CN116143903B - 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肽聚糖识别蛋白‑3及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明利用蛋白分离纯化技术从柞蚕中分离纯化获得天然肽聚糖识别蛋白‑3，解析其一级结构(基因和蛋白质)后利用基因工程技术实现肽聚糖识别蛋白‑3及其衍生物或类似物或部分片段基因在宿主细胞的表达，纯化获得重组肽聚糖识别蛋白‑3及其衍生物或类似物或部分片段，免疫动物，获得相应的抗体。本发明的天然、重组肽聚糖识别蛋白‑3以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。

Description

肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及肽聚糖识别蛋白-3的结构及其获得方法与应用。具体地说，本发明涉及肽聚糖识别蛋白-3及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、影响合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白-3及其类似物或活性片段的抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术：
先天免疫系统的激活是通过一系列高度保守的模式识别受体识别病原体相关分子模式。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)家族是重要的模式识别受体，从昆虫到人类均高度保守，可识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌，在先天免疫和获得性免疫应答中发挥重要的识别和调节功能。昆虫肽聚糖识别蛋白作为模式识别受体(pattern recognition receptor，PPR)家族的一员，可识别仅存在于病原生物表面的病原相关分子模式(pathogen-related molecular patterns，PAMPs)实现对外来病原物的感知，进而选择性激活Toll途径、IMD途径、JAK-STAT途径、活性氧代谢或者黑化反应等途径清除病原物。
1996年，Yoshida等(Yoshida,H.；Kinoshita,K.；Ashida,M.Purification of aPeptidoglycan Recognition Protein from Hemolymph of the Silkworm,BombyxMori.J.Biol.Chem.1996,271(23),13854–13860.https://doi.org/10.1074/jbc.271.23.13854.)从家蚕血液中纯化得到一个具有信号肽、等电点为6.5、分子量为19kD的肽聚糖识别蛋白，也是生物界最早从昆虫中得到的小型肽聚糖识别蛋白。该蛋白存在于家蚕的血淋巴和表皮中，对肽聚糖和革兰氏阳性菌具有较高结合活性，体外结合试验结果表明，该肽聚糖识别蛋白结合肽聚糖以后能够激活酚氧化酶原系统。随后又从其他昆虫和哺乳动物中克隆得到肽聚糖识别蛋白基因，到目前为止，除后口动物和植物外，已经发现了近100种肽聚糖识别蛋白受体。
肽聚糖识别蛋白都具有一个大小约165个氨基酸残基的保守肽聚糖结合结构域，该结构域序列和微生物的T7溶菌酶具有30％的相似性。就像T7溶菌酶一样，具有酰胺酶活力的PGRP通过切开L-型肽聚糖的桥链而水解肽聚糖，另一部分肽聚糖识别蛋白因缺少一个结合锌离子的半胱氨酸而不能水解肽聚糖。昆虫的肽聚糖识别蛋白在如血细胞、脂肪体和中肠等免疫器官中均有表达，且很多都能被肽聚糖或细菌诱导上调表达，暗示其在抗菌反应中起到很重要的作用。
肽聚糖识别蛋白识别细菌细胞壁的PGN能够激活Toll受体，从而起始Toll信号通路。Toll信号通路的激活使得昆虫体内一些抗菌肽基因表达，产生的抗菌肽在对抗革兰阳性菌及真菌感染中发挥着重要作用。Toll信号通路主要被来自于革兰阳性菌细胞壁的Lys-type PGN激活，但对于来自于革兰阴性菌细胞壁的Dap-type PGN的刺激也有弱的响应。Immune Deficiency(IMD)信号通路是PGRPs参与的昆虫体内的第2条信号通路，目前已知在果蝇体内具有酰胺酶活性的PGRPs通过降解PGN，控制免疫反应的强度，如PGRP-LB、PGRP-SC1与PGRP-SC2对果蝇的IMD信号通路有负调控作用，这种负调控作用可以调整对革兰阴性菌感染的免疫反应。酚氧化酶原反应的信号通路是PGRPs参与的昆虫体内的第3条信号通路，PGRPs与PGN结合激活酚氧化酶原反应，促使伤口愈合以及黑色素的产生。
肽聚糖识别蛋白是为数不多的从低等动物到高等动物都非常保守的模式识别蛋白，对了解宿主免疫调控和免疫相关疾病研究有重要意义。
目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫肽聚糖识别蛋白-3的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。
发明内容：
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的PGRP-3，研究天然PGRP-3的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组PGRP-3及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组PGRP-3及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
本发明首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然PGRP-3。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析PGRP-3的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现PGRP-3基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组PGRP-3。同时，利用基因重组技术，获得PGRP-3的类似物或部分片段。天然、重组PGRP-3以及其类似物或部分片段能特异性识别细菌、真菌等微生物，并影响抗菌肽的合成。本发明的天然、重组PGRP-3以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本发明的天然、重组PGRP-3以及其类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对天然肽聚糖识别蛋白-3、重组肽聚糖识别蛋白-3、重组肽聚糖识别蛋白-3类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.影响抗菌肽合成及其获得的抗菌肽在生物医药领域应用。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的PGRP-3、PGRP-3活性片段是利用基因工程表达获得，包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞或乳酸菌，(2)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备PGRP-3、PGRP-3类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种肽聚糖识别蛋白-3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-3来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。
本发明另一方面提供编码所述的肽聚糖识别蛋白-3的基因。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-3的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有肽聚糖识别蛋白-3的生物学活性。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段选自Met-PGRP-3序列、Met-His6标签-PGRP-3序列、Met-PGRP-3-His6标签序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-PGRP-3-凝血酶酶切位点-GST标签序列、Met-PGRP-3-Flag标签序列、Met-Flag标签-PGRP-3序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3-His6标签序列。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-3的制备方法，天然肽聚糖识别蛋白-3(PGRP-3)的制备方法，包括：
以昆虫血淋巴作为原料，分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤一种或两种以上的组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的PGRP-3。
