CN105132431A - 一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白。本发明还公开了一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的制备方法。本发明还公开一种所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备广谱抗菌类药物、免疫增强剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。本发明的蛋白Cs-PGRP具有光谱的杀菌效果，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有明显的抑菌杀菌作用，在开发新型抗菌药物、饲料添加剂以及免疫增强剂等方面具有潜在的应用价值。

Description

一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因开放阅读框的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，重组蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的杀菌抑菌作用的研究。同时，还涉及到该重组蛋白作为一种新型抗菌药物、饲料添加剂以及免疫增强剂在生产中的应用价值。

背景技术

1996年Yoshida等从家蚕纯化出了一个分子量为19kDa的蛋白质，该蛋白能够结合G⁺细菌和肽聚糖（PGN）并能够激活过氧化物酶级联反应，将其命名为肽聚糖识别蛋白（PGRPs）。之后，在鱼类、鼠和人中均已克隆得到PGRP分子，表明PGRP是一类进化保守的蛋白质家族。PGRP作为一种PRR分子，在机体抵御细菌类病原体中发挥着重要的作用。

通过对果蝇基因组进行分析显示，在果蝇中有13个PGRP基因至少编码17个PGRP蛋白。根据PGRP氨基酸长度的不同，PGRP可以分为长型（PGRP-L）和短型（PGRP-S）两种。果蝇中有7种PGRP-S和10种PGRP-L。非洲按蚊有7种PGRP基因，其中有3个PGRP基因编码3种PGRP-S，4个PGRP基因编码7个PGRP-L。在斑马鱼中目前报道了6种PGRP，包括PGRP-SC2，-SC1a，-L，PGRP-2A，-2B和PGRP-6。目前，在哺乳类中只发现了4种PGRP蛋白，分别是PGLYRP-1、-2、-3和-4，其中PGLYRP-1为短型PGRP，PGLYRP-2为长型PGRP，PGLYRP-3和-4长度介于短型和长型之间，为中间型PGRP。

尽管非脊椎动物和脊椎动物的PGRP在结构上较为相似，但是且具有不同的功能。昆虫中的PGRP具有细胞激活、吞噬和水解PGN的功能。具有细胞激活作用的PGRP（如果蝇的PGRP-SA、PGRP-SD和PGRP-SC1）通过激活Toll或Imd信号通路诱导抗菌肽表达而发挥抗菌作用。有些PGRP如蚕的PGRP-S则通过激活酚过氧化酶原级联反应诱导抗菌肽表达。其他的PGRP如果蝇的PGRP-SC1、PGRP-LB、和PGRP-SB1具有N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶活性，能够能水解细菌中N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸之间的酰胺键，将活性肽聚糖分子转变为没有活性的肽聚糖片断，而将肽聚糖清除。昆虫中只有PGRP-SB1同时具有酰胺酶和杀菌作用，但是只对一种细菌Bacillusmegaterium具有杀菌作用，而该功能有可能是依赖其酰胺酶活性产生的。哺乳类中的PGRP具有酰胺酶和杀菌活性，其中PGLYRP-2具有酰胺酶活性；另外的PGLYRP-1，-2，和-3具有抗菌活性，能够对多种G⁺和G^-具有杀菌作用。相对于昆虫的PGRP，哺乳类中的PGRP广谱杀菌作用并不依赖其酰胺酶活性。

同高等脊椎动物一样，鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害，通过固有免疫反应和适应性免疫反应来维持机体的正常功能及自身内环境的稳定。研究显示，鱼类是最早具有适应性免疫的低等脊椎动物。但，相对适应性免疫系统而言，鱼类的固有免疫系统更为完善，在防御外界病原入侵的过程中，发挥着更为关键的作用。由于鱼类特殊的进化地位以及一些重要的生物学特性，已成为研究免疫系统进化的重要模式生物。目前，借鉴人体免疫学预防各种疾病的成功经验，采用科学而环保的免疫学方法来防治鱼类疾病，已成为鱼病学研究者的共识。

相对于昆虫和哺乳类而言，鱼类PGRP的研究起步相对较晚。但是，研究显示，鱼类中的PGRP功能较为特殊，同时具有酰胺酶和杀菌功能。本发明中的半滑舌鳎PGRP为长型肽聚糖识别蛋白，其重组蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌均具有较强的抗菌功能。PGRPs在鱼类中的研究，将为进一步揭示固有免疫系统的分子进化及作用途径，广谱抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。

