CN116284332A - 一种肽聚糖识别蛋白-d、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肽聚糖识别蛋白‑D、制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。本发明利用蛋白分离纯化技术从柞蚕中分离纯化获得天然肽聚糖识别蛋白‑D，解析其一级结构(基因和蛋白质)后利用基因工程技术实现肽聚糖识别蛋白‑D及其衍生物或类似物或部分片段基因在宿主细胞的表达，纯化获得重组肽聚糖识别蛋白‑D及其衍生物或类似物或部分片段，免疫动物，获得相应的抗体。本发明的天然、重组肽聚糖识别蛋白‑D以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体可广泛应针对微生物、微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。

Description

一种肽聚糖识别蛋白-D、制备方法及其应用
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及肽聚糖识别蛋白-D的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本发明涉及肽聚糖识别蛋白-D及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、对昆虫合成不同类型抗菌肽影响等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白-D及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术：
肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)作为模式识别受体(pattern recognition receptor，PPR)家族的一员，可识别仅存在于病原生物表面的病原相关分子模式(pathogen-related molecular patterns，PAMPs)实现对外来病原物的感知，进而选择性激活Toll途径、IMD途径、JAK-STAT途径、活性氧代谢或者黑化反应等途径来清除病原物。
1996年肽聚糖识别蛋白由Yoshida等(Yoshida,H.；Kinoshita,K.；Ashida,M.Purification of a Peptidoglycan Recognition Protein from Hemolymph of theSilkworm,Bombyx Mori.J.Biol.Chem.1996,271(23),13854–13860.)在家蚕中首次发现，随后PGRPs在软体动物、棘皮动物和脊椎动物种相继发现。PGRPs含有一个或多个约165个氨基酸残基组成的PGRP结构域。该结构域与N-乙酰胞壁酸-丙氨酸酰胺酶同源，与具有酰胺酶活性的噬菌体T7溶菌酶相似性大约30％。通过结构分析发现：PGRP结构域是由位于中心区域的五个β-折叠和外围的三个α-螺旋组成的一个倒L型凹槽结构。PGRPs依据蛋白分子量大小和酰胺酶活性划分为不同的类型。按照蛋白分子量大小PGRPs分为长型、中型和短型。按照是否具有酰胺酶活性可将PGRPs划分为有催化活性的PGRPs和非催化活性的PGRPs。具有催化活性的PGRPs可以切断肽聚糖N-乙酰胞壁酸与L-赖氨酸之间的酰胺键，将肽聚糖裂解成更小的、没有免疫刺激活力的片段，进而可以降低细菌对IMD途径的刺激。而非催化活性PGRPs不能裂解肽聚糖，但可作为识别受体参与其它免疫反应。
黄粉虫的TmPGRP-D可与PGN结合并与TmGNBP1、丝氨酸蛋白酶MSP相互作用激活
Figure BDA0004108446490000011
前体剪切酶，将/>
Figure BDA0004108446490000012
前体剪切成成熟的/>
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Figure BDA0004108446490000014
与Toll途径中的Toll受体结合并激活Toll途径合成抗菌肽。与黄粉虫类似，在果蝇中PGRP-D、SD和革兰氏阴性结合蛋白-1(GNBP-1)协同检测细菌细胞壁胞外Lys型PGN，启动Toll通路的激活；而BmPGRP-S1参与激活IMD通路诱导AMPs表达。酚氧化酶级联反应导致黑色素形成参与昆虫对入侵病原微生物的防御。一些具有受体功能的PGRPs可以通过识别微生物或PAMPs参与酚氧化酶级联反应的激活。在过量表达具有识别受体功能的DmPGRP-LE和持续激活具有识别受体功能的DmPGRP-LC可以引发黑化反应。在家蚕中，BmPGRP-S1结合PGN后可参与酚氧化酶级联反应的激活；在烟草天蛾中，MsPGRP-1不仅可以识别PGN，还可以参与烟草天蛾的酚氧化酶级联反应；玉米螟PGRP-S可以在结合S.aureus和B.thuringiensis后激活酚氧化酶级联反应；棉铃虫PGRP-A也可参与酚氧化酶级联反应的激活。果蝇分泌的PGRP-SC1、-SC2和-LB具有酰胺酶活性，可以切割PGN分子。在斑马鱼体内鉴定了3个PGRP基因，分别为PGLYRP-2(或称zfPGRP2)、PGLYRP-5(zfPGRP-SC)和PGLYRP-6(zfPGRP6)，3个PGRP基因均表现出酰胺酶活性和抗菌活性。
肽聚糖识别蛋白是为数不多的从低等动物到高等动物都非常保守的模式识别蛋白，对了解宿主免疫调控和免疫相关疾病研究有重要意义。然而，目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫肽聚糖识别蛋白-D的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。
发明内容：
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的PGRP-D，研究天然PGRP-D的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组PGRP-D及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组PGRP-D及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
