CN114317504B - 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲎因子C截短蛋白及其制备方法和应用，所述鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少90％以上同源性的氨基酸序列。本发明的鲎因子C截短蛋白性质稳定，同时表达量高、纯度高、活性高，能够有效地避免葡聚糖产生假阳性的可能性；该鲎因子C截短蛋白能够作为一种新型的内毒素检测试剂的原料，代替传统的鲎试剂，既解决了鲎数量急剧减少的问题，又能避免传统的鲎试剂因原材料引起的批次不稳定性的缺点。

Description

一种鲎因子C截短蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种鲎因子C截短蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鲎试剂(Tachypiens Amebocyte Lysate，TAL)是国际上至今位置检测内毒素的金标准，具有简单、快速、灵敏度高等特点。被广泛应用于检测注射剂与植入性医疗器械中污染的革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以及临床使用的透析液和血液中的细菌内毒素含量。但鲎试剂是由美洲鲎(Limulus polyphemus)或东方鲎(Tachypleus tridentatus)的血液变形细胞溶解物提取而成，随着生物药制品，医药如：注射用药剂、化学药品类、放射性药品类、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器械(如一次性注射器，植入性生物材料)等生产单位迅速增长，定量内毒素检测试剂的需求越来越大，使得海洋中鲎的数量逐渐减少，造成鲎试剂原料供应紧张的问题。

鲎试剂主要成分包括C因子(Factor C，FC)、B因子(FactorB，FB)、凝固酶原(Proclotting enzyme)、凝固蛋白原(或显色基质)以及二价阳离子、缓冲盐等。其酶的级联反应的基本原理已被广泛研究，其一条凝集反应途径为：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(clottingenzyme)，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶。其中，C因子(FC)是鲎提取物中的一种丝氨酸蛋白酶，对内毒素高度亲和，内毒素通过激活C因子，进一步促进鲎试剂的凝集反应。重组C因子法与传统鲎试剂方法最大的区别在于重组C因子法只使用1个单一的蛋白(重组C因子)作为其有效活性成分。在反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量测定荧光复合物来量化细菌内毒素，从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性。

在昆虫细胞中成功表达有活性的C因子蛋白的专家推断出“在昆虫细胞中的表达，而不是在原核或简单的真核表达系统中的表达，适于制备具有完全生物活性的C因子。此外，鲎和昆虫属于相同的门(节肢动物门)，因而在它们的生理和生化上，昆虫细胞比酵母细胞更近似于鲎的细胞。因此，在昆虫细胞中制备的C因子可能更近似于从鲎中纯化的蛋白，并且保留了具有被LPS激活的丝氨酸蛋白酶活性的生物活性”。从上述专家的评估和经历多年的在各种宿主系统中的重组表达所获得的结果可见，昆虫宿主细胞中的杆状病毒表达系统被认为是重组制备有活性的C因子蛋白的金标准。尽管杆状病毒表达重组蛋白具有快速、大量以及低成本等优点，但是昆虫宿主细胞的表达量及工业化生产和应用是不可逾越的瓶颈。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的缺陷，提供一种鲎因子C截短蛋白及其构建方法和制备方法，该重组C因子蛋白片段包含His标签、性质稳定，同时表达量高、纯度高、活性高，能够有效地避免葡聚糖产生假阳性的可能性，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不稳定的缺点，可作为新型检测内毒素检测试剂。

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种鲎因子C截短蛋白，所述鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少90％以上同源性的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种编码如第一方面所述的鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列具有至少90％以上同源性的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，包括如第一方面所述的鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列。

进一步地，所述表达载体为质粒pET-21a，所述表达载体带有组氨酸标签。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，包括如第三方面所述的表达载体，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明第五方面提供了一种包括第一方面所述的鲎因子C截短蛋白的宿主细胞的构建方法，包括：

以pET30a-rFC作为模板，与引物进行PCR扩增，获得目标片段，所述目标片段中包括鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列，所述目标片段的两端分别含有酶切位点；

将所述目标片段与载体连接，获得表达载体，所述载体带有组氨酸标签；

将所述表达载体转入宿主细胞中，筛选获得鲎因子C截短蛋白的宿主细胞。

进一步地，所述酶切位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。

本发明第六方面提供了一种鲎因子C截短蛋白的提取方法，包括：

构建如第五方面所述的宿主细胞，并对所述宿主细胞进行培养；

收集培养后的宿主细胞，进行裂解、离心，得到上清液；

对上清液进行纯化，得到所述鲎因子C截短蛋白。

进一步地，所述对上清液进行纯化，包括：

将所述上清液和Ni层析介质加入Ni亲和柱，采用咪唑溶液洗脱，收集Ni亲和洗脱液；

将Ni洗脱液加入Buffer平衡柱进行洗脱，收集目标洗脱液；

对所述目标洗脱液依次进行电泳和考马斯亮蓝染色，筛选得到所述鲎因子C截短蛋白。

本发明第七方面提供了一种如第一方面所述的鲎因子C截短蛋白、如第三方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞在检测内毒素中的应用。