其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到的抽提液。
PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2～pH10，优选pH4-pH9；(3)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L～0.8mol/L，优选0.01mol/L～0.5mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响PGRP-3的生物活性。
本发明的分离分析方法包含如下一种或两种以上的组合：
1.离子交换层析分离纯化PGRP-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度为0.00mol/L～3mol/L。利用抗PGRP-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析填料，如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析填料，如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH11；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响PGRP-3的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化PGRP-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L浓度溶液进行阶段方式洗脱。利用抗PGRP-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择PGRP抗体、肽聚糖及其片段、甘露糖、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、sepharose CL-4B、脂多糖、脂磷壁酸、葡聚糖等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使PGRP-3发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得PGRP-3。
3.疏水层析分离纯化PGRP-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2-3mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2-3mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0-3.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用2.5mol/L、2.0mol/L、1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗PGRP-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化PGRP-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗PGRP-3抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-3的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.1M及以上。
5.盐析分离纯化PGRP-3
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到PGRP-3仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到PGRP-3沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；(3)在使PGRP-3处于溶解状态时，选择中性盐在5％-50％，优选10％-40％；(4)在使PGRP-3处于沉淀状态时，选择中性盐在40％-90％，优选45％-75％。
6.超滤分离纯化PGRP-3以及处理PGRP-3溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-3的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化PGRP-3。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使PGRP-3透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使PGRP-3得以分离纯化；透过超滤膜的PGRP-3溶液，再选择一定规格的超滤膜，使PGRP-3被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使PGRP-3得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使PGRP-3先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使PGRP-3透过超滤膜，从而使PGRP-3得以分离纯化。
超滤处理PGRP-3溶液的目的，是除去PGRP-3溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对PGRP-3溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使PGRP-3被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：透过PGRP-3的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa～50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按PGRP-3提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述任何一种方法所获得的PGRP-3纯度，有时无法满足相应需要。可将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
本发明按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对PGRP-3进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然PGRP-3的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得PGRP-3进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得PGRP-3分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNA pool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得PGRP-3基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得PGRP-3全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增PGRP-3染色体基因，通过基因序列测定分析获得PGRP-3染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述所获得PGRP-3的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得PGRP-3全长一级结构序列、天然PGRP-3一级结构序列。
本发明另一方面提供了重组PGRP-3活性片段、衍生物或类似物的制备
本发明所述的重组PGRP-3活性片段含有PGRP-3序列，包括：Met-PGRP-3序列、Met-His6标签-PGRP-3序列、Met-PGRP-3-His6标签序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-PGRP-3-凝血酶酶切位点-GST标签序列、Met-PGRP-3-Flag标签序列、Met-Flag标签-PGRP-3序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3-His6标签序列。
本发明的重组PGRP-3部分片段通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将PGRP-3部分片段编码DNA重组至表达载体；(2)用步骤(1)的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述重组PGRP-3部分片段的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