本发明首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然PGRP-D。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析PGRP-D的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现PGRP-D基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组PGRP-D。同时，利用基因重组技术，获得PGRP-D的类似物或部分片段。天然、重组PGRP-D以及其类似物或部分片段，能特异性识别脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物。上述结合，一方面激活昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统，另一方面影响不同类型昆虫抗菌肽的合成。本发明的天然、重组PGRP-D以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本发明的天然、重组PGRP-D以及其类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的PGRP-D、PGRP-D活性片段是利用基因工程表达获得，包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞或乳酸菌，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备PGRP-D、PGRP-D类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种肽聚糖识别蛋白-D，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-D来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。
本发明另一方面提供编码所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有肽聚糖识别蛋白-D的生物学活性。
基于上述技术方案，进一步地，所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段选自Met-PGRP-D序列、Met-His6标签-PGRP-D序列、Met-PGRP-D-His6标签序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-PGRP-D-凝血酶酶切位点-GST标签序列、Met-PGRP-D-Flag标签序列、Met-Flag标签-PGRP-D序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D-His6标签序列。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-D的制备方法，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴、血液、血细胞裂解物、淋巴液、匀浆液中的一种或两种以上的组合作为原料液，通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中一种或两种以上方法的组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的肽聚糖识别蛋白-D；
或者将编码所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的肽聚糖识别蛋白-D。
基于上述技术方案，进一步地，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中：
(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；
(2)溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；
(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或其混合溶液，碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或其混合溶液；
(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；
(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，将编码所述的肽聚糖识别蛋白-D衍生物或类似物或活性片段的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，分离纯化后获得重组表达的所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段。
基于上述技术方案，进一步地，表达体系包括原核生物系统和昆虫细胞系统，原核生物系统的宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞；昆虫细胞系统的宿主细胞为昆虫细胞；表达形式为细胞内表达或分泌形式表达。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-D或其衍生物或类似物或活性片段的抗体，以所述的天然肽聚糖识别蛋白-D或所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生。
本发明另一方面提供所述的肽聚糖识别蛋白-D或所述的肽聚糖识别蛋白-D衍生物或类似物或活性片段或所述的抗体在影响酚氧化酶原激活系统、抗菌肽合成、微生物及其相关分子模式检测中的应用。
基于上述技术方案，进一步地，所述的相关分子模式包括脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明所述的天然、重组PGRP-D及其部分片段获得方法常规、简单、产量高，可广泛应用于针对微生物、微生物相关分子模式、的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域，.针对天然肽聚糖识别蛋白-D、重组肽聚糖识别蛋白-D、重组肽聚糖识别蛋白-D类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用以及对昆虫抗菌肽合成的影响及其获得的抗菌肽在生物医药领域应用。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为天然PGRP-D的分离纯化，其中，Lane M：Molecular weight markers；lane1：方法1纯化的天然PGRP-D；lane 2：方法2纯化的天然PGRP-D；lane 3：方法3纯化的天然PGRP-D。
图2为重组PGRP-D(原核表达体系)分离纯化电泳图谱，其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：C端后融合组氨酸标签的PGRP-D；lane 2：C端后融合组氨酸标签及凝血酶酶切位点的PGRP-D；lane 3：N端前融合GST标签的PGRP-D；lane 4：N端前融合组氨酸-SUMO标签及凝血酶酶切位点的PGRP-D。