本发明所述的鲎因子C截短蛋白，选择原核细胞大肠杆菌作为宿主，能够在原核细胞大肠杆菌中高效表达，该鲎因子C截短蛋白包含组氨酸标签，有利于对鲎因子C截短蛋白进行亲和层析纯化，该鲎因子C截短蛋白性质稳定，同时表达量高、纯度高、活性高，能够有效地避免葡聚糖产生假阳性地可能性；该鲎因子C截短蛋白能够作为一种新型的内毒素检测试剂的原料，代替传统的鲎试剂，既解决了鲎数量急剧减少的问题，又能避免传统的鲎试剂因原材料引起的批次不稳定性的缺点；本发明提供的鲎因子C截短蛋白的提取方法简单，生产成本低，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例提供的9段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列从模板进行PCR扩增后各个片段的核苷酸电泳图；

图2为本发明实施例提供的PET-21a载体图谱；

图3为本发明实施例中PET-21a载体中不同鲎因子C截短蛋白的电泳图；

图4为本发明实施例提供的pCOLD-TF载体图谱；

图5为本发明实施例中pCOLD-TF载体中不同鲎因子C截短蛋白的电泳图；

图6为本发明实施例5中目标洗脱液的电泳图；

图7为本发明实施例中rFC-171-301核苷酸序列在20℃至25℃诱导12h至16h后的电泳图；

图8为本发明实施例中rFC-142-322核苷酸序列在20℃至25℃诱导12h至16h后的电泳图；

图9为本发明实施例中rFC-142-319核苷酸序列在20℃至25℃诱导12h至16h后的电泳图；

图10为本发明实施例中rFC-171-301核苷酸序列在16℃诱导过夜后的电泳图；

图11为本发明实施例中rFC-142-322核苷酸序列在16℃诱导过夜后的电泳图；

图12为本发明实施例中rFC-142-319核苷酸序列在16℃诱导过夜后的电泳图；

图13为本发明实施例中内毒素与不同浓度的rFC-142-322蛋白结合的曲线图；

图14为本发明实施例中rFC-142-322蛋白与不同浓度的内毒素结合的曲线图；

图15为本发明实施例中内毒素抑制显色曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

另外，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。

此外，本发明虽然对制备中的各步骤进行了如步骤1、步骤2、步骤3等形式的描述，但此描述方式仅为了便于理解，如步骤1、步骤2、步骤3等形式并不表示对各步骤先后顺序的限定。

对于本发明所述的序列的同源性解释如下：本领域技术人员可通过蛋白序列相似度比对得到蛋白相似度信息，以及分析同源蛋白在进化过程中的序列保守型，预测可能存在的蛋白结构域。序列同源性检测可以通过检测过高的相似度来识别同源蛋白质或基因：当两个序列的相似度超过偶然的预期时，我们推断这两个序列存在同源性。本发明的同源性计算公式为相同氨基酸个数与全场序列的氨基酸总数的百分比或相同碱基个数与全场序列的碱基总数的百分比。

本发明中，可以对SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行化学修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但只要能够保证获得的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少90％以上同源性的氨基酸序列即可；也可以对SEQ ID NO.3所示核苷酸序列进行化学修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，但只要能够保证获得的核苷酸序列与SEQ IDNO.3所示核苷酸序列具有至少90％以上同源性的核苷酸序列即可。

本发明的实施例中先通过PCR扩增获得目标片段rFC，再分别用含有两种不同标签的表达载体与目标片段rFC连接，对目标片段rFC的N末端进行保护性修饰，获得两种不同的重组表达载体，其中一种重组表达载体带有组氨酸标签(6×His-tag)，另一种重组表达载体带有组氨酸标签和TF标签，对两组重组表达载体进行筛选，获得候选的表达载体，该候选的表达载体中含有如SEQ ID NO.2所示的鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列(即鲎因子C截短蛋白选定位点对应于目标片段rFC第142和第322之间的位置)，所筛选得到的候选表达载体包括两种，即N末端带有组氨酸标签的候选表达载体，以及N末端带有组氨酸标签和TF标签的候选表达载体，虽然TF标签的携带能够促进蛋白的量增加，但TF标签过大，可能造成蛋白结构的变形，也为蛋白带来较大的空间位阻，更不易与内毒素进行结合，而仅有组氨酸标签对Sushi(包括Sushi1、Sushi2和Sushi3)的结构影响较小。因此，最终选定质粒pET21a，且N末端仅带有组氨酸标签(6×His-tag)的候选表达载体作为最终的目标表达载体，并将该目标表达载体转入宿主细胞中，获得鲎因子C截短蛋白的宿主细胞，其中，宿主细胞为大肠杆菌细胞，Rosetta(DE3)大肠杆菌或BL21(DE3)大肠杆菌。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式进行详细说明。在不冲突的情况下，下述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

实施例1重组pET21a载体的构建

步骤1、以pET30a-rFC作为模板，使用上下游引物进行PCR，经过多轮PCR和通过电泳之后，进行胶回收，获得目标片段rFC，在该目标片段rFC的5'端引入了NdeI酶切位点，在该目标片段rFC的3'端引入了XhoI酶切位点，其中，目标片段rFC的基因序列如SEQ ID NO.1所示，NdeI酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

