域(参见图10中标记5、9对应的泳道)。综合图10的结果发现，3F11识别的表位均为纤毛蛋白头上的构象表位。与间接ELISA和细胞微量中和实验结果相一致。3F11识别Ad11、Ad7、Ad55的纤毛蛋白的头部结构域，不识别Ad14p1纤毛蛋白的头部结构域。
实施例6
序列比对和结构分析
对Ad11、Ad7、Ad14p1、Ad55的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)的氨基酸序列及构象进行比对分析。由于Ad55和Ad14原型株(Ad14p)的纤毛蛋白的fiber knob的氨基酸序列相同，在此表示为Ad55/Ad14p或Ad55(Ad14p)。分析结果如图11及图12所示。其中，图13中A～J指Ad11、Ad7、Ad14p1、Ad55/Ad14p的纤毛蛋白头的头部结构域的β-折叠片对应的氨基酸序列，折叠片间为环(loop)结构对应的氨基酸序列，需要说明的是，Ad55/Ad14p指Ad55或者Ad14p。
由图11可知，Ad55或Ad14p与Ad14p1的纤毛蛋白的头部结构域(fiber knob)仅存在两个氨基酸的差异，即在图中的箭头位置，Ad14p1的纤毛蛋白的头部结构域(fiberknob)上F-G环中缺失的两个氨基酸(250EK251)。Ad7和Ad11相应位置氨基酸序列与Ad55/Ad14p相同(250EK251)。结合微量中和实验、ELISA、免疫印迹实验的结果(3F11特异性中和Ad11、Ad7、Ad55，而不能中和Ad14p1)可知，3F11识别Ad11、Ad7、Ad55/Ad14p的共同表位。更进一步表明了250EK251为3F11识别的构象表位的两个关键性氨基酸，这两个氨基酸的缺失导致病毒不能被3F11所中和。
由图12可知，Ad7、Ad11、Ad55/Ad14p在该区域为短α螺旋结构(248SREKE252)，Ad14p1上250EK251的缺失破坏了该α螺旋结构，导致构象改变。
实施例7
杂交瘤细胞株3F11的抗体基因序列测序分析
(1)提取杂交瘤细胞株3F11的mRNA，采用5’RACE反转录cDNA，PCR获得抗体重链/轻链可变区基因，重链及轻链可变区(V)和铰链区(J)基因克隆测序，生物信息学分析测序结果，剔除非功能抗体基因，确定可能的CDR区序列。
生物信息学分析结果显示，3F11的轻链为κ型，编码该轻链的基因如SEQ ID NO.3所示的碱基序列，该轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3F11的重链为IgG型，编码该轻链的基因如SEQ ID NO.4所示的碱基序列，该轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)分别将轻链的基因序列、氨基酸序列、重链的基因序列及氨基酸序列在抗体数据库中比对，对比结果如图13及图14所示。
图13的对比结果显示，3F11的轻链的V区基因及等位基因与Musmus IGKV10-96*01F相似性最高，达98.57％(275/279nt)，有四个氨基酸差异；J区基因Musmus IGKJ2*01 F相似性最高，达97.37％(37/38nt)，无氨基酸差异。4个FR区(FR-IMGT)分别为[26.17.36.10]个氨基酸，3个CDR区(FR-IMGT)分别为[6.3.9]个氨基酸，AA JUNCTION序列为CQQGNALPYTF。
图14的对比结果显示，3F11的重链的V区基因及等位基因与Musmus IGHV8-8*01 F相似度最高，达93.81％(273/291nt)，有13个氨基酸差异；J区基因与Musmus IGHJ4*01 F相似度最高，达88.89％(48/54nt)，有2个氨基酸差异；D区为第一阅读框。4个FR区(FR-IMGT)分别有[25.17.38.11]个氨基酸，3个CDR区(FR-IMGT)分别有[10.7.14]个氨基酸，AAJUNCTION序列为CVRRTSVVAGYAMDSW。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学附属第一医院
<120> 杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Ala Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Pro Leu Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Ala Tyr Ile Trp Trp Asp Asp Asp Glu Asp Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Gln Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg
85 90 95
Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Thr Ser Val Val Ala Gly Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
130 135 140
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
145 150
<210> 3
<211> 434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattgaagtc aagactcagc ctggacatga tgtcctctgc tcagttcctt ggtctcctgt 60
tgctctgttt tcaaggtacc agatgtgata tccagatgac acagactaca tcctccctgt 120
ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagcaatt 180
ttttaaactg gtatcagcag aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc cactacacat 240
caagattaca ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt 300
ctctcaccat tagcaacctg gagcaagaag atgttgccac ttacttttgc caacagggta 360
atgcgcttcc gtacacgttc ggagggggga ccaagctgga aataaaccgg gctgatgctg 420
caccaactgt atcc 434
<210> 4
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaagtgtgc agacatggac aggcttactt cttcattcct gctgctgatt gtccctgcat 60
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ccctcagtct gacttgttct ttctctgggt tttcactgag cacttctggt atgggtgtag 180
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atgatgagga ctataaccca tccctgaaga gtcagttcac aatctccaag gatacctcca 300
gaaaccaggt attcctcaag atcaccagtg tggacactgc agatgctgcc acttactact 360
gtgttcgaag aacttcggta gtagcggggt atgctatgga ctcctggggt caaggaacct 420
cagtcaccgt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctg 477
<210> 5
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacaacattt gcattgatga caatattaac accttatgga caggagtcaa ccccaccgaa 60
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aatatgctaa ctacacacag aaatataaat tttactgcag agctgttttt cgattctact 240
ggtaatttac taactagact ctcatccctc aaaactccac ttaatcataa atcaggacaa 300
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cctttcaatg ataattctag agaaaaagaa aactacattt acggaacttg ttactacaca 420
gctagtgatc gcactgcttt tcccattgac atatctgtca tgcttaaccg aagagcaata 480
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<210> 6
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Val
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Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Ile Met Asn Ser Ser Glu Ser Asn