图3为重组PGRP-D(昆虫表达体系)分离纯化电泳图谱，其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得的重组PGRP-D；lane 2：pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得的PGRP-D。
图4为PGRP-D与微生物结合能力分析，其中，(A)：天然PGRP-D与不同菌的结合能力；(B)：重组PGRP-D与不同菌的结合能力。
图5为PGRP-D mRNA表达量与免疫相关性，其中，(A)：菌诱导后体内ApPGRP-D随时间变化表达情况的变化；(B)：菌诱导后各组织中ApPGRP-D表达情况的变化，图中Mg：中肠；Fb：脂肪体；Mt：马氏管；Hc：血细胞；Em：表皮。
图6为外源性重组PGRP-D对酚氧化酶原激活系统的影响，其中，HL：柞蚕血淋巴；PGRP：重组Ap-PGRP-D蛋白；MIC：微生物；误差线为均值±标准差，实验重复3次；*代表t检验P<0.05，**代表t检验P<0.01，***代表t检验P<0.001，****代表t检验P<0.0001。
图7为PGRP-D抗体对酚氧化酶原激活系统的抑制作用，，其中，HL：柞蚕血淋巴；Ab：兔源Ap-PGRP-D多克隆抗体；Micro：微生物；误差线为均值±标准差，实验重复3次；*代表t检验P<0.05，**代表t检验P<0.01，***代表t检验P<0.001，****代表t检验P<0.0001。
图8为降低内源性PGRP-D对酚氧化酶原激活系统的抑制作用，其中，DEPC：注射DEPC水的对照组；dsEGFP：注射EGFP双链RNA组；dsPGRP：注射Ap-PGRP-D双链RNA；误差线为均值±标准差，实验重复3次；**代表t检验P<0.01，***代表t检验P<0.001，****代表t检验P<0.0001。
图9为干扰PGRP-D对抗菌肽产生的影响，其中，(A)：干扰PGRP-D对E.coli诱导抗菌肽产生的影响；(B)：干扰PGRP-D对S.aureus诱导抗菌肽产生的影响；(C)：干扰PGRP-D对C.albicans诱导抗菌肽产生的影响，误差线为均值±标准差，实验重复3次；*代表t检验P<0.05，**代表t检验P<0.01。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1：天然PGRP-D的分离纯化
本实施例将柞蚕用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至-5℃条件下收集血淋巴。
1.方法1
收取血淋巴，12000×g离心后取上清。进行50％硫酸铵沉淀；离心取沉淀用50mM柠檬酸缓冲溶液pH5.2，100mM NaCl,5％甘油进行复溶；离心后取上清，过Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出组分；该组分用50mM PB pH8.0透析后，经PGRP抗体亲和柱以0-3M NaCl梯度洗脱，收集含目的蛋白的流出组分。
试验结果如图1lane1，天然PGRP-D的纯度达到电泳纯。
2.方法2
将溶于昆虫生理盐水(120mM NaCl、0.9mM CaCl2、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mMNaHCO3、1mM NaH2PO4、38.8mM葡萄糖)的真菌(白色念珠菌)、革兰阳性菌(藤黄微球菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌)混合物(10μl)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后收集菌诱导后的血淋巴，用50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5稀释10倍，流经Mono-Q离子交换层析柱，利用0-3M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5进行线性梯度洗脱。收集目的组分超滤浓缩至1mL，用10mM磷酸钠缓冲液pH4.5稀释10倍，流经Octyl-sepharose4-Fast Flow，利用10-500mM硫酸钠缓冲液pH4.5进行线性洗脱，获得目的蛋白成分。
试验结果如图1lane2，天然PGRP-D的纯度达到电泳纯。
3.方法3
柞蚕血淋巴使用70％硫酸铵沉淀，8000×g离心15min后弃上清。沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶，上羟基磷灰石柱，用磷酸根离子梯度洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析，上阴离子交换柱HiTrapTM Q，使用NaCl浓度梯度(0-1M)进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分添加(NH4)2SO4至浓度为2M，上苯基疏水柱，使用(NH4)2SO4浓度降低梯度(0-50％)进行洗脱，收集含目的蛋白组分；上述组分经PGN-sepharose亲和层析，收集含目的蛋白组分。
试验结果如图1lane3，天然PGRP-D的纯度达到电泳纯。
实施例2：PGRP-D结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对PGRP-D进行结构解析，获得PGRP-D完整核苷酸序列及其氨基酸序列。
天然PGRP-D(成熟肽链)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码天然PGRP-D的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
利用分子生物学技术、方法获得PGRP-D全长的cDNA序列，如SEQ ID NO：3所示，编码的氨基酸序列如如SEQ ID NO：4所示。
实施例3：利用原核生物表达系统获得重组PGRP-D及其类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明PGRP-D及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
PGRP-D衍生物、类似物、活性片段结构
(1)Met-PGRP-D氨基酸序列
MYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(2)Met-His6标签-PGRP-D序列
MHHHHHHYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(3)Met-PGRP-D-His6标签序列
MYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAAC YTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSESHHHHHH
(4)Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列
MHHHHHHLVPRGSYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(5)Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFELGLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(6)Met-PGRP-D-凝血酶酶切位点-GST标签序列
MYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSESLVPRGSILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFELGLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
(7)Met-PGRP-D-Flag标签序列
MYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSESDYKDDDDK
(8)Met-Flag标签-MSPH序列
MDYKDDDDKYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVI HHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(9)Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSES
(10)Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D-His6标签序列
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSYPSIFSVESVGNEVPPYDFPFVSRSQWNARKPNETLPLQTPVPYVVIHHSATPAACYTKEECCIAMRSMQNFHIDGRRWWDIGYHFGVGSDATVYEGRGWSALGAHSLHFNSVSIGICVIGDWTGSLPPADQIKATKSLIAAGVDLGYIRPDYKLVGHRQVRATECPGDALYENIKTWPHYSAFPSSDKDLINVKELPESFRQKYFNKTKSESHHHHHH。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.PGRP-D的表达载体构建
根据天然PGRP-D的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建PGRP-D基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1。以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在PGRP-D的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在PGRP-D的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在亲和层析标签与PGRP-D之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然PGRP-D蛋白结构一致的重组PGRP-D蛋白。
2.重组PGRP-D蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将PGRP-D基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导PGRP-D基因的表达，从而获得含有PGRP-D的培养液或菌体。含有PGRP-D的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组PGRP-D的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.PGRP-D基因可表达于细胞内或细胞外；4.存在于细胞内的PGRP-D需通过裂解液裂解、超声破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含PGRP-D的原料液中分离纯化重组PGRP-D及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pET-19b构建C端后融合组氨酸标签的PGRP-D基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，PGRP-D-His表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-D的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-D至电泳纯(图2lane 1)。
(2)采用pET-28a(+)构建C端后融合组氨酸标签及凝血酶的PGRP-D基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-D的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-D至电泳纯(图2lane 2)。
(3)采用pGEX4T-1构建N端前融合GST标签的PGRP-D表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，GST-PGRP-D表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-D的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-D至电泳纯(图2lane 3)。
(4)采用pET-28a-SUMO构建N端前融合组氨酸-SUMO标签及凝血酶酶切位点的PGRP-D表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，His-SUMO-凝血酶酶切位点-PGRP-D表达于胞内。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-D至电泳纯(图2lane 4)。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得PGRP-D，该重组PGRP-D的结构与天然的PGRP-D的结构相同。
