CN101649311B - 人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制备方法及其在防治奶牛乳房炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，同时还提供了其基因工程制备方法，本发明进一步提供了该融合蛋白生物制剂在防治奶牛乳房炎中的应用，通过基因重组方式以融合蛋白的形式将人溶菌酶和抗菌肽Catesbeianin-1基因连接至高效真核表达载体上，进一步增强融合蛋白的抗菌和抗病毒活性，得到具有更高活性的抗菌和抗病毒的重组蛋白，并将此融合蛋白在防治奶牛乳房炎中应用，开发一种无化药残留，无抗生素残留和低耐药性的防治奶牛乳房炎的新型药物。

Description

人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制备方法及其在防治奶牛乳房炎中的应用

技术领域

本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，同时还提供了其基因工程制备方法，本发明进一步提供了该融合蛋白生物制剂在防治奶牛乳房炎中的应用，属于兽医学生物制药领域。

背景技术

奶牛乳房炎是奶牛最常见、防治最难、花费最多的疾病之一，给奶牛业生产造成了严重的危害。严重影响牛奶的品质，间接影响人体健康，给奶牛业带来巨大的经济损失。

目前常用的治疗奶牛乳房炎的药物为抗生素，如环丙沙星、青霉素等，但是由于抗生素长期使用造成了严重的耐药现象，近几年凝固酶阴性葡萄球菌的比例上升，其中葡萄球菌的耐药率达90％以上，直接导致乳房炎的治疗效果显著下降。同时，抗生素在乳中残留严重危害人类健康，如果用含抗生素的奶做酸奶或奶酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。我国食品卫生法规定，在应用抗生素期间和停药后5天内的乳不能食用。因此，抗生素的疗效越来越差，应用范围也受到很大限制。

本发明涉及的人溶菌酶是人体内的一种蛋白质，和人体具有天然相容性，在临床上应用时，比其它溶菌酶更安全，且没有刺激性和副作用。抗菌肽又叫抗微生物肽，是哺乳动物防御系统的一个重要组成部分，具有热稳定性好，水溶性好，广谱杀菌的特点，对较大的离子强度和较低或较高的PH值都有较强的抗性。

近年来虽然有报道克隆人溶菌酶基因进行基因工程表达及探讨转基因小鼠表达人溶菌酶的研究，也有报道有关抗菌肽基因以及与其它相关基因融合的克隆和表达，但未见将人溶菌酶和抗菌肽融合表达产物用于治疗奶牛乳房炎的研究，也没有和本项目相关内容的专利公开。

发明内容

本发明公开一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，为一种新的融合蛋白。

本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，采用基因工程方法生产生物制剂。

本发明进一步公开了该融合蛋白在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途。

本发明的人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，其特征在于它是由人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1在基因水平融合后表达的重组蛋白：所述的人溶菌酶氨基酸序列如SEQ1D NO.1所示，抗菌肽氨基酸序列为SEQ 1D NO.2序列所示，连接肽氨基酸序列为SEQ 1D NO.3序列所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白氨基酸序列为SEQ1D NO.4所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白通过人溶菌酶-15个柔性氨基酸的连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1的方式连接。

本发明人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

1、从人胎盘组织中克隆人溶菌酶基因至pMD18T载体，通过设计引物PCR，获得人溶菌酶基因；

2、采用人工合成方法获得抗菌肽Catesbeianin-1基因以及连接肽基因；

3、通过酶切连接的方法把人溶菌酶基因，连接肽基因和抗菌肽Catesbeianin-1基因连接，得到人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因；

4、人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因与经过EcoR1和Xbal 1双酶切的pPICZαA载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α中，通过PCR和双酶切鉴定，筛选阳性克隆送至上海生物工程测序；

5、将测序正确的重组质粒pPICZαA-hlyz-linker-Catesbeianin-1电转化至酵母宿主菌GS115中，通过Zeocin抗生素的筛选获得高效酵母表达菌株；

6、挑取阳性酵母菌甲醇诱导表达，收获表达上清，经SDS-PAGE和western-blot鉴定，获得人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白。

以下实验表明人溶菌酶-Catesbeianin-1抗菌肽融合蛋白(简称：rhlyz-Catesbeianin-1)对乳房炎的治疗效果：

实验例1

rhlyz-Catesbeianin-1对试验性小鼠乳房炎治疗

1.实验动物与分组方法

50只40日龄健康昆明系小白鼠(购自长春高新实验动物中心)，体重40±2g，没有配种经历。饲喂市售饲料，自由饮水。适应性饲养一周后，将50只昆明小鼠随机抽取10只设为空白组(n＝10，不作任何处理)，将另40只小鼠随机分成2个菌组，每组20只，分别为金黄色葡萄球菌组、大肠杆菌组；再将每个菌组的20只小鼠随机分成对照组(Con)n＝10和实验组(T)n＝10。对照组为注射生理盐水组，实验组为注射rhlyz-Catesbeianin-1组。

