CN106632664B

CN106632664B - 载脂蛋白ii/i及其制备方法、生物学功能及应用

Info

Publication number: CN106632664B
Application number: CN201710022491.3A
Authority: CN
Inventors: 张嵘; 张景海; 吴春福
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2037-01-12
Also published as: CN106632664A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，涉及载脂蛋白II/I的结构及其获得方法、新生物学功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本发明涉及载脂蛋白II/I及其活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备载脂蛋白II/I与活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。本发明的载脂蛋白II/I的氨基酸序列如SEQ ID：2所示；编码所述载脂蛋白II/I的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：1所示。本发明还提供了所述天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段，如SEQ ID：3‑6所示。

Description

载脂蛋白II/I及其制备方法、生物学功能及应用

技术领域：

本发明涉及生物医药技术领域，涉及载脂蛋白II/I的结构及其获得方法、新生物学功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本发明涉及载脂蛋白II/I及其活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备载脂蛋白II/I与活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。

背景技术：

载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，其基本功能是转运脂类物质、稳定脂蛋白结构等。载脂蛋白在人类等哺乳动物中被称为apolipoprotein(apo)，分为A、B、C、D、E五类。这些载脂蛋白亚型的异常，已经被证实与阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等疾病相关。而在昆虫中，载脂蛋白被称为apolipophorin(apoLp)，它们构成了昆虫脂蛋白的蛋白部分。

昆虫apoLp-I及apoLp-II来源于同一个mRNA前体apoLp-II/I，并在蛋白的翻译后修饰及分泌过程中被弗林蛋白酶(Furin)切割形成。而apoLp-II/I的载脂功能并不依赖于这种切割作用。apoLp-II为N端部分、apoLp-I为C端部分，二者参与形成高密度脂蛋白(high-density lipophorin,HDLp)。昆虫载脂蛋白前体apoLp-II/I与哺乳动物apoB-48同源，两者均是脂蛋白颗粒中的重要组成部分，在脂类运输及代谢上起到不可或缺的作用。

ApoLp-II/I与其他家族成员一样，其N端包含一个较大的LLT结构域，该结构域形成一个“lipid pocket”样的结构，主要参与与脂类的结合，起到贮存或运输的作用。除了N端结构域之外，apoLp-II/I还包含一个DUF1081结构域，以及靠近C端的von Willebrandfactor module D(VWD)结构域。但这些结构域的功能目前尚无定论。

对昆虫apoLp-II/I的研究主要集中在其结构、生物合成与分泌，以及脂类转运作用等方面。但最新的研究发现，apoLp-II/I还参与了昆虫的先天性免疫反应。有报道指出，家蚕apoLp-II/I能够抑制金黄色葡萄球菌的溶血毒性。纯化后的apoLp-II/I能够降低S.aurues中与溶血素(hemolysin)相关的基因，包括hla，hlb，saeRS以及RNAIII的表达。进一步研究发现，apoLp-II/I是通过与S.aurues细胞表面的LTA结合，进而通过后者的双组份系统影响S.aurues的saePQRS操纵子，最终抑制了溶血素的表达及分泌。在冈比亚按蚊中，apoLp-II/I是全身性免疫反应的负向调控因子。RNA干扰apoLp-II/I后，按蚊的免疫应答程度显著性提高了。而这种提高作用是补体样蛋白TEP1(thioester-containing protein 1，硫酯蛋白)依赖性的，干扰apoLp-II/I能够使TEP1的表达量增高，而后者经由JNK通路产生免疫反应。上述例子表明，昆虫apoLp-II/I不仅参与了脂类的转运和代谢，同时也是一种先天性免疫相关蛋白。

目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫载脂蛋白II/I的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一系列载脂蛋白II/I及其制备方法。

所述的载脂蛋白II/I的氨基酸序列如SEQ ID：2所示；

编码所述载脂蛋白II/I的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：1所示。

本发明还提供了所述天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段。

所述的载脂蛋白II/I活性片段包括SEQ ID：1或SEQ ID：2所述的序列。

所述的载脂蛋白II/I活性片段的序列如SEQ ID：3-6所示。

本发明进一步提供了所述天然载脂蛋白II/I，重组载脂蛋白II/I活性片段，以天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用，包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.通通过其抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的酚氧化酶原激活系统的激活情况，从而抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统，提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力。

本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的apoLp-II/I，研究天然apoLp-II/I的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组apoLp-II/I活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组apoLp-II/I活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然apoLp-II/I。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析apoLp-II/I的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现apoLp-II/I基因片段在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组apoLp-II/I。同时，利用基因重组技术，获得apoLp-II/I部分片段。天然、重组apoLp-II/I部分片段，能特异性识别Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸等多种微生物相关分子模式以及革兰阳性菌和部分真菌、革兰阴性菌等微生物。上述结合，能够抑制昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统。本发明的天然、重组apoLp-II/I及其部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。

本发明的apoLp-II/I，其核苷酸序列如SEQ ID：1，其氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

其制备方法如下：

一、天然apoLp-II/I的制备

本发明所获得天然apoLp-II/I是通过如下技术方案实现的，包括：

以昆虫血淋巴作为原料，分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的apoLp-II/I。

其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到的抽提液。

apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)溶液的酸碱度在pH2～pH10，优选pH4-pH9；(2)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(3)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(4)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L～0.8mol/L，优选0.01mol/L～0.3mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响apoLp-II/I的生物活性。

昆虫血淋巴的收集：将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至～5℃条件下收集昆虫血淋巴。

本发明的分离分析方法包含如下中的两种或两种以上的组合：

1.离子交换层析分离纯化apoLp-II/I

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度为0.00mol/L～3mol/L。利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有apoLp-II/I的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。

离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析填料，如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析填料，如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响apoLp-II/I的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。

2.亲和层析分离纯化apoLp-II/I

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗APOLP-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有APOLP-II/I的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。

亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择apoLp-II/I抗体、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、sepharose CL-4B、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、葡聚糖等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使apoLp-II/I发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得apoLp-II/I。

3.疏水层析分离纯化apoLp-II/I

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有apoLp-II/I的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。

疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料；(2)中性盐选择(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。

4.凝胶层析分离纯化apoLp-II/I

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有APOLP-II/I的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。

凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。

5.盐析分离纯化apoLp-II/I

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到apoLp-II/I仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到apoLp-II/I沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。

盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)盐析使用的中性盐，选择(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl，优选(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄；(3)在使apoLp-II/I处于溶解状态时，选择中性盐在5％—45％，优选10％—40％；(4)在使apoLp-II/I处于沉淀状态时，选择中性盐在40％—90％，优选45％—75％。

6.超滤分离纯化apoLp-II/I以及处理apoLp-II/I溶液

取上述方法所获昆虫血淋巴，按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化apoLp-II/I。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使apoLp-II/I透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使apoLp-II/I得以分离纯化；透过超滤膜的apoLp-II/I溶液，再选择一定规格的超滤膜，使apoLp-II/I被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使apoLp-II/I得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使apoLp-II/I先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使apoLp-II/I透过超滤膜，从而使apoLp-II/I得以分离纯化。

超滤处理apoLp-II/I溶液的目的，是除去apoLp-II/I溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对apoLp-II/I溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使apoLp-II/I被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。

超滤分离纯化和处理的特征：透过apoLp-II/I的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa～50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。

通过上述任何一种方法所获得的apoLp-II/I纯度，有时无法满足相应需要。

本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度apoLp-II/I，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于，将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。

本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

本发明所述的载脂蛋白II/I、载脂蛋白II/I活性片段是利用基因工程表达获得，包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备载脂蛋白II/I、载脂蛋白II/I类似物或活性片段的来源。

所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

二apoLp-II/I结构解析以及其基因序列解析

按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对apoLp-II/I进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然apoLp-II/I的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得apoLp-II/I进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得apoLp-II/I分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNApool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得apoLp-II/I基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得apoLp-II/I全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增apoLp-II/I染色体基因，通过基因序列测定分析获得apoLp-II/I染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述所获得apoLp-II/I的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得apoLp-II/I全长一级结构序列、天然apoLp-II/I一级结构序列(参见SEQ ID:1和ID:2)。