半滑舌鳎，为近海名贵的大中型经济鱼类，我国主要集中于渤海、黄海海域。因其肉嫩味美、营养丰富，深受人们的喜爱。迄今，人们对半滑舌鳎的免疫学方面的研究相对较少。

发明内容

发明目的：本发明对半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白（Cs-PGRP）基因编码区进行原核重组，对其蛋白功能进行研究，深入探讨Cs-PGRP的杀菌抑菌活性，为抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。

本发明的第一个目的是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：4所示。

本发明的另一个目的在于提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

本发明的又一个目的是提供半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的制备方法。

本发明的又一目的是提供一种所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备广谱抗菌类药物、免疫增强剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：4所示。

一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

含有所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

所述的重组表达载体，将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的重组表达载体。

所述大肠杆菌表达载体为pET-32a。

一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白中的应用。

一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）利用带有限制性内切酶位点的引物CsExPGRP-F和CsExPGRP-R扩增半滑舌鳎Cs-PGRP基因开放阅读框片段得到PCR扩增产物；其碱基序列如SEQIDNO：4所示。

2）将PCR扩增产物和pET32a经KpnI和HindIII双酶切，连接后转化表达菌株BL21（DE3）得到重组子；

3）将重组子进行IPTG诱导表达，超声波破碎收集菌体得到重组蛋白，经纯化、复性后得到具有抗菌活性的肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP。

一种所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备广谱抗菌类药物、免疫增强剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

（1）Cs-PGRP蛋白对革兰氏阳性细菌的抑菌杀菌效果：

低浓度的Cs-PGRP蛋白对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，高浓度则具有杀菌作用。当在培养基中加入60μg/mL的重组蛋白时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长明显受到了抑制；当向培养基中加入90μg/mL的重组蛋白时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌几乎无法生长，8小时抑菌率为80.9%和77.9%。

（2）Cs-PGRP蛋白对革兰氏阴性细菌的抑菌杀菌效果

当在培养基中加入60μg/mL的重组蛋白时，大肠杆菌的生长同样受到了抑制；当向培养基中加入90μg/mL的重组蛋白时，大肠杆菌的生长受到了明显抑制，8小时抑菌率为74.8%。

附图说明

图1半滑舌鳎PGRP-L基因用于原核表达片段的电泳结果；泳道1:csPGRP-L扩展片段；M:DNA分子量标准（DL2000）；

图2IPTG诱导pET32a-csPGRP-L表达重组蛋白的SDS-PAGE分析；泳道1-4分别为0.5mMIPTG诱导后0、2、4和6h；M：蛋白质分子量标准；

图3半滑舌鳎长型PGRP重组蛋白纯化；泳道1：纯化后的半滑舌鳎长型PGRP重组蛋白；M：半滑舌鳎长型PGRP重组蛋白；

图4：半滑舌鳎Cs-PGRP对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图5：半滑舌鳎Cs-PGRP对枯草芽孢杆菌生长的影响；

图6：半滑舌鳎Cs-PGRP对大肠杆菌生长的影响。

具体实施方式

实施例1：表达载体的构建

采用特异性引物CsExPGRP-F（GAAGGTACCGTGGTCCTTGCCCAAGATGG）和CsExPGRP-R（GTCAAGCTTGTCCACTGCATGACGTGACGG）扩增CsPGRPcDNA序列。其中上游引物含有KpnI酶切位点（GGTACC），下游引物含有HindIII酶切位点（AAGCTT）。PCR反应体系：25μL反应体积中包括125μMdNTPs各125μM，上下游引物各0.2μM，12UExTaq酶，1μL半滑舌鳎肝脏cDNA(补水至总体积25μL)。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃40s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。对扩增的目的片段进行回收纯化。与pMD-18-T载体连接，构建亚克隆。转化大肠杆菌DH5α筛选阳性克隆，提取质粒；使用双酶切亚克隆质粒。同时，将表达载体pET-32a同样进KpnI和HindIII双酶切。采用胶回收试剂盒对酶切产物纯化回收。将酶切的目的片段与酶切后的pET-32a连接，完成表达载体的构建。参见图1半滑舌鳎PGRP-L基因用于原核表达片段的电泳结果。

