CN107384933A - pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用 - Google Patents

pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107384933A
CN107384933A CN201710769914.8A CN201710769914A CN107384933A CN 107384933 A CN107384933 A CN 107384933A CN 201710769914 A CN201710769914 A CN 201710769914A CN 107384933 A CN107384933 A CN 107384933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
amino acid
nucleotide sequence
polyclonal antibody
acid polyclonal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710769914.8A
Other languages
English (en)
Inventor
常伟东
付爱根
霍艳爽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest University
Original Assignee
Northwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest University filed Critical Northwest University
Priority to CN201710769914.8A priority Critical patent/CN107384933A/zh
Publication of CN107384933A publication Critical patent/CN107384933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的核苷酸序列，以及采用该核苷酸序列制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的方法，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的制备方法简单，得到的多克隆抗体免疫反应效果好，可以很好的用于pD1蛋白的检测，具有很好的应用前景。

Description

pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的核苷酸序列、多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
生物圈的能量基本来自植物光合作用，对光合作用的研究可能是解决能源问题的一个途径，从而成为研究重点。植物光合作用涉及到大量重要的蛋白，而光合中心D1蛋白是接受太阳能转化光能的核心蛋白，因此成为研究热点。D1蛋白首先以前体形式合成，然后C端若干氨基酸被剪切掉成为成熟形式。现在一般采取判断蛋白大小的方法分辨D1蛋白是否成熟，而D1蛋白C端需要切掉的氨基酸一般为9个或16个，通过大小判断D1蛋白是否成熟是比较困难的，且实验证据不直接，所以有必要制备C端被剪切掉的若干氨基酸的抗体，通过免疫反应可以直接看到D1蛋白是否成熟。另外在光合生物中，pD1是一个比较保守的蛋白，所以该抗体的制备可能适用于大多数光合生物中pD1的检测。
pD1蛋白在生物体内的变化主要是通过分子大小判断，且未成熟形式和成熟形式之间只有9个或16个氨基酸大小的差别(模式植物拟南芥pD1蛋白C端有9个氨基酸必须被切除)，所以通过分子大小判断pD1蛋白不仅不是直接证据而且又比较困难。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是免疫反应效果好，检测pD1蛋白简单的多克隆抗体。
本发明的第一个目的是提供一种用于制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供采用上述核苷酸序列制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的方法，具体按照如下步骤实施：
S1：人工合成核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的目的基因；
S2：以内切酶BamHI和XhoI双酶切如SEQ ID No：1所示的目的基因，并回收90bp的目的基因片段，以内切酶BamHI和XhoI双酶切细菌表达载体pGEX4T.3，并回收4877bp的载体基因片段，将目的基因片段连接到载体基因片段上，并转化到大肠杆菌DH5α中，验证阳性菌落，并测序，回收正确的质粒；
S3：将所述正确的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中进行表达，获得重组蛋白抗原；
S4：将所述重组蛋白抗原在动物体内进行免疫，经血清分离纯化获得pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体。
优选地，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL-21。
更优选地，S3的具体步骤为：
S31：将所述正确的质粒转化到大肠杆菌BL-21中，利用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，获得GST融合目的蛋白，诱导条件为：24℃，10h，0.1mM IPTG；
S32：通过GE公司的GlutahioneSepharose 4B提纯所述融合蛋白，获得重组蛋白抗原。