实施例4：利用昆虫细胞表达系统获得重组PGRP-D及其类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明PGRP-D及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组PGRP-D及其类似物、活性片段
将PGRP-D及其类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-PGRP-D重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组PGRP-D在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗PGRP-D抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组PGRP-D及其类似物、活性片段
将PGRP-D及其类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-PGRP-D重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组PGRP-D在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。
实施例5：PGRP-D抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4获得的各种PGRP-D作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中PGRP-D抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了PGRP-D抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有PGRP-D抗体的血清中分离纯化不同纯度的PGRP-D抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的PGRP-D抗体，以适于不同要求的应用。
实施例6：天然PGRP-D及重组PGRP-D部分片段的生物学活性
本实施例中天然PGRP-D、重组PGRP-D活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然PGRP-D、重组PGRP-D活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然PGRP-D、重组PGRP-D活性片段的应用范围。
1.天然PGRP-D及重组PGRP-D部分片段与微生物的结合特异性
(1)天然PGRP-D与微生物的结合特异性
采用western-blotting方法考察天然PGRP-D与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。利用天然PGRP-D分别与等量的微生物孵育，采用1M NaCl洗脱后，在高温(55℃)条件下2％SDS再次洗脱组分，利用PGRP-D多克隆抗体间接检测天然PGRP-D与不同种类微生物的结合情况。结果如图4-A所示，天然PGRP-D与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母均结合。
(2)重组PGRP-D及其部分片段与微生物的结合特异性
按照实施例6中1-(1)中所述western-blotting方法考察重组PGRP-D部分片段与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。结果如图4-B所示，重组PGRP-D与上述三种微生物均具有结合作用，该实验结果与天然PGRP-D的实验结果一致。
上述实验说明，天然及重组PGRP-D能够与革兰阳性菌、部分革兰阴性菌、部分真菌发生特异性结合。采用实施例3、4中所述重组PGRP-D部分片段可获得相同的实验结果。
2.PGRP-D的表达量与先天性免疫的相关性
将E.coli、S.aureus、C.albicans三种代表性微生物等比例混合溶液注射到蚕体后，以天然柞蚕组织18S rRNA作为内参基因，使用Real-time PCR方法检测3h、6h、9h、12h、18h、24h时柞蚕体内PGRP-D的表达情况，结果如图5-A所示，以及在柞蚕各组织中能够表达情况，结果如图5-B所示，随微生物诱导时间变化，柞蚕体内PGRP-D mRNA的表达量逐渐增加，在12h表达量达到峰值；五种组织中，PGRP-D mRNA在表皮中的表达量最高，其次为脂肪体、中肠和血细胞，在中肠内几乎不表达。从上述实验结果可以看出，PGRP-D参与了柞蚕先天性免疫防御系统，并主要在表皮和脂肪体中发挥其作用。
3.天然、重组PGRP-D及其抗体对酚氧化酶原激活系统的影响
(1)重组PGRP-D及其片段对酚氧化酶原激活系统的影响
使用六种可溶性PAMPs与三种微生物考察重组PGRP-D对酚氧化酶原激活系统的影响，结果如图6所示，与血淋巴+Tris-HCl缓冲溶液对照组相比，PAMPs及微生物均能显著激活PPO-AS；同时加入外源重组PGRP-D后，各实验组均表现出了PO活力显著上升的现象。
(2)体内干扰PGRP-D表达对酚氧化酶原激活系统的影响
采用RNAi技术减少内源性PGRP-D的表达，进一步考察内源性天然PGRP-D对PPO-AS的影响。结果如图8所示，与注射DEPC水对照组和dsEGFP对照组相比，天然PGRP-D干扰后的各实验组中PO活力显著下降。
(3)抗PGRP-D抗体对酚氧化酶原激活系统的影响
使用兔源抗PGRP-D多克隆抗体封闭内源性天然PGRP-D蛋白，通过六种可溶性PAMPs与三种微生物考察内源性PGRP-D对酚氧化酶原激活系统的影响。结果如图10所示，与柞蚕血淋巴+Tris-HCl缓冲溶液对照组相比，PAMPs及微生物能显著激活PPO-AS；同时加入抗PGRP-D多克隆抗体后，各实验组均表现出了PO活力显著下降的现象。
4.天然、重组PGRP-D对抗菌肽合成的影响
为考察PGRP-D对抗菌肽合成的影响，本实验在注射dsPGRP-D 72h下调内源PGRP-D表达后，分别向柞蚕幼虫体内注射E.coli、S.aureus，考察柞蚕体内抗菌肽mRNA水平的变化情况。结果如图9所示，与对照组相比，干扰PGRP-D实验组注射E.coli后，抗菌肽Defensin、Gloverin、Attacin、Lebocin的mRNA水平均显著下调。而干扰PGRP-D实验组注射S.aureus后，抗菌肽Defensin、Gloverin、Attacin、Lebocin的mRNA水平均显著上调。上述结果表明，PGRP-D对不同病原体诱导的抗菌肽合成途径的影响具有明显差异。
实施例7：天然PGRP-D、重组PGRP-D活性片段及其抗体的应用
本实施例以PGRP-D为代表进行描述，PGRP-D活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以PGRP-D及重组PGRP-D活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展PGRP-D及重组PGRP-D活性片段及其抗体的应用范围。
1.PGRP-D及其活性片段影响酚氧化酶原激活系统与抗菌肽合成途径
如实施例6中所描述，PGRP-D及其活性片段能够激活酚氧化酶原的激活，并对不同微生物诱导的抗菌肽合成产生不同影响。基于此，可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统、以及抗菌肽合成的相关领域。
2.PGRP-D及其活性片段用于微生物的检测
如实施例5中所描述，PGRP-D及其活性片段能够与部分微生物及相关分子模式结合，基于此，通过检测微生物与PGRP-D及其活性片段是否结合，检测样品中是否含有微生物或其相关分子模式。
3.PGRP-D及其活性片段抗体的应用
针对实施例5获得的PGRP-D及其活性片段的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过PGRP-D及其活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的PGRP-D免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备PGRP-D过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组PGRP-D活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的PGRP-D及其活性片段抗体。按照本实施例中的PGRP-D及其活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
如实施例6中所描述，PGRP-D及其活性片段可以激活酚氧化酶原的激活，而利用PGRP-D及其活性片段的抗体封闭PGRP-D，能够显著抑制酚氧化酶的活性。基于此，可通过利用PGRP-D及其活性片段抗体调整酚氧化酶的活性，进而可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统的相关领域。
上述结果表明：PGRP-D及其活性片段的抗体，通过与PGRP-D及其活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使PGRP-D及其活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。

Claims (10)

1.一种肽聚糖识别蛋白-D，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白-D，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白-D来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。
3.编码权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因。
4.根据权利要求3所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有肽聚糖识别蛋白-D的生物学活性。
6.根据权利要求5所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段选自Met-PGRP-D序列、Met-His6标签-PGRP-D序列、Met-PGRP-D-His6标签序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-PGRP-D-凝血酶酶切位点-GST标签序列、Met-PGRP-D-Flag标签序列、Met-Flag标签-PGRP-D序列、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D序列、Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-PGRP-D-His6标签序列。
7.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白-D的制备方法，其特征在于，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴、血液、血细胞裂解物、淋巴液、匀浆液中的一种或两种以上的组合作为原料液，通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中一种或两种以上方法的组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的肽聚糖识别蛋白-D；
或者将编码所述的肽聚糖识别蛋白-D的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的肽聚糖识别蛋白-D。
8.权利要求5或6所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，其特征在于，将编码所述的肽聚糖识别蛋白-D衍生物或类似物或活性片段的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，分离纯化后获得重组表达的所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段。
9.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白-D或权利要求5或6所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段的抗体，其特征在于，以所述的天然肽聚糖识别蛋白-D或所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生。
10.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白-D或权利要求5或6所述的肽聚糖识别蛋白-D的衍生物或类似物或活性片段或权利要求9所述的抗体在影响酚氧化酶原激活系统、抗菌肽合成、微生物及其相关分子模式检测中的应用。
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