CN113651882B - 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113651882B
CN113651882B CN202110890402.3A CN202110890402A CN113651882B CN 113651882 B CN113651882 B CN 113651882B CN 202110890402 A CN202110890402 A CN 202110890402A CN 113651882 B CN113651882 B CN 113651882B
Authority
CN
China
Prior art keywords
variable region
chain variable
heavy chain
light chain
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110890402.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113651882A (zh
Inventor
刘振卫
周荣
冼钰婷
田新贵
李潇
刘铭龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Institute Of Respiratory Disease Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Institute Of Respiratory Disease Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Institute Of Respiratory Disease Medical Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Institute Of Respiratory Disease Medical Technology Co ltd
Priority to CN202110890402.3A priority Critical patent/CN113651882B/zh
Publication of CN113651882A publication Critical patent/CN113651882A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113651882B publication Critical patent/CN113651882B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人源化抗HAdV‑B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用。编码人源化抗HAdV‑B3单克隆中和抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。人源化抗HAdV‑B3单克隆中和抗体能够解决鼠源抗HAdV‑B3单克隆中和抗体引起人体免疫排斥反应的问题。

Description

人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用。
背景技术
HAdV是常见的呼吸道病毒，其感染所致的重症肺炎是儿童致死、致残的重要原因之一。据文献报道，重症肺炎患儿中高达13.3%为HAdV感染所致。B种HAdV是HAdV重症肺炎患儿感染的最主要型别，其中，B种HAdV 3型（HAdV-B3）最为常见。目前尚无有效的方法用于预防和治疗HAdV肺炎。广谱抗病毒药物西多福韦对早期HAdV感染有一定的疗效，但对HAdV肺炎疗效并不明显。国外学者尝试寻找新的抗HAdV化学药物，但尚未取得重大突破。
抗病毒单克隆中和抗体凭借特异性高和抗病毒效果显著的特点，在病毒的预防和治疗方面发挥着重要的作用，同时，给HAdV感染的防治带来了希望。目前，已有报道的抗HAdV-B3单克隆中和抗体均为鼠源抗体。实践证明，鼠源抗体进入人体后，引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应，可使鼠源抗体加速被清除，甚至引起过敏性休克，因而被淘汰。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够解决鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体引起人体免疫排斥反应的问题的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用。
一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
在其中一些实施例中，所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；
其中，所述重链互补决定区包括：SEQ ID NO.3所示的重链CDR1、SEQ ID NO.4所示的重链CDR2和SEQ ID NO.5所示的重链CDR3；所述重链骨架区包括SEQ ID NO.6所示的重链FR1、SEQ ID NO.7所示的重链FR2、SEQ ID NO.8所示的重链FR3和SEQ ID NO.9所示的重链FR4。
在其中一些实施例中，所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；
其中，所述轻链互补决定区包括：SEQ ID NO.10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.12所示的轻链CDR3；所述轻链骨架区包括SEQ ID NO.13所示的轻链FR1、SEQ ID NO.14所示的轻链FR2、SEQ ID NO.15所示的轻链FR3和SEQ ID NO.16所示的轻链FR4。
在其中一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在其中一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明的目的之一还在于提供了一种核酸分子。
一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
本发明的目的之一还在于提供了一种重组载体。
一种重组载体，所述重组载体含有所述的核酸分子。
本发明的目的之一还在于提供了一种重组载体的制备方法。
一种所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染，然后检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，
本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞的基因组中整合有所述的核酸分子。
本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的重组载体。
本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞的制备方法。
一种所述的重组细胞的制备方法，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转，然后检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（9）人源化抗体的表达与纯化
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化人源化抗体，浓缩后测定浓度；
（10）检测人源化抗体抗HAdV-B3的中和活性。
本发明的目的之一还在于提供了一种药物组合物。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
在一些实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
本发明的目的之一还在于提供了所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体在制备检测HAdV-B3的诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提供了一种重症肺炎病毒诊断试剂盒。
一种重症肺炎病毒诊断试剂盒，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒包括所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，所述重症肺炎病毒为HAdV-B3。
