CN117186213B - 抗人腺病毒中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗人腺病毒中和抗体及其制备方法和应用。该中和抗体，其重链可变区包含如下所示的VH‑CDR1、VH‑CDR2和VH‑CDR3：VH‑CDR1如SEQ ID NO.13所示，VH‑CDR2如SEQ ID NO.14所示，VH‑CDR3如SEQ ID NO.15所示；以及，其轻链可变区包含如下所示的VL‑CDR1、VL‑CDR2和VL‑CDR3：VL‑CDR1如SEQ ID NO.16所示，VL‑CDR2如SEQ ID NO.17所示，VL‑CDR3如SEQ ID NO.18所示，能与HAdV‑B7、HAdV‑B55和HAdV‑B11均具有较高的亲和力和中和活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗人腺病毒中和抗体及其制备方法和应用。
背景技术
人腺病毒(human Adenovirus,HAdV)可以感染多种粘膜组织，如胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及眼角结膜等，导致急性呼吸道感染(ARI)、急性胃肠炎、肾炎、眼角膜结膜炎、膀胱炎等自限性的粘膜感染甚至严重的致死性感染。腺病毒流行广泛，传播快，近年来在多个国家和地区时有爆发和流行，严重威胁到社会公共卫生安全。各个年龄段人群均能被腺病毒感染，其中易感人群多为婴幼儿和免疫功能受损的患者(如骨髓移植、人类免疫缺陷病毒感染)，常可引起严重甚至致死性感染。HAdV暴发感染多发生在封闭或拥挤的场所，大规模流行中其所致的重症肺炎病死率较高，甚至未经治疗的重症HAdV肺炎或弥散性疾病的死亡率可能超过50％。腺病毒引起的肺炎尤为严重，不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡，而且通常预后较差。腺病毒是致病毒性肺炎的主要病原体之一，B组、C组、E组腺病毒都可以引起呼吸道感染，其中B组7型、55型腺病毒是儿童和成人发热性呼吸道疾病的重要病原体，传染性强，常导致爆发流行，引起重症肺炎。目前还没有用于预防和治疗HAdV肺炎的有效疫苗和药物，特别是能够广谱抗HAdV-B7、HAdV-B55和HAdV-B11的产品。
发明内容
基于此，本申请实施例的主要目的提供抗人腺病毒中和抗体及其制备方法和应用，该中和抗体与HAdV-B7、HAdV-B55和HAdV-B11均具有较高的亲和力和中和活性。技术方案包括：
在本申请的第一方面，提供一种抗人腺病毒中和抗体，其重链可变区包含如下所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3：
VH-CDR1如SEQ ID NO.13所示，
VH-CDR2如SEQ ID NO.14所示，
VH-CDR3如SEQ ID NO.15所示；
以及，其轻链可变区包含如下所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3：
VL-CDR1如SEQ ID NO.16所示，
VL-CDR2如SEQ ID NO.17所示，
VL-CDR3如SEQ ID NO.18所示。
在本申请的一些实施方式中，其重链骨架区和所述轻链骨架区的序列独立地包含来源于人的抗体骨架区序列以及鼠的抗体骨架区序列其中之一；可选地，所述重链骨架区和所述轻链骨架区的序列全部为来源于人的抗体骨架区序列。
在本申请的一些实施方式中，其重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；或者，其重链可变区如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.7之一所示，其轻链可变区如SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.12之一所示。
在本申请的一些实施方式中，其恒定区满足如下条件中的一个或者多个：
(1)其恒定区的序列选自IgG、IgA、IgM、IgE及IgD任何其中之一恒定区的序列；可选地，所述恒定区的序列为IgG的恒定区的序列；以及，
(2)其恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或者人；可选地，所述恒定区来源于人。
在本申请的第二方面，提供一种核酸，其编码第一方面中所述的中和抗体。
在本申请的第三方面，提供一种重组载体，其含有第二方面中所述的核酸；可选地，所述重组载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或者哺乳动物细胞病毒。
在本申请的第四方面，提供一种宿主细胞，其包含第二方面中所述的核酸或者第三方面中所述的重组载体；可选地，所述宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或HEK293细胞。