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Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr
35 40 45
Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr
50 55 60
Thr His Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Thr
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Gly Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His
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Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Gly
100 105 110
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Lys Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Tyr Thr Ala Ser Asp Arg
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<210> 7
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 192
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Met Leu Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Asp Asp Thr Thr Ser Ala
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Ser Phe Ser Tyr Thr Trp Thr Asn Gly Ser Tyr Ile Gly
165 170 175
Ala Thr Phe Gly Ala Asn Ser Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu
180 185 190
<210> 9
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacaatattt gtattgatga taatattaat accctgtgga ccggcgtgaa tccgacccgt 60
gccaattgtc agattatggc ctctagcgaa agcaatgatt gtaaactgat tctgacctta 120
gttaaaaccg gcgccttagt gaccgcattt gtgtatgtga ttggtgtgtc taatgatttt 180
aatatgctga ccacccataa aaatattaat tttaccgcag aactgttctt tgatagcacc 240
ggcaatctgt taacctcatt atcttctctg aaaaccccgc tgaatcataa atctggtcag 300
aatatggcaa ccggtgcact gaccaatgcc aaaggcttta tgccgagtac caccgcctat 360
ccgtttaatg tcaactctcg cgaaaaagaa aattatatct acggcacctg ttattatacc 420
gcaagcgatc ataccgcatt tccgattgat attagcgtga tgctgaatca gcgcgcctta 480
aacaacgaaa ccagctattg tattcgtgtt acctggagtt ggaataccgg cgttgccccg 540
gaagtgcaga cctcagccac caccctggtt accagtccgt ttacctttta ttatattcgc 600
gaagatgat 609
<210> 10
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Val
1 5 10 15
Asn Pro Thr Arg Ala Asn Cys Gln Ile Met Ala Ser Ser Glu Ser Asn
20 25 30
Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr
35 40 45
Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asp Phe Asn Met Leu Thr
50 55 60
Thr His Lys Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Thr
65 70 75 80
Gly Asn Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Leu Thr Asn Ala Lys Gly
100 105 110
Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Val Asn Ser Arg Glu
115 120 125
Lys Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Tyr Thr Ala Ser Asp His
130 135 140
Thr Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Gln Arg Ala Leu
145 150 155 160
Asn Asn Glu Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Val Thr Trp Ser Trp Asn Thr
165 170 175
Gly Val Ala Pro Glu Val Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser
180 185 190
Pro Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp
195 200
<210> 11
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatagcattg cactgaaaaa taacaccctg tggaccggtc cgaaaccgga agccaattgt 60
attattgaat atggcaaaga aaatccggat agtaaactga ccttaattct ggttaaaaat 120
ggcggcattg ttaatggcta tgtgaccctg atgggcgcct cagattatgt taataccctg 180
tttaaaaaca aaaatgtgag cattaatgtg gaactgtatt ttgatgcaac cggtcatatt 240
ctgccggatc tgtcaagtct gaaaaccgat ctgcagctga aatacaaaca gaccacccat 300
tttagcgcac gcggctttat gccgtctacc accgcctatc cgtttgtgct gccgaatgca 360
ggcaccgata acgaaaatta tatttttggt cagtgttatt acaaggcaag cgatggcgca 420
ctgtttccgc tggaagtgac cgtgaccctg aataagcgtc tgccggatag tcgtaccagc 480
tatgtgatta cctttctgtg gagcctgaat gcaggcttag ccccggaaac cacccaggcc 540
accttaatta cctctccgtt tacctttagc tatattaccg aagatgat 588
<210> 12
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro
1 5 10 15
Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Glu Asn Pro Asp Ser Lys
20 25 30
Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val
35 40 45
Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys
50 55 60
Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile
65 70 75 80
Leu Pro Asp Leu Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Gln Leu Lys Tyr Lys
85 90 95
Gln Thr Thr His Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala
100 105 110
Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr Asp Asn Glu Asn Tyr Ile
115 120 125
Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu
130 135 140
Glu Val Thr Val Thr Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser
145 150 155 160
Tyr Val Ile Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu
165 170 175
Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile
180 185 190
Thr Glu Asp Asp
195
<210> 13
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aataacattt gtattgatga taatattaat accctgtgga ccggtgtgaa tccgaccgaa 60
gccaattgtc agatgatgga tagtagcgaa agcaatgatt gtaaactgat tctgacctta 120
gttaaaaccg gcgcactggt gaccgccttt gtgtatgtga ttggcgtttc aaataacttt 180
aatatgttaa ccacctatcg taatattaat tttaccgcag aactgttctt cgatagcgca 240
ggcaatctgc tgacctctct gtctagtctg aaaaccccgc tgaatcataa aagtggtcag 300
aatatggcaa ccggtgccat taccaatgcc aagagcttta tgccgagcac caccgcctat 360
ccgtttaaca acaattcacg cgaaaattat atatacggca cctgtcatta taccgcctca 420
gatcataccg cctttccgat tgatattagt gttatgctga atcagcgtgc cattcgtgca 480
gataccagct attgtattcg cattacctgg agttggaata ccggcgatgc cccggaaggc 540
cagacctctg caaccaccct ggtgaccagt ccgtttacct tttattatat tcgcgaagat 600
gat 603
<210> 14
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Val
1 5 10 15
Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Met Met Asp Ser Ser Glu Ser Asn
20 25 30
Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr
35 40 45
Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr
50 55 60
Thr Tyr Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Ser
100 105 110
Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asn Asn Ser Arg Glu
115 120 125
Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys His Tyr Thr Ala Ser Asp His Thr Ala
130 135 140
Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Gln Arg Ala Ile Arg Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr Gly Asp
165 170 175
Ala Pro Glu Gly Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser Pro Phe
180 185 190
Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp
195 200
<210> 15
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacaacattt gcattgatga caatattaac accctgtgga caggaattaa ccccaccgaa 60
gccaactgtc aaatgatgga ctccagtgaa tctaatgatt gcaaattaat tctaacacta 120
gttaaaactg gagccctagt cactgcattt gtttatgtta taggagtatc taacaatttt 180
aatatgctaa ctacatacag aaatataaat tttactgcgg agctgttttt tgattctgcg 240
ggtaatttac taactagcct gtcatcccta aaaactccac ttaatcataa atcaggacaa 300
aacatggcta ctggtgccat tactaatgct aaaagtttca tgcccagcac aactgcttat 360
cctttcaata ataattctag agaaaaagaa aactacattt acggaacctg tcactacaca 420
gctagtgatc acactgcttt tcccattgac atatctgtca tgcttaacca aagagcaata 480
agagctgata catcatattg tattcgtata acttggtcct ggaacacagg agatgcccca 540
gaggggcaaa cctctgctac aaccctagtt acctccccat ttacctttta ctacatcaga 600
gaagacgac 609
<210> 16
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Ile
1 5 10 15
Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Met Met Asp Ser Ser Glu Ser Asn
20 25 30
Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr
35 40 45
Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr
50 55 60
Thr Tyr Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Ser
100 105 110
Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asn Asn Ser Arg Glu
115 120 125
Lys Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys His Tyr Thr Ala Ser Asp His
130 135 140
Thr Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Gln Arg Ala Ile
145 150 155 160
Arg Ala Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Pro Glu Gly Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser
180 185 190
Pro Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp
195 200

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC No：C201874。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体标记为3F11。
3.一种抗Ad11FK单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列包括如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞或如权利要求2～3任一项所述的单克隆抗体在制备治疗感染人腺病毒相关疾病的药物中的应用，所述人腺病毒为人7型腺病毒、人11型腺病毒和人55型腺病毒中的至少一种。
5.一种治疗人腺病毒感染的药物，其特征在于，包括权利要求2～3任一项所述的单克隆抗体，所述人腺病毒为人7型腺病毒、人11型腺病毒和人55型腺病毒中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。
7.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求2～3任一项所述的单克隆抗体。
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