在一些实施例中，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒采用酶联免疫检测法、化学发光免疫测定法或者免疫层析法。
本发明的目的之一还在于提供了一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的制备方法。
一种所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的制备方法，包括如下步骤：
培养重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，其中，所述重组细胞含有重组载体，所述重组载体含有编码所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的核酸序列。
本发明的成功表达和纯化了人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体稀释4608倍后，浓度为0.47μg/mL，可抑制90%的细胞产生致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。鼠源抗体的人源化改造，使原本的鼠源成分绝大部分被替换成人源成分，从而避免HAMA反应的发生，因此，本发明的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体在使用上更加安全。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的电泳示意图；
图2为本发明实施例1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体对HAdV-B3作用示意图；
图3为本发明实施例2所述的小鼠肺组织苏木精-伊红染色结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请实施例提供一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
在其中一些实施例中，所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；
其中，所述重链互补决定区包括：SEQ ID NO.3所示的重链CDR1、SEQ ID NO.4所示的重链CDR2和SEQ ID NO.5所示的重链CDR3；所述重链骨架区包括SEQ ID NO.6所示的重链FR1、SEQ ID NO.7所示的重链FR2、SEQ ID NO.8所示的重链FR3和SEQ ID NO.9所示的重链FR4。
在其中一些实施例中，所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；
其中，所述轻链互补决定区包括：SEQ ID NO.10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.12所示的轻链CDR3；所述轻链骨架区包括SEQ ID NO.13所示的轻链FR1、SEQ ID NO.14所示的轻链FR2、SEQ ID NO.15所示的轻链FR3和SEQ ID NO.16所示的轻链FR4。
在其中一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在其中一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明另一实施例还提供了一种核酸分子。
一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
本发明另一实施例还提供了一种重组载体。
一种重组载体，所述重组载体含有所述的核酸分子。
本发明另一实施例还提供了一种重组载体的制备方法。
一种所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染，然后检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，
本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞的基因组中整合有所述的核酸分子。
本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的重组载体。
本发明另一实施例还提供了一种重组细胞的制备方法。
一种所述的重组细胞的制备方法，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转，然后检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（9）人源化抗体的表达与纯化
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化人源化抗体，浓缩后测定浓度；
（10）检测人源化抗体抗HAdV-B3的中和活性。
本发明另一实施例还提供了一种药物组合物。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
在一些实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
本发明另一实施例还提供了所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体在制备检测HAdV-B3的诊断试剂盒中的应用。
本发明另一实施例还提供了一种重症肺炎病毒诊断试剂盒。
一种重症肺炎病毒诊断试剂盒，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒包括所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，所述重症肺炎病毒为HAdV-B3。
在一些实施例中，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒采用酶联免疫检测法、化学发光免疫测定法或者免疫层析法。
本发明另一实施例还提供了一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的制备方法。
一种所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的制备方法，包括如下步骤：
培养重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，其中，所述重组细胞含有重组载体，所述重组载体含有编码所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的核酸序列。
实施例1
一种所述的重组细胞的制备方法，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞（3D7），并使用液氮冷冻保存细胞，37℃水浴复苏杂交瘤细胞（3D7）后，使用含10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，在37℃、含5% CO2的培养箱中，对其进行扩大培养。
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：使用EasyPure® RNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）提取杂交瘤细胞（3D7）的总RNA。
（2.2）反转录：使用TransScript® Ⅱ All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for PCR（北京全式金生物技术有限公司）对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA。
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerasewith GC Buffer（Takara）分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，50μL反应体系：1μL cDNA，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，2×PrimeSTARGC Buffer，dNTP Mixture，10μM各亚型鼠源抗体重链可变区和鼠源抗体轻链可变区混合引物；反应体系：98℃10sec，60℃5sec，72℃1min，30个循环。反应液经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick® Gel Extrection Kit（Qiagen）分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段。