本发明的第三个目的是提供一种上述方法制备得到的pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供该pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体在pD1蛋白检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的制备方法，方法简单，多克隆抗体的免疫反应效果好，可以很好的用于pD1蛋白的检测，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例得到的融合蛋白胶图；
图2为本发明实施例中以WT和mutant两种材料作为检验抗体，检测免疫后的血清中是否产生C端9个氨基酸短肽多克隆抗体的检测结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，所涉及试剂若无特殊说明均为市售。除非另有定义，下文中所用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种用于制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核苷酸序列基因包含pD1蛋白C端9个氨基酸的基因序列的三次重复，命名为pD1-C-3*27bp，其表示的是pD1蛋白基因C端9个氨基酸的基因重复了三次，每9个氨基酸27bp碱基。
基于同一种发明构思，本发明还提供了采用上述核苷酸序列制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的方法，按照如下步骤实施：
S1：通过生物公司人工合成核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的目的基因；
该目的基因的核苷酸序列片段如下：
ACAGTGGATCCGCTGTTGAGGCTCCATCTACAAATGGAGCTGTTGAGGCTCCATCTACAAATGGAGCTGTTGAGGCTCCATCTACAAATGGATAACTCGAGTGACA，其中前端下划线碱基部分为BamHI酶切位点，后端下划线碱基部分为XhoI酶切位点，黑体字母碱基部分(TAA)为终止密码子，斜体字母碱基部分为保护碱基。也就是说，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段包括BamHI、XhoI的酶切位点。
S2：提供细菌表达载体pGEX4T.3，细菌表达载体pGEX4T.3上多克隆位点信息如下式1所示：
用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切目的基因pD1-C-3*27bp(根据TAKARA公司生产的BamHI和XhoI限制性内切酶的特性使用)，用TIANGEN公司生产的胶回收试剂盒回收上述酶切产生的目的基因片段；
同时，用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切细菌表达载体pGEX4T.3，用TIANGEN公司生产的胶回收试剂盒回收上述酶切产生的载体基因片段，将上述回收的目的基因片段用TAKARA公司生产的T4ligase连接酶连接到回收的载体基因片段上，并转化到大肠杆菌DH5α中，验证阳性菌落，并测序鉴定是否构建成功，用TIANGEN公司生产的质粒小提试剂盒纯化回收正确的质粒；
需要说明的是，上述大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL-21均购自TAKARA公司，上述细菌表达载体pGEX4T.3购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
S3：将上述正确的质粒转化到BL-21大肠杆菌感受态细胞中，利用IPTG诱导大肠杆菌表达GST融合目的蛋白(标记为GST-pD1-C`-3*9aa)，诱导条件为：24℃，10h，0.1mM IPTG；通过GE公司的GlutahioneSepharose 4B提纯该融合蛋白，获得重组蛋白抗原。该步骤提纯的融合蛋白胶图如图1所示，由图1可以看出，在该诱导条件下可以产生纯度高且浓度高的融合蛋白抗原。
S4：将上述提纯的重组蛋白抗原注射到兔子体内进行免疫，并分离血清，得到pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体血清。
进一步地，我们以WT和mutant作为抗体检验的两种材料，检测上述免疫后的血清是否产生C端9个氨基酸的多克隆抗体。其中，WT为野生拟南芥，只有不含C端短肽的pD1蛋白；mutant为AtCtpA蛋白突变体拟南芥，只有含C端短肽的pD1蛋白。检测结果如图2所示，由图2可以看出，上述方法制备的C端9个氨基酸多克隆抗体可以与pD1蛋白产生免疫反应。
由此可见，上述pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体可以应用在pD1蛋白检测中，适用于大多数光合生物中pD1的检测。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西北大学
<120> pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用
<141> 2017-08-03
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagtggatc cgctgttgag gctccatcta caaatggagc tgttgaggct ccatctacaa 60
atggagctgt tgaggctcca tctacaaatg gataactcga gtgaca 106

Claims (6)