步骤2、将N末端带有组氨酸标签(6×His-tag)的载体pET-21a与目标片段rFC使用Nde I和Xho I两个限制性内切酶在37℃酶切30min，经过电泳后，进行胶回收，得到线性化的载体和酶切后的多个片段。利用T4 DNA连接酶(Thermo)将酶切后的多个片段分别与线性化的载体在22℃下孵育1h，随后通过42℃热处理90s转化到感受态细胞Trans5α中，经37℃培养复苏1h然后涂布到LB平板(分别含有氨苄青霉素与庆大霉素)上进行筛选，37℃过夜培养。第二天挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，将筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒，最后进行基因测序鉴定，获得pET-21a重组载体；

步骤3、该pET-21a重组载体中包括如表1所示的9段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列，将9个pET-21a重组载体转入Rosetta(DE3)大肠杆菌中，在37℃表达3h，通过SDS-PAGE对比鉴定表达量，表达情况如表1和图3所示。

表1

由表1和图3可以看出，9段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列中有3段核苷酸序列可以表达，且2段核苷酸序列有大量表达，其余皆无明显表达。

实施例2重组pCOld-TF载体的构建

步骤1、以pET30a-rFC作为模板，使用上下游引物进行PCR，经过多轮PCR和通过电泳之后，进行胶回收，获得目标片段rFC，在该目标片段rFC的5'端引入了NdeI酶切位点，在该目标片段rFC的3'端引入了XhoI酶切位点，其中，目标片段rFC的基因序列如SEQ ID NO.1所示，NdeI酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

步骤2、将N末端带有组氨酸标签(6×His-tag)和TF标签的载体pCOld-TF与目标片段rFC使用Nde I和Xho I两个限制性内切酶在37℃酶切30min，经过电泳后，进行胶回收，得到线性化的载体和酶切后的多个片段。利用T4 DNA连接酶(Thermo)将酶切后的多个片段分别与线性化的载体在22℃下孵育1h，随后通过42℃热处理90s转化到感受态细胞Trans5α中，经37℃培养复苏1h然后涂布到LB平板(分别含有氨苄青霉素与庆大霉素)上进行筛选，37℃过夜培养。第二天挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，将筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒，最后进行基因测序鉴定，获得pCOld-TF重组载体，该pCOld-TF重组载体中包括如表2所示的6段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列，也即，rFC-171-301、rFC-142-322、rFC-106-301、rFC-106-322、rFC-1-301、rFC-1-322这6段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列。

实施例3筛选表达载体

将实施例2中获得的6段不同的编码鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列，也即，rFC-171-301、rFC-142-322、rFC-106-301、rFC-106-322、rFC-1-301、rFC-1-322的核苷酸序列分别克隆到pET-21a重组载体和pCOld-TF重组载体中，并进行基因测序鉴定，将测序成功的pET-21a重组载体和pCOld-TF重组载体通过42℃热处理45s转化到感受态细胞shuffle中，放大培养阳性克隆的菌落，分别提取纯化鲎因子C截短蛋白，鉴定两种重组载体中纯化鲎因子C截短蛋白的表达量，表达情况如表2所示，对pCOld-TF重组载体中的几种截短蛋白通过SDS-PAGE对比鉴定表达量，得到图5所示的结果，其中，C代表细菌裂解液；S代表细菌裂解液离心后上清；P代表细菌裂解液离心后沉淀；PM代表蛋白标准marker；1至6依次代表表2中序号为1至6的核苷酸序列所对应的截短蛋白，即1C代表rFC-171-301蛋白细菌裂解液；1S代表rFC-171-301蛋白细菌裂解液离心后上清；1P代表rFC-171-301蛋白细菌裂解液离心后沉淀，剩下的5组依次类推。

表2

由表2和图5可以看出，仅有rFC-142-322的核苷酸序列在pET-21a重组载体和pCOld-TF重组载体中均有表达，虽然rFC-142-319的核苷酸序列在pET-21a重组载体中有表达，但其表达量较差，且rFC-142-319的核苷酸序列和rFC-142-322的核苷酸序列有较高的重叠，因此，鲎因子C截短蛋白选定位点对应于目标片段rFC第142和第322之间的位置，鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例4蛋白稳定性验证

采用如下方法检测鲎因子C截短蛋白的内毒素保存活性随时间变化的关系：

步骤1、取10EU/mL内毒素标准品100ul包被到96孔ELISA板，另取低内毒素的BSA作为阴性对照，4℃过夜或者37℃放置两小时，其中，低内毒素的BSA为从sigma公司购置的不超过2EU/mL的BSA溶液，将其稀释后使用；

步骤2、将低内毒素试剂BSA封闭1h；

步骤3、洗板后取6种纯化所得的rFC蛋白(也即rFC-171-301、rFC-142-322、rFC-106-301、rFC-106-322、rFC-1-301和rFC-1-322对应的蛋白)，分别稀释为10uM，加入100ul到对应孔中，37℃孵育30min；