三、重组apoLp-II/I活性片段的制备

本发明还包含具有apoLp-II/I序列的重组apoLp-II/I活性片段。

所述的重组apoLp-II/I活性片段含有apoLp-II序列，包括Met-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-apoLp-II成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-apoLp-II成熟肽氨基酸序列(参见SEQ ID：3-6)。

本发明的重组apoLp-II/I部分片段通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将apoLp-II/I部分片段编码DNA重组至表达载体；(2)用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。

本发明同时提供上述重组apoLp-II/I部分片段的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。

四、apoLp-II/I及其部分片段的生物学功能及其应用

本发明再一个目的是针对天然、重组apoLp-II/I部分片段的体外结合特异性、对微生物的结合与凝集作用以及对激活酚氧化酶原激活系统的激活情况、对抗菌肽合成的激活作用的对比，确定了天然、重组apoLp-II/I部分片段的生物活性。同时，考察apoLp-II/I在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组APOLP-II/I部分片段的应用。

此外，本发明也研究了天然、重组apoLp-II/I及其部分片段作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。

本发明所述的天然、重组apoLp-II/I及其部分片段获得方法常规、简单、产量高。

附图说明：

图1为分离纯化天然apoLp-II/I电泳图谱

A：实施例1中方法-1分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱；

B：实施例1中方法-2分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱；

C：实施例1中方法-3分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱。

图2为分离纯化重组apoLp-II/I部分片段(原核表达体系)电泳图谱

泳道1：实施例3中方法-(1)所获得重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱；

泳道2：实施例3中方法-(2)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱；

泳道3：实施例3中方法-(3)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱。

图3为分离纯化重组apoLp-II/I部分片段(真核表达体系)电泳图谱

泳道1：实施例4中方法-(1)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱；

泳道2：实施例4中方法-(2)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱。

图4为天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段的生物学活性

4-A：实施例6中天然apoLp-II/I与微生物的结合特异性；

4-B：实施例6中天然apoLp-II/I与微生物相关分子模式的结合特异性；

4-C：实施例6中重组apoLp-II/I部分片段与微生物的结合特异性；

4-D：实施例6中apoLp-II/I的表达量与先天性免疫的相关性；

4-E：实施例6中体外抑制天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段活性对酚氧化酶原激活系统的影响；

4-F：实施例6中体内干扰apoLp-II/I表达对酚氧化酶原激活系统的影响。

具体实施方式：

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

实施例1

天然apoLp-II/I的分离纯化

1.方法1

收取血淋巴，12000×g离心后取上清。进行40％硫酸铵沉淀；离心取沉淀用50mM柠檬酸缓冲溶液pH5.2，100mM NaCl,5％甘油进行复溶；离心后取上清，过Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出组分；该组分用50mM PB pH8.0透析后，经HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的流出组分。

试验结果如图1-A泳道7，其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II，天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。

2.方法2

柞蚕血淋巴使用70％硫酸铵沉淀，然后于4℃，8000×g离心15min。弃上清沉淀用50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2复溶并透析。透析后样品过磷酸纤维素柱，用200mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的组分。上述组分用50mM MES，100mMNaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2透析，透析后样品于4℃，8000×g离心15min。除去沉淀。上清组分过Mono S柱，用150mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白组分上述组分过SuperdexTM 200柱(50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2)，收集含目的蛋白组分。

试验结果如图1-B泳道4，其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II，天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。

3.方法3

柞蚕血淋巴使用70％硫酸铵沉淀，然后于4℃，8000×g离心15min。弃上清沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶，上羟基磷灰石柱，用磷酸根离子梯度洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析，上阴离子交换柱HiTrapTM Q，使用NaCl浓度梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分添加(NH₄)₂SO₄至浓度为2M，上苯基疏水柱，使用(NH₄)₂SO₄浓度降低梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分上凝胶过滤柱Sephacryl S-100，收集含目的蛋白组分。

试验结果如图1-C泳道5，其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II，天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。

实施例2：

apoLp-II/I结构解析以及其基因序列解析

按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对apoLp-II/I进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。

获得apoLp-II/I完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。

实施例3：

利用原核生物表达系统获得重组apoLp-II/I活性片段

本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明apoLp-II/I活性片段基因的构建策略和基本方法。

原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。

本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。

对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。

1.apoLp-II/I活性片段的表达载体构建

根据天然apoLp-II/I中N末端apoLp-II的氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建apoLp-II基因的表达载体。

本实施例表达载体构建的特征：1。以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在apoLp-II的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在apoLp-II的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在亲和层析标签与apoLp-II之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然apoLp-II蛋白结构一致的重组apoLp-II蛋白。

2.重组apoLp-II/I活性片段的获得

利用基因工程技术，将含有apoLp-II/I基因中apoLp-II核苷酸序列的表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导apoLp-II基因的表达，从而获得含有apoLp-II的培养液或菌体。含有apoLp-II的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组APOLP-II/I的原料液备用。

重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.apoLp-II基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的apoLp-II需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。

按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含apoLp-II的原料液中分离纯化重组apoLp-II至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。

例如：

(1)采用pTYB11构建无标签apoLp-II表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，apoLp-II表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化apoLp-II的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道1)。

(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的apoLp-II基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-apoLp-II表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化apoLp-II的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道2)。

(3)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的apoLp-II基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，apoLp-II-His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道4)。

上述表达重组的apoLp-II结构如SEQ ID：3-5所示，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图2所示。

上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得apoLp-II，该重组apoLp-II的结构与天然apoLp-II的结构相同。

实施例4：

利用昆虫细胞表达系统获得重组apoLp-II/I活性片段

本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明apoLp-II/I活性片段基因的构建策略和基本方法。

昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。

本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。

对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。

1.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组apoLp-II/I活性片段

将apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-凝血酶酶切位点-apoLp-II重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组apoLp-II在细胞内表达。

收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID：6所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。

2.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组apoLp-II/I活性片段

将apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-apoLp-II重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组apoLp-II在细胞内表达。

收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗apoLp-II抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。

实施例5：

apoLp-II/I及其活性片段抗体的获得

按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4获得的各种apoLp-II/I及其活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。

利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中apoLp-II/I抗体产生情况。

当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生apoLp-II/I抗体体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。

利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有apoLp-II/I抗体的血清中分离纯化不同纯度的apoLp-II/I抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的apoLp-II/I抗体，以适于不同要求的应用。

实施例6：

天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段的生物学活性

为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段的应用范围。

1.天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段与微生物及其相关分子模式的结合特异性

(1)天然apoLp-II/I与微生物的结合特异性

采用western blotting方法考察天然apoLp-II/I与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌和绿脓假单胞杆菌)和真菌(白色念珠菌和酿酒酵母)的结合特性。利用天然apoLp-II/I分别与等量的微生物孵育，采用1MNaCl洗脱后，在高温条件下2％SDS再次洗脱组分，利用apoLp-II/I多克隆抗体间接检测天然apoLp-II/I与不同种类微生物的结合情况。结果如图4-A所示，天然apoLp-II/I与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌、酿酒酵母结合，而与绿脓假单胞杆菌、白色念珠菌不结合。

(2)天然apoLp-II/I与微生物相关分子模式的结合特异性

采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测天然apoLp-II/I对6种可溶性的，分别来自不同种微生物的典型分子模式(PAMP)的识别能力。Lys-PGN和LTA属于革兰阳性菌的特异PAMPs，DAP-PGN和LPS属于革兰阴性菌的特异PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan属于真菌的特异PAMP。不同浓度的PAMPs被包被在96孔板上，依次将天然apoLp-II/I，兔源抗apoLp-II/I多克隆抗血清(一抗)以及偶联有辣根过氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并彻底洗涤未结合组分，最后加入辣根过氧化酶底物，检测在450nm下底物显色的光吸收情况。如图4-B所示，天然apoLp-II/I对Lys-PGN、LTA和DAP-PGN的结合具有浓度依赖性和饱和性，属于特异性结合。天然apoLp-II/I对LPS、可溶性β-1,3葡聚糖和Mannan不具有结合能力。