在本申请的第五方面，提供一种抗人腺病毒中和抗体的生产方法，其采用第四方面中所述的宿主细胞生产抗人腺病毒中和抗体。
在本申请的第六方面，提供一种药物，其包含第一方面中所述的中和抗体、第二方面中所述的核酸或者第三方面中所述的重组载体。
在本申请的第七方面，提供一种检测试剂盒，其包括第一方面中所述的中和抗体。
本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为H3L4与Ad55 knob重组蛋白结合曲线图；
图2为人源化单抗H1L4对Ad11E、Ad7E、Ad55E病毒的抑制曲线；
图3为人源化抗体的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
抗病毒单克隆中和抗体具有高特异性，在病毒的预防和治疗方面发挥着重要的作用，抗腺病毒中和抗体为HAdV感染防治带来了希望。但鼠源抗体进入人体后，会引起机体免疫系统的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)反应，使鼠源抗体被加速清除，甚至引起过敏性反应。对高活性鼠源单抗进行人源化改造是解决HAMA反应的重要方法，本研究提供了一种高中和活性的人源化广谱抗HAdV-B7、B55、B11单克隆抗体。技术问题：人B组7型、55型腺病毒是致儿童和成人重症肺炎的重要病原体，有必要制备一种具有高效中和活性的抗人腺病毒人源化单抗。
本申请的第一方面
本申请提供一种抗人腺病毒中和抗体，其重链可变区包含如下所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3：
VH-CDR1如SEQ ID NO.13所示，
VH-CDR2如SEQ ID NO.14所示，
VH-CDR3如SEQ ID NO.15所示；
以及，其轻链可变区包含如下所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3：
VL-CDR1如SEQ ID NO.16所示，
VL-CDR2如SEQ ID NO.17所示，
VL-CDR3如SEQ ID NO.18所示。
本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。因此，本发明也包括该中和抗体的“功能性衍生物”。“功能性衍生物”是指氨基酸替换的变体，一个功能性衍生物保留有可检测的结合蛋白活性。“功能性衍生物”可以包含“变体”和“片段”，因其具有与本发明所述的中和抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。
本文描述的中和抗体，相对于上述CDR序列，可以包含具有一或多个的取代、缺失或插入的氨基酸，例如氨基酸插入、替换或缺失的数量不超过3个，优选为1个。通过如定点突变或者PCR介导的突变的常规技术，可给编码本发明的结合蛋白的核酸分子引入取代、缺失或插入。在一些实施方案中，在一个或者多个位点进行了保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替的情况。具有类似侧链的氨基酸家族在现有技术中已有限定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或者轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称30为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
在一些实施方案中，其重链骨架区和所述轻链骨架区的序列独立地包含来源于人的抗体骨架区序列以及鼠的抗体骨架区序列其中之一；可选地，所述重链骨架区和所述轻链骨架区的序列全部为来源于人的抗体骨架区序列。
当在本文中使用时，“骨架”、“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或片段是人源化的，因为它包含至少一个人框架区；进一步可选地，所述重链骨架区和所述轻链骨架区的序列全部为来源于人的抗体骨架区序列。例如，由本发明的杂交瘤所产生的抗体的一或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个或六个)框架区可替换为一或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个或六个)人框架区。相对非人源化抗体，人源化抗体一般对人的免疫原性更低，因此在某些情况可带来治疗上的优势。本领域技术人员知道各种人框架区。制备人源化抗体的方法是本领域已知的。
在本申请的一些实施方式中，其重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；或者，其重链可变区如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.7之一所示，其轻链可变区如SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.12之一所示。