步骤4、洗板后对应加入100ul抗体作为一抗，用于识别rFC蛋白，37℃孵育30min；

步骤5、洗板后对应加入100ul二抗，37℃孵育30min；

步骤6、洗板后加入100ul显色液，37℃孵育15min；

步骤7、加入50ul稀硫酸(2M)终止反应，在酶标仪上测定450nm处吸光度。以吸光度代表活性强度，将各蛋白在2℃至8℃下保存，分别在0天(0d)、7天(7d)、14天(14d)和30天(30d)测定，得到如表3所示的结果。

表3

由表3可以看出，含有TF标签的pCOld-TF重组载体融合rFC基因(rFC-171-301、rFC-142-322、rFC-106-301、rFC-106-322、rFC-1-301、rFC-1-322)，导入大肠杆菌后进行表达，所得蛋白表达量虽然更多，但是活性相对而言，远远不如仅带有组氨酸标签(6×His-tag)的蛋白(rFC1)。TF标签的携带可以促进蛋白的量增加，但是TF标签过大，可能造成蛋白结构的变形，也为蛋白带来较大的空间位阻，更不易与内毒素进行结合，而pET-21a质粒翻译表达出来的rFC末端仅有组氨酸标签(6×His-tag)，对Sushi(包括Sushi1、Sushi2和Sushi3)的结构影响较小。因此，最终选定质粒pET-21a为表达载体，该表达载体带有组氨酸标签(6×His-tag)，组氨酸标签的引入便于后续使用His与NTA(氨三乙酸)结合原理进行亲和层析纯化重组蛋白。

以内毒素(LPS)作为抗原固定到96孔ELISA板，将纯化所得的rFC-142-322蛋白作为抗体去结合ELISA板上的内毒素，并通过酶标抗体结合与底物显色，验证rFC-142-322蛋白的特异性结合。

将内毒素的浓度固定不变，改变rFC-142-322蛋白的浓度，并以未添加内毒素的孔作为对照组，得到如图13所示的结果，由图13可以看出，当内毒素的浓度固定不变时，随着rFC-142-322蛋白浓度不断提高，底物相应的信号也不断增强，说明rFC-142-322蛋白与酶标板上的内毒素物质结合，且对照组未固定内毒素的孔内没有出现显色反应，说明rFC-142-322蛋白与内毒素结合。

将rFC-142-322的浓度固定不变，改变内毒素的浓度，且内毒素的浓度呈梯度提高，得到如图14所示的结果，由图14可以看出，随着内毒素的浓度呈梯度提高，底物响应的信号随着内毒素的固定量不断增加，当内毒素的量达到0.5EU/ml至0.6EU/ml时，信号强度达到顶点，随后信号强度逐渐下降，说明内毒素的最佳固定浓度为0.5EU/ml至0.6EU/ml之间，后续内毒素浓度提高，但信号强度下降的原因可能是平板表面空间位阻影响结合能力。

对照组中将内毒素的浓度固定不变，改变rFC-142-322蛋白的浓度；实验组中先让5EU/mL内毒素与rFC-142-322蛋白反应，得到反应后的内毒素，在将反应后的内毒素加入ELISA板的孔内，改变加入每个孔中的rFC-142-322蛋白的浓度，得到如图15所示的结果，由图15可以看出，对照组中固定相同浓度的内毒素，随着rFC-142-322蛋白的浓度提高，底物响应的信号也不断增强，当rFC-142-322蛋白的浓度达到200ng至300ng时，信号强度达到顶点；实验组中由于让5EU/mL的内毒素与rFC-142-322蛋白先反应，然后再加入到孔中，已与内毒素结合的rFC-142-322蛋白受到抑制，几乎不再结合板上的内毒素，说明内毒素与rFC-142-322蛋白为特异性结合。

由以上结果也可以说明，纯化所得的rFC-142-322蛋白为具有内毒素或脂多糖结合能力的蛋白，说明该rFC-142-322蛋白能够作为新型检测内毒素检测试剂的原料。

实施例5鲎因子C截短蛋白的提取方法

步骤1、以N末端带有组氨酸标签(6×His-tag)的pET-21a质粒为表达载体，该表达载体中含有鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列(对应于目标片段rFC第142和第322之间的位置)，将该表达载体转入Rosetta(DE3)大肠杆菌，获得含有鲎因子C截短蛋白的大肠杆菌，在适宜的条件下，培养大肠杆菌；

步骤2、收集培养后的大肠杆菌，用Tris缓冲液将菌体重悬，然后使用超声(功率600w，35％至40％)将菌体破碎，释放出菌体内的可溶性蛋白，至溶液澄清，在11000rpm、4℃下离心15min，获得上清液；

步骤3、使用重力流空柱(Biorad，Econo-Pac)配合Ni亲和层析柱材进行纯化，将上清液和Ni层析介质加入Ni亲和柱中，采用咪唑溶液洗脱，利用Ni亲和柱中的填料硫酸镍和组氨酸融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑溶液的竞争性结合到Ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来，收集Ni亲和洗脱液；