(3)重组apoLp-II/I部分片段与微生物的结合特异性

按照实施例6中1-(1)中所述western blotting方法考察重组apoLp-II/I部分片段(包含apoLp-II基因)与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。以重组apoLp-II-His为例，结果如图4-C所示，重组apoLp-II-His与上述三种微生物均具有结合作用，该实验结果与天然apoLp-II/I的实验结果一致。

上述实验说明，天然apoLp-II/I可能通过特异性识别典型分子模式而与革兰阳性菌、部分革兰阴性菌、部分真菌发生特异性结合。采用实施例3、4中所述重组apoLp-II/I部分片段可获得相同的实验结果。

2.apoLp-II/I的表达量与先天性免疫的相关性

取五龄期柞蚕幼虫，一组未处理，一组为注射20μl金黄色葡萄球菌(OD600＝0.8)12小时后，解剖后分别取表皮、脂肪体、马氏管、中肠，于液氮中研磨，然后取约100μl样品，加入1ml Trizol溶液充分混匀。另取血细胞约100μl直接加入1ml Trizol溶液充分混匀。上述组分提取总RNA，经逆转录后进行Real-time PCR检测apoLp-II/I的表达量。如图4-D所示，apoLp-II/I在脂肪体和表皮中表达，其中脂肪体的表达量最大；apoLp-II/I的表达量因金黄色葡萄球菌的作用而显著增加。上述结果说明，apoLp-II/I与昆虫先天性免疫具有相关性。

3.天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段对酚氧化酶原激活系统的影响

(1)体外抑制天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段活性对酚氧化酶原激活系统的影响

将血淋巴首先与apoLp-II/I抗体共孵育，以封闭血淋巴中apoLp-II/I的生物学功能，利用6种微生物相关分子模式—Lys-PGN、LTA、DAP-PGN、LPS、laminarin、和Mannan分别激活血淋巴，比较apoLp-II/I抗体封闭前后，血淋巴中酚氧化酶原激活系统受6种微生物相关分子模式的激活情况。结果如图4-E所示，apoLp-II/I抗体封闭后，6种微生物相关分子模式对血淋巴中酚氧化酶原激活系统的激活作用均有不同程度的提高。采用实施例3、4中所述重组apoLp-II/I部分片段可获得相同的实验结果。

(2)体内干扰apoLp-II/I表达对酚氧化酶原激活系统的影响

以dsEGFP为阴性对照，采用显微注射法将apoLp-II/I特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内，经24h诱导后，收集血淋巴后分别加入微生物相关分子模式-可溶性β-1,3葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN，通过测定PO的活力以判断apoLp-II/I对酚氧化酶原激活系统的影响。如图4-F所示，apoLp-II/I表达量的降低能够体外显著增强三种微生物相关分子模式对血淋巴酚氧化酶原的激活情况。

实施例7：

天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的应用

为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以apoLp-II/I的生物活性为代表进行描述，apoLp-II/I活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以apoLp-II/I及重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展apoLp-II/I及重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的应用范围。

1.apoLp-II/I及其活性片段抑制酚氧化酶原激活系统

如实施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，基于此，可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统的相关领域。

2.apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的检测

如实施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段能够与部分微生物及相关分子模式结合，基于此，通过检测微生物与apoLp-II/I及其活性片段是否结合，检测样品中是否含有微生物或其相关分子模式。

3.apoLp-II/I及其活性片段抗体的应用

针对实施例5获得的apoLp-II/I及其活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过apoLp-II/I及其活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的apoLp-II/I免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备apoLp-II/I过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组apoLp-II/I活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。

在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的apoLp-II/I及其活性片段抗体。按照本实施例中的apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。

如实施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，而利用apoLp-II/I及其活性片段的抗体封闭apoLp-II/I，能够显著提高酚氧化酶的活性。基于此，可通过利用apoLp-II/I及其活性片段抗体调整酚氧化酶的活性，进而可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统的相关领域。

上述结果表明：apoLp-II/I及其活性片段的抗体，通过与apoLp-II/I及其活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使apoLp-II/I及其活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳药科大学

<120> 载脂蛋白-II/I及其功能、制备方法和应用

<160> 10

<210> 1

<211> 10278

<212> DNA

<213> 柞蚕（Antheraea pernyi）

<220>

<221> mRNA

<222> (1)...(10278)

<220>

<221> CDS

<222> (93)...(10010)

<220>

<221> 5'UTP

<222> (1)...(92)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (93)...(164)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (165)...(10007)

<220>

<221> 3'UTP

<222> (10011)...(10278)

