CN108794622A - 一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，该抗体基因含有如SEQ ID NO：43和44所述序列。本发明还提供了制备方法：扩增鼠源性单克隆抗体的轻链和重链序列；将轻链序列与人轻链恒定区序列和轻链信号肽连接，将重链序列与人重链恒定区序列和重链信号肽连接，轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换，重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换；再分别插入真核表达载体中，转染到细胞系。本发明提供的抗体基因含有如SEQ ID NO：43和44所述序列，并通过更换信号肽、提供适合的信号肽的组合，提高了人3型腺病毒中和性人源化单克隆抗体的产量，对研制高产量的可治疗感染性疾病的单抗有着重要意义。

Description

一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于免疫学与分子生物学领域，具体涉及一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
腺病毒的传播途径主要通过人、水、器械等传播。在常温下，腺病毒能在被污染物种内存活长至3周。儿童更容易发生腺病毒感染并且大规模流行，研究表明大多数婴幼儿在出生后至少感染过一种腺病毒。腺病毒也能感染免疫力低下的宿主，例如免疫遗传缺陷的病人、艾滋病人等，造血干细胞移植者如被腺病毒感染，常能引发高发病率与死亡率。其中HAdv-3症状比其他型较为严重，在全年整年都均能导致一系列的呼吸道及肠道等临床症状。
腺病毒是没包膜病毒，在低pH的环境下也可稳定存活，有强的耐化学和物理试剂作用，腺病毒可抵抗胃肠分泌物及胆汁的分解，所以它能在胃肠内大量复制。因为腺病毒能在人的咽、肠道、呼吸道内繁殖，能导致许多各种不同的临床症状，例如：呼吸道感染、胃肠炎、肝炎等。
目前在世界范围内还没有针对腺病毒的疫苗和特异有效的治疗药物，也无有效的中和性治疗抗体，其治疗主要采取对症治疗。接种腺病毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一，腺病毒疫苗近年来成为国内外研究的热点。在抵抗病毒感染中，特异性中和抗体发挥重要作用，已有研究表明输注中和性抗体进行被动免疫可能是目前治疗病毒感染的最有效的方法，制备特异性抗腺病毒感染的中和性单克隆抗体对于治疗腺病毒重症感染有重要意义。
但是目前还没有高中和效价的抗腺病毒3型的单克隆抗体的报道。而抗体分泌量低是世界难题，分泌量会因抗体的结构发生变化，人源化改造后的抗体有可能导致抗体分泌量更低，目前尚未有高分泌量的人源化人腺病毒3型的单克隆抗体的报道。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用，获得针对人3型腺病毒的中和活性人源化单克隆抗体，采用抗体基因信号肽更换其他人源蛋白信号肽的方法达到使该抗体分泌量大大提高的目的。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体，包含轻链序列和重链序列，所述抗体的基因含有如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所述序列。
优选的，所述轻链序列包含如SEQ ID NO：43所述序列。
优选的，所述重链序列包含如SEQ ID NO：44所述序列。
本发明还提供了制备上述人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)扩增鼠源性单克隆抗体的轻链和重链序列；
(2)将所述步骤(1)中得到的轻链序列与人源抗体轻链恒定区序列和人源抗体轻链信号肽连接，得到轻链连接序列；将所述步骤(1)中得到的重链序列与人源抗体重链恒定区序列和人源抗体重链信号肽连接，得到重链连接序列；
(3)将所述步骤(2)中得到的轻链连接序列和重链连接序列分别插入到真核表达载体中；
(4)将所述步骤(3)中得到的插入后的真核表达载体转染到细胞系，得到稳定表达所述抗体的细胞系。
优选的，上述步骤(2)中的人源抗体轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换，或者上述步骤(2)中的人源抗体重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换。
优选的，上述步骤(2)中的人源抗体轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换，并且上述步骤(2)中的人源抗体重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换。
本发明还提供了一种包含上述SEQ ID NO：43所述的序列或载体。
本发明还提供了一种包含上述SEQ ID NO：44所述的序列或载体。
本发明还提供了分泌上述抗体的CHO-S细胞株。
本发明还提供了一种包含上述抗体作为有效成分的药物组合物。