步骤4、用水冲洗Ni亲和柱，将柱子中的乙醇冲洗掉，然后用结合Buffer平衡柱，用咪唑溶液进行梯度洗杂X(X分别为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L和50mmol/L)、咪唑溶液进行梯度洗脱Y(Y分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L)，洗杂洗脱时用考马斯亮蓝G250检测液检测滴落液滴，直到检测液不变蓝，停止洗脱，收集目标洗脱液；

步骤5、将收集的目标洗脱液通过SGS-PAGE分管进行电泳，并进行考马斯亮蓝染色，得到染色结果，观察染色结果对应分子量位置的条带，选取表达量高、杂蛋白少的洗脱液，使用10kD的超滤管超滤或者过分子筛柱除去咪唑溶液，更换为10mmol/L硼酸盐缓冲液(pH为8.0)储存体系，于-80℃下保存鲎因子C截短蛋白。

通过SGS-PAGE分管进行电泳的结果如图6所示，其中，S代表裂解液离心后上清；P代表裂解液离心后沉淀；AW代表洗杂后柱材；E1代表100mmol/L咪唑洗脱；AE1代表100mmol/L咪唑洗脱后柱材；E1代表200mmol/L咪唑洗脱；AE2代表200mmol/L咪唑洗脱后柱材；E3代表300mmol/L咪唑洗脱；AE3代表300mmol/L咪唑洗脱后柱材；PM代表蛋白标准品。

在提取鲎因子C截短蛋白的过程中各个阶段使用的缓冲液的具体组成如表4所示。

表4

实施例6蛋白表达温度的选定

以N末端带有组氨酸标签(6×His-tag)的pET-21a质粒为表达载体，该表达载体中含有鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列(对应于目标片段rFC第142和第322之间的位置)，将该表达载体转入BL21(DE3)大肠杆菌后，从平板挑取菌落摇菌，37℃培养至OD600为0.8至1.0，然后分别加入0.5mmol/L IPTG诱导，诱导时采用3种条件：1)37℃诱导3h(诱导表达结果图见图3)；2)20℃至25℃诱导12h至16h(诱导表达结果图见图7至图9)；3)16℃诱导过夜(诱导表达结果图见图10至图12)。

诱导表达结果见图7至图12，其中，图7至图9三组为20℃至25℃诱导12h至16h表达，图10至图12为16℃诱导过夜。其中图7和图10为rFC-171-301；图8和图11为rFC-142-322；图9和图12为rFC-142-319(均转入BL21(DE3)中表达)。图7至图12中的CE代表破碎后的全细胞样品，HS代表高离上清样品；HP代表高离沉淀样品；FL代表过亲和层析柱后的高离上清样品；N1代表挂过蛋白的的Ni柱柱材；W代表洗杂蛋白后的缓冲液样品；10N代表含10mmol/L咪唑洗杂蛋白后的柱材；20N代表含20mmol/L咪唑洗杂蛋白后的柱材；30N代表含30mmol/L咪唑洗杂蛋白后的柱材；40N代表含40mmol/L咪唑洗杂蛋白后的柱材；E代表洗脱下来的蛋白溶液；N2代表洗脱目的蛋白后的柱材；PM代表Protein Maker。

由图3、图7至图12可以看出，37℃诱导下，蛋白表达量较小，仅可用于初步试表达，当产量需要提高时，需要降低温度延长时间。降低温度到20℃至25℃诱导12h至16h，rFC-171-301蛋白全在包涵体中，未能在柱材上富集，rFC-142-322蛋白能在柱材上大量富集，rFC-142-319蛋白只能在柱材上少量富集。温度降至16℃过夜诱导表达，蛋白的表达量明显提高，但是rFC-171-301蛋白仍然主要为包涵体，难以在柱材上富集，rFC-142-322蛋白的纯度相比rFC-142-319蛋白更高，另外rFC-142-322蛋白要多3个氨基酸，结构完整性更好。经过温度的筛选，rFC蛋白更适合在16℃低温下诱导表达，rFC-142-322蛋白为所有可溶表达选项中最优的选择。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 健帆生物科技集团股份有限公司

<120> 一种鲎因子C截短蛋白及其制备方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3066

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatcca tggtgctggc gagcttcctg gttagcggtc tggttctggg cctgctggct 60