<400> 1

attacttctc gctgaggtat aggcatcgga ccatagtatc tgcgtacaag actgacttat 60

aatttgtagt gatatacttt taccctgaca aaatggggaa aagtagactt agcttattta 120

gtgttatttt aataatttcc gttttatgga aaccagttta tagtaaagat aaatgctcta 180

tagaatgtca aggatctcct tcaaatccgg ctttcgtaca aggaaataaa tacagttata 240

gcgtcgaggg aacagtcacc atcttcctct cacccgctga tgaccaagtg accagcgtga 300

aactcattgg tcaagtttcg gtcgacgcct tggctaactg tgtccatgag ttatctgtgc 360

agaatctagt tatttccgga cctgatggaa agaaatatca gccgccaccc ggcatcgata 420

aggtcgtccg gttcggattc caagatggac gcgttggacc tgaaatatgc gcacatggag 480

acgatactcg ccgttcactc aatatcaaga gggccatcat atccttgctg caaacagagc 540

agaagccgtc gacacaggtg gatgtgttcg gtgtttgccc tacggaagtg tcctcatccc 600

aagaaggcag tgccgtcctt gtgcacagaa cacgtgacct ctctagatgc tctcatcgtg 660

aacaaggcaa aaatgacatc atcacttcta ttaccaaccc tgacgctgga atcaaggata 720

tgcaagtact ccagtctata ctgaacgtag agtcgaaagt aaacagcgga gttccagaga 780

aagtatctgc cacagaagag tacctttata aacctttctc tgttggagaa aacggtgcaa 840

gagcaaaggt tcatacaaaa ttaacgctta ctggaaaatc atcgtgcgga cagggagtag 900

cgtactgcac cgagtcacgt agcatcatct tcgacaaccc acatggtgtg aagccagttc 960

ctggtaatgc caattccgcc cttgctgctg tcaaggacgt tgcaaaatct gtatcaagca 1020

tcgtggaatc taaatctgct ggcgcatttg cacaacttat cagaattcta cgtatcacca 1080

gtaaggacga tctaatgaag gtttacagcc aagtgaaagg aagcaatttg gaaaagcggg 1140

tgttcctgga tgcccttctt cgagccggta ccggcgatag cattgaagca tctattaaca 1200

tcttgaagag tcgtgagttg ggtcaactgg agcagcaact ggtctacttg tctcttggaa 1260

acgcgagaca tgtcaataat gccgccctga aagccgctgc ctctttgctc gaccaaccaa 1320

acctgcctaa agaagtttat ctcggagttg gagcattggc cggtgcatac tgccgagaac 1380

acgagtgcca tactacaaag cctgtaggta tcgttgctct gagccaaaaa cttggagcca 1440

aactgcagaa ctgcagaccg agatccaaaa ctgaggaaga cactattgtt gccatcctca 1500

agggtatccg tagcatccgc catctggaag actcgcttat caataaaata gtacactgtg 1560

ccgcggataa taacgtgaag gctagtgtta aggcggcagc cttggaagct ttccacgccg 1620

acccttgcag cgctgcgata aagaaaactg caattgagat catgaagaat cgtcaattag 1680

actctgaaat ccgtatcaag gcttaccttg cagttatcca atgcccatgt ggtcaatcag 1740

ctaacgagat taagaacttg ttggatacag aacccgtaca tcaagttggt aattttatct 1800

caacatctct tcgttatatc cgaacgtcag caaatcccga caagcagctc gcgcgtcaac 1860

actacggcct cattaggaca cctaacaaat tcaattccga cgatcgaaaa tattcgttct 1920

accgcgagac atcattcaat atagatgctc ttggagctgg tggtagtgtt gatcaaaccg 1980

tcatttactc ccaagattcg tatctacctc gagaggctag cgttaactta actgttgaac 2040

tatttggaca tagctacaac gtgctagagt tgggaggacg ccaaggtaat ctagaccgtg 2100

taatcgaaca cttcttggga cctaaaggat atttccgtac cagtgaccct caggcactat 2160

acgacgatct ggtaaagaga tacgaggagt caaagaataa agtccaacgt ggtttcggtc 2220

gtggacgcag gtccatcaaa aacgaaatcg ataatttcga caaaaatctg aaagccgaat 2280

ctaattcata ccacaacgag ctcgatctgg atatctatgt gaagtttttc ggaactgatg 2340

ctgtcttcct gtcctttgga gatgacaaag gttttgactt taacaagatt ctcgatgaaa 2400

tccttggtac ttgcaacagt ggcattaata agctgaagca tttccagcaa gaactgcgca 2460

ctcatcttct atttatggac gccgaactaa gttatcctac atctgtgggt ctccccctgc 2520

gcttgaatct cgtaggatcc cttactgctc gtcttgatgt tgccactaat gtggatatcc 2580

aagaaatcat gaaatcacct caaagcgcaa aggtcgatgt caaattcgta ccaagcacag 2640

acgtcgaaat tgctggggct ctactcattg atgctgactc tgttaccacg ggtcttaaag 2700

ttatcaccaa cttacgctct tcaactggtc tccacgttat cgcgaaagtc atcgagaatg 2760

gtcgcggttt cgacctacaa cttggcctcc cagtagacaa acaagagatt ctggtagcct 2820

ctaatgaact ggtatacgtg acagctgaaa agggtcaaag ggagaaacaa acgaaaatta 2880

aaactggaca gagtatgcac gattattcgc cgtgtttcga ccagttgtct ggtgttcttg 2940

gtttgacact ctgcggacat ttctctttac ctttcagtat atctaatcgt gaaaaaccca 3000

gcgaccaaat aatctctcaa tttttcaatc ggttcccact atccggaaca gcttcagcga 3060

aaattgtcct tgaaaaaaac gacttaagtg gttatcatat taaaggtgtt gtccgtgagg 3120

atgccgctgc tggtaaaaag agcttcgaat ttttattcga cgcagaaggc tctcagaacc 3180

gtcacaccaa attaacaggt caatacgtct acaactcaaa tgaaatcggt gttaagcttg 3240

aacttcagtc tcctattaaa aatctttatg gagaaatatc agcctgtaat aatcccagag 3300

aactgatggc taaatacgta ggtagagtgg actccatgga atacaaaggt cggattggtt 3360

ttactgtcca gggcaatgag caacggtcag tttacagacc ggtatttgag tacagtatcc 3420

cagatggcag tgggcaaact cattcggctg aaattgttgg cgaagttatc aaagagacaa 3480

gtggcagaaa gtccaaatat acagccaggg gtttacagat cccaatggcg aaaggacaac 3540

agccagtgga agtaaatgga tacgtgtctc tgcaagatca gcccagagat gttgaggttg 3600

acctggcagt gaaaggatac gctagcctca agggttcttt gaaaggatct gacgttatga 3660

tagactttga gaacaattta aatcccaacg ttaatttcaa tatgaagggt aaattcgatt 3720

acaataatat gattcacaac gaattcgagc ttcaatacgg ccctaagaaa aatgatccac 3780

tatcaaaagt gagcttcttt cagcacctga aatatcacat tcaatctagc gaagattaca 3840

acatcatcac caaaaacagc tttgaaatcc gtgcggttcc actgaaggtg gtagcaaatg 3900

ctgacattga ccctaagaag gtcgtcattg atatcggagg acaatacgtt gacagaagcg 3960

ctaagcttga agtggaagct agaacaaaga tcaagaggcc aggagattac agcgtaaaag 4020

tcaaagctaa cctcaacgat gcctgtattg aagtcttatc gaaaagagat gttgtttccg 4080

ctgataaatc caacttcgag aattacctcg acatcacagg cgtagggcga tatgaactct 4140

caggagttgt gcttcataag accaaaccaa atgatatgaa cgttggtgct atcggtcatt 4200

ttaagattaa ggctggttcc aataatgaag atattaaatt cgatatcgga ttaattgaaa 4260

cttccaacat atactcttca cacgcccaag tctctaacag caaaggcgaa gtgcttgact 4320

ttttgttaaa agtaactcgc actgggaatc ccactggtca gctgaagttc aacttaaaag 4380

atatcatcgt aactcatgga gaattcaagg tcactgataa tgacggcaag ggtaatggaa 4440

tgatcatagt ggagttcaaa aaactacaac gtaaaataaa aggtgacgtc aaattcgtct 4500

ctaaggaccc ggtcttcatt accgacattg agttatacct cgattttgaa aagaataaca 4560

acaacaaatt ccacttcgta acgaataatc ggaagactca gaagctcgtt tcttccaaga 4620

acaaggttga gtacgatggt aaagttaccg aagtgaacta cgtacaagaa ggagttttct 4680

ctataactgg aaaaaccaat ctcaactttg acgtagtact cccaacagaa agatgtatta 4740

gcttgaagat agaccgcgat gtagccttga aagatggtaa atatagtgga catgcagagt 4800

tacttctctc tgattccgtg aagcgtggct cggcgtcgtc tgttatcagc tacaaaggaa 4860

aaattgttga caccgatatt gaaaaagaaa taattaatta tgagggccag cttgaattcc 4920

gtcttaagga tggtaaacaa ctgctgaaca cgttctacct gaagaacatt cctgagggca 4980

ataaattcaa gtttgacttt aagtctgacg tgaccggcaa cctgcttccc aaaccggcat 5040

ctcttagcgc tactggttct tacctcgact ccgagacaat cataaatcag aattatcgag 5100

tgaagggcaa ttatggggac gacattagct ttgaatatgt cgatcagtgg acgtgcaatt 5160

attcgagaag gacaaaaaaa tacttgagtg actacacagt aaccgtgcac cttccgttcg 5220

agaaggctca cgatatcaaa tgggcatcga cagttcagta cctacagcct gacggcaagg 5280

atatcgctga gtacacaata gttgaatctg tccaagttaa tgctgacgtc ttcaaggtgg 5340

acgctaatgg aaaagtcggt atcaagaacg gctccggagc tattaaagta ctcattccac 5400

ataacgatcc atttatagta gatttcaatt acaagagaga cagccaaggt gacaaaaata 5460

acaactttgt ggaagttaaa gcaaaatacg gcaagggcaa gactacttcg ctttcaattg 5520

actcttcgtt cgctcctcac gacagcactc tccaagtgaa agcttattct ccgaatgctg 5580

aaaaactcaa gaaactcgaa ctcaatattc actcaaagaa cccatctcct gatacataca 5640

gtaattctat aataatggac gctgatggac gtatctacaa atctgaatct accatcgtat 5700

tatcaaaggc tcacccagta ttggacattc aatacgttaa ccccgaaact aataaaccta 5760

gcagaatcta cgtgaaaggc agctcgctca gctcaactca aggcaagatc gaagtcaaag 5820

tagacaatat ttacaaaatc tgcttcgacg ttgtggccga gggtagtgtg cagaaagaca 5880

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acaagaacgt aattagtgga agcacgtcgt ttataagcaa gcaggaaggt cagaagacga 6060