在一些实施方案中，其恒定区满足如下条件中的一个或者多个：
(1)其恒定区的序列选自IgG、IgA、IgM、IgE及IgD任何其中之一恒定区的序列；可选地，所述恒定区的序列为IgG的恒定区的序列；以及，
(2)其恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或者人；可选地，所述恒定区来源于人。
本文描述的抗体可以是嵌合的，也可以是人源化的，包含至少一个人恒定区。例如，由本申请的杂交瘤产生的抗体的恒定区可替换为人恒定区。相对非嵌合抗体，嵌合抗体一般对人的免疫原性更低，因此在某些情况可带来治疗上的优势。在一些实施方案中，本文描述的嵌合抗体包含IgG恒定区。本领域技术人员知道各种人恒定区。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。
本申请的第二方面
本申请提供一种核酸，其编码第一方面中所述的中和抗体。
本申请的第三方面
本申请提供一种重组载体，其含有第二方面中所述的核酸。
在一些实施方案中，所述重组载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或者哺乳动物细胞病毒。
本申请的第四方面
本申请提供一种宿主细胞，其包含第二方面中所述的核酸或者第三方面中所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或HEK293细胞。
本申请的第五方面
本申请提供一种抗人腺病毒中和抗体的生产方法，其采用第四方面中所述的宿主细胞生产抗人腺病毒中和抗体。
本申请的第六方面
本申请提供一种药物，其包含第一方面中所述的中和抗体、第二方面中所述的核酸或者第三方面中所述的重组载体。
本申请的第七方面
本申请提供一种检测试剂盒，其包括第一方面中所述的中和抗体。
本申请的中和抗体可以被制备成检测试剂盒，在该检测试剂盒中，中和抗体能够用于广谱捕获Ad7、Ad55、Ad11。本申请对检测试剂盒的检测原理(例如双抗夹心法、免疫比浊法等)不做特别限定，相应地，对检测试剂盒所包括的检测试剂也不做特别限定，毕竟根据公知技术，在获得本申请的中和抗体的情况下制备这样的检测试剂盒是很容易的。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
本申请的发明人前期获得了一株分泌高效价广谱抗Ad7、Ad55、Ad11中和抗体的杂交瘤细胞，通过扩增重链可变区基因和轻链可变区基因片段，克隆到抗体表达质粒上，制备了人-鼠嵌合抗体，再通过人源化改造，克隆到抗体表达质量上，转染真核细胞进行表达和纯化，获得了人源化单抗，经亲和力检测、细胞微量中和实验分析，获得具有高亲和力、高中和活性的人源化单抗。鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性和与抗原的亲和力，并且将原本的鼠源成分绝大部分被替换成人源成分，从而降低甚至避免HAMA反应的发生，因此，本发明的人源化广谱抗人腺病毒单克隆中和抗体具有更强的中和活性、在使用上更加安全。
实施例1、鼠源单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因扩增测序
采用杂交瘤技术制备分泌鼠源广谱抗HAdV-B7、HAdV-B55、HAdV-B11单克隆中和抗体的杂交瘤细胞(A11K)，液氮冷冻保存细胞，冻存杂交瘤细胞经37℃水浴复苏，用10％胎牛血清+1％双抗的1640培养基，在37℃、含5％CO2培养箱中培养。
取1×106个细胞离心后弃上清，收集细胞沉淀，用RNA Kit(北京全式金)提取总RNA，采用5’RACE反转录cDNA，PCR获得抗体重链/轻链可变区基因，重链及轻链可变区(V)和铰链区(J)基因克隆测序，生物信息学分析测序结果，剔除非功能抗体基因，确定可能的CDR区序列。用/>ⅡAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMixfor PCR(北京全式金)对提取的杂交瘤细胞总RNA进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用Prime />HSDNA Polymerase with GC Buffer(Takara)，根据测序结果设计重链和轻链引物，分别PCR扩增鼠源抗体VH和VL基因片段，50μL总反应体系中包括：5μL cDNA模板，10μM正向引物和反向特异引物各1μL。反应程序：98℃10sec，60℃5sec，72℃1min，30个循环。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用/>Gel Extrection Kit(Qiagen)回收。