cagaagatgc gtccggtgca gagcaaaggt gttgatctgg gcctgtgcga cgagacccgt 120

ttcgaatgca agtgcggtga cccgggctac gtgttcaaca tcccggttaa acagtgcacc 180

tacttctacc gttggcgtcc gtactgcaag ccgtgcgacg atctggaggc gaaagatatc 240

tgcccgaagt acaaacgttg ccaggaatgc aaggctggtc tggacagctg cgtgacctgc 300

ccgccgaaca agtacggcac ctggtgcagc ggtgaatgcc agtgcaaaaa cggtggcatc 360

tgcgatcaac gtaccggtgc ttgcgcttgc cgtgaccgtt acgagggtgt tcactgcgaa 420

atcctgaaag gttgcccgct gctgccgagc gacagccagg tgcaggaagt tcgtaacccg 480

ccggataacc cgcagaccat cgactacagc tgtagcccgg gtttcaagct gaaaggcatg 540

gcgcgtatca gctgcctgcc gaacggccag tggagcaact tcccgccgaa gtgcatccgt 600

gagtgcgcta tggtgagcag cccggaacac ggcaaagtta acgcgctgag cggtgatatg 660

atcgagggcg ctaccctgcg tttcagctgc gacagcccgt actacctgat cggtcaggaa 720

accctgacct gccagggtaa cggccagtgg aacggccaga tcccgcagtg caagaacctg 780

gtgttctgcc cggatctgga cccggttaac cacgcggagc acaaggtgaa aatcggtgtt 840

gaacagaaat acggccagtt cccgcagggc accgaggtga cctacacctg tagcggtaac 900

tacttcctga tgggcttcga taccctgaag tgcaacccgg atggtagctg gagcggcagc 960

cagccgagct gcgtgaaggt tgcggatcgt gaggtggatt gcgacagcaa agctgttgac 1020

ttcctggacg atgtgggtga accggttcgt atccactgcc cggcgggttg cagcctgacc 1080

gcgggcaccg tgtggggcac cgctatctac cacgaactga gcagcgtttg ccgtgcggct 1140

atccacgctg gcaagctgcc gaacagcggt ggcgctgtgc acgtggttaa caacggcccg 1200

tacagcgatt tcctgggtag cgacctgaac ggcatcaaga gcgaggaact gaaaagcctg 1260

gcgcgtagct tccgtttcga ctacgtgcgt agcagcaccg ctggtaaaag cggttgcccg 1320

gatggttggt tcgaggttga cgaaaactgc gtgtacgtta ccagcaaaca acgtgcttgg 1380

gagcgtgctc agggcgtgtg caccaacatg gcggctcgtc tggcggtgct ggataaggac 1440

gttatcccga acagcctgac cgaaaccctg cgtggtaaag gcctgaccac cacctggatc 1500

ggtctgcacc gtctggacgc ggagaagccg ttcatctggg aactgatgga tcgtagcaac 1560

gtggttctga acgacaacct gaccttctgg gctagcggcg agccgggcaa cgaaaccaac 1620

tgcgtgtaca tggatatcca ggaccagctg caaagcgtgt ggaagaccaa aagctgcttc 1680

cagccgagca gcttcgcgtg catgatggat ctgagcgacc gtaacaaggc taaatgcgac 1740

gatccgggta gcctggagaa cggtcacgct accctgcacg gtcagagcat cgacggtttc 1800

tacgctggca gcagcatccg ttacagctgc gaggtgctgc actacctgag cggcaccgaa 1860

accgttacct gcaccaccaa cggcacctgg agcgctccga agccgcgttg catcaaagtg 1920

atcacctgcc agaacccgcc ggtgccgagc tacggtagcg ttgagatcaa gccgccgagc 1980

cgtaccaaca gcatcagccg tgttggcagc ccgttcctgc gtctgccgcg tctgccgctg 2040

ccgctggctc gtgcggctaa gccgccgccg aaaccgcgta gcagccagcc gagcaccgtg 2100

gacctggcta gcaaggttaa actgccggaa ggtcactacc gtgtgggcag ccgtgctatc 2160

tacacctgcg agagccgtta ctacgaactg ctgggtagcc agggccgtcg ttgcgatagc 2220

aacggtaact ggagcggccg tccggctagc tgcatcccgg tttgcggtcg tagcgacagc 2280

ccgcgtagcc cgttcatctg gaacggtaac agcaccgaga tcggccagtg gccgtggcaa 2340

gctggtatca gccgttggct ggctgatcac aacatgtggt tcctgcaatg cggtggcagc 2400

ctgctgaacg agaagtggat cgtgaccgcg gctcactgcg ttacctacag cgcgaccgct 2460

gaaatcatcg acccgaacca gttcaagatg tacctgggta aatactaccg tgacgatagc 2520

cgtgacgatg actacgtgca ggttcgtgag gcgctggaaa tccacgtgaa cccgaactac 2580

gatccgggca acctgaactt cgacatcgct ctgatccagc tgaagacccc ggtgaccctg 2640

accacccgtg ttcagccgat ctgcctgccg accgatatca ccacccgtga gcacctgaag 2700

gaaggcaccc tggctgtggt taccggttgg ggcctgaacg agaacaacac ctacagcgaa 2760

accatccaac aagctgtgct gccggtggtt gctgctagca cctgcgagga aggttacaag 2820

gaagcggacc tgccgctgac cgttaccgaa aacatgttct gcgcgggtta caagaaaggc 2880

cgttacgatg cttgcagcgg tgacagcggt ggcccgctgg tgttcgcgga tgacagccgt 2940

accgagcgtc gttgggtgct ggaaggtatc gttagctggg gcagcccgag cggttgcggc 3000

aaggctaacc agtacggtgg cttcaccaaa gtgaacgttt tcctgagctg gattcgtcag 3060

ttcatc 3066

<210> 2

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Lys Gly Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu Val