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到pFUSEss-CHIg-hG1表达载体上，转化鉴定，连接产物转化DH5α感受态细菌，在含有Zeocin的LLB平板上过夜培养。挑取单个菌落，接种于含有Zeocin的LLB培养基中，37℃过夜培养。使用Plasmid Mini Kit（Omega）提取质粒后，进行基因测序，从而确定鼠源抗体重链可变区基因表达载体。
回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到pFUSE2ss-CLIg-hk表达载体上，转化鉴定，连接产物转化DH5α感受态细菌，在含有Blasticidin的LLB平板上过夜培养。挑取单个菌落，接种于含有Blasticidin的LLB培养基中，37℃过夜培养。使用Plasmid Mini Kit（Omega）提取质粒后，进行基因测序，从而确定鼠源抗体轻链可变区基因表达载体。
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
使用Endo-Free Plasmid Mini Kit（Omega）分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，使用TransIntroTM ELTransfection Reagent（北京全式金生物技术有限公司），将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染ExpiCHO细胞，7天后收集细胞培养上清，然后检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性。
（5）嵌合抗体的表达与纯化
使用Endo-Free Plasmid Maxi Kit（Omega）分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，使用TransIntroTM ELTransfection Reagent（北京全式金生物技术有限公司），将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染ExpiCHO细胞，隔天添加补料，7天后收集细胞培养上清，然后使用Protein G纯化介质分离纯化嵌合抗体，并使用50kDa超滤管浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度。
（6）检测嵌合抗体的中和活性
应用基于流式细胞术的中和试验检测嵌合抗体对HAdV-B3的中和作用。
（7）人源化改造
使用MOE软件分析嵌合抗体重链可变区和嵌合抗体轻链可变区，确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到pFUSEss-CHIg-hG1表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到pFUSE2ss-CLIg-hk表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体。
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
使用Endo-Free Plasmid Mini Kit（Omega）分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，使用TransIntroTM EL TransfectionReagent（北京全式金生物技术有限公司），将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染ExpiCHO细胞，获得重组细胞，7天后收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性。
（9）人源化抗体的表达与纯化
使用Endo-Free Plasmid Maxi Kit（Omega）分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，使用TransIntroTM EL TransfectionReagent（北京全式金生物技术有限公司），将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染ExpiCHO细胞，获得重组细胞。培养重组细胞，隔天添加补料，7天后收集重组细胞培养上清，然后使用Protein G纯化介质分离纯化人源化抗体，并使用50kDa超滤管浓缩人源化抗体，测定浓度，得到人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
（10）检测人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的中和活性
应用微量中和试验检测人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的中和作用，步骤如下：在96孔板上稀释待测人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，以1:9作为起始浓度，4倍稀释人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体至1:2304，共设5个稀释度，每个稀释度含165μL稀释的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体；每个稀释度分别加入165μL稀释的HAdV-B3（200TCID50/0.1mL，GenBank：DQ099432.4），混匀，在37℃含5% CO2培养箱内孵育1h；将在96孔板中单层贴壁生长，细胞密度为80%的细胞的生长液弃去，每孔加入人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体和HAdV-B3混合液100μL，每个稀释度设3个复孔，同时设立病毒对照和空白对照，在37℃含5%CO2的培养箱内吸附2h；弃去人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体和HAdV-B3混合物，每孔补加100μL DMEM/F-12，在37℃含5% CO2培养箱内培养3天；观察CPE。
应用基于流式细胞术的中和试验检测人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体对HAdV-B3的中和作用。步骤如下：人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体稀释步骤与微量中和试相同；每个稀释度分别加入165μL稀释的表达增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescentprotein，EGFP）的HAdV-B3（使18%-32%的细胞表达EGFP/0.1ml），混匀，在37℃含5% CO2培养箱内孵育1h；将在96孔板中单层贴壁生长，细胞密度为90%的细胞的生长液弃去，每孔加入人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体和表达EGFP的HAdV-B3混合液100μL，每个稀释度设3个复孔，同时设立病毒对照和空白对照，在37℃含5% CO2的培养箱内吸附2h；弃去人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体和表达EGFP的HAdV-B3混合物，每孔补加100μL DMEM/F-12，在37℃含5% CO2培养箱内培养3天；通过计算单位浓度的中和比值，比较人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体与嵌合抗体的中和活性的强弱，计算公式如下：
单位浓度中的中和比值=（病毒对荧光细胞比值-样品荧光细胞比值）/样品浓度。
参见图1所示，本实施例成功表达和纯化人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
由表1结果显示：人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。
表1为人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体与嵌合抗体的中和活性比较结果