回收的鼠源抗体VH基因片段连接到pAb20-hCHIgG1载体(AscI酶切位点)上，转化DH5α感受态细菌，涂布Amp抗性LB琼脂板，过夜培养。挑单菌落接种于Amp抗性LB培养基中摇培过夜，用Plasmid Mini Kit(Omega)提取质粒，并进行基因测序，确定VH嵌合表达载体。
回收的鼠源抗体VL基因片段连接到pAb20-hCK载体上，同样方法制备质粒，进行基因测序，确定VL嵌合表达载体。
A11K序列信息
重链VH(A11K-H-WT，SEQ ID NO.1)：
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWVRQPLGKGLEWLAYIWWDDDEDYNPSLKSQFTISKDTSRNQVFLKITSVDTADAATYYCVRRTSVVAGYAMDSWGQGTSVTVSS。
轻链VL(KAPPA)(A11K-L-WT，SEQ ID NO.2)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGNALPYTFGGGTKLEIN。
本实施例上述反应体系中：
轻链正向引物(SEQ ID NO.19)：AATTGAAGTCAAGACTCAGCCT；
轻链反向引物(SEQ ID NO.20)：GGATACAGTTGGTGCAGCATCA；
重链正向引物(SEQ ID NO.21)：ACAAGTGTGCAGACATGGACAG；
重链反向引物(SEQ ID NO.22)：CAGGGGCCAGTGGATAGACA。
实施例2、人-鼠嵌合抗体的表达及中和活性分析
使用Endo-Free Plasmid Mini Kit(Omega)分别提取实施例1构建的人-鼠嵌合抗体轻、重链嵌合表达质粒后，用转染试剂共转染HEK293F细胞，7天后收集细胞培养上清，用带荧光蛋白重组腺病毒rAd11-EGFP、rAd7-EGFP、rAd55-EGFP检测嵌合抗体(HWT-LWT)中和活性。对三种重组腺病毒均具有显著中和活性(荧光细胞计数抑制率>50％)。
使用Endo-Free Plasmid Maxi Kit(Omega)分别提取实施例1构建的人-鼠嵌合抗体轻、重链嵌合表达质粒后，用转染试剂共转染HEK293F细胞，隔天补料，7天后收集细胞培养上清，用Protein G纯化介质分离纯化，用50kDa超滤管浓缩，测定嵌合抗体浓度。检测嵌合抗体抗rAd11-EGFP、rAd7-EGFP、rAd55-EGFP中和活性，嵌合抗体HWT-LWT(IC50分别约3.6、56、108ng/mL)与鼠源抗体(IC50分别约4.5、60、120ng/mL)中和效价一致，无显著差异。
实施例3、鼠单抗的人源化改造及表达
采用CDR移植方法进行人源化。搜索抗体基因数据库，采用最适匹配原则选择人源胚系基因框架区(FR)模板；分析可变区序列，包括确定各个CDR区和FR区、分析规范残基、VH和VL的接触面残基、特殊FR区残基、可变区空间结构的模建；将CDR插入到模板人胚系基因FR框架上，确定FR区鼠、人序列之间不同的氨基酸残基，根据可变区序列分析结果，确定重要残基，对不重要的鼠源氨基酸直接人源化替换，重要残基的鼠源、人源副本同时作为候选。按照CHO细胞密码子合成人源化抗体VH和VL基因，将人源化抗体VH基因片段连接到pAb20-hCHIgG1载体，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体κ轻链VL基因连接到pAb20-hCK载体表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体。使用Endo-Free Plasmid Maxi Kit(Omega)分别提取人源化抗体轻、重链表达质粒后，用转染试剂共转染HEK293F细胞，隔天补料，7天后收集细胞培养上清，用Protein G纯化介质分离纯化，用50kDa超滤管浓缩，测定人源化抗体浓度。
人源化单抗氨基酸序列：
表1
VH-CDR1(SEQ ID NO.13)：GFSLSTSGMG。
VH-CDR2(SEQ ID NO.14)：IWWDDDE。
VH-CDR3(SEQ ID NO.15)：VRRTSVVAGYAMDS。
VL-CDR1(SEQ ID NO.16)：QDISNF。
VL-CDR2(SEQ ID NO.17)：YTS。
VL-CDR3(SEQ ID NO.18)：QQGNALPYT。
实施例4、人源化抗体的抗病毒活性检测
1、对纯化的人源化抗体进行ELISA检测。
分别包被抗原Ad7 knob和Ad55 knob重组蛋白5μg/ml，抗体起始浓度0.1mg/ml，10倍梯度稀释，稀释8个梯度。见表2和表3。所有人源化单抗的效价较嵌合型单抗(HWTLWT)有提升，人源化单抗在10ng/mL与Ad7 knob或Ad55 knob能检测到反应(OD值>0.2)，而嵌合型单抗在10ng/mL时与Ad7 knob或Ad55 knob已不能检测到反应。