1.一种用于制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.采用权利要求1所述核苷酸序列制备pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体的方法，其特征在于，按照如下步骤实施：
S1：人工合成核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的目的基因；
S2：以内切酶BamHI和XhoI双酶切如SEQ ID No：1所示的目的基因，并回收90bp的目的基因片段，以内切酶BamHI和XhoI双酶切细菌表达载体pGEX4T.3，并回收4877bp的载体基因片段，将目的基因片段连接到载体基因片段上，并转化到大肠杆菌DH5α中，验证阳性菌落，并测序，回收正确的质粒；
S3：将所述正确的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中进行表达，获得重组蛋白抗原；
S4：将所述重组蛋白抗原在动物体内进行免疫，经血清分离纯化获得pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL-21。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S3的具体步骤为：
S31：将所述正确的质粒转化到大肠杆菌BL-21中，利用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，获得GST融合目的蛋白，诱导条件为：24℃，10h，0.1mM IPTG；
S32：通过GE公司的GlutahioneSepharose 4B提纯所述融合蛋白，获得重组蛋白抗原。
5.利用权利要求2-4中任一项方法制备的pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体。
6.权利要求5所述的pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体在pD1蛋白检测中的应用。
CN201710769914.8A 2017-08-31 2017-08-31 pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用 Pending CN107384933A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710769914.8A CN107384933A (zh) 2017-08-31 2017-08-31 pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710769914.8A CN107384933A (zh) 2017-08-31 2017-08-31 pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107384933A true CN107384933A (zh) 2017-11-24

Family

ID=60347801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710769914.8A Pending CN107384933A (zh) 2017-08-31 2017-08-31 pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107384933A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020201442A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Orega Biotech Combination therapies based on pd1 and il-17b inhibitors
WO2021170750A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Orega Biotech Combination therapies based on ctla4 and il-17b inhibitors
WO2022135457A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 广东菲鹏制药股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其应用
EP4257609A1 (en) 2022-04-08 2023-10-11 iOmx Therapeutics AG Combination therapies based on pd-1 inhibitors and sik3 inhibitors

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020201442A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Orega Biotech Combination therapies based on pd1 and il-17b inhibitors
WO2021170750A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Orega Biotech Combination therapies based on ctla4 and il-17b inhibitors
WO2022135457A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 广东菲鹏制药股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其应用
EP4257609A1 (en) 2022-04-08 2023-10-11 iOmx Therapeutics AG Combination therapies based on pd-1 inhibitors and sik3 inhibitors
WO2023194622A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Iomx Therapeutics Ag Combination therapies based on pd-1 inhibitors and sik3 inhibitors

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107384933A (zh) pD1蛋白C端9个氨基酸多克隆抗体、核苷酸序列、制备方法及应用
WO2020078321A1 (zh) 一种用于表达Bt杀虫蛋白的高效蛋白质表达系统
CN110746499A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法
CN111500504B (zh) 一种泛性型惰性载体沙门氏菌及其潜在应用
CN116333957A (zh) 一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN108796040A (zh) 一种基于转录激活子样效应因子的生物发光检测探针及其构建方法及应用
CN106543272A (zh) 多功能标签融合蛋白及其表达方法和应用
CN105874058A (zh) 多肽组合物及使用其的多能干细胞的培养方法
CN104610443B (zh) 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途
WO2021232800A1 (zh) 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用
CN105255931A (zh) 一种基于细菌表面展示系统的病毒受体捕获体系
CN106834252B (zh) 一种高稳定型MazF突变体及其应用
CN102618557B (zh) 一种重组禽黄病毒e蛋白及其应用
CN106834324B (zh) 一种能促进蛋白可溶性表达及提高表达量的重组表达载体
CN102382194B (zh) 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用
CN110484516A (zh) 一种用crispr系统将量子点标记至病毒核酸的方法和应用
CN108802357A (zh) 一种用于免疫印迹分析的生物发光探针及其应用
CN117843768A (zh) 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用
CN104560911B (zh) 一种融合抗原蛋白质
CN107142273A (zh) 一种利用磁感应蛋白作为纯化标签实现外源蛋白一步纯化与固定化的方法，应用及通用载体
CN105296478A (zh) 一种多标签抗原及其制备方法和应用
CN108359686A (zh) 融合标签NusA在大肠杆菌表达PLCG2蛋白中的应用
CN114317504B (zh) 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
CN114292321B (zh) 可溶性表达eg95蛋白及其制备方法和应用
CN109843908A (zh) 脂蛋白输出信号及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171124

RJ01 Rejection of invention patent application after publication