2.菌种

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，本实验室从长春地区患临床乳房炎奶牛的乳汁中经分离鉴定冻干保存的地方菌株。

3.乳腺基部注射法

将每一实验组的20只小鼠进行乳腺基部注射，细菌接种方法如下：左手将小鼠仰面固定，用75％酒精棉球对第四对乳腺及周围皮肤进行消毒，将稀释好的细菌悬液从第四对乳腺的乳房基部小角度插入，轻挑针尖至乳头正下方，边退出边注射，注射0.05mL菌悬液，感到稍有阻力则表示已注入乳房内，记录注射时间。24h后，同菌组中，任选10只发病小鼠作为实验组，在第四对乳腺分别注射2MIC质量浓度的rhlyz-Catesbeianin-1蛋白0.05mL，每隔四小时注射一次，共注射3次，另10只作为对照组，在第四对乳腺注射相同剂量的生理盐水，注射方法同上，从第一次注射算起24h后剖杀。

4测定指标及方法

4.1.临床症状变化

剖杀前，对照组小鼠精神沉郁，被毛蓬乱，活动较少，不断舔拭腹部，实验组和空白组小鼠临床症状不明显，活动较正常。

4.2剖检变化

空白组(不接菌不治疗)乳腺组织粘膜潮红色，乳腺组织支持血管较细。

对照组(接菌不治疗)病变较明显，四种细菌接种组乳腺组织均有肿大，变硬，出血，支持乳腺组织的血管变粗，程度稍有不同，金黄色葡萄球菌组病变较明显，出血较严重，大肠杆菌组次之。

实验组(接菌治疗)未见明显病理变化。

4.3.病理切片结果

对照组金黄色葡萄球菌组和大肠杆菌组乳腺组织结构崩塌，间质变宽，不可辨认，大量炎性细胞浸润在乳腺小叶间质、腺泡间、腺泡腔内及血管周围。

实验组乳腺组织结构逐渐恢复，炎性细胞减少。

空白组无异常。如图3所示。

4.4免疫组化检测rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白

采集小鼠乳腺组织制作石蜡切片，用兔抗人溶菌酶多克隆抗体作为第一抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为第二抗体、使用SP试剂盒、DAB发色对切片进行免疫组化染色，结果表明在注射rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白的小鼠乳腺上皮细胞明显着色，表明注射rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白的小鼠乳腺上皮细胞中有大量融合蛋白存在，正常小鼠染色结果中也有轻微着色，原因为小鼠自身分泌乳汁中即含有微量溶菌酶。如图4所示。

4.5乳腺组织研磨液平板培养结果

将乳腺组织研磨液稀释10³倍后，接种，并标记对应的小数组别及分组，在37℃培养18-24h后计数活菌数，对照组乳腺组织研磨液培养物中均有菌落长出，实验组中有部分乳腺组织研磨液培养物中有菌落长出。根据乳腺组织研磨液培养物的接种结果可推算出融合蛋白相对应各菌组的治愈率，金黄色葡萄球菌性乳腺炎的治愈率为80％，大肠杆菌组乳腺炎的治愈率为60％。

实验例2

rhlyz-Catesbeianin-1对奶牛乳房炎治疗

1、试验动物

吉林省吉林市某奶牛场泌乳期黑白花奶牛。

2、实验试剂与药品

CMT奶牛隐性乳房炎诊断试剂配制：称取十二烷基磺酸钠4g，氢氧化钠1.5g，溴甲酚紫0.01g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，室温保存。青霉素和链霉素注射液，乳炎消，江苏长青兽药有限公司生产，纯度为90％的rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白。

3、对隐性乳房炎的治疗

经CMT检测反应判为+++的奶牛分成三组，每组5头奶牛。第一组乳池内注射20毫克rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白，第二组乳池内注射100万单位青霉素和25万单位链霉素，第三组乳池内注射15毫升中药乳炎消，每天注射1次，共注射3次。以CMT反应下降1个以上+号为判断依据，用药一周后四个治疗组的有效率分别为4/5、5/5和3/5，十天后的有效率分别为3/5、3/5和2/5；三个治疗组乳汁的细菌总数、金黄色葡萄球菌数、链球菌数和大肠杆菌数均较治疗前有明显下降；在治疗期间的7天内，四个治疗组的平均产奶量分别较治疗前增加2.73、2.91和1.93公斤/头/天；在随后的7天内，四个治疗组的平均产奶量分别较治疗前增加2.79、2.91和0.30公斤/头/天。