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tcatccgcac agtactgacg gagagtagtg aacagggtgt tgagacattc ttcaatgttg 6180

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cttatgtcta ctgtgaagag aagaagcaat gcgctcatgc tgaaatacaa tcaaagatcg 6300

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cgcggttcac cctcgacctg cacgtcaata gccaggagag aaagtatcac ctccacgcgt 6480

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tattggctct tgaatacact ctcgactatc ctaccgacaa gcttatgccg ttccccgtta 6600

ggggagaggt ttgtctggat cttgataaga ataagccggg acataagaca tctgctagat 6660

tcctcgtcga cttcactaac gctggaggaa gtcaagacac tgccattgct gaaattggat 6720

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gcagggaccg cgtctctaaa ctcttactgg aagtctcccc acgcaagttc gagttcttga 6900

ctgaaacacc attcgtaaag gtattgcaca tcgacgctgg cttcacatca accccggagc 6960

agagaactta ccagtcacta ttcagcgttt gcctactgga aggcaatgtg gttcaaataa 7020

aaacactgct caaggacttc caatatttcg aattcacaac agaggaatcc ggctgcaaat 7080

tctcgatcgt tgcacatctg gtaccggaga aacgtgctga tatcagtgcg gacctcatcc 7140

tatctggagg caagaagaac atcgctcacg gtgctttgtt ccttaaagac aacacgattc 7200

aatccgagta cggtgcctct aaggacaact tcaaccattt aatggctact gttaagaagg 7260

acgctgagag cctgaacgat cgtatcaaag atctcggtga aaaatccagt caagacttcc 7320

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ccctgaatga ggtcattcac tatttggcta agatattcga tgaaattctc caaggaacca 7500

aacccttggt agaccagatc accaagacct tcactgagac ttctgagaag atatcaggaa 7560

tgtacaagaa gacgcttgaa cctcaactga aacagctgta tgagactctt ggcaaaattc 7620

taaaagaata cttggatgct gccatcgaag ttgttgcaca tttaggcgca cttgtcagtg 7680

acttcttcga gaaacataag caagaacttc agcaactgac caacgtcatg actgaaatat 7740

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aggtgtatgg ggaactcgtc caactaataa acaacatgcc gatcattgag gctattaaag 7860

aggagtggaa ggatggttta ccaaaggacc aaatactcgg aatgtgcaac caaggttacg 7920

ccgctatata ccaagtgctt ccaaataagg aattcaaaga ttttgctgaa gctttgaaca 7980

attacgtgat caagaaactc cgttcggaac aaatcgatga cgcaaaatcg ctgcaggtca 8040

tttaccaaaa gctgattgca gcgttcagtt cgctgtcaca attcatccca tcacagatta 8100

ccagttacac tgcttctgga cctacctctt ggagtagcta cttcttctct cctgcgagca 8160

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ggaacttcac tgtacttctg cagttgcaga acggacagcc caaagcctta gttctggagg 8460

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ttcacgggtt cccagtcatc gaaaaggatg tgtttgcatt caaacagact aacggacgca 8580

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acttcgaagt ggacggtttc tacctgggca aattacgtgg tctccttgga gatggtaaca 8700

atgagcccta tgatgacttc agactaccga acggaaagat ttgcacatcg gaaagtgaat 8760

tcggcaacgg gtacggtcta gtacacagct gtccgaaagt ccaggctccg gagcactccc 8820

accaccagat gcacgccgcc cttccaccag catgtgaaca ggtgttcgga ggaatctccc 8880

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ctgacttgaa actgaagagc tccaagcttc atttcgatga cacggaccgg tacgaccgca 9360

cgccttacgt caaaactgga tttgagactt tcgacaaata cgagaagaac cttgtcgaat 9420

tcattgatgc ggtcaaaatt aaacttggca taaccaacat tgcatttagt gaatattcac 9480

tcatggatct acctttccgt gctggtgctg tgaaacacgt tttcttgaca gtgtctgaac 9540

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tggagaacat gggcatgtcc atgtcattag ttacggcgac accggagatg aaatgcggcg 9660

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tacctgtgtc ttgctctttc attcattaaa caatgccatc aagtgaattc ttagttattt 10140

atgatgccgt ctctctcaga aggtattatt taatcatgtc atttgtatta caattaataa 10200

taaaaaatta tatattattc aaaaaaaaaa aaaaaaagat atcggatccg aattccgaat 10260

ctctagagga tccccggg 10278

<210> 2

<211> 3305

<212> PRT

<213> 柞蚕（Antheraea pernyi）

<400> 2

Met Gly Lys Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Val Ile Leu Ile Ile Ser

1 5 10 15

Val Leu Trp Lys Pro Val Tyr Ser Lys Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys

20 25 30

Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser

35 40 45

Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp

50 55 60

Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu

65 70 75 80

Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly

85 90 95

Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val

100 105 110

Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His

115 120 125

Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser

130 135 140

Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly

145 150 155 160

Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu

165 170 175

Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly

180 185 190

Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys

195 200 205

Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn

210 215 220

Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys

225 230 235 240

Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys

245 250 255

Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys

260 265 270

Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro

275 280 285

Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala

290 295 300

Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala

305 310 315 320

Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys

325 330 335

Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu

340 345 350

Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile

355 360 365

Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val

370 375 380

Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys

385 390 395 400

Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr

405 410 415

Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys

420 425 430

His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly

435 440 445

Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr

450 455 460

Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp

465 470 475 480

Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys

485 490 495

Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys

500 505 510

Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln

515 520 525

Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys

530 535 540

Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu

545 550 555 560

Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile

565 570 575

Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly

580 585 590

Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser

595 600 605

Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly

610 615 620

Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg

625 630 635 640

Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn

645 650 655

Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu

660 665 670

His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala

675 680 685

Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val

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Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg Ser Ile Lys Asn Glu Ile Asp

705 710 715 720

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Lys Ala Glu Ser Asn Ser Tyr His Asn Glu

725 730 735

Leu Asp Leu Asp Ile Tyr Val Lys Phe Phe Gly Thr Asp Ala Val Phe

740 745 750

Leu Ser Phe Gly Asp Asp Lys Gly Phe Asp Phe Asn Lys Ile Leu Asp

755 760 765

Glu Ile Leu Gly Thr Cys Asn Ser Gly Ile Asn Lys Leu Lys His Phe

770 775 780

Gln Gln Glu Leu Arg Thr His Leu Leu Phe Met Asp Ala Glu Leu Ser

785 790 795 800

Tyr Pro Thr Ser Val Gly Leu Pro Leu Arg Leu Asn Leu Val Gly Ser

805 810 815

Leu Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Thr Asn Val Asp Ile Gln Glu Ile

820 825 830

Met Lys Ser Pro Gln Ser Ala Lys Val Asp Val Lys Phe Val Pro Ser

835 840 845

Thr Asp Val Glu Ile Ala Gly Ala Leu Leu Ile Asp Ala Asp Ser Val

850 855 860

Thr Thr Gly Leu Lys Val Ile Thr Asn Leu Arg Ser Ser Thr Gly Leu

865 870 875 880

His Val Ile Ala Lys Val Ile Glu Asn Gly Arg Gly Phe Asp Leu Gln

885 890 895

Leu Gly Leu Pro Val Asp Lys Gln Glu Ile Leu Val Ala Ser Asn Glu

900 905 910

Leu Val Tyr Val Thr Ala Glu Lys Gly Gln Arg Glu Lys Gln Thr Lys

915 920 925

Ile Lys Thr Gly Gln Ser Met His Asp Tyr Ser Pro Cys Phe Asp Gln

930 935 940

Leu Ser Gly Val Leu Gly Leu Thr Leu Cys Gly His Phe Ser Leu Pro

945 950 955 960

Phe Ser Ile Ser Asn Arg Glu Lys Pro Ser Asp Gln Ile Ile Ser Gln

965 970 975

Phe Phe Asn Arg Phe Pro Leu Ser Gly Thr Ala Ser Ala Lys Ile Val

980 985 990

Leu Glu Lys Asn Asp Leu Ser Gly Tyr His Ile Lys Gly Val Val Arg

995 1000 1005

Glu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Lys Ser Phe Glu Phe Leu Phe Asp