表2
表3
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2、Gator亲和力检测。
选取单抗HWTLWT、H1L1、H1L4、H2L1、H2L4和H5L5分别作为配体与Ad55 knob重组蛋白进一步进行Gator亲和力检测(表4)，图1为H1L4与Ad55 knob亲和力检测结果示例，其中单抗H1L4有最强的亲和力，人源化单抗相对人-鼠嵌合抗体与抗原的亲和力有显著提升。
表4、人源化抗体的Gator亲和力检测
| 抗体 | FullR2 | Koff(1/s) | Kon(1/Ms) | KD(M) |
| HWTLWT | 0.943 | 8.12E-04 | 7.82E+04 | 1.04E-08 |
| H1L1 | 0.98 | 5.85E-05 | 2.98E+05 | 1.97E-10 |
| H1L4 | 0.979 | 4.15E-05 | 4.40E+05 | 9.42E-11 |
| H2L1 | 0.98 | 5.85E-05 | 2.98E+05 | 1.97E-10 |
| H2L4 | 0.955 | 2.10E-04 | 5.52E+05 | 3.80E-10 |
| H5L5 | 0.95 | 3.37E-04 | 4.77E+04 | 7.05E-09 |
3、细胞微量中和实验检测人源化抗体抗rAd11-EGFP、rAd7-EGFP、rAd55-EGFP中和活性。步骤如下：
待测抗体稀释到0.4mg/mL后，在96孔板上梯度稀释待测抗体，以1:100作为起始浓度，4倍梯度稀释待测抗体至1:102400，共设6个稀释度，每个稀释度等体积分别加入的带绿色荧光蛋白的Ad55、Ad7和Ad11(病毒量为200TCID50/0.1mL)，混匀，室温孵育1h，病毒-抗体混合液100μL加入单层培养的293T细胞中，设3个复孔，设病毒对照和细胞对照，在37℃含5％CO2培养箱内培养2-3天，观察CPE及荧光，计数荧光细胞数。计算抗体抑制率＝(PBS对照病毒孔荧光细胞数-待测抗体病毒孔荧光细胞数)/PBS对照病毒孔荧光细胞数*100％。
H1L4中和实验结果示例见图2。根据抑制率曲线计算抗体半数抑制浓度(IC50)(表5)。
表5、人源化抗体对抗原的IC50
选取3株人源化抗体H1L1、H1L4、H2L1进行了大量表达，并进行电泳检测纯化的蛋白(图3)。
人源化抗体H1L1、H1L4、H2L1稀释到2μg/ml后，与带绿色荧光蛋白的Ad55、Ad7、Ad11及Ad3、Ad5、Ad4(病毒量为200TCID50/0.1mL)孵育，进行细胞微量中和实验。三种人源化单抗对Ad55、Ad7、Ad11的抑制率大于90％，而对Ad3、Ad5、Ad4无抑制(<50％)。表明这几种人源化单抗对Ad55、Ad7、Ad11具有广谱中和活性，而对Ad3、Ad5、Ad4无中和作用。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1. 一种抗人腺病毒中和抗体，其重链可变区如SEQ ID NO.3所示，其轻链可变区如SEQID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的抗人腺病毒中和抗体，其恒定区满足如下条件中的一个或者多个：
（1）其恒定区的序列选自IgG、IgA、IgM、IgE及IgD任何其中之一恒定区的序列；以及，
（2）其恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或者人。
3.根据权利要求2所述的抗人腺病毒中和抗体，其中，所述恒定区的序列为IgG的恒定区的序列。
4.根据权利要求2所述的抗人腺病毒中和抗体，其中，所述恒定区来源于人。
5.一种核酸，其编码权利要求1至4任一项所述的中和抗体。
6.一种重组载体，其含有权利要求5所述的核酸。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其中，所述重组载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或者哺乳动物细胞病毒。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸、权利要求6或者7所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或HEK293细胞。
10.一种抗人腺病毒中和抗体的生产方法，其采用权利要求8或者9所述的宿主细胞生产抗人腺病毒中和抗体。
11.一种药物，其包含权利要求1至4任一项所述的中和抗体、权利要求5所述的核酸、权利要求6或者7所述的重组载体。
12.一种检测试剂盒，其包括权利要求1至4任一项所述的中和抗体。
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