本发明还提供了PGRP-3及其部分片段的生物学功能及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组PGRP-3部分片段对微生物的特异性结合、对抗菌肽合成的影响作用的对比，确定了天然、重组PGRP-3部分片段的生物活性。同时，考察PGRP-3在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组PGRP-3部分片段的应用。此外，本发明也研究了天然、重组PGRP-3及其部分片段作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明所述的天然、重组PGRP-3及其部分片段获得方法常规、简单、产量高；可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为天然PGRP-3的分离纯化，其中，Lane M：Molecular weight markers；lane1：方法1纯化的天然PGRP-3；lane 2：方法2纯化的天然PGRP-3；lane 3：方法3纯化的天然PGRP-3。
图2为重组PGRP-3(原核表达体系)分离纯化电泳图谱，其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：C端后融合组氨酸标签的PGRP-3；lane 2：C端后融合组氨酸标签及凝血酶酶切位点的PGRP-3；lane 3：N端前融合GST标签的PGRP-3；lane 4：N端前融合组氨酸-SUMO标签及凝血酶酶切位点的PGRP-3。
图3为重组PGRP-3(昆虫表达体系)分离纯化电泳图谱，其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得的重组PGRP-3；lane 2：pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得的PGRP-3。
图4为PGRP-3与不同菌结合能力分析，其中，(A)：天然PGRP-3与不同菌的结合能力；(B)：重组PGRP-3与不同菌的结合能力。
图5为PGRP-3mRNA表达量与免疫相关性，其中，(A)：菌诱导后体内ApPGRP-3随时间变化表达情况的变化；(B)：菌诱导后各组织中ApPGRP-3表达情况的变化，图中Mg：中肠；Fb：脂肪体；Mt：马氏管；Hc：血细胞；Em：表皮。
图6为干扰PGRP-3对抗菌肽产生的影响，其中，(A)：干扰PGRP-3对E.coli诱导抗菌肽产生的影响；(B)：干扰PGRP-3对S.aureus诱导抗菌肽产生的影响；(C)：干扰PGRP-3对C.albicans诱导抗菌肽产生的影响，误差线为均值±标准差，实验重复3次；*代表t检验P<0.05，**代表t检验P<0.01。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1：天然PGRP-3的分离纯化
本实施例将柞蚕用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至-5℃条件下收集血淋巴。
1.方法1
收取柞蚕血淋巴，12000×g离心后取上清，进行35％硫酸铵沉淀；离心取沉淀用含200mM NaCl的50mM柠檬酸缓冲溶液pH6.0进行复溶；离心后取上清，在相同缓冲溶液条件下经DEAE-sepharose离子交换柱，以0.2-3M NaCl梯度洗脱收集含有目的蛋白的流出组分；该组分用50mM PB pH8.0透析后，经PGRP抗体亲和柱以0-3M NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的流出组分。
试验结果如图1lane1，天然PGRP-3的纯度达到电泳纯。
2.方法2
将溶于昆虫生理盐水(120mM NaCl、0.9mM CaCl2、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mMNaHCO3、1mM NaH2PO4、38.8mM葡萄糖)的真菌(白色念珠菌)、革兰阳性菌(藤黄微球菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌)混合物(10μl)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后收集菌诱导后的血淋巴，用50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5稀释10倍，流经Mono-Q离子交换层析柱，利用0-3M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5进行线性梯度洗脱。收集目的组分超滤浓缩至1mL，用10mM磷酸钠缓冲液pH4.5稀释10倍，流经Octyl-sepharose4-Fast Flow，利用10-500mM硫酸钠缓冲液pH4.5进行线性洗脱，获得目的蛋白成分。上述样品浓缩后经Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出组分。
试验结果如图1lane2，天然PGRP-3的纯度达到电泳纯。
3.方法3
柞蚕血淋巴使用70％硫酸铵沉淀，8000×g离心15min后弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶，上羟基磷灰石柱，用磷酸根离子梯度洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析，上阴离子交换柱HiTrapTM Q，使用NaCl浓度梯度(0-1.5M)进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分添加(NH4)2SO4至浓度为2M，上苯基疏水柱，使用(NH4)2SO4浓度降低梯度(0-60％)进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分经PGN-sepharose亲和层析，收集含目的蛋白组分。
试验结果如图1lane3，天然PGRP-3的纯度达到电泳纯。
实施例2：PGRP-3结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对PGRP-3进行结构解析，获得PGRP-3完整核苷酸序列及其氨基酸序列。
天然PGRP-3(成熟肽链)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码天然PGRP-3的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
利用分子生物学技术、方法获得PGRP-3全长的cDNA序列，如SEQ ID NO：3所示，编码的氨基酸序列如如SEQ ID NO：4所示。
实施例3：利用原核生物表达系统获得重组PGRP-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明PGRP-3及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
PGRP-3衍生物、类似物、活性片段结构
(1)Met-PGRP-3氨基酸序列
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
(2)Met-His6标签-PGRP-3氨基酸序列
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(3)Met-PGRP-3-His6标签氨基酸序列
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEH WRSDPKDATNHHHHHH
(4)Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3氨基酸序列
MHHHHHHLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
(5)Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列
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(6)Met-PGRP-3-凝血酶酶切位点-GST标签序列
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(7)Met-PGRP-3-Flag标签序列
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(8)Met-Flag标签-MSPH序列
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(9)Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列
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(10)Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3-His6标签序列