1 5 10 15

Arg Asn Pro Pro Asp Asn Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Pro

20 25 30

Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly

35 40 45

Gln Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val

50 55 60

Ser Ser Pro Glu His Gly Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met Ile

65 70 75 80

Glu Gly Ala Thr Leu Arg Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu Ile

85 90 95

Gly Gln Glu Thr Leu Thr Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly Gln

100 105 110

Ile Pro Gln Cys Lys Asn Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro Val

115 120 125

Asn His Ala Glu His Lys Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr Gly

130 135 140

Gln Phe Pro Gln Gly Thr Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn Tyr

145 150 155 160

Phe Leu Met Gly Phe Asp Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser Trp

165 170 175

Ser Gly Ser Gln Pro

180

<210> 3

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgaaaggtt gcccgctgct gccgagcgac agccaggtgc aggaagttcg taacccgccg 60

gataacccgc agaccatcga ctacagctgt agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg 120

cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag 180

tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc 240

gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc 300

ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg 360

ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa 420

cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 480

ttcctgatgg gcttcgatac cctgaagtgc aacccggatg gtagctggag cggcagccag 540

ccg 543

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaattcata tgtgcccgct gctgccga 28

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattctcg agcacgcagc tcggct 26

<210> 6

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg 60

agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc 120

aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac 180

agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac 240

ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac 300

gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc 360

gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 390

<210> 7

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgaaaggtt gcccgctgct gccgagcgac agccaggtgc aggaagttcg taacccgccg 60

gataacccgc agaccatcga ctacagctgt agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg 120

cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag 180

tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc 240

gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc 300

ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg 360

ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa 420

cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 480

ttcctgatgg gcttcgatac cctgaagtgc aacccggatg gtagctggag cggc 534

<210> 8

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acctggtgca gcggtgaatg ccagtgcaaa aacggtggca tctgcgatca acgtaccggt 60

gcttgcgctt gccgtgaccg ttacgagggt gttcactgcg aaatcctgaa aggttgcccg 120

ctgctgccga gcgacagcca ggtgcaggaa gttcgtaacc cgccggataa cccgcagacc 180

atcgactaca gctgtagccc gggtttcaag ctgaaaggca tggcgcgtat cagctgcctg 240

ccgaacggcc agtggagcaa cttcccgccg aagtgcatcc gtgagtgcgc tatggtgagc 300

agcccggaac acggcaaagt taacgcgctg agcggtgata tgatcgaggg cgctaccctg 360

cgtttcagct gcgacagccc gtactacctg atcggtcagg aaaccctgac ctgccagggt 420

aacggccagt ggaacggcca gatcccgcag tgcaagaacc tggtgttctg cccggatctg 480

gacccggtta accacgcgga gcacaaggtg aaaatcggtg ttgaacagaa atacggccag 540

ttcccgcagg gcaccgaggt gacctacacc tgtagcggta actac 585

<210> 9

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acctggtgca gcggtgaatg ccagtgcaaa aacggtggca tctgcgatca acgtaccggt 60

gcttgcgctt gccgtgaccg ttacgagggt gttcactgcg aaatcctgaa aggttgcccg 120

ctgctgccga gcgacagcca ggtgcaggaa gttcgtaacc cgccggataa cccgcagacc 180

atcgactaca gctgtagccc gggtttcaag ctgaaaggca tggcgcgtat cagctgcctg 240

ccgaacggcc agtggagcaa cttcccgccg aagtgcatcc gtgagtgcgc tatggtgagc 300

agcccggaac acggcaaagt taacgcgctg agcggtgata tgatcgaggg cgctaccctg 360

cgtttcagct gcgacagccc gtactacctg atcggtcagg aaaccctgac ctgccagggt 420

aacggccagt ggaacggcca gatcccgcag tgcaagaacc tggtgttctg cccggatctg 480

gacccggtta accacgcgga gcacaaggtg aaaatcggtg ttgaacagaa atacggccag 540

ttcccgcagg gcaccgaggt gacctacacc tgtagcggta actacttcct gatgggcttc 600

gataccctga agtgcaaccc ggatggtagc tggagcggca gccagccg 648

<210> 10

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acctggtgca gcggtgaatg ccagtgcaaa aacggtggca tctgcgatca acgtaccggt 60

gcttgcgctt gccgtgaccg ttacgagggt gttcactgcg aaatcctgaa aggttgcccg 120

ctgctgccga gcgacagcca ggtgcaggaa gttcgtaacc cgccggataa cccgcagacc 180

atcgactaca gctgtagccc gggtttcaag ctgaaaggca tggcgcgtat cagctgcctg 240

ccgaacggcc agtggagcaa cttcccgccg aagtgcatcc gtgagtgcgc tatggtgagc 300

agcccggaac acggcaaagt taacgcgctg agcggtgata tgatcgaggg cgctaccctg 360

cgtttcagct gcgacagccc gtactacctg atcggtcagg aaaccctgac ctgccagggt 420

aacggccagt ggaacggcca gatcccgcag tgcaagaacc tggtgttctg cccggatctg 480

gacccggtta accacgcgga gcacaaggtg aaaatcggtg ttgaacagaa atacggccag 540

ttcccgcagg gcaccgaggt gacctacacc tgtagcggta actacttcct gatgggcttc 600

gataccctga agtgcaaccc ggatggtagc tggagcggc 639

<210> 11

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaatgcaagt gcggtgaccc gggctacgtg ttcaacatcc cggttaaaca gtgcacctac 60

ttctaccgtt ggcgtccgta ctgcaagccg tgcgacgatc tggaggcgaa agatatctgc 120

ccgaagtaca aacgttgcca ggaatgcaag gctggtctgg acagctgcgt gacctgcccg 180

ccgaacaagt acggcacctg gtgcagcggt gaatgccagt gcaaaaacgg tggcatctgc 240

gatcaacgta ccggtgcttg cgcttgccgt gaccgttacg agggtgttca ctgcgaaatc 300

ctgaaaggtt gcccgctgct gccgagcgac agccaggtgc aggaagttcg taacccgccg 360

gataacccgc agaccatcga ctacagctgt agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg 420

cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag 480

tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc 540

gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc 600

ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg 660

ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa 720

cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 780

<210> 12

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatgcaagt gcggtgaccc gggctacgtg ttcaacatcc cggttaaaca gtgcacctac 60

ttctaccgtt ggcgtccgta ctgcaagccg tgcgacgatc tggaggcgaa agatatctgc 120

ccgaagtaca aacgttgcca ggaatgcaag gctggtctgg acagctgcgt gacctgcccg 180

ccgaacaagt acggcacctg gtgcagcggt gaatgccagt gcaaaaacgg tggcatctgc 240

gatcaacgta ccggtgcttg cgcttgccgt gaccgttacg agggtgttca ctgcgaaatc 300

ctgaaaggtt gcccgctgct gccgagcgac agccaggtgc aggaagttcg taacccgccg 360

gataacccgc agaccatcga ctacagctgt agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg 420

cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag 480

tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc 540

gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc 600

ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg 660

ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa 720

cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 780

ttcctgatgg gcttcgatac cctgaagtgc aacccggatg gtagctggag cggcagccag 840

ccg 843

<210> 13

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaatgcaagt gcggtgaccc gggctacgtg ttcaacatcc cggttaaaca gtgcacctac 60

ttctaccgtt ggcgtccgta ctgcaagccg tgcgacgatc tggaggcgaa agatatctgc 120

ccgaagtaca aacgttgcca ggaatgcaag gctggtctgg acagctgcgt gacctgcccg 180

ccgaacaagt acggcacctg gtgcagcggt gaatgccagt gcaaaaacgg tggcatctgc 240

gatcaacgta ccggtgcttg cgcttgccgt gaccgttacg agggtgttca ctgcgaaatc 300

ctgaaaggtt gcccgctgct gccgagcgac agccaggtgc aggaagttcg taacccgccg 360

gataacccgc agaccatcga ctacagctgt agcccgggtt tcaagctgaa aggcatggcg 420

cgtatcagct gcctgccgaa cggccagtgg agcaacttcc cgccgaagtg catccgtgag 480

tgcgctatgg tgagcagccc ggaacacggc aaagttaacg cgctgagcgg tgatatgatc 540

gagggcgcta ccctgcgttt cagctgcgac agcccgtact acctgatcgg tcaggaaacc 600

ctgacctgcc agggtaacgg ccagtggaac ggccagatcc cgcagtgcaa gaacctggtg 660

ttctgcccgg atctggaccc ggttaaccac gcggagcaca aggtgaaaat cggtgttgaa 720

cagaaatacg gccagttccc gcagggcacc gaggtgacct acacctgtag cggtaactac 780

ttcctgatgg gcttcgatac cctgaagtgc aacccggatg gtagctggag cggc 834

Claims (8)

1.一种鲎因子C截短蛋白，其特征在于，所述鲎因子C截短蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的鲎因子C截短蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒pET-21a，所述表达载体带有组氨酸标签。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的表达载体，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

6.一种鲎因子C截短蛋白的提取方法，其特征在于，包括：

构建如权利要求5所述的宿主细胞，并对所述宿主细胞进行培养；

收集培养后的宿主细胞，进行裂解、离心，得到上清液；

对上清液进行纯化，得到所述鲎因子C截短蛋白。

7.根据权利要求6所述的鲎因子C截短蛋白的提取方法，其特征在于，所述对上清液进行纯化，包括：

将所述上清液和Ni层析介质加入Ni亲和柱，采用咪唑溶液洗脱，收集Ni亲和洗脱液；

将Ni洗脱液加入Buffer平衡柱进行洗脱，收集目标洗脱液；

对所述目标洗脱液依次进行电泳和考马斯亮蓝染色，筛选得到所述鲎因子C截短蛋白。

8.一种如权利要求1所述的鲎因子C截短蛋白、如权利要求3或4所述的表达载体或如权利要求5所述的宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。