本发明所提供的人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体基因含有如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所述序列，并通过更换信号肽、提供适合的信号肽的组合，提高了人3型腺病毒中和性人源化单克隆抗体的产量，对研制高产量的可治疗感染性疾病的单抗有着重要意义。
附图说明
图1为中和性单克隆细胞株抗体轻链Vκ和重链VH的扩增产物的电泳图；其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1是Vk基因，泳道2是VH基因；
图2为含Vk基因的T质粒的酶切电泳图，其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1、2、3、4、5、6是含Vk基因的六个T质粒样本；
图3为含VH基因的T质粒的酶切电泳图，其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1、2、3、4、5、6是含VH基因的六个T质粒样本；
图4是Vk-4基因的测序结果图；
图5是VH3基因的测序结果图；
图6为含Vκ基因的T质粒和含VH基因的T质粒的扩增Vκ基因和VH基因的电泳图，其中，M为DNAMarker，泳道1为Vκ基因，泳道2为VH基因；
图7为Vκ-4插入Pa-L5载体后酶切鉴定结果图，其中，M代表DNAMarker，泳道1为Vκ-4基因，泳道2为CL基因，泳道3为L基因；
图8为重组的Pa-L5载体中L基因和重组的Pa-H2载体中H基因的扩增电泳图，其中，M为DNAMarker，泳道1为L基因，泳道2为H基因；
图9为L基因及H基因分别插入PcDNA3.1(+)后酶切鉴定图，其中M为DNAMarker，泳道1为L基因，泳道2为H基因；
图10为VH-3插入Pa-H2载体后酶切鉴定图，其中，M为DNAMarker，泳道1为VH-3基因，泳道2为CH基因，泳道3为H基因；
图11为OSTE前导肽替换轻链信号肽后的pcDNA3.1-3D7L载体示意图；
图12为PPT前导肽替换轻链信号肽后的pcDNA3.1-3D7H载体示意图；
图13为OSTE信号肽替换轻链人源性抗体信号肽测序结果图；
图14为PPT信号肽替换重链人源性抗体信号肽测序结果图；
图15为信号肽不同配搭的抗体分泌量结果比较图，其中，L为人抗体轻链信号肽；LPPT为轻链前胰蛋白酶信号肽；LAP为轻链碱性磷酸酶信号肽；LOSTE为轻链人骨粘连蛋白信号肽；H为人抗体重链信号肽；HPPT为重链前胰蛋白酶信号肽；HAP为重链碱性磷酸酶信号肽；HOSTE为重链人骨粘连蛋白信号肽；
图16为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的浓度标准曲线；
图17为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体还原条件Western-blot检测结果图，其中，泳道1、2、3、4、5、6分别为3D7嵌合抗体的6个待测上清抗体；
图18为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体非还原条件Western-blot检测结果图，其中，M为蛋白Marker，泳道1为3D7嵌合抗体，泳道2为空白对照；
图19为接种抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体5天后的体外微量中和实验结果图，其中，左边图为接种待测培养上清+荧光ADV3，中间图为接种鼠源性mAb infA+荧光ADV3，右边图为空白对照。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本说明书实施例中所述病毒株、细胞系和实验动物术语及相关说明如下：
(1)Ad3EGFP：重组3型腺病毒载体，该载体是人3型腺病毒E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的腺病毒载体，能表达人3型腺病毒基因组和增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒。
(2)CHO-S细胞：中国仓鼠卵巢细胞，作为转染宿主细胞，表达人源化抗体。
(3)HEK 293细胞：人胚肾细胞，购自生物资源中心ATCC，用于培养上述重组腺病毒。
(4)杂交瘤细胞3D7株：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.C2014175。
(5)杂交瘤3D7细胞培养使用的培养基：含有100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素和10％胎牛血清的1640培养基(Gibco，USA)。
(6)HEK-293细胞培养使用的培养基：含有100IU/ml青霉素,100IU/ml链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，USA)。
(7)CHO-S细胞培养使用的培养基：FreeStyle CHO表达培养基。(Gibco，USA)
本发明的实施技术方案是：以抗HAdv-3中和特异性鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞3D7株为材料，获取该鼠源性单克隆抗体轻重链可变区基因，并与人源抗体恒定区基因连接，实现人源化，并更换信号肽，构建分泌该人源化抗体的真核质粒，通过转染入CHO细胞，表达出人源化抗体，并证明有明显的中和活性。
实施例1：含中和性单克隆细胞株抗体轻链可变区基因Vk序列的质粒和含中和性单克隆细胞株抗体重链可变区VH基因序列的质粒的制备
1、提取杂交瘤细胞3D7细胞株RNA：
1)复苏杂交瘤细胞3D7于T25培养瓶中，在含10％FCS的1640培养基中进行培养；
2)待细胞生长状态良好后，用吸管吹下细胞并转入50ml离心管中，1000rpm×5min；
3)弃上清，用1640培养液洗细胞一次，1000rpm×5min；
4)吸取1.5ml TRIzoL裂解细胞，用吸管反复吹打；
5)离心管室温静置5min，然后加入0.3ml氯仿，剧烈混匀，室温放置3min；
6)14000rpm，4℃离心15min，取上层无色水相至一新的EP管中，加入2/3体积异丙醇，室温孵育10min，14000rpm，4℃离心10min；
7)弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤一次，14000rpm，4℃离心10min；
弃上清，于烘箱烘干RNA沉淀。用60μl DEPC水溶解RNA，放-70℃冰箱保存。
2、总RNA逆转录cDNA：
1)在0.2ml EP管中加入以下反应体系：
2)65℃放置10min；冰上放置15min；
3)上述反应体系加入M-MLVRT酶1μl，RNA酶抑制剂1μl；
4)在PCR反应仪中42℃反应1h。
3、利用自行设计的多条引物对鼠源性单克隆抗体可变区基因序列进行扩增：
1)反应体系如下：
2)PCR程序如下：
在扩增中和性单克隆细胞株抗体轻链可变区基因Vk序列时，在上述反应体系中所述的正向引物为如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17所述序列的引物的混合物，反向引物为如SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：20所述序列的引物的混合物。
在扩增中和性单克隆细胞株抗体重链可变区基因VH序列时，在上述反应体系中所述的正向引物为SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：39所述序列的引物的混合物，反向引物为SEQID NO：40至SEQ ID NO：42所述序列的引物的混合物。
对扩增后产物进行电泳检测，结果如图1所示，图1为中和性单克隆细胞株抗体轻链Vκ和重链VH的扩增产物的电泳图；其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1是Vk基因，泳道2是VH基因。由图1可见，Vκ基因与VH基因的条带位于400bp的位置，与预期结果相吻合。
4.将Vκ基因产物与VH基因产物分别连接在T载体上
将步骤3中扩增后得到的Vκ基因产物与VH基因产物用Axygen胶回收试剂盒回收。回收后的Vκ基因与VH基因分别与pUC-T18连接。
其中，上述目的基因分别为酶切后的Vκ与VH基因。
5.对步骤4)中得到的Vκ与VH基因的两种连接物进行电转化，并挑取单克隆，测序。
1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2)将0.1cm的电极杯置于冰上预冷。
3)取1μl纯化后的质粒加入解冻的感受态细胞中，小心混匀，冰上放置。
4)打开电转仪，调至ECO1，调节电压为2.1KV。
5)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
6)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入500μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
7)37℃，160rpm复苏30min。
8)取100μl转化产物并加入4ul 200mg/ml IPTG，40ul 20mg/ml x-gal在160μl LB平板上涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。
9)挑取6个单菌落，14h培养，分别提取质粒并进行酶切鉴定。
酶切鉴定结果如图2和图3，图2为含Vk基因的T质粒的酶切电泳图，其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1、2、3、4、5、6是含Vk基因的六个T质粒样本。由图2可见，6份质粒样本均符合预期。
图3为含VH基因的T质粒的酶切电泳图，其中，M道是DNAMarker电泳道，泳道1、2、3、4、5、6是含VH基因的六个T质粒样本；由图3可见，6份质粒样本中，编号3和6的样本符合预期。
再取上述含Vk基因的6个质粒和含VH基因编号为3和6的2个质粒进行测序，测序结果如图4和5，图4是Vk-4基因的测序结果图。图5是VH3基因的测序结果图。由图4可知，Vk基因序列为如SEQ ID NO：43所述序列，由图5可知，VH基因序列为如SEQ ID NO：44所述序列。
实施例2：构建抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的真核表达载体
1.鼠源性单克隆抗体轻链可变区序列与人轻链恒定区序列连接
1)取实施例1中编号为4的含轻链可变区基因质粒，以该质粒作为模板，以引物PaLVκF/PaLVκR扩增，得到的轻链可变区序列命名为Vκ-4；其中引物PaLVκF的序列如SEQ IDNO：45所述序列，引物PaLVκR的序列如SEQ ID NO：46所述序列。结果如图6所示，图6为含Vκ基因的T质粒扩增Vκ基因和含VH基因的T质粒的扩增VH基因的电泳图，其中，M为DNAMarker，泳道1为Vκ基因，泳道2为VH基因；M为DNA Marker，泳道2为VH基因，由图6可见，Vκ基因位于接近400bp处的条带，与预期Vκ基因相吻合。
2)通过Sac I/Hind III限制性酶切位点将Vκ-4基因插入Pa-L5载体中，其中，Pa-L5载体含有人源抗体轻链恒定区CL序列及人源抗体轻链信号肽。Pa-L5载体中的人源抗体轻链信号肽、鼠源性单克隆抗体轻链Vκ-4及人源抗体轻链恒定区序列CL基因成功连接后的序列称之为L基因链。
Vκ-4基因的酶切体系(40μl)如下：
通过跑2％胶回收Vκ-4基因产物。
Pa-L5的酶切体系(40μl)如下：
通过跑1％胶回收Pa-L5产物。
将酶切后的Vκ-4基因与酶切后的Pa-L5基因进行连接，连接体系(20μl)如下：
3)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。
L酶切鉴定体系(15μl)：
Vκ-4酶切鉴定体系(15μl)：
CL酶切鉴定体系(15μl)：
37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。
将Vκ-4基因和CL基因以及L基因跑胶观察目标条带。结果如图7所示，图7为Vκ-4插入Pa-L5载体后酶切鉴定结果图，其中，M代表DNAMarker，泳道1为Vκ-4基因，泳道2为CL基因，泳道3为L基因，由图7可见，与预期Vκ-4、CL、L相吻合。
2.构建pcDNA3.1-3D7L载体
1)通过引物PCLF/PCLR对L链进行扩增；其中，L链的核苷酸序列如SEQ ID NO：47所述。引物PCLF的序列如SEQ ID NO：48所述，引物PCLR的序列如SEQ ID NO：49所述。扩增后的结果见图8，图8为重组的Pa-L5载体中L基因和重组的Pa-H2载体中H基因的扩增电泳图，其中，M为DNAMarker，泳道1为L基因，泳道2为H基因。由图8可见，L基因与预期相吻合。扩增后L链产物进行纯化。
2)再通过BamHI/EcoRI限制性酶切位点将L链插入pcDNA3.1载体中。
酶切体系(40μl)如下：
连接体系(20μl)如下：
3)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。
该质粒通过酶切进行鉴定。
酶切鉴定体系(15μl)：
37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。结果如图9所示，图9为L基因及H基因分别插入PcDNA3.1(+)后酶切鉴定图，其中M为DNA Marker，泳道1为L基因，泳道2为H基因。由图9可见，L基因与预期相吻合。
3.鼠源性单克隆抗体重链可变区序列与人源抗体重链恒定区序列连接
1)取实施例1中编号为3的含重链可变区基因质粒，以该质粒作为模板，该质粒中重链可变区序列称之为VH-3，VH-3通过引物PaHVHF/PaHVHR进行扩增；其中，引物PaHVHF的序列如SEQ ID NO：50所述，引物PaHVHR的序列如SEQ ID NO：51所述。扩增后对VH-3重链产物进行纯化。结果如图6所示，图6为含Vκ基因的T质粒扩增Vκ基因和含VH基因的T质粒的扩增VH基因的电泳图，其中，M为DNA Marker，泳道1为Vκ基因，泳道2为VH基因；M为DNAMarker，泳道2为VH基因，由图6可见，VH基因位于400bp处的条带，与预期VH基因为403bp的结果相吻合。
2)通过Xho I/NheI限制性酶切位点将VH-3基因插入Pa-H2载体中，Pa-H2载体含有人源抗体重链恒定区CH基因序列及人源抗体重链信号肽。Pa-H2载体中的人源抗体重链信号肽、鼠源性单克隆抗体重链VH-3及人源抗体重链恒定区序列CH成功连接后的序列称之为H链。
酶切体系(40μl)：
连接体系(20μl)：
3)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。
该质粒通过酶切进行鉴定。
VH酶切鉴定体系(15μl)：
CH酶切鉴定体系(15μl)：
H酶切鉴定体系(15μl)：
37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。将VH-3基因和CH基因以及H基因跑胶观察目标条带。结果如图10所示，图10为VH-3插入Pa-H2载体后酶切鉴定图，其中，M为DNA Marker，泳道1为VH-3基因，泳道2为CH基因，泳道3为H基因。由图10可见，结果与预期VH-3、CH、H基因长度相吻合，结果符合预期。
4.构建pcDNA3.1-3D7H载体
1)将H链通过引物PCHF/PCHR进行扩增，其中所述H链的序列如SEQ ID NO：52所述，引物PCHF的序列如SEQ ID NO：53所述，引物PCHR的序列如SEQ ID NO：54所述。扩增后的结果见图8，图8为重组的Pa-L5载体中L基因和重组的Pa-H2载体中H基因的扩增电泳图，其中，M为DNA Marker，泳道1为L基因，泳道2为H基因。由图8可见，H基因与预期H基因长度相吻合。
2)通过HindIII/BamHI限制性酶切位点将H链插入pcDNA3.1载体。
酶切体系(40μl)如下：
连接体系(20μl)如下：
3)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。
该质粒通过酶切进行鉴定。
酶切鉴定体系(15μl)：
37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。结果如图7所示，图9为L基因及H基因分别插入PcDNA3.1(+)后酶切鉴定图，其中M为DNA Marker，泳道1为L基因，泳道2为H基因。由图9可见，H基因与预期H基因长度相吻合。
5.更换信号肽
1)合成OSTE前导肽基因，运用分子克隆等技术方法将OSTE前导肽替换pcDNA3.1-3D7L中轻链信号肽。所述OSTE前导肽的基因序列如SEQ ID NO：55所示。
图11为OSTE前导肽替换轻链信号肽后的pcDNA3.1-3D7L载体示意图。
2)合成PPT前导肽基因，运用分子克隆等技术方法将PPT前导肽替换pcDNA3.1-3D7H中重链信号肽。所述PPT前导肽的基因序列如SEQ ID NO：56所示。
图12为PPT前导肽替换轻链信号肽后的pcDNA3.1-3D7H载体示意图。
图13为OSTE信号肽替换轻链人源性抗体信号肽测序结果图，测序结果所示，OSTE信号肽序列完全正确。
图14为PPT信号肽替换重链人源性抗体信号肽测序结果图，测序结果所示，PPT信号肽序列完全正确。
6.将不同信号肽进行搭配，检测抗体分泌量
按实例3中瞬时转染的操作步骤进行。
结果如图15所示，图15为信号肽不同搭配的抗体分泌量结果比较图，其中，L为人抗体轻链信号肽；LPPT为轻链前胰蛋白酶信号肽；LAP为轻链碱性磷酸酶信号肽；LOSTE为轻链人骨粘连蛋白信号肽；H为人抗体重链信号肽；HPPT为重链前胰蛋白酶信号肽；HAP为重链碱性磷酸酶信号肽；HOSTE为重链人骨粘连蛋白信号肽。由图11可见，通过不同信号肽配搭，抗体分泌量也发生相应的变化。人抗体信号肽的抗体分泌量为81ng/ml，而LOSTE/HPPT信号配搭的抗体分泌量为220ng/ml，约为原人抗体信号肽分泌量的三倍，大大提高了嵌合抗体在CHO细胞的分泌量。
实施例3：稳定表达抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体CHO-S细胞系的建立与筛选
1)瞬时转染
把实施例2中步骤2得到pcDNA3.1-3D7L和步骤4得到pcDNA3.1-3D7H质粒利用LipofectAMINE PLUS转染试剂盒(Invitrogen)以1：1比例转染至CHO-S细胞。
第一天：均匀铺CHO细胞于6孔板，细胞计数：4×105/ml。
第二天：配制A液(每孔)：150μl opti-men+5μl LipofectAMINE，静置10min。
配制B液(每孔)：150μl opti-men+2.4μg DNA+5μl PLUS，静置10min。
A液与B液混合，静置10min，利用800μl/每孔的opti-men换取已铺细胞的培养基，培养6h后，每孔替换2ml含5％FBS的CHO细胞无血清培养基，培养过夜。
第三天：每孔替换2ml不含FBS的CHO细胞无血清培养基，培养3～5天，收样，用化学发光酶免疫分析法(CLEIA)检测抗体是否表达。
通过上述方法，对质粒pcDNA3.1-3D7L和pcDNA3.1-3D7H共转染后的抗体含量进行测定。对已经转染72h后的CHO细胞上清进行CLEIA检测，结果RLUs值为200～400，根据标准曲线(标准曲线按实施例4中标准曲线制备方法得到)推算150～300ng/ml。
2.构建稳定细胞系
1)转染：pcDNA3.1-3D7L，pcDNA3.1-3D7H质粒及m98质粒(含puromycin筛选标记的真核质粒)利用LipofectAMINE PLUS转染试剂盒(Invitrogen)转染至CHO-S细胞。
第一天：均匀铺CHO细胞于6孔板中的其中3孔，细胞计数：4×105/ml。
第二天：
配制A液(每孔)：150μl opti-men+5μl LipofectAMINE，静置10min。
配制B液(每孔)：150μl opti-men+2.4μg DNA(1μg pcDNA3.1-3D7L+1μgpcDNA3.1-3D7H+400ng m98)+5μl PLUS，静置10min。
A液与B液混合，静置10min，利用800μl/每孔的opti-men换取已铺细胞的培养基，培养6h后，每孔替换2ml含5％FBS的CHO细胞freestyle无血清培养基，培养过夜。并设有正常细胞对照孔，和转染载体的阴性对照孔。
第四天：吸取6ml上清加入6ml含5％FBS的CHO培养基并加入1％双抗。每孔贴壁细胞用200μl胰酶消化，5分钟后加入freestyle培养基终止消化，1000rpm离心10分钟，弃上清，把上述配好的CHO适应性培养基每孔加4ml，把3孔共12ml分成120μl/每孔分装于96孔板中。
2)有限稀释法筛选克隆化
两天后，细胞状态比较好，即换含有适合浓度的筛选药物puromysin不含FBS的CHO细胞培养基培养。观察细胞状态，每3天换液一次。筛选4周左右，抗性细胞长满后每隔2～4天用CLEIA法检测抗体是否表达。结合细胞生长状态，将较高表达的细胞孔消化出，用有限稀释法进行第一次克隆化，将细胞每孔约1个接种于96孔板中，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体是否表达。挑选出表达量较高的孔继续进行第二次克隆化，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体。挑选出表达量较高的孔继续进行第三次克隆化，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体表达量是否提高。CLEIA检测二抗为HRP-山羊抗人IgG(H+L)抗体。当高表达孔单克隆细胞在96孔板内生长约至80％，将其转入24孔板，细胞状态稳定后转入25cm2培养瓶中培养。待细胞生长至瓶底约80％后，其中3/4细胞冻存，剩余1/4细胞继续培养。
运用上述方法对CHO稳定细胞系抗体含量进行测定。对构建好的CHO稳定细胞系的上清进行CLEIA检测，结果RLUs值能达到20000，根据标准曲线推(标准曲线按实施例4中标准曲线制备方法得到)算19.9ug/ml。
实施例4：抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的表达、鉴定及生物学活性检测
1.CLEIA建立抗体浓度标准曲线测定抗体浓度
1)人抗体标准品抗一定浓度稀释，稀释浓度分别至45ng/ml、136ng/ml、400ng/ml、1.2μg/ml、3.6μg/ml、11μg/ml、33μg/ml和100μg/ml，并设置空白孔。
2)用PBS以标准品：PBS＝1：6比例稀释每孔100μl包被至ELISA孔，4℃包被过夜。
3)次日用3％封闭液37℃封闭2h。
4)加入1×PBST清洗3次。
5)用1×PBST 1:1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)孵育1h。
6)加入1×PBST清洗3次。
7)加入化学发光底物(Lumino1-H2O2)，用多功能酶标仪(BioTek，SYNERGYHTX)进行分析，建立标准曲线。
瞬时转染及稳定细胞系的培养上清均按上述流程操作。
图16为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的浓度标准曲线。标准曲线方程为y＝0.954x+0.197，R2＝0.989，瞬时表达细胞培养上清RLUs值200-400，根据标准曲线，推算抗体浓度为150-300ng/ml。稳定表达细胞培养上清RLUs值能达到20000，根据标准曲线推算抗体浓度为19.9μg/ml。
2.Western blot检测目的蛋白
分别用还原和非还原Western-blot检测培养上清的人源化抗体。
1)将含有人源化抗体的上清分别在还原和非还原条件下分别用12％，8％的分离胶完成。SDS-PAGE，每孔上样量为40μl。还原条件下设定6个待测上清孔，非还原条件下设定1个待测上清孔及1个阴性对照(没有转染的细胞上清)
2)转移至PVDF膜，转膜条件为380A，120min。
3)将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，摇床震荡，每次5min。
4)在5％的封闭液中37℃封闭2h。
5)取出PVDF膜将其放入1×TBST清洗3次，每次5min。
6)将PVDF膜加入用1×TBST 1:1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)中37℃孵育1h。
7)用1×TBST洗膜3次，每次5min。
8)加入化学发光底物，用Chemstudio多功能成像仪(Analytikjena)扫描成像。
结果如图17和18所示，图17为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体还原条件Western-blot检测结果图，其中，泳道1、2、3、4、5、6分别为3D7嵌合抗体的6个待测上清抗体。由图13可见，54kd条带是重链，28KD条带是轻链，证明6个待测上清抗体结构正确。
图18为抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体非还原条件Western-blot检测结果图，其中，M为蛋白Marker，泳道1为3D7嵌合抗体，泳道2为空白对照。由图14可见，140KD附近有条带，证明待测上清是完整抗体。
3.微量中和实验检测抗体中和活性
1)将HEK-293细胞接种入24孔板，培养1天约至90％汇合度。
2)以含荧光信号的Ad3EGFP重组病毒株作为攻击病毒，用DMEM培养基稀释病毒10-3后，将病毒分别与鼠源性mAb infA(阴性对照)和培养上清(待检样品)等体积混合后37℃孵育1h。
3)将孵育后的混合液分别接种到培养好的HEK-293单层细胞，37℃孵育2h。同时设置正常细胞作为未感染组对照。
4)用微量移液器将每孔的混合液吸弃，加入500μl温育好的DMEM培养液继续培养，连续培养7天。
5)检测：用荧光显微镜观察绿色荧光数量。
如图19结果显示，图19为接种抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体5天后的体外微量中和实验结果图，其中，左边图为接种待测培养上清+荧光ADV3，中间图为接种鼠源性mAb infA+荧光ADV3，右边图为空白对照。由图15可见，接种5天后，接种了培养上清(含抗HAdv人源化抗体)的荧光相对接种鼠源性mAb infA少得多，证实该人源化抗体有明显的中和活性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<120> 一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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ggaagatcta gaggaaccac cgcccgagcc accgccacca gaggatttta tttccaactt 60
tgtccc 66
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ggtccc 66
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ggtggttcct ctagatcttc cctcgaggtc caactvcagc arcc 44
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gagctcgaca ttgtgatgac ccaatctcct gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg 60
gccaccatct catacagggc cagcaaaagt gtcagtacat ctggctatag ttatatgcac 120
tggaaccaac agaaaccagg acagccaccc agactcctca tctatcttgt atccaaccta 180
gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 240
atccatcctg tggaggagga ggatgctgca acctattact gtcagcacat tagggagctt 300
acacgttcgg aggggggaca aagttggaaa gaaaatcctc tggtggcggt ggctcgggcg 360
gtggtt 366
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gaggtgcagc tgcagcagtc tgggactgaa gtggtgaaac ctggggcttc agtgacgctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagagg 120
cctgggcaag gccttgagtg gattggagaa attaatcctg ccaacggtcg gactaattac 180
aatgagaagt tcaagagtaa ggccatactg actgttgaca gatcctccac cacaacgttc 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcgatct attactgtgc aagatggtta 300
tctttctggg gccagggaac tctggtcact gtctctgtag ccaaaacgac acccccatct 360
gtcactagtggccaggccggccag 384
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tctcaagctt ggtaaccacc gcccgagcca ccg 33
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gacattgtga tgacccaatc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gacaaagttg gaaagaaaat cctctggtgg cggtggctcg ggcggtggtt 360
accaagcttg agatcagacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
agatcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702
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tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagagg 120
cctgggcaag gccttgagtg gattggagaa attaatcctg ccaacggtcg gactaattac 180
aatgagaagt tcaagagtaa ggccatactg actgttgaca gatcctccac cacaacgttc 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcgatct attactgtgc aagatggtta 300
tctttctggg gccagggaac tctggtcact gtctctgtag ccaaaacgac acccccatct 360
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ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 480
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 540
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 600
tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 660
aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140
aaaggcttct atcccagtga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320
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<213> 人工序列PCHF
<400> 53
acttaagctt gccaccatgg agtttgggct gagctggct 39
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列PCHR
<400> 54
tagtggatcc ctactgcgtg tagtggt 27
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
atgagggcct ggatcttctt tctcctttgc ctggccggga gggccttggc a 51
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
atggtgtctg cacttctgat cctagctctt gttggagctg cagttgctga ctacaaagac 60
gatgacgacaag 72

Claims (10)

1.一种人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体，包含轻链序列和重链序列，其特征在于，所述抗体的基因含有如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所述序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链序列包含如SEQ ID NO：43所述序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链序列包含如SEQ ID NO：44所述序列。
4.制备权利要求1-3之一所述抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)扩增鼠源性单克隆抗体的轻链和重链序列；
(2)将所述步骤(1)中得到的轻链序列与人源抗体轻链恒定区序列和人源抗体轻链信号肽连接，得到轻链连接序列；将所述步骤(1)中得到的重链序列与人源抗体重链恒定区序列和人源抗体重链信号肽连接，得到重链连接序列；
(3)将所述步骤(2)中得到的轻链连接序列和重链连接序列分别插入到真核表达载体中；
(4)将所述步骤(3)中得到的插入后的真核表达载体转染到细胞系，得到稳定表达所述抗体的细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的人源抗体轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换或所述步骤(2)中的人源抗体重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的人源抗体轻链信号肽由人骨粘连蛋白信号肽所替换，并且所述步骤(2)中的人源抗体重链信号肽由前胰蛋白酶信号肽所替换。
7.一种包含如权利要求1所述SEQ ID NO：43所述的序列或载体。
8.一种包含如权利要求1所述SEQ ID NO：44所述的序列或载体。
9.分泌权利要求1-3之一所述抗体的CHO-S细胞株。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3之一所述抗体作为有效成分。
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