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATNHHHHHH。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.PGRP-3的表达载体构建
根据天然PGRP-3的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNApool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建PGRP-3基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1。以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在PGRP-3的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在PGRP-3的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在亲和层析标签与PGRP-3之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然PGRP-3蛋白结构一致的重组PGRP-3蛋白。
2.重组PGRP-3蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将PGRP-3基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导PGRP-3基因的表达，从而获得含有PGRP-3的培养液或菌体。含有PGRP-3的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组PGRP-3的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.PGRP-3基因可表达于细胞内或细胞外；4.存在于细胞内的PGRP-3需通过裂解液裂解、超声破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含PGRP-3的原料液中分离纯化重组PGRP-3及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pTYB11构建无标签PGRP-3表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，PGRP-3表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-3至电泳纯(图2-泳道1)。
(2)采用pGEX-2T构建N端前融合Flag标的PGRP-3表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-3至电泳纯(图2-泳道2)。
(3)采用SYPHU-1b构建C端后融合组氨酸标签及凝血酶酶切位点的PGRP-3表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，PGRP-3-凝血酶酶切位点-His表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液后经凝血酶酶切获得的样品作为进一步分离纯化PGRP-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-3至电泳纯(图2-泳道3)。
(4)采用pET-28a-SUMO构建N端前融合组氨酸-SUMO标签及凝血酶酶切位点的PGRP-3表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，His-SUMO-凝血酶酶切位点-PGRP-3表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液后经凝血酶酶切获得的样品作为进一步分离纯化PGRP-3的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-3至电泳纯(图2-泳道4)。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得PGRP-3，该重组PGRP-3的结构与天然的PGRP-3的结构相同。
实施例4：利用昆虫细胞表达系统获得重组PGRP-3及其类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明PGRP-3及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组PGRP-3及其类似物、活性片段
将PGRP-3及其类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-PGRP-3重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组PGRP-3在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗PGRP-3抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组PGRP-3及其类似物、活性片段
将PGRP-3及其类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-PGRP-3重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组PGRP-3在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。
实施例5：PGRP-3抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4获得的各种PGRP-3作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中PGRP-3抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了PGRP-3抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有PGRP-3抗体的血清中分离纯化不同纯度的PGRP-3抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的PGRP-3抗体，以适于不同要求的应用。
实施例6：天然PGRP-3及重组PGRP-3部分片段的生物学活性
本实施例中天然PGRP-3、重组PGRP-3活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然PGRP-3、重组PGRP-3活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然PGRP-3、重组PGRP-3活性片段的应用范围。
1.天然PGRP-3及重组PGRP-3部分片段与微生物的结合特异性
(1)天然PGRP-3与微生物的结合特异性
采用western-blotting方法考察天然PGRP-3与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。利用天然PGRP-3分别与等量的微生物孵育，采用2M NaCl洗脱后，在高温(55℃)条件下2％SDS再次洗脱组分，利用PGRP-3多克隆抗体间接检测天然PGRP-3与不同种类微生物的结合情况。结果如图4-A所示，结果表明，天然PGRP-3与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母均结合。
(2)重组PGRP-3及其部分片段与微生物的结合特异性
按照实施例6中1-(1)中所述western-blotting方法考察重组PGRP-3部分片段(Met-His6-PGRP3)与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。结果如图4-B所示，重组PGRP-3与上述三种微生物均具有结合作用，该实验结果与天然PGRP-3的实验结果一致。
上述实验说明，天然及重组PGRP-3能够与革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌发生特异性结合。采用实施例3、4中所述重组PGRP-3部分片段可获得相同的实验结果。
2.PGRP-3的表达量与先天性免疫的相关性
将E.coli、S.aureus、C.albicans三种代表性微生物等比例混合溶液注射到柞蚕体内后，以天然柞蚕组织18S rRNA作为内参基因，使用Real-time PCR方法检测3h、6h、12h、18h、24h、48h时柞蚕体内PGRP-3的表达情况，结果如图5-(A)所示，以及在柞蚕各组织中的表达情况，结果如图5-(B)所示，随微生物诱导时间变化，柞蚕体内PGRP-3mRNA的表达量逐渐增加，在18h表达量达到峰值；五种组织中，PGRP-3mRNA在表皮中的表达量最高，其次为脂肪体、马氏管和血细胞，在中肠内几乎不表达。从上述实验结果可以看出，PGRP-3可能参与了柞蚕先天性免疫防御系统，并主要在表皮和脂肪体中发挥其作用。