试验结果表明，人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白治疗奶牛乳房炎的效果与抗生素合剂接近。

4、经抗生素治疗无效的乳房炎的治疗

选择临床常用抗生素(青霉素治疗一周)治疗无效的乳房炎乳区10个，乳池内注射rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白40毫升(40毫克)，每天注射1次，共注射3次。结果在注射后第七天时，除2个乳区的临床症状无改善外，其余乳区的临床表现均有不同程度的减轻，包括红、肿、热、痛消失，乳汁颜色及PH恢复正常，CMT检测结果显示，治疗有效率为40％(4/10)。

试验结果表明，人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白对经抗生素治疗无效的顽固性乳房炎也有一定的治疗效果。

本发明的积极效果在于：通过基因重组方式以融合蛋白的形式将人溶菌酶和抗菌肽Catesbeianin-1基因连接至高效真核表达载体上，进一步增强融合蛋白的抗菌和抗病毒活性，得到具有更高活性的抗菌和抗病毒的重组蛋白，并将此融合蛋白在防治奶牛乳房炎中应用，开发一种无化药残留，无抗生素残留和低耐药性的防治奶牛乳房炎的新型药物。

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-hlyz-linker-Catesbeianin-1的构建流程图；

图2为融合蛋白抑菌效果图：1.金黄色葡萄球菌；2.沙门氏菌；3.大肠杆菌；4.枯草芽胞杆菌；5.链球菌；6.白色念珠菌；

图3为小鼠乳腺病理切片图：1.正常小鼠乳腺图2.攻毒小鼠乳腺图3.经融合蛋白治疗后小鼠乳房炎；

图4为小鼠乳腺免疫组化图：1.正常小鼠乳房图；2.注射融合蛋白小鼠乳房图；

图5为融合蛋白的免疫印迹分析1阴性对照；2.人溶菌酶标准品；3.融合蛋白；

M低分子量蛋白Maker

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例

rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白的制备

1.引物设计与合成：

根据Genebank上发表的人溶菌酶基因序列(NC-000012.10)和抗菌肽基因序列设计引物：P1、P2、C1、C2、T1和T2，设计15个柔性氨基酸Linker把人溶菌酶基因与抗菌肽Catesbeianin-1基因串连。所有引物由上海生物工程公司合成，引物序列如下：

人溶菌酶上游引物P1.5′-CGGAATTCATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3′(引入EcoR I酶切位点)

人溶菌酶下游引物P2：5′-TTGCGGCCGCCACTCCACAACCTTGAACA-3′(引入Not I酶切位点)

Catesbeianin-1上游引物C1：5′-TCGGAAAAGGAGAGAAG-3′

Catesbeianin-1下游引物C2：5′-GTAGGAATGTCACAGTAACG-3′

特异性上游引物T1：5′-GAAGGTCTTTGAAAGGTG-3′

特异性下游引物T2：5′-CAATCAATACTGTATAATCCAA-3′

2.人溶菌酶基因的克隆

从人胎盘组织中提取细胞总RNA，反转录cDNA，根据人溶菌酶基因序列(NC-000012.10)设计合成引物P1和P2，进行PCR扩增(PCR循环参数：94℃预变性1min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸8min，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳)，回收PCR产物与PMD-18T载体在T4连接酶作用下连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，α-互补(蓝/白斑筛选法)进行阳性克隆的初步筛选，白斑初步确定为阳性菌株，挑取单克隆鉴定，把PCR和酶切鉴定正确的单菌落送至上海生物工程公司进行测序，测序结果与GeneBank中的序列进行比对，结果显示与已发表的人溶菌酶序列完全一致。

3.融合基因的设计与合成

人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白是以人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1的方式连接，因此人溶菌酶基因在前，抗菌肽Catesbeianin-1基因在后，见SEQ 1D NO.5。

4.重组质粒pPICZαA-hlyz-Catesbeianin-1的构建

重组质粒pPICZαA-hlyz-Catesbeianin-1的构建流程，见图1。

5.GS115-hlyz-Catesbeianin-1工程菌的筛选

用Sac I酶切pPICZαA-hlyz-linker-Catesbeianin-1质粒，回收线性化片段，于电转化杯中与冰预冷的感受态酵母菌GS115混匀，进行电转化(电转化杯与ECM399电转化仪均为美国BTXTM公司产品)，电转条件：270v，11ms，转化酵母菌液均匀涂布于YPDS平板(含200μg/mL的Zeocin)，28～30℃静置培养3～10d，直至转化菌落出现。参照酵母基因组提取试剂盒提取基因组DNA，经酵母通用引物(5’AOX1和3’AOX1引物：上游引物：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)和特异性引物T1和T2进行PCR检测(循环参数：94℃预变性1min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳)人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1基因已经稳定整合到毕赤酵母染色体上。