1010 1015 1020

Ala Glu Gly Ser Gln Asn Arg His Thr Lys Leu Thr Gly Gln Tyr

1025 1030 1035

Val Tyr Asn Ser Asn Glu Ile Gly Val Lys Leu Glu Leu Gln Ser

1040 1045 1050

Pro Ile Lys Asn Leu Tyr Gly Glu Ile Ser Ala Cys Asn Asn Pro

1055 1060 1065

Arg Glu Leu Met Ala Lys Tyr Val Gly Arg Val Asp Ser Met Glu

1070 1075 1080

Tyr Lys Gly Arg Ile Gly Phe Thr Val Gln Gly Asn Glu Gln Arg

1085 1090 1095

Ser Val Tyr Arg Pro Val Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Asp Gly Ser

1100 1105 1110

Gly Gln Thr His Ser Ala Glu Ile Val Gly Glu Val Ile Lys Glu

1115 1120 1125

Thr Ser Gly Arg Lys Ser Lys Tyr Thr Ala Arg Gly Leu Gln Ile

1130 1135 1140

Pro Met Ala Lys Gly Gln Gln Pro Val Glu Val Asn Gly Tyr Val

1145 1150 1155

Ser Leu Gln Asp Gln Pro Arg Asp Val Glu Val Asp Leu Ala Val

1160 1165 1170

Lys Gly Tyr Ala Ser Leu Lys Gly Ser Leu Lys Gly Ser Asp Val

1175 1180 1185

Met Ile Asp Phe Glu Asn Asn Leu Asn Pro Asn Val Asn Phe Asn

1190 1195 1200

Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr Asn Asn Met Ile His Asn Glu Phe

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Tyr Gly Pro Lys Lys Asn Asp Pro Leu Ser Lys Val

1220 1225 1230

Ser Phe Phe Gln His Leu Lys Tyr His Ile Gln Ser Ser Glu Asp

1235 1240 1245

Tyr Asn Ile Ile Thr Lys Asn Ser Phe Glu Ile Arg Ala Val Pro

1250 1255 1260

Leu Lys Val Val Ala Asn Ala Asp Ile Asp Pro Lys Lys Val Val

1265 1270 1275

Ile Asp Ile Gly Gly Gln Tyr Val Asp Arg Ser Ala Lys Leu Glu

1280 1285 1290

Val Glu Ala Arg Thr Lys Ile Lys Arg Pro Gly Asp Tyr Ser Val

1295 1300 1305

Lys Val Lys Ala Asn Leu Asn Asp Ala Cys Ile Glu Val Leu Ser

1310 1315 1320

Lys Arg Asp Val Val Ser Ala Asp Lys Ser Asn Phe Glu Asn Tyr

1325 1330 1335

Leu Asp Ile Thr Gly Val Gly Arg Tyr Glu Leu Ser Gly Val Val

1340 1345 1350

Leu His Lys Thr Lys Pro Asn Asp Met Asn Val Gly Ala Ile Gly

1355 1360 1365

His Phe Lys Ile Lys Ala Gly Ser Asn Asn Glu Asp Ile Lys Phe

1370 1375 1380

Asp Ile Gly Leu Ile Glu Thr Ser Asn Ile Tyr Ser Ser His Ala

1385 1390 1395

Gln Val Ser Asn Ser Lys Gly Glu Val Leu Asp Phe Leu Leu Lys

1400 1405 1410

Val Thr Arg Thr Gly Asn Pro Thr Gly Gln Leu Lys Phe Asn Leu

1415 1420 1425

Lys Asp Ile Ile Val Thr His Gly Glu Phe Lys Val Thr Asp Asn

1430 1435 1440

Asp Gly Lys Gly Asn Gly Met Ile Ile Val Glu Phe Lys Lys Leu

1445 1450 1455

Gln Arg Lys Ile Lys Gly Asp Val Lys Phe Val Ser Lys Asp Pro

1460 1465 1470

Val Phe Ile Thr Asp Ile Glu Leu Tyr Leu Asp Phe Glu Lys Asn

1475 1480 1485

Asn Asn Asn Lys Phe His Phe Val Thr Asn Asn Arg Lys Thr Gln

1490 1495 1500

Lys Leu Val Ser Ser Lys Asn Lys Val Glu Tyr Asp Gly Lys Val

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Thr Glu Val Asn Tyr Val Gln Glu Gly Val Phe Ser Ile Thr Gly

1520 1525 1530

Lys Thr Asn Leu Asn Phe Asp Val Val Leu Pro Thr Glu Arg Cys

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Ile Ser Leu Lys Ile Asp Arg Asp Val Ala Leu Lys Asp Gly Lys

1550 1555 1560

Tyr Ser Gly His Ala Glu Leu Leu Leu Ser Asp Ser Val Lys Arg

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Gly Ser Ala Ser Ser Val Ile Ser Tyr Lys Gly Lys Ile Val Asp

1580 1585 1590

Thr Asp Ile Glu Lys Glu Ile Ile Asn Tyr Glu Gly Gln Leu Glu

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Phe Arg Leu Lys Asp Gly Lys Gln Leu Leu Asn Thr Phe Tyr Leu

1610 1615 1620

Lys Asn Ile Pro Glu Gly Asn Lys Phe Lys Phe Asp Phe Lys Ser

1625 1630 1635

Asp Val Thr Gly Asn Leu Leu Pro Lys Pro Ala Ser Leu Ser Ala

1640 1645 1650

Thr Gly Ser Tyr Leu Asp Ser Glu Thr Ile Ile Asn Gln Asn Tyr

1655 1660 1665

Arg Val Lys Gly Asn Tyr Gly Asp Asp Ile Ser Phe Glu Tyr Val

1670 1675 1680

Asp Gln Trp Thr Cys Asn Tyr Ser Arg Arg Thr Lys Lys Tyr Leu

1685 1690 1695

Ser Asp Tyr Thr Val Thr Val His Leu Pro Phe Glu Lys Ala His

1700 1705 1710

Asp Ile Lys Trp Ala Ser Thr Val Gln Tyr Leu Gln Pro Asp Gly

1715 1720 1725

Lys Asp Ile Ala Glu Tyr Thr Ile Val Glu Ser Val Gln Val Asn

1730 1735 1740

Ala Asp Val Phe Lys Val Asp Ala Asn Gly Lys Val Gly Ile Lys

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Asn Gly Ser Gly Ala Ile Lys Val Leu Ile Pro His Asn Asp Pro

1760 1765 1770

Phe Ile Val Asp Phe Asn Tyr Lys Arg Asp Ser Gln Gly Asp Lys

1775 1780 1785

Asn Asn Asn Phe Val Glu Val Lys Ala Lys Tyr Gly Lys Gly Lys

1790 1795 1800

Thr Thr Ser Leu Ser Ile Asp Ser Ser Phe Ala Pro His Asp Ser

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Thr Leu Gln Val Lys Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Glu Lys Leu Lys

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Lys Leu Glu Leu Asn Ile His Ser Lys Asn Pro Ser Pro Asp Thr

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Tyr Ser Asn Ser Ile Ile Met Asp Ala Asp Gly Arg Ile Tyr Lys

1850 1855 1860

Ser Glu Ser Thr Ile Val Leu Ser Lys Ala His Pro Val Leu Asp

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Ile Gln Tyr Val Asn Pro Glu Thr Asn Lys Pro Ser Arg Ile Tyr

1880 1885 1890

Val Lys Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Gln Gly Lys Ile Glu Val

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Lys Val Asp Asn Ile Tyr Lys Ile Cys Phe Asp Val Val Ala Glu