实施例2：重组蛋白的表达、纯化和复性

将构建好的重组表达载体转化宿主菌BL21（DE3），筛选阳性克隆。通过测序确认表达框的正确后，挑取单克隆细胞，接种于500mlLB培养液中，在37℃条件下培养至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度为1mmol/l，37℃继续诱导，于诱导后2h、4h和6h取菌液各1ml。离心去上清，加入80μl水和20μl5×蛋白上样buffer混合，沸水中变性10min。离心后冰上放置5分钟，采用SDS-PAGE电泳对表达产物进行鉴定。

4℃下10000g离心5min收集菌体，收集的菌体按每100ml培养基所得菌体加入10ml1×结合缓冲液（不含尿素）冰浴30min，超声波破碎30min，重悬菌体。4℃，13000g离心15min，将沉淀重悬于10ml1×结合缓冲液，重复上述步骤。加入6ml含6mol/l尿素的1×结合缓冲液重悬沉淀。冰浴1h。4℃13000g离心30min。参见图2IPTG诱导pET32a-csPGRP-L表达重组蛋白的SDS-PAGE分析。

用3ml灭菌的去离子水润湿、清洗蛋白纯化柱，再加入1mlHis·BindResin树脂悬液，待自然沉降后，先后加入3ml灭菌双蒸水，2.5ml1×离子化缓冲液，1.5ml含6mol/l尿素的1×结合缓冲液，以清洗、离子化和平衡纯化柱。待结合缓冲液下降至层析介质表面，小心加入包涵体溶液，让缓冲液缓慢流出，控制流速5ml/h；再依次用5ml含6mol/l尿素的1×结合缓冲液、3ml含6mol/l尿素的1×漂洗结合缓冲液漂洗；然后加2.5ml含6mol/l尿素的1×洗脱缓冲液，按照咪唑浓度由低向高进行梯度洗脱，每0.5ml收集一管，纯化的蛋白存在于洗脱液中。经SDS-PAGE电泳检测其纯度和浓度。

将变性纯化产物经50mMTris-HCl（pH8.0）、0.6M精氨酸、1MPPS、5mM巯基乙醇、10%甘油复性。采用Brafford法测定重组蛋白浓度为2mg/mL。参见图3半滑舌鳎长型PGRP重组蛋白纯化后的电泳图。

本发明的CsPGRP蛋白序列特征：

长度：481个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线形

特性：分子量为53.78kDa，等电点为6.31，其中1-21为氨基酸为信号肽序列。成熟肽分子量为51.45kDa，等电点为6.32。具有保守的PGRP结构域。

来源：半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）

实施例3：

CsPGRP蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制试验：试验共分为空白对照组、Tris-HCl对照组、60μg/mL重组蛋白组和90μg/mL重组蛋白组。分别向对处于对数生长期的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌LB液体培养基（含有5μMZnSO₄）中加入终浓度为60μg/mL和90μg/mL重组蛋白、Tris-HCl，37℃培养，分别检测0h、4h、8h、12h和24hOD₆₀₀值，每个实验组设三个重复，根据3次测得的结果取平均值作图。参见图4、图5、图6，通过本试验观察，显示低浓度的CsPGRP对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌村子抑制作用，高浓度则具有杀菌作用。8h测得90μg/mL重组蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌率分别为80.9%、77.9%和74.8%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO：4所示。

2.一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

3.含有权利要求1所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pET-32a。

6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.权利要求1所述的DNA序列、权利要求4所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白中的应用。

8.一种半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP基因编码蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）利用带有限制性内切酶位点的引物CsExPGRP-F和CsExPGRP-R扩增半滑舌鳎Cs-PGRP基因开放阅读框片段得到PCR扩增产物；其碱基序列如SEQIDNO：4所示；

2）将PCR扩增产物和pET32a经KpnI和HindIII双酶切，连接后转化表达菌株BL21（DE3）得到重组子；

3）将重组子进行IPTG诱导表达，超声波破碎收集菌体得到重组蛋白，经纯化、复性后得到具有抗菌活性的肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP。

9.一种权利要求2所述的半滑舌鳎肽聚糖识别蛋白Cs-PGRP在制备广谱抗菌类药物、免疫增强剂、保健品、饲料添加剂方面的应用。