Figure 235012DEST_PATH_IMAGE001
*为3个复孔的均值
参见图2所述，人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体（2.18mg/mL）稀释4608倍后，浓度为0.47μg/mL，可抑制90%的细胞产生CPE。
实施例2
本实施例采用实施例1制备得到的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体进行小鼠保护测试。
将18只10周龄雌性BALB/c小鼠（无特定病原体级）随机平均分为两组（实验组和对照组）后，每只小鼠分别滴鼻攻毒30μL纯化的HAdV-B3病毒（5×106TCID50/100μL）。6h后，实验组的每只小鼠分别尾静脉注射200μL实施例1制备得到的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，对照组的每只小鼠分别尾静脉注射200μL磷酸盐缓冲液。尾静脉注射后的第1天、第4天和第7天，分别从实验组与对照组各取3只小鼠的肺组织，做组织病理切片以及苏木精-伊红染色。参见图3所示，图3为小鼠肺组织苏木精-伊红染色结果。图3结果显示：对照组小鼠肺部有大量的炎性渗出，而实验组小鼠肺组织结构正常，肺泡壁完好，肺泡腔清晰可见，肺泡及肺间质无明显水肿现象。可见，实施例1制备得到的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体对HAdV-B3具有较好的抑制作用。
综上所述，本发明的成功表达和纯化了人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体稀释4608倍后，浓度为0.47μg/mL，可抑制90%的细胞产生CPE。鼠源抗体的人源化改造，使原本的鼠源成分绝大部分被替换成人源成分，从而避免HAMA反应的发生，因此，本发明的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体在使用上更加安全。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州呼研所医药科技有限公司
<120> 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用
<130> 1
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg ccagcggcta caccttcaca agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggccagg gactggagtg gatcggcgag atcaatcccg ccaacggcag aaccaactac 180
aacgagaagt ttaagagcag ggtgaccctg accgtggata ggagcatcag caccacctac 240
atggagctgt ccaggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagatggctg 300
agcttttggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagc 339
<210> 2
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gagatcgtga tgacacagag ccctcccacc ctgagcctgt cccctggcga gagggtgaca 60
ctgagctgca gatcctccaa gagcctgctg cacaccaatg gcatcacata cctgtgttgg 120
taccagcaga agcccggcca ggcccccaga ttcctgatct accagaagag caccctggcc 180
agcggcatcc ccgccagatt ttccggctcc ggctccggaa ccgacttcac actgacaatc 240
agcagcctgc agcctgagga ctttgccgtg tactactgtg cccagaatct ggagctgccc 300
tggaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaag 336
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Glu Ile Asn Pro Ala Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Trp Leu Ser Phe
1
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Cys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Gln Lys Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 12
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Phe Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 15
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 16
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ala Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Leu Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 18
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Phe Leu Ile Tyr Gln Lys Ser Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (11)

1.一种人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，其特征在于，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体能够表达权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的重链可变区和轻链可变区。
3.一种权利要求2所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞，对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染细胞，收集细胞培养上清，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩后测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体，人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体与人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求2或3所述的重组载体。
6.一种权利要求5所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）杂交瘤细胞的复苏与培养
应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV-B3单克隆中和抗体的杂交瘤细胞，对其进行扩大培养；
（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增
（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；
（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；
（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；
（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建
回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；