1910 1915 1920

Gly Ser Val Gln Lys Asp Asn Val Ala Phe Lys Ala Val Ala Asn

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Ser Lys Glu Leu Gly Trp Asn Asn Tyr Asn Val Asp Ile Ser Ser

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Lys Asp Ser Gly Asn Gly Lys Arg Leu Asp Phe His Ala Ile Asn

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Asp Asn Lys Asn Val Ile Ser Gly Ser Thr Ser Phe Ile Ser Lys

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Gln Glu Gly Gln Lys Thr Ile Ile Glu Gly Ser Gly Ser Val Lys

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Val Lys Glu Glu Gln Lys Trp Ala Asn Phe Lys Phe Ile Arg Thr

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2030 2035 2040

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2045 2050 2055

Gln Cys Ala His Ala Glu Ile Gln Ser Lys Ile Asp Met Ser Thr

2060 2065 2070

Pro Gly Val Ile Val Asn Leu Val Asn Ile Gly Phe Asp Leu Arg

2075 2080 2085

Lys Leu Gly Val Ala Pro Glu Leu Gly Leu Gln Met Arg Asp Glu

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Val Ser Thr Ser Lys Pro Pro Arg Phe Thr Leu Asp Leu His Val

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2120 2125 2130

Glu His Gly His Phe Ala Ser Gly Val Thr Val Arg Leu Pro Ser

2135 2140 2145

Arg Leu Leu Ala Leu Glu Tyr Thr Leu Asp Tyr Pro Thr Asp Lys

2150 2155 2160

Leu Met Pro Phe Pro Val Arg Gly Glu Val Cys Leu Asp Leu Asp

2165 2170 2175

Lys Asn Lys Pro Gly His Lys Thr Ser Ala Arg Phe Leu Val Asp

2180 2185 2190

Phe Thr Asn Ala Gly Gly Ser Gln Asp Thr Ala Ile Ala Glu Ile

2195 2200 2205

Gly Phe Phe His Pro Lys Ile Glu Lys Glu Ala Val Phe Arg Ile

2210 2215 2220

Asn Gly Val Val Lys Arg Pro Gly Asp Gly Thr Phe Lys Phe Glu

2225 2230 2235

Thr Ser Ala Thr Leu Ser Cys His Ser Ala Phe Gly Arg Asp Arg

2240 2245 2250

Val Ser Lys Leu Leu Leu Glu Val Ser Pro Arg Lys Phe Glu Phe

2255 2260 2265

Leu Thr Glu Thr Pro Phe Val Lys Val Leu His Ile Asp Ala Gly

2270 2275 2280

Phe Thr Ser Thr Pro Glu Gln Arg Thr Tyr Gln Ser Leu Phe Ser

2285 2290 2295

Val Cys Leu Leu Glu Gly Asn Val Val Gln Ile Lys Thr Leu Leu

2300 2305 2310

Lys Asp Phe Gln Tyr Phe Glu Phe Thr Thr Glu Glu Ser Gly Cys

2315 2320 2325

Lys Phe Ser Ile Val Ala His Leu Val Pro Glu Lys Arg Ala Asp

2330 2335 2340

Ile Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Gly Gly Lys Lys Asn Ile Ala

2345 2350 2355

His Gly Ala Leu Phe Leu Lys Asp Asn Thr Ile Gln Ser Glu Tyr

2360 2365 2370

Gly Ala Ser Lys Asp Asn Phe Asn His Leu Met Ala Thr Val Lys

2375 2380 2385

Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asn Asp Arg Ile Lys Asp Leu Gly Glu

2390 2395 2400

Lys Ser Ser Gln Asp Phe Gln Gln Leu Leu Gln Arg Ala Thr Pro

2405 2410 2415

Tyr Phe Lys Arg Ile Asp Asp Asp Phe Arg Ala Glu Trp Glu Arg

2420 2425 2430

Phe Tyr Asn Glu Ile Ala Val Asp Lys Val Phe Lys Glu Leu Ser

2435 2440 2445

His Thr Leu Asn Glu Val Ile His Tyr Leu Ala Lys Ile Phe Asp

2450 2455 2460

Glu Ile Leu Gln Gly Thr Lys Pro Leu Val Asp Gln Ile Thr Lys

2465 2470 2475

Thr Phe Thr Glu Thr Ser Glu Lys Ile Ser Gly Met Tyr Lys Lys

2480 2485 2490

Thr Leu Glu Pro Gln Leu Lys Gln Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Lys

2495 2500 2505

Ile Leu Lys Glu Tyr Leu Asp Ala Ala Ile Glu Val Val Ala His

2510 2515 2520

Leu Gly Ala Leu Val Ser Asp Phe Phe Glu Lys His Lys Gln Glu

2525 2530 2535

Leu Gln Gln Leu Thr Asn Val Met Thr Glu Ile Phe Lys Asp Leu

2540 2545 2550

Thr Arg Ile Ile Val Ala Gln Leu Lys Glu Met Pro Gly Lys Phe

2555 2560 2565

Asn Gln Val Tyr Gly Glu Leu Val Gln Leu Ile Asn Asn Met Pro

2570 2575 2580

Ile Ile Glu Ala Ile Lys Glu Glu Trp Lys Asp Gly Leu Pro Lys

2585 2590 2595

Asp Gln Ile Leu Gly Met Cys Asn Gln Gly Tyr Ala Ala Ile Tyr

2600 2605 2610

Gln Val Leu Pro Asn Lys Glu Phe Lys Asp Phe Ala Glu Ala Leu

2615 2620 2625

Asn Asn Tyr Val Ile Lys Lys Leu Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asp

2630 2635 2640

Ala Lys Ser Leu Gln Val Ile Tyr Gln Lys Leu Ile Ala Ala Phe

2645 2650 2655

Ser Ser Leu Ser Gln Phe Ile Pro Ser Gln Ile Thr Ser Tyr Thr

2660 2665 2670

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Ser Thr Pro Val Trp Ser Gly Asp Ala Ser Trp Ser Leu Leu Lys

2690 2695 2700

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2705 2710 2715

Ala Tyr Arg Pro Arg Ser Leu Asp Pro Phe Asp Glu Met Pro Ala

2720 2725 2730

Lys Leu Arg Ala Val Val Ile Asn Gly Gln His Ile Phe Thr Phe

2735 2740 2745

Asp Gly Lys His Leu Thr Phe Pro Gly Gln Cys Arg Tyr Val Leu

2750 2755 2760

Ile His Asn Tyr Val Asp Arg Asn Phe Thr Val Leu Leu Gln Leu

2765 2770 2775

Gln Asn Gly Gln Pro Lys Ala Leu Val Leu Glu Asp Lys Ser Gly

2780 2785 2790

Thr Ile Ile Glu Leu Lys Asp Asn Gly Gln Val Thr Leu Asn Gly

2795 2800 2805

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2810 2815 2820

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2825 2830 2835

Lys Ala Phe Cys Thr Ser Lys Leu Glu Val Cys Tyr Phe Glu Val

2840 2845 2850

Asp Gly Phe Tyr Leu Gly Lys Leu Arg Gly Leu Leu Gly Asp Gly

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Asn Asn Glu Pro Tyr Asp Asp Phe Arg Leu Pro Asn Gly Lys Ile

2870 2875 2880

Cys Thr Ser Glu Ser Glu Phe Gly Asn Gly Tyr Gly Leu Val His

2885 2890 2895

Ser Cys Pro Lys Val Gln Ala Pro Glu His Ser His His Gln Met

2900 2905 2910

His Ala Ala Leu Pro Pro Ala Cys Glu Gln Val Phe Gly Gly Ile

2915 2920 2925

Ser Pro Leu Arg Pro Val Ser Leu Leu Leu Asp Val Ser Pro Phe

2930 2935 2940

Arg Gln Ala Cys Ile His Ala Val Thr Gly Ala Asp Ala Ala Lys

2945 2950 2955

Asp Leu His Gln Ala Cys Asp Leu Ala Arg Gly Tyr Ala Ala Leu

2960 2965 2970

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2975 2980 2985

Arg Cys Thr Asp Ala Asp Lys Pro Arg Ala Ile Gly Asp Met Tyr

2990 2995 3000

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3005 3010 3015

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Tyr Ala Ile Leu Tyr Asp Thr Asp Leu Lys Leu Lys Ser Ser Lys

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Leu His Phe Asp Asp Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Thr Pro Tyr Val

3080 3085 3090

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3170 3175 3180

Pro Glu Met Lys Cys Gly Gly Asn Leu Ala His Val Val Gly Phe

3185 3190 3195

Asp Glu Ser Ser Val Leu Met Leu Gly Asn Met Lys Arg Thr Lys

3200 3205 3210

Glu Ser Glu Ala Leu Arg Ala Thr Leu Glu Leu Pro Ser Ser Ser

3215 3220 3225

Cys Ile Asp Phe Thr Gln Ala Val Asp Gly Leu Val Phe Ser Ser

3230 3235 3240

Thr Asn Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gln Arg Lys Gln Phe Leu

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Gln Thr Ala Ala Asn Ala Ile Thr Gln Lys Met Thr Lys Ala His

3260 3265 3270

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3275 3280 3285

Arg Ser Ala Cys Phe Thr Arg Glu Lys Lys Glu Val Ala Arg Arg

3290 3295 3300

Arg Lys

3305

<210> 3

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始

<400> 3

Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro

65 70 75 80

Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg

85 90 95

Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu

100 105 110

Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro

115 120 125

Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser

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Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile

165 170 175

Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile

180 185 190

Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser

195 200 205

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210 215 220

Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser

225 230 235 240

Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe

245 250 255

Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala

260 265 270

Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu

275 280 285

Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile

290 295 300

Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu

340 345 350

Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg

355 360 365

His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln

370 375 380

Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly

385 390 395 400

Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile

405 410 415

Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro

420 425 430

Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile

435 440 445

Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His

450 455 460

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465 470 475 480

Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala

485 490 495

Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys

500 505 510

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515 520 525

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595 600 605

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610 615 620

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Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr

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660 665 670

Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg

675 680 685

Arg

<210> 4

<211> 695

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添组氨酸标签

<400> 4

Met His His His His His His Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser

20 25 30

Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val

35 40 45

Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn

50 55 60

Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp

65 70 75 80

Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe

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Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp

100 105 110

Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu

115 120 125

Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys

130 135 140

Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His

145 150 155 160

Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn

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Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met

180 185 190

Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly

195 200 205

Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe

210 215 220

Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr

225 230 235 240

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245 250 255

Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro

260 265 270

Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser

275 280 285

Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu

290 295 300

Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr

305 310 315 320

Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile

340 345 350

Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu

355 360 365

Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala

370 375 380

Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly

385 390 395 400

Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr

405 410 415

Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys

420 425 430

Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val

435 440 445

Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu

450 455 460

Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser

465 470 475 480

Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala

485 490 495

Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp

500 505 510

Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys

515 520 525

Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val

530 535 540

His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr

545 550 555 560

Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile

565 570 575

Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr

580 585 590

Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val

595 600 605

Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala

610 615 620

Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu

625 630 635 640

Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe

645 650 655

Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr

660 665 670

Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg

675 680 685

Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg

690 695

<210> 5

<211> 695

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (690)...(695)

<223> 人工增添组氨酸标签

<400> 5

Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala

1 5 10 15

Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr

20 25 30

Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile

35 40 45

Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser

50 55 60

Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro

65 70 75 80

Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg

85 90 95

Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu

100 105 110

Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro

115 120 125

Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser

145 150 155 160

Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile

165 170 175

Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile

180 185 190

Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser

195 200 205

Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly

210 215 220

Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser

225 230 235 240

Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe

245 250 255

Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala

260 265 270

Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu

275 280 285

Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile

290 295 300

Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu

340 345 350

Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg

355 360 365

His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln

370 375 380

Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly

385 390 395 400

Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile

405 410 415

Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro

420 425 430

Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile

435 440 445

Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His

450 455 460

Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu

465 470 475 480

Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala

485 490 495

Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys

500 505 510

Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu

515 520 525

Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe

530 535 540

Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys

545 550 555 560

Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe

565 570 575

Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn

580 585 590

Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr

595 600 605

Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val

610 615 620

Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln

625 630 635 640

Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr

645 650 655

Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg

660 665 670

Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg

675 680 685

Arg His His His His His His

690 695

<210> 6

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添组氨酸标签

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (8)...(13)

<223> 人工增添凝血酶酶切位点

<400> 6

Met His His His His His His Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Asp Lys

1 5 10 15

Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu

35 40 45

Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val

50 55 60

Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn

65 70 75 80

Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly

85 90 95

Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro

100 105 110

Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys

115 120 125

Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln

130 135 140

Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu

145 150 155 160

Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser

165 170 175

His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro

180 185 190

Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val

195 200 205

Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu

210 215 220

Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala

225 230 235 240

Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln

245 250 255

Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro

260 265 270

His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala

275 280 285

Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser

290 295 300

Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys

305 310 315 320

Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu

325 330 335

Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser

340 345 350

Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu

355 360 365

Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn

370 375 380

Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu

385 390 395 400

Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys

405 410 415

Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu

420 425 430

Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys

435 440 445

Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile

450 455 460

Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala

465 470 475 480

Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe

485 490 495

His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile

500 505 510

Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu

515 520 525

Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn

530 535 540

Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr

545 550 555 560

Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala

565 570 575

Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp

580 585 590

Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala

595 600 605

Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp

610 615 620

Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe

625 630 635 640

Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu

645 650 655

Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr

660 665 670

Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu

675 680 685

Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg

690 695 700

Claims

1. 天然载脂蛋白II/I，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

2. 重组载脂蛋白II/I活性片段，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：3-6所示。

3.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

收取柞蚕血淋巴，12000×g离心后取上清，进行40%硫酸铵沉淀；离心取沉淀用50mM 柠檬酸缓冲溶液pH5.2，100mM NaCl, 5%甘油进行复溶；离心后取上清，过Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出组分；该组分用50mM PB pH8.0透析后，经HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的流出组分。

4.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀，然后于4°C，8000×g离心15min，弃上清沉淀用50mMMES，200mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2复溶并透析，透析后样品过磷酸纤维素柱，用200mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的组分；上述组分用50mM MES，100mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2透析，透析后样品于4°C，8000×g离心15min，除去沉淀，上清组分过Mono S柱，用150mM-600mM NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白组分上述组分过SuperdexTM200柱， 50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5%甘油，pH6.2 ，收集含目的蛋白组分。

5.如权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I的制备方法，其特征在于：

柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀，然后于4°C，8000×g离心15min，弃上清沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶，上羟基磷灰石柱，用磷酸根离子梯度洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析，上阴离子交换柱HiTrapTM Q，使用NaCl浓度梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分添加(NH₄)₂SO₄至浓度为2M，上苯基疏水柱，使用(NH₄)₂SO₄浓度降低梯度进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分上凝胶过滤柱Sephacryl S-100，收集含目的蛋白组分。

6.权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段的重组表达产物的基因表达方法，其特征在于，它包括（1）利用基因工程技术表达载脂蛋白II/I活性片段（2）从上述表达体系中分离纯化重组的载脂蛋白II/I活性片段，上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组载脂蛋白II/I活性组分，上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯或HPLC纯度的重组载脂蛋白II/I活性片段。

7.如权利要求6所述的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括（1）原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，（2）昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备重组载脂蛋白II/I活性片段的来源。

8.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备特异性识别Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸的微生物相关分子模式的检测试剂中的应用。

9.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备革兰阳性菌和部分真菌、革兰阴性菌的检测试剂中的应用。

10.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备酚氧化酶原激活系统抑制剂中的应用。

11.权利要求1所述的天然载脂蛋白II/I或权利要求2所述的重组载脂蛋白II/I活性片段在制备微生物及其相关分子模式检测试剂中的应用。