3.天然、重组PGRP-3对抗菌肽合成的影响
为考察PGRP-3对抗菌肽合成的影响，本实验在注射dsPGRP-3 60h下调内源PGRP-3表达后，分别向柞蚕幼虫体内注射E.coli、S.aureus、C.albicans，考察柞蚕体内抗菌肽mRNA水平的变化情况。结果如图6所示，与对照组相比，PGRP-3对不同病原体诱导的抗菌肽合成途径的影响具有差异，但绝大多数抗菌肽的合成均体现出显著上调现象。
实施例7：天然PGRP-3、重组PGRP-3活性片段及其抗体的应用
本实施例以天然PGRP-3为代表进行描述，PGRP-3活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以PGRP-3及重组PGRP-3活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展PGRP-3及重组PGRP-3活性片段及其抗体的应用范围。
1.PGRP-3及其活性片段影响抗菌肽合成途径
如实施例6中所描述，PGRP-3及其活性片段能够抑制绝大多数抗菌肽的合成。基于此，可应用于抗菌肽合成的相关领域。
2.PGRP-3及其活性片段用于微生物的检测
如实施例5中所描述，PGRP-3及其活性片段能够与部分微生物及相关分子模式结合，基于此，通过检测微生物与PGRP-3及其活性片段是否结合，检测样品中是否含有微生物或其相关分子模式。
3.PGRP-3及其活性片段抗体的应用
针对实施例5获得的PGRP-3及其活性片段的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过PGRP-3及其活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的PGRP-3免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备PGRP-3过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组PGRP-3活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的PGRP-3及其活性片段抗体。按照本实施例中的PGRP-3及其活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
上述结果表明：PGRP-3及其活性片段的抗体，通过与PGRP-3及其活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使PGRP-3及其活性片段失去了原有的生物活性，基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。

Claims (7)

1. 一种肽聚糖识别蛋白-3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白-3的基因。
3. 根据权利要求2所述的肽聚糖识别蛋白-3的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，
所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段选自Met-PGRP-3序列、Met-His6标签-PGRP-3序列、Met-PGRP-3- His6标签序列、Met- His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met-PGRP-3-凝血酶酶切位点-GST标签序列、Met-PGRP-3-Flag标签序列、Met- Flag标签-PGRP-3序列、Met- His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列、Met- His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3- His6标签序列；
Met-PGRP-3氨基酸序列如下：
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met-His6标签-PGRP-3氨基酸序列如下：
MHHHHHHADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met-PGRP-3- His6标签氨基酸序列如下：
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATNHHHHHH
Met- His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3氨基酸序列如下：
MHHHHHHLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列如下：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFELGLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIR YIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTH PDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met-PGRP-3-凝血酶酶切位点-GST标签序列如下：
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATNLVPRGSSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFEL GLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSK LPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWP LQGWQATFGGGDHPPKSD
Met-PGRP-3-Flag标签序列如下：
MADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATNDYKDDDDK
Met- Flag标签- PGRP-3序列如下：
MDYKDDDDKADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met- His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3序列如下：
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATN
Met- His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-3- His6标签序列如下：
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSADCGAVAITEWGENDLKRKDLLPSPVNVVVIQHTASPDCLSDAECVKIARAVRKHHINKLKFDDIGTSFLVGGNGKVYEGAGWKYVGAHTRGYNTISIGIAFIGDFRAKLPTPEAMDAVKNLLNCGVEQKLLSDKYHLFGHRQLTKTISPGEALQKEIEGWEHWRSDPKDATNHHHHHH。
5.权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白-3的制备方法，其特征在于，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴、血液、血细胞裂解物、淋巴液、匀浆液中的一种或两种以上的组合作为原料液，通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中一种或两种以上方法的组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的肽聚糖识别蛋白-3；
或者将编码所述的肽聚糖识别蛋白-3的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的肽聚糖识别蛋白-3。
6.权利要求4所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，其特征在于，将编码所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，分离纯化后获得重组表达的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段。
7.权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白-3或权利要求4所述的肽聚糖识别蛋白-3的衍生物或类似物或活性片段在制备微生物检测试剂中的应用。
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