（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染细胞，收集细胞培养上清，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩后测定嵌合抗体的浓度；
（6）检测嵌合抗体的中和活性
（7）人源化改造
确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗HAdV-B3的中和活性；
（9）人源化抗体的表达与纯化
分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化人源化抗体，浓缩后测定浓度；
（10）检测人源化抗体抗HAdV-B3的中和活性。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
9.权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体在制备检测HAdV-B3的诊断试剂盒中的应用。
10.一种重症肺炎病毒诊断试剂盒，其特征在于，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒包括权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，所述重症肺炎病毒为HAdV-B3。
11.一种权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体，其中，所述重组细胞含有重组载体，所述重组载体含有编码如权利要求1所述的人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体的核酸序列。
CN202110890402.3A 2021-08-04 2021-08-04 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用 Active CN113651882B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110890402.3A CN113651882B (zh) 2021-08-04 2021-08-04 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110890402.3A CN113651882B (zh) 2021-08-04 2021-08-04 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113651882A CN113651882A (zh) 2021-11-16
CN113651882B true CN113651882B (zh) 2022-06-10

Family

ID=78490338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110890402.3A Active CN113651882B (zh) 2021-08-04 2021-08-04 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113651882B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104086650B (zh) * 2014-06-16 2017-01-04 广州锐达生物科技有限公司 人7型腺病毒的中和性单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108794622A (zh) * 2017-05-02 2018-11-13 广州医科大学附属第医院 一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
WO2019079496A2 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio, Inc. FULLY HUMAN ANTIBODY-BASED THERAPEUTIC AGENTS HAVING POST-TRANSLATION MODIFICATION
CN110724194B (zh) * 2018-07-17 2021-03-19 上海生物制品研究所有限责任公司 抗her3人源化单克隆抗体及其制剂
US20220136004A1 (en) * 2019-01-11 2022-05-05 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Targeted In Vivo Genome Modification

Also Published As

Publication number Publication date
CN113651882A (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113336844B (zh) 一种靶向新冠病毒n蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用
Guthmiller et al. An efficient method to generate monoclonal antibodies from human B cells
EP4019541A1 (en) Humanized monoclonal antibody for 2019 novel coronavirus and use thereof
CN110078826B (zh) 抗bcma的人源化单链抗体及应用
CN115340602A (zh) 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN113698477B (zh) 一种抗SARS-CoV-2单链抗体及其制备方法和应用
EP0169146A2 (en) Monoclonal antibodies directed against the cellular receptor of human rhinovirus
CN115340600A (zh) 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN114656556B (zh) 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用
CN112661841A (zh) 一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用
CN116836269A (zh) 抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体及其应用
CN115850461A (zh) 沙贝病毒广谱中和抗体及其应用
CN110373393B (zh) 一种分泌抗传染性法氏囊病毒vp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1h6
CN113461810B (zh) 一种抗新型冠状病毒刺突蛋白的全人源单克隆抗体及其应用
Balcioğlu et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody development strategies
CN113651882B (zh) 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用
WO2022027037A1 (en) Anti-sars corona virus-2 spike protein antibodies
CN113651883B (zh) 人源化抗HAdV-B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用
CN115960220A (zh) 特异性结合柯萨奇病毒a6的单克隆抗体及其用途
CN116063466A (zh) 抗SARS-CoV-2病毒N蛋白的结合抗体及其应用
CN104830902A (zh) 单克隆抗体的制备方法及应用
CN114560940B (zh) 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
CN109535249B (zh) 一种单克隆抗体ZKns3G2及其应用
CN109503712B (zh) 一种单克隆抗体ZKns2E11及其应用
CN109553680B (zh) 一种单克隆抗体ZKns4B8及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant