JP2024500511A - 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、バイオ医薬品の分野に関し、具体的に言えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用に関する。本開示によって提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質と高い親和性及び高い特異性で結合し、細胞の表面において発現されたＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を効果的に遮断することができを、サイトカインの生成を刺激する生物学的機能活性を有し、幅広い使用が見込まれる。

Description

関連出願の相互参照

本開示は、２０２０年１２月２３日に中国国家知的財産権局へ提出された、出願番号が２０２０１１５４１１０７．９で、名称が「抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全ての内容が引用により本開示に組み込まれている。

本開示は、免疫学の技術分野に関し、具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用に関する。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、別称ＣＤ２７９）は、抗原によって刺激されたＴ細胞の表面において発現される共刺激受容体である。ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３）は、ＰＤ－１の２種のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び巨細胞などを含む造血細胞、並びに血管内皮細胞、角化細胞、膵島細胞、星状膠細胞、栄養膜合胞体層、角膜上皮及び内皮細胞を含む非造血細胞において発現される。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、様々な腫瘍細胞及び腫瘍間質において発現される。

ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１は、いずれも免疫スーパーファミリータンパク質における膜貫通型タンパク質Ｉ型に属し、また、Ｉｇ－Ｖ及びＩｇ－Ｃ様の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン並びに短い配列の細胞内ドメインによって構成されている。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の細胞外ドメインとの相互作用は、ＰＤ－１タンパク質のコンフォメーション変化を誘導して、細胞内の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）がＳｒｃファミリーキナーゼによってリン酸化されることを誘導できる。リン酸化されたチロシンモチーフが、その後、ＳＨＰ－２及びＳＨＰ－１タンパク質チロシンホスファターゼを募集してＴ細胞活性化シグナルを下方制御する。ＰＤ－１に加え、ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ８０と相互作用して、Ｔ細胞の活性を阻害するシグナルを伝達する。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞の増殖の阻害、サイトカインの放出、他のエフェクター機能など、様々な面においてＴ細胞の活性を下方制御する。

ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、免疫系の恒常性にとって特に重要である。異なる遺伝子型のＰＤ－１欠損マウスにおいては、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス又は致命的な自己免疫性心筋症が起こる傾向がある。ＰＤ－１欠損マウスにおいては胸腺におけるＴ細胞の順化が変化され、ＰＤ－Ｌ１の遮断は胎児と母親との間の忍容性を破壊することができる。また、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害することは、病原体に対する宿主の免疫作用を強化する。

ＰＤ－Ｌ１は、様々な予後不良の腫瘍（例えば、腎がん、胃がん、尿路上皮がん、卵巣がん、黒色腫）において発現され、ＰＤ－Ｌ１抗体を用いて腫瘍細胞を殺し又は傷害性Ｔ細胞ＣＴＬｓの活性を阻害することができる。免疫応答の下方制御におけるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の重要性を考えると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１との相互作用を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を開発し、それを腫瘍の免疫療法に用いることは大きな意義を有する。

本開示が解決しようとする技術的課題は、既存の抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＰＤ－Ｌ１とが結合する親和性及び特異性は高くなく、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を効果的に遮断できないという欠点及び不足を克服することであり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用を提供する。

本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、
配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示される又は配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ１、配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示される又は配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ２、配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示される又は配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ３、及び
配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示される又は配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ１、配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示される又は配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ２、配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示される又は配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ３であるＣＤＲｓを含有する。

本開示は、前記抗体又はその抗原結合性断片の重鎖可変領域をコードする第１核酸、及び／又は、前記抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖可変領域をコードする第２核酸を含む核酸を提供する。

本開示は、さらに、前記核酸を含むベクターを提供する。

本開示は、さらに、前記核酸又は前記ベクターを含む細胞を提供する。

本開示は、さらに、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合性断片、前記核酸、前記ベクター又は前記細胞を含有する医薬組成物を提供する。

本開示は、さらに、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は病状を治療する医薬物の製造における、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片、及びその関連する核酸ベクター、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用に関する。

以下、本開示の実施例の技術的解決手段をはっきり説明するために、以下に、実施例で用いられる必要がある図面を簡単に紹介する。なお、以下の図面が本開示の一部の実施例を示しているだけで、範囲に対する限定と見なされないことは、理解されべきである。当業者は、創造性の労働を払わない前提で、これらの図面から他の関連する図面を得ることができる。
ＣＨＯヌル細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果である。 ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果である。 アカゲザルＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果である。 ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果である。 ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の競合的結合活性の検出結果である。 実験方法１の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断の検出結果である。 実験方法２の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断のモード２の検出結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＣＤ８０ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断の検出結果である。 ルシフェラーゼレポーター遺伝子法による、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ活性の解析のプレート１、プレート２の結果であり、ここで、図（ａ）はプレート１の結果であり、図（ｂ）はプレート２の結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＬ－２の分泌のプレート１の結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＬ－２の分泌のプレート２の結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＦＮγの分泌のプレート１の結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＦＮγの分泌のプレート２の結果である。 組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ、ｈＰＤ－Ｌ２ｈＦｃ、ｈＩＣＯＳＬＧｈＦｃ、ｈＢ７－Ｈ３ｈＦｃに対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性の結果であり、ここで、図（ａ）は、組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃに対する結合特異性の結果であり、図（ｂ）は、組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ２ｈＦｃに対する結合特異性の結果であり、図（ｃ）は、組換えタンパク質ｈＩＣＯＳＬＧｈＦｃに対する結合特異性の結果であり、図（ｄ）は、組換えタンパク質ｈＢ７－Ｈ３ｈＦｃに対する結合特異性の結果である。 組換えタンパク質ｈＣＤ２８ｈＦｃ、ｈＣＤ８６ｈＦｃ、ｈＣＴＬＡ－４ｈＦｃに対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性の結果であり、ここで、図（ａ）は、組換えタンパク質ｈＣＤ２８ｈＦｃに対する結合特異性の結果であり、図（ｂ）は、組換えタンパク質ｈＣＤ８６ｈＦｃに対する結合特異性の結果であり、図（ｃ）は、組換えタンパク質ｈＣＴＬＡ－４ｈＦｃに対する結合特異性の結果である。 抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビボ活性の特性評価の結果であり、ここで、図（ａ）は、マウスの腫瘍体積に対するｍＩｇＧ１サブタイプの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体の影響の結果であり、図（ｂ）は、マウスの腫瘍体積に対するｍＩｇＧ２ａサブタイプの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体の影響の結果であり、図（ｃ）は、マウスの体重に対するｍＩｇＧ１サブタイプ、ｍＩｇＧ２ａサブタイプの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体の影響の結果である。

以下、具体的な実施例を用いて本開示をさらに説明し、実施例は本開示に対していかなる形態でも限定を構成するものではない。特に説明がない限り、本開示で使用される試薬、方法及び装置は当技術分野の通常の試薬、方法及び装置である。

特に説明がない限り、以下の実施例で使用される試薬及び材料はいずれも市販品である。

本開示の一部の実施形態は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片を開示し、前記抗体は、
配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示される又は配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ１、配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示される又は配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ２、配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示される又は配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ３、及び
配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示される又は配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ１、配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示される又は配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ２、配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示される又は配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ３であるＣＤＲｓを含有する。

当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片の１つの重要な利点は、ＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性及び高い特異的結合能力を有することである。

当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片の１つの重要な利点は、細胞の表面において発現されるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を遮断する作用を有することである。

当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片の１つの重要な利点は、サイトカインの生成を刺激できることである。

したがって、当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片は、抗体医薬品として又はそれを製造するために使用することができる。

本開示ではＫａｂａｔナンバリングシステムを用いてＣＤＲ領域をマークするが、他の方法でマークされるＣＤＲ領域も本開示の請求範囲に属する。

本開示ではＫａｂａｔナンバリングシステムを用いてＣＤＲ領域をマークするが、他の方法でマークされるＣＤＲ領域も本開示の請求範囲に属する。

本開示において、本文で使用される様に、用語「抗体又はその抗原結合性断片」は、特定の抗原と結合するタンパク質であり、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を含むあらゆるタンパク質及びタンパク質断片を指す。「抗体」とは特に全長抗体を指し、「全長抗体」という用語には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が含まれる。「抗原結合性断片」は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原と特異的に結合できる、抗体のＣＤＲの一部又は全部を含む物質である。このような断片は、生理活性を有し、それらが、標的抗原と結合し、且つ他の抗原結合分子（無傷抗体を含む）と所定のエピトープへ競合的に結合できるからである。

本文で使用される様に、用語「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を指す。３種類の重鎖ＣＤＲ及び３種類の軽鎖ＣＤＲがある。ここで、場合によっては、用語「ＣＤＲ」及び「ＣＤＲｓ」は、抗体又はその抗原結合性断片と、それによって認識される抗原又はエピトープとの結合親和性に役割を果たす主要アミノ酸残基の１種若しくは複数種、又は、ひいては全体を含む領域を指す。

本文で使用される様に、用語「特異的結合」又は類似する表現とは、抗体又はその抗原結合性断片の予め決定された抗原におけるエピトープへの結合を指す。一般に、抗体又はその抗原結合性断片は、約１０^－６Ｍ未満、例えば、約１０^－７Ｍ未満、約１０^－８Ｍ未満、約１０^－９Ｍ未満若しくは約１０^－１０Ｍ未満又はさらに小さい親和力（ＫＤ）で結合する。ＫＤとは解離速度と結合速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、当該量は当業者によく知られる方法で測定することができる。

一部の実施形態において、前記抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５、９、１３、１７のいずれかに示されており、又は配列番号５、９、１３、１７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、
一部の実施形態において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６、１０、１４、１８のいずれかに示されており、又は配列番号６、１０、１４、１８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列である。

本開示において、前記抗体は定常領域を有し、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭから選ばれるいずれか１種であり、軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖である。

一部の実施形態において、前記定常領域の由来種はヒト又はマウスである。

一部の実施形態において、前記抗体は、二重特異性抗体、ＣＤＲ移植抗体、多量体抗体のうちのいずれか１種又は複数種である。

一部の実施形態において、前記抗原結合性断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ及びシングルドメイン抗体のうちのいずれか１種又は複数種である。

一部の実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１は、ヒト、サル又はマウスＰＤ－Ｌ１である。

本開示の一部の実施形態は、さらに、前記抗体又はその抗原結合性断片の重鎖可変領域をコードする第１核酸、及び／又は、前記抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖可変領域をコードする第２核酸を含む核酸を開示する。

核酸は、一般にＲＮＡ又はＤＮＡであり、核酸分子は、一本鎖でもよいし二本鎖でもよいが、一部の実施形態において、二本鎖ＤＮＡである。核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、核酸は「作動可能に連結」される。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合に、プロモーター又はエンハンサーは前記コード配列に作動可能に連結される。それがベクターに接続される場合、一部の実施形態において、ＤＮＡは用いられる。また、抗体が膜タンパク質であるため、核酸は一般にシグナルペプチド配列を備える。

一部の実施形態において、前記第１核酸の塩基配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５のいずれかに示されており、又は配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列である。

一部の実施形態において、前記第２核酸の塩基配列は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６のいずれかに示されており、又は配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列である。

本開示の一部の実施形態は、さらに、前記核酸を含むベクターを開示する。

本文で使用される様に、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ポリヌクレオチドをその中に挿入できる核酸送達ツールである。挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質をベクターが発現させることができる場合に、当該ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターを形質転換、形質導入又はトランスフェクションによりホスト細胞に導入することで、それに携帯する遺伝物質エレメントをホスト細胞において発現することができる。ベクターは当業者に周知されており、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、ファージ（例えば、λファージ又はＭ１３ファージ）、動物ウイルスなどを含み、ただしそれらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含み、ただしそれらに限定されない。

本開示の一部の実施形態は、さらに、前記核酸又は前記ベクターを含む細胞を開示する。

一部の実施形態において、前記細胞は真核哺乳動物細胞である。

任意の実施形態において、前記細胞はチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞である。

本開示の一部の実施形態は、さらに、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合性断片、前記核酸、前記ベクター又は前記細胞を含有する医薬組成物を開示する。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターをさらに含有する。

本文で使用される様に、用語「医薬組成物」とは、活性成分の生理活性が有効であることが許される形で存在し、また前記組成物を投与される対象に対して容認できない毒性を有する追加の成分を含まないものである。

本文で使用される様に、用語「薬学的に許容されるベクター」は、抗体の保管期限又は有効性を延長するための、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むことができる。

また、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は病状を治療する医薬物の製造における、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片、及びその関連する核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用も、本開示の請求範囲に含まれるべきである。

（発明の効果）
本開示は、以下の有益な効果を有する。
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片、及びＰＤ－Ｌ１タンパク質と高い親和性及び高い特異性で結合する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を提供し、当該抗体は、細胞の表面において発現されたＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を遮断でき、且つインビトロ細胞機能実験では、サイトカインの生成を刺激する生物学的機能活性を示す。したがって、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片、核酸、ベクター、細胞又は前記医薬組成物には、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は病状を治療する医薬物の製造における幅広い使用が見込まれる。

（実施例１）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の生成：
１．免疫原
組換えヒトＰＤ－Ｌ１融合タンパク質を免疫原として使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を生成させる。免疫プロセスでは、ｍＦｃタグを携帯するヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン融合タンパク質ｈＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を免疫原として使用した。

２．免疫プロセス
通常のマウスハイブリドーマ系を使用して抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体を生成する。プロセスは次のとおりである。
組換えヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質０．２５ｍｇ／ｍＬと完全フロイントアジュバント（ｓｉｇｍａ）を等体積で混合して、油性のエマルジョンを得て、０．２ｍＬの用量で６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（広東省医学実験動物センター）の背側の部位に皮下投与した。最初の免疫から７日後、組換えヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質と不完全フロイントアジュバント（ｓｉｇｍａ）を等体積で混合した後、腹腔内において免疫し、４～５針免疫した後、尾から採血して力価を検出し、力価が所定の滴定量に達したら、生理食塩水で希釈した免疫原０．１ｍＬで追加免疫を行い、３日後に脾臓の融合を行った。

３．ハイブリドーマ細胞の製造
マウス腫瘍細胞と脾臓免疫細胞を１：２の細胞数比で混合し、５０ｍＬの遠心管に移して、ＲＰＭＩ１６４０基礎培地で１回洗浄した。上清を捨て、１８ｍＬの電気融合液（ＢＴＸ）で細胞を均一に混合して、電気融合タンクに加え、所定のパラメータで電気融合を行った。融合後、１００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０基礎培地を加えて軽やかに懸濁化し、９６ウェルプレートに均等に分け、合計で２０枚であり、５０μＬ／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ_２細胞インキュベーターに静置して培養した。培養が６日目になったら、ＨＴを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地と１回交換した。

４．抗ヒトＰＤ－Ｌ１クローン上清の検出
０．０５Ｍ炭酸バッファーでヒトＦｃタグを携帯する自製のヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質を、最終濃度が１μｇ／ｍＬになるまで希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、２～８℃で夜通しコーティングした。上清を捨て、２００μＬ／ウェルでブロッキング溶液（１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を加えて、３７℃で１時間ブロッキングした。融合後７日目になったら、１００μＬ／ウェルで細胞上清を加え、３７℃で３０分間静置してインキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で３０分間静置してインキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、顕色反応を行った。

５．サブクローンのスクリーニング
ＯＤ４５０≧０．５の融合体を選択し、限界希釈法でクローニングし、少なくとも２回であった。前記ステップ４の実験プロセスで検出し、得られた陽性サブクローンに対しては、インビトロ培養を介して株保存及び発現を行った。

６．抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の発現
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を生成するクローンが８０～９０％コンフルエントになるまで成長したら、細胞を吹き飛ばし、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、５％のＦＢＳを含む３０ｍＬのＳＦＭ完全培地で細胞を再懸濁し、１５０ｍＬのＳＦ振とうフラスコに移し、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで２～３日培養した。細胞密度が５×１０Ｅ^５／ｍＬになった時、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５０ｍＬの無血清ＳＦＭ基礎培地で細胞を再懸濁し、２５０ｍＬのＳＦ振とうフラスコに移し、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで４～５日培養し、９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を回収し、クローンの結合の同定を行った。

７．発酵上清の結合活性の同定
抗ヒトＰＤ－Ｌ１クローンの発酵上清とヒトＰＤ－Ｌ１及びアカゲザルＰＤ－Ｌ１との結合活性を評価するために、ヒトＰＤ－Ｌ１全長タンパク質（ＵｎｉｐｒｏｔＮｏ．ＮＰ＿０５４８６２１．１、配列番号１）及びアカゲザルＰＤ－Ｌ１（ＵｎｉｐｒｏｔＮｏ．ＸＰ＿００５５８１８３６、配列番号２）を安定的に発現するチャイニーズハムスターＣＨＯ安定細胞株をスクリーニングし構築した。抗ヒトＰＤ－Ｌクローンの発酵上清の結合活性の評価を行った。実験プロセスは次のとおりである。
１×ＦＣＭバッファー（１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）でＣＨＯ安定細胞株を２×１０Ｅ^６／ｍＬになるまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに加え、２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１００μＬ／ウェルで抗ヒトＰＤ－Ｌ１クローンの発酵上清を加え、氷上に静置して３０分間インキュベートして、２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨てた。１×ＦＣＭで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したｉＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３ＧＡＭ蛍光二次抗体（希釈倍率１：４００）（ＡＴＴｂｉｏｑｕｅｓｔ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。

８．精製
陽性クローンの上清を選択して精製した。精製ではＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた。プロセスは次のとおりである。
ＡＫＴＡａｖａｎｔ１５０クロマトグラフ装置を用いて、少なくとも５ＣＶの平衡化バッファー（１０ｍＭＰＢＳ）でカラム（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＬＸ、ＧＥ）を平衡化し、サンプルをカラムにロードして、目的タンパク質をカラムに吸着させて他の不純物を透過させて分離した。ローディングを完了した後に少なくとも５ＣＶの平衡化バッファー（１０ｍＭＰＢＳ）を用いて再びカラムを洗い流し、その後、溶出バッファー（２０ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ＝３．４）を用いて目的タンパク質を溶出し、回収管には予め中和バッファー（１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）を加え、中和バッファーの添加体積は溶出サンプルの推定含有量から決めた（一般に溶出体積量の１０％を加える）。

９．抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体濃度の測定
サンプルは、Ｂｉｏｔｅｋ－Ｅｐｏｃｈ－Ｔａｋｅ－３を用いて濃度の測定を行い、Ａ２８０法を用いて抗体濃度を検出し、即ち、吸光係数Ｅ．Ｃ．＝１．３７、光路長さ＝０．０５ｍｍ（Ｔａｋｅ－３プレートのウェルによって光路長さに微細な差があるが、自動的に補正される）により、装置においてサンプルの吸光度値を検出し、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒｌａｗに従って被検抗体の濃度を計算した。サンプル濃度が低過ぎる場合は限外濾過濃縮を行う必要があり、限外濾過濃縮管（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ、３０ｋＤ）を用いて取扱説明書に記載の一般的な操作方法に従って、サンプル濃度を>０．５ｍｇ／ｍＬである様に濃縮し、濃縮端のサンプルを回収し、０．２２μｍ滅菌シリンジフィルターで滅菌濾過した（科百特、ＰＥＳ、０．２２μｍ、直径１３ｍｍ）。

１０．抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体サブタイプの同定
０．０５Ｍである、ｐＨ９．５の炭酸バッファーで、ヒトＦｃタグを携帯する自製の組換えヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質を希釈し、その最終濃度を１μｇ／ｍＬにした。１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、２～８℃で夜通しコーティングした。上清を吸い出して捨て、２００μＬ／ウェルでブロッキング溶液（１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を加えて、３７℃で１時間ブロッキングした。１％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳで抗体を１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｓｉｇｍａＡ０１６８－１ＭＬ）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＭ３２２０７）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＰＡ１－７４４２１）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＭ３２４０７）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＭ３２６０７）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ３１４４０）を加え、３７℃で３０分間静置してインキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、顕色反応を行った。４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（Ｆ０１６－２１、Ｆ０１６－１９３、Ｆ０１６－５６８、Ｆ０１６－８７０）を得た。

１１．抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の配列同定
前記４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体（Ｆ０１６－２１、Ｆ０１６－１９３、Ｆ０１６－５６８及びＦ０１６－８７０）のマウスハイブリドーマクローンの配列取得及び配列決定は通常の方法を利用し、次のとおりに概述する。
ＲＮＡ抽出キットＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ－（東洋紡）を用いて、５×１０^６個のマウスハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し獲得した。５’ＲＡＣＥ法のプロセスにより、ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥ５’Ｋｉｔキット（タカラバイオ）を用いて、ｃＤＮＡ配列を得た。５’ＲＡＣＥユニバーサルプライマー及び３’マウス特異的保存領域（conserved region）プライマーを用いて、抗体可変領域の配列を増幅し、可変領域の配列を含むＰＣＲクローン配列をｐＭＤ１８－Ｔベクター（タカラ、Ｃａｔ．Ｄ１０１Ａ）に連結させて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αコンピテントセル（ＮＥＢ）をトランスフェクションした。ＳａｎＰｒｅｐカラム式プラスミドＤＮＡミニ抽出キット（生工生物）を使用してプラスミドを抽出し、次に配列決定を行った。
４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の可変領域のヌクレオチド配列を表１に示し、アミノ酸配列を表２に示す。

（実施例２）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性：
１．ＣＨＯ－ＦＰ１（ＣＨＯヌル細胞）に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出：
（１）実験方法
ＣＨＯヌル細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性を検出し、プロセスは次のとおりである。
１×ＦＣＭバッファー（１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）でＣＨＯヌル細胞を２×１０Ｅ^６／ｍＬになるまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに加えた。１×ＦＣＭバッファーで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。１００μＬ／ウェルで細胞に加え、氷上に静置して３０分間インキュベートして、２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨てた。１×ＦＣＭで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したｉＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３ＧＡＭ蛍光二次抗体（希釈倍率１：４００）（ＡＴＴｂｉｏｑｕｅｓｔ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ及びＡＰＣ抗ｍＩｇＧを対照抗体とした。

（２）実験結果
ＣＨＯ－ＦＰ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果を図１に示し、結果は、４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体がＣＨＯヌル細胞と結合しないことを示した。

２．ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出
（１）実験方法
膜タンパク質ＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性の特性評価のために、１×ＦＣＭバッファー（１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）で抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を３倍の倍率で希釈し、初期濃度は６０μｇ／ｍＬであり、次にＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１安定細胞株とコインキュベーションした。具体的な実験プロセスは前記ステップ１と同じであった。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプを対照抗体とした。

（２）実験結果
ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果を図２に示す。
結果は、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性のＥＣ_５０が０．５～１．３ｎＭであり、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する対照抗体の結合活性のＥＣ_５０が０．２～１．０ｎＭであることを示した。

３．アカゲザルＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出
（１）実験方法
アカゲザルＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性の特性評価のために、１×ＦＣＭバッファー（１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）で抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を３倍の倍率で希釈し、初期濃度は３０μｇ／ｍＬであり、次にＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１安定細胞株とコインキュベーションした。具体的な実験プロセスは前記ステップ１と同じであった。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプを対照抗体とした。

（２）実験結果
アカゲザルＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果を図３に示し、結果は、ＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１に対する４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性のＥＣ_５０が０．９～１．３ｎＭであり、ＣＨＯ－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１に対する対照抗体の結合活性のＥＣ_５０が０．５～２．１ｎＭであることを示した。

４．ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出
（１）実験方法
ヒトＩＦＮγで腫瘍細胞の表面のＰＤ－Ｌ１の発現を刺激し、ＰＤ－Ｌ１膜タンパク質に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性を検出した。実験プロセスは次のとおりである。
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ）でヒト黒色腫細胞Ａ３７５（上海セルバンク）を夜通し刺激してヒトＰＤ－Ｌ１を発現させ、翌日、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でＡ３７５細胞を消化処理し、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、生細胞の密度を２Ｅ^６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに加えた。１×ＦＣＭバッファーで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を６０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。１００μＬ／ウェルで細胞に加え、氷上に静置して３０分間インキュベートして、２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨てた。１×ＦＣＭで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したｉＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３ＧＡＭ蛍光二次抗体（希釈倍率１：４００）（ＡＴＴｂｉｏｑｕｅｓｔ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプを対照抗体とした。

（２）実験結果
ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合活性の検出結果を図４に示し、結果は、ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合のＥＣ_５０が０．１２～０．１８ｎＭであり、ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞に対する対照抗体の結合のＥＣ_５０が０．１２～０．１９ｎＭであることを示した。

５．ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合動力学ＫＤの解析
（１）実験方法
ＭＤＦｏｒｔｅＢＩＯＱＫ^ｅプラットフォームを使用してヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合動力学定数の解析を行った。実験方法は次のとおりである。
平衡化バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０２％ツイーン２０）で、ｈｉｓタグを携帯する自製のヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを、最終濃度が５μｇ／ｍＬになるまで希釈した。平衡化バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０２％ツイーン２０）で４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を２倍の倍率で希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、合計で７つの濃度であった。ａｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）が充分に水和したら、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ組換えタンパク質を先ず１５０秒凝固し、９０秒平衡化した後、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と結合し、ここで、結合時間は１８０秒であり、解離時間は６００秒であった。反応全体は２５℃、１０００ｒｐｍの条件で行われた。最後にＯｃｔｅｔ解析ソフトウェアで曲線当てはめを行って、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合動力学定数ＫＤを得た。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）及びアテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）を対照抗体とした。

（２）実験結果
ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合動力学ＫＤの解析結果を表３に示し、結果は、対照抗体と同じように、ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合動力学定数がいずれもｐＭレベルであることを示した。

（実施例３）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のエピトープの解析：
１．エピトープ結合（ｅｐｉｔｏｐｅｂｉｎｎｉｎｇ）
（１）実験方法
ＭＤＦｏｒｔｅＢＩＯＱＫｅプラットフォームを使用して抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のエピトープ競合解析を行った。実験方法は次のとおりである。
平衡化バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０２％ツイーン２０）で、ｈｉｓタグを携帯する自製のヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを、最終濃度が５μｇ／ｍＬになるまで希釈した。平衡化バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０２％ツイーン２０）で抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を最終濃度が２０μｇ／ｍＬになるまで希釈した。ａｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢＩＯ、Ｃａｔ．１８－５１２２）が充分に水和したら、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ組換えタンパク質を先ず１５０秒凝固し、９０秒平衡化した後、第１の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と１２０秒結合し、９０秒平衡化した後、再び第２の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と結合し、ここで、結合時間は１２０秒であった。反応全体は２５℃、１０００ｒｐｍの条件で行われた。最後にＯｃｔｅｔ解析ソフトウェアでエピトープ結合の解析を行った。

（２）実験結果
エピトープ結合解析の結果は、Ｆ０１６－２１及びＦ０１６－１９３がアベルマブと競合しないことを示した。

２．細胞レベルの抗体エピトープ競合解析
（１）実験方法
１×ＦＣＭバッファー（１×ＦＢＳ＋３％ＢＳＡ）で抗ＰＤ－Ｌ１抗体を希釈し、ここで、第１の抗体は、アベルマブ－ｈＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１サブタイプ）、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を含み、その濃度は４０μｇ／ｍＬであり、第２の抗体は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体であり、その濃度は２μｇ／ｍＬであった。１×ＦＣＭバッファーでＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１安定細胞株を再懸濁して、細胞密度を２×１０Ｅ^６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに分け、５０μＬの第１の抗体を加え、氷上で３０分間インキュベートした後、５０μＬの第２の抗体を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨てた。１×ＦＣＭで２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したｉＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３ＧＡＭ蛍光二次抗体（希釈倍率１：４００）（ＡＴＴｂｉｏｑｕｅｓｔ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を用いて検出を行った。

（２）実験結果
ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の競合的結合活性の検出結果を図５に示し、Ｆ０１６－２１及びＦ０１６－１９３はアベルマブと競合しない。

（実施例４）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介されたリガンド遮断実験：
１．ＰＤ－１との結合を遮断する活性
腫瘍細胞又は抗原提示細胞によって発現されるＰＤ－Ｌ１タンパク質は、リンパ球の表面において発現されるＰＤ－１タンパク質と結合することにより、リンパ球の刺激活性を阻害する。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合の遮断型抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体に対して評価を行い、実験方法１及び２によって行うことができ、実験方法１及び２はそれぞれ次のとおりである。

１）実験方法１
（１）実験方法
１×ＦＣＭバッファーで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を３倍の倍率で希釈し、初期濃度は２００μｇ／ｍＬであった。１×ＦＣＭバッファーで、ｈＦｃを携帯する自製の組換えヒトＰＤ－１タンパク質を、濃度が４μｇ／ｍＬになるまで希釈した。１×ＦＣＭバッファーで、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、細胞密度が２×１０Ｅ^６／ｍＬになるまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに均等に分けた。５０μＬ／ウェルで抗体をＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルで組換えヒトＰＤ－１－ｈＦｃタンパク質を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭで１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＦｃ蛍光二次抗体（希釈倍率１：５００）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）及びアテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）を対照抗体とした。

（２）実験結果
実験方法１の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断の検出結果を図６に示し、結果は、４つの株のマウスモノクローナル抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断のＩＣ_５０が４．９～６．９ｎＭであり、対照抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断のＩＣ_５０が５．０～６．４ｎＭであることを示した。

２）実験方法２
（１）実験方法
１×ＦＣＭバッファーで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を３倍の倍率で希釈し、初期濃度は２００μｇ／ｍＬであった。１×ＦＣＭバッファーで、ｈＦｃを携帯する自製の組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を、濃度が２μｇ／ｍＬになるまで希釈した。１×ＦＣＭバッファーで、ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を、細胞密度が２×１０Ｅ^６／ｍＬになるまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに均等に分けた。５０μＬ／ウェルで抗体をＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルで組換えヒトＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃタンパク質を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭで１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＦｃ蛍光二次抗体（希釈倍率１：５００）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。
アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）を対照抗体とした。

（２）実験結果
実験方法２の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断の検出結果を図７に示し、結果は、４つの株のマウスモノクローナル抗体によるＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合活性の遮断のＩＣ_５０が０．９～１．７ｎＭであり、対照抗体によるＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合活性の遮断のＩＣ_５０が１．１～１．６ｎＭであることを示した。

２．ＣＤ８０との結合を遮断する活性
（１）実験方法
腫瘍細胞又は抗原提示細胞において発現されるＰＤ－Ｌ１タンパク質は、リンパ球の表面において発現されるＣＤ８０タンパク質と結合することにより、リンパ球の刺激活性を阻害する。ＣＤ８０とＰＤ－Ｌ１との結合の遮断型抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体に対して評価を行い、実験方法は次のとおりである。
１×ＦＣＭバッファーで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を３倍の倍率で希釈し、初期濃度は２００μｇ／ｍＬであった。１×ＦＣＭバッファーで、ｈＦｃを携帯する自製の組換えヒトＣＤ８０タンパク質を、濃度が１６０μｇ／ｍＬになるまで希釈した。１×ＦＣＭバッファーで、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、細胞密度が２×１０Ｅ^６／ｍＬになるまで再懸濁し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＶ底プレートに均等に分けた。
５０μＬ／ウェルで抗体をＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルで組換えヒトＣＤ８０－ｈＦｃタンパク質を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭで１回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、１×ＦＣＭバッファーで希釈したＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＦｃ蛍光二次抗体（希釈倍率１：５００）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間遠心分離した後、上清を吸い出して捨て、１×ＦＣＭを加えて２回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を使用して検出を行った。
アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）を対照抗体とした。

（２）実験結果
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体による、ｈＣＤ８０ｈＦｃ組換えタンパク質に対するＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１の結合活性の遮断の検出結果を図８に示し、結果は、４つの株のマウスモノクローナル抗体によるＰＤ－Ｌ１のＣＤ８０との結合活性の遮断のＩＣ_５０が４．１～５．０ｎＭであり、対照抗体によるＰＤ－Ｌ１のＣＤ８０との結合活性の遮断のＩＣ_５０が４．０～４．４ｎＭであることを示した。

（実施例５）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ活性の特性評価：
１．Ｊｕｒｋａｔ－ＧＬ４．３０－ｈＰＤ－１とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１－ＯＫＴ３とのコインキュベーションにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子系の検出
（１）実験方法
ルシフェラーゼレポーター遺伝子系を利用して抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を検出するために、レンチウイルスパッケージング系により、ｈＰＤ－１及びルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ－ＧＬ４．３０－ｈＰＤ－１エフェクター細胞株を構築した。同時に、ＰＤ－Ｌ１提示細胞ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１－ＯＫＴ３を構築し、即ち、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞を使用してｈＰＤ－Ｌ１及び抗原非依存性ＴＣＲ細胞表面キネシンを安定的に発現する。実験の当日、１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地でＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１－ＯＫＴ３細胞及びＪｕｒｋａｔ－ＧＬ４．３０－ｈＰＤ－１細胞を再懸濁し、生細胞の密度は、それぞれ、１×１０Ｅ^６／ｍＬ、５×１０Ｅ^６／ｍＬであり、４０μＬ／ウェルで９６ウェル蛍光マイクロプレートに分けた。１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０完全培地で抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体を希釈し、初期濃度は５０μｇ／ｍＬであり、２０μＬ／ウェルで抗体を吸い出してＪｕｒｋａｔ－ＧＬ４．３０－ｈＰＤ－１とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１－ＯＫＴ３との混合細胞に入れ、均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ_２細胞インキュベーターにおいて６時間培養した。１００μＬ／ウェルで、予め解凍したＢｒｉｇｈｔ－Ｌｕｍｉ（登録商標）溶液（碧云天）を加え、暗所で５分間静置した後、多目的マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘ多目的マイクロプレートリーダー）を用いてＬｕｍｉモードにおいて検出を行った。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１サブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプを対照抗体とした。

（２）実験結果
ルシフェラーゼレポーター遺伝子法による、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ活性の解析のプレート１、プレート２の結果をそれぞれ図９に示し、結果は、４つの株の抗体が、ルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナルのコールバックを媒介でき、抗体用量依存的であることを示した。

２．Ｔ－ＤＣ同種異系混合リンパ球反応系におけるＩＬ－２及びＩＦＮγの生成の刺激
（１）実験方法
同種異系Ｔ－ＤＣＭＬＲ実験により、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のサイトカインＩＬ－２及びＩＦＮγを刺激する活性を評価する。実験プロセスは次のとおりである。
ヒトリンパ球分離液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）を使用して健康なヒト末梢血から末梢血リンパ球ＰＢＭＣを分離した。なお、ドナー１のＰＢＭＣは、ヒトＣＤ１４Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でポジティブ・スクリーニングしてＣＤ１４^＋単球を得た。単球を５×１０Ｅ^５／ｍＬでＴ７５培養フラスコに接種し、サイトカインであるヒトＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を、最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬである様に追加して、６日間連続で刺激した後、ヒトＴＮＦαを最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬである様に追加し、引き続き３日間分化誘導して成熟ＤＣ細胞を得た。ドナー２のＰＢＭＣは、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ＨｕｍａｎＴＣｅｌｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＫｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）でネガティブ・スクリーニングしてＣＤ３^＋Ｔ細胞を得た。ＤＣ：Ｔ細胞比は１：５、ＤＣ細胞量は２×１０Ｅ^４／ウェルとして、ＤＣとＴ細胞を均一に混合して９６ウェルＵ底プレートに分け、合計で１５０μＬ／ウェル系であった。Ｘ－ＶＩＶＯ１５完全培地で抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を希釈し、初期濃度は２０μｇ／ｍＬであり、４倍の倍率で希釈し、５０μＬ／ウェルで細胞に加えた。混合リンパ球反応実験が３～５日になったら、細胞上清におけるＩＬ－２及びＩＦＮγの発現を検出した。アベルマブ－ｍＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａサブタイプ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプ及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプを対照抗体とした。

（２）実験結果
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＬ－２の分泌のプレート１、プレート２の結果を、それぞれ、図１０、図１１に示し、そのＥＣ_５０は順に０．０７～０．１μｇ／ｍＬ、０．０５～０．０９μｇ／ｍＬであり、対照抗体のＥＣ_５０は、順に０．０３μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬであり、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体によって媒介された混合リンパ球反応におけるＩＦＮγの分泌のプレート１、プレート２の結果を、それぞれ、図１２、図１３に示し、そのＥＣ_５０は、順に０．１４～０．１７μｇ／ｍＬ、０．１～０．１４μｇ／ｍＬであり、対照抗体のＥＣ_５０は、順に０．０８９μｇ／ｍＬ、０．０７７μｇ／ｍＬであった。結果は、Ｔ－ＤＣ同種異系混合リンパ球反応実験では、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体がサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮγの上方制御を媒介でき、抗体の用量と正の相関であることを示した。

（実施例６）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性の解析：
ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、Ｂ７ファミリータンパク質に属し、当該ファミリーのタンパク質は、ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２）、Ｂ７－Ｈ３ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）などを含む。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性を検出するための実験プロセスは次のとおりである。
５０ｍＭＣＢバッファーで、ｈＦｃタグを携帯する組換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質、ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ヒトＩＣＯＳＬＧタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ヒトＢ７－Ｈ３タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ヒトＣＤ２８タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ヒトＣＤ８６タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）及びヒトＣＴＬＡ－４タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡ検出プレートに加え、２～４℃で夜通しコーティングした。上清を捨て、２００μＬ／ウェルでブロッキング溶液（１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を加えて、３７℃で１時間ブロッキングした。１％のＢＳＡを含むＰＢＳで抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で３０分間静置してインキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｓｉｇｍａＡ０１６８－１ＭＬ）を加え、３７℃で３０分間静置してインキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、顕色反応を行った。

２．実験結果
組換えタンパク質ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ、ｈＰＤ－Ｌ２ｈＦｃ、ｈＩＣＯＳＬＧｈＦｃ、ｈＢ７－Ｈ３ｈＦｃに対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性の結果を図１４に示し、組換えタンパク質ｈＣＤ２８ｈＦｃ、ｈＣＤ８６ｈＦｃ、ｈＣＴＬＡ－４ｈＦｃに対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性の結果を図１５に示し、結果は、４つの株の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が、いずれもＰＤ－Ｌ１以外の他のＢ７ファミリータンパク質及び他の関連タンパク質（ｈＰＤ－Ｌ１ｈＦｃ、ｈＰＤ－Ｌ２ｈＦｃ、ｈＩＣＯＳＬＧｈＦｃ、ｈＢ７－Ｈ３ｈＦｃ、ｈＣＤ２８ｈＦｃ、ｈＣＤ８６ｈＦｃ、ｈＣＴＬＡ－４ｈＦｃ）と結合せず、対照抗体が、ＰＤ－Ｌ１と結合する他に、ＰＤ－Ｌ２、ＩＣＯＳＬＧ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２８、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４とも比較的非常に高い結合を有することを示しており、対照抗体と比べて、本開示の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の結合特異性がより強いことが示される。

（実施例７）
抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビボ活性の特性評価：
本実施例では、マウス腫瘍モデルの遮断に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体の有効性を研究した。本開示で得られた抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体は、マウスＰＤ－Ｌ１と交差しないため、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを持つｈＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス（百奥賽図）を使用した。実験方法は次のとおりである。
マウスの右側に１×１０Ｅ^６のＭＣ３８ｈＰＤ－Ｌ１安定発現結腸・直腸がん細胞を皮下接種した。接種当日を研究の０日目と定義した。平均腫瘍体積が６０～８０ｍｍ^３に達したら、マウスを腫瘍体積でランダムに群分けし、研究の８日目には、マウスを腫瘍体積でランダムに１０群に分け、１群当たり８匹のマウスであり、腹腔内投与を開始した。投与計画は表４に示すとおりである。

８日目から腫瘍体積の測定を始め記録し、研究期間中、バーニヤで腫瘍の長径及び短径を週２回に測定した。（１／２）×長径×（短径）^２で腫瘍体積を計算した。マウスの体積が２０％減少し又は腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超える時には、慈悲殺の基準を満たし、ＣＯ_２窒息法でマウスを殺した。

抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のインビボ活性の特性評価の結果を表５及び図１６に示し、結果は、ｍＩｇＧ１サブタイプの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体Ｆ０１６－２１（ＴＧＩ＝６９．１９％、ＣＲ：３／８）及びＦ０１６－８７０（ＴＧＩ＝５３．２２％、ＣＲ：０／８）の抗腫瘍効果が、アテゾリズマブ－ｍＩｇＧ１（ＴＧＩ＝３６．２９％、ＣＲ：０／８）（図１６のａ参照）より優れることを示した。ｍＩｇＧ２ａサブタイプの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体Ｆ０１６－２１、Ｆ０１６－８７０及びＦ０１６－５６８の抗腫瘍効果は、顕著であり、ＴＧＩが、それぞれ、１０３．８３％、１０６．７３％、９２．６２％であった。８匹のマウスのうち腫瘍が完全に解消された（ＣＲ）のは、それぞれ、７匹、７匹、４匹（即ち、ＣＲは、それぞれ、７／８、７／８、４／８）であった（図１６のｂ参照）。また、抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体の各投与群ではマウスの体重に顕著な影響がなかった（図１６のｃ参照）。

上記の実施例は本開示の好ましい実施形態であり、本開示の実施形態は上記の実施例に限定されず、本開示の趣旨と原理を逸脱せずに行われる他の変更、修正、置換、組み合わせ、簡素化は、いずれも同等な置換形態として、本開示の請求範囲に含まれるものとする。

本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、
配列番号３７、１９、３１、２５のいずれかに示される又は配列番号３７、１９、３１、２５のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ１、配列番号３８、２０、３２、２６のいずれかに示される又は配列番号３８、２０、３２、２６のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ２、配列番号３９、２１、３３、２７のいずれかに示される又は配列番号３９、２１、３３、２７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ３、及び
配列番号４０、２２、３４、２８のいずれかに示される又は配列番号４０、２２、３４、２８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ１、配列番号４１、２３、３５、２９のいずれかに示される又は配列番号４１、２３、３５、２９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ２、配列番号４２、２４、３６、３０のいずれかに示される又は配列番号４２、２４、３６、３０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ３であるＣＤＲｓを含有する。

本開示の一部の実施形態は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片を開示し、前記抗体は、
配列番号３７、１９、３１、２５のいずれかに示される又は配列番号３７、１９、３１、２５のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ１、配列番号３８、２０、３２、２６のいずれかに示される又は配列番号３８、２０、３２、２６のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ２、配列番号３９、２１、３３、２７のいずれかに示される又は配列番号３９、２１、３３、２７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ３、及び
配列番号４０、２２、３４、２８のいずれかに示される又は配列番号４０、２２、３４、２８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ１、配列番号４１、２３、３５、２９のいずれかに示される又は配列番号４１、２３、３５、２９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ２、配列番号４２、２４、３６、３０のいずれかに示される又は配列番号４２、２４、３６、３０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ３であるＣＤＲｓを含有する。

一部の実施形態において、前記抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１７、５、１３、９のいずれかに示されており、又は配列番号１７、５、１３、９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、
一部の実施形態において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１８、６、１４、１０のいずれかに示されており、又は配列番号１８、６、１４、１０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列である。

８日目から腫瘍体積の測定を始め記録し、研究期間中、バーニヤで腫瘍の長径及び短径を週２回に測定した。（１／２）×長径×（短径）^２で腫瘍体積を計算した。マウスの体重が２０％減少し又は腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超える時には、慈悲殺の基準を満たし、ＣＯ_２窒息法でマウスを殺した。

Claims (10)

1. 配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示される又は配列番号１９、２５、３１、３７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ１、配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示される又は配列番号２０、２６、３２、３８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ２、配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示される又は配列番号２１、２７、３３、３９のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＨＣＤＲ３、及び
   配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示される又は配列番号２２、２８、３４、４０のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ１、配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示される又は配列番号２３、２９、３５、４１のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ２、配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示される又は配列番号２４、３０、３６、４２のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に表われるＬＣＤＲ３である相補性決定領域ＣＤＲｓを含有することを特徴とする抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片。
2. 前記抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５、９、１３、１７のいずれかに示されており又は配列番号５、９、１３、１７のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、
   前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６、１０、１４、１８のいずれかに示されており又は配列番号６、１０、１４、１８のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片。
3. 前記抗体は、定常領域を有し、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭから選ばれるいずれか１種であり、軽鎖定常領域は、κ鎖又はλ鎖であることを特徴とする請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片。
4. 前記抗体は、二重特異性抗体、ＣＤＲ移植抗体、多量体抗体のうちのいずれか１種又は複数種であり、前記抗原結合性断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ及びシングルドメイン抗体のうちのいずれか１種又は複数種であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片の配列をコードする核酸であって、
   好ましくは、前記抗体又はその抗原結合性断片の重鎖可変領域をコードする第１核酸、及び／又は、前記抗体又はその抗原結合性断片の軽鎖可変領域をコードする第２核酸を含むことを特徴とする核酸。
6. 前記第１核酸の塩基配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５のいずれかに示されており又は配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であり、
   前記第２核酸の塩基配列は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６のいずれかに示されており又は配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６のいずれかに示されるのと少なくとも９５％の同一性を有する配列であることを特徴とする請求項５に記載の核酸。
7. 請求項５又は６に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
8. 請求項５若しくは６に記載の核酸、又は請求項７に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
9. 請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項５若しくは６に記載の核酸、請求項７に記載のベクター又は請求項８に記載の細胞を含有することを特徴とする医薬組成物。
10. ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は病状を治療する医薬物の製造における、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項５若しくは６に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の細胞又は請求項９に記載の医薬組成物の使用。
    
    

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