6.rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白诱导表达及鉴定

将一阳性菌落接种于5mL的YPD中，30℃培养16～18h。4000r/min离心10min收集菌体，用50mL的BMGY培养基重悬菌体，30℃、250r/min培养。当菌体浓度达到OD600为2～6时，4000r/min离心10min收集菌体，用50mL的BMMY培养基重悬沉淀，在培养瓶瓶口加盖4层纱布，于28℃、250r/min培养56-84小时。在培养的过程中，每隔24h加入一次100％甲醇至终浓度为1.0％。84h以后，4℃、5000r/min离心10min回收上清，进行SDS-PAGE电泳，并用人溶菌酶标准品(Sigma)做对照。电泳结束后，以50mA恒流、室温下1h将蛋白质电转移至PVDF膜上。PVDF膜以5％脱脂奶粉封闭过夜，经pH 7.4、0.02mol/L PBS漂洗3次后，加入1∶100稀释的兔抗人hlyz多抗，室温反应1h(或4℃过夜)，PBS漂洗3次，再与羊抗兔的二抗反应1h后充分洗涤进行化学发光。经western-blot鉴定证实为人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，见图5。

7.rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白的纯化

凝胶层析：

称取5g Sephadex G-100，置于250ml的烧杯中，用0.01mol，pH值为7.0的PBS缓冲液在沸水浴中溶胀3h，充分溶胀后，倒出上层多余的水分和细小悬浮的颗粒。将处理好的Sephadex G-100装入柱子中，不要产生气泡，装好后，接通洗脱瓶，打开下口，洗脱6h，平衡凝胶柱，调整恒流泵流速0.50～0.70mL/min。将收集的样品分别测定OD280值，并根据OD值作图，然后根据图形波峰波谷的情况，将样品分为几部分。

反相高效液相色谱(RP-HPLC)：

连接高效液相A、B液体，A为超纯水(含0.1％三氟乙酸)，B为乙腈(含0.1％三氟乙酸)，设置程序，时间和B液的浓度如表1。重复冲洗针头和系统2～3次。先设定程序并上样，根据峰型调整程序。手动收集样品，作好标记。合并后冻干。

表1反相高效液相色谱程序设定

8.rhlyz-Catesbeianin-1融合蛋白理化性质鉴定

8.1.抗菌活性测定

平板扩散法测定rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白的抑菌活性：37℃培养16h后结果：对临床分离的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、枯草芽胞杆菌、白色念株菌等耐药菌有抑制作用，见图2。

二倍稀释法测定rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白的MIC(最小抑菌浓度)和MBC(最小杀菌浓度)，见表2。酵母表达的人溶菌酶做对照，证明rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白具有天然人溶菌酶和抗菌肽属性。

表2rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白的最小抑菌浓度

注：ND表示没有作用

8.2.最适反应温度

选取25℃，30℃，35℃，37℃，39℃，40℃，45℃不同温度条件，测定酶活性，结果表明，酶的最适反应温度为37℃。

8.3.最适PH值

选择磷酸缓冲液配制底物溶液，浓度为0.2mg/ml，其它条件不变，测定酶活力。结果表明，rhLYZ-Catesbeianin-1在磷酸缓冲液中的最适反应PH值为8。

8.4.热稳定性

将等量rhLYZ-Catesbeianin-1分别置于35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃不同温度下30min，冷却后于37℃按常规方法测定酶活性，结果表明，rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白在50℃之前热稳定性良好。

8.5.酶的米氏常数

以Micrococcus lysodeikticus为酶的底物，分别配0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的浓度，测定酶活力，用双倒数法，得到Km＝0.04845mg/ml.

8.6.金属离子对酶活性的影响

选取不同金属离子分别加入rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白溶液，终浓度为0.1mg/ml测定其活力，结果表明，Cu²⁺，Fe³⁺，Fe²⁺，Ca²⁺等金属离子都对酶活力有影响，其中Cu²⁺能够使酶活力全部丧失，见表3。

表3金属离子对融合蛋白酶活力的影响

9.安全性检验

9.1小鼠实验

用500微克溶解在500毫升生理盐水中的rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白肌肉注射实验小鼠(昆明小鼠10只，18～22g)，注射后连续观察7～10天，10只小鼠未出现不良反应和死亡现象；

9.2犊牛实验

用25毫克溶解在生理盐水中的rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白肌肉注射初生犊牛注射后连续观察5天，5头犊牛未出现体温升高和异常临床表现；

9.3奶牛实验

将50毫克溶解在生理盐水中的rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白注射入患乳腺炎奶牛乳腺注射后连续观察1周，4个乳区未出现异常临床表现。

9.4药物残留实验

取rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白治疗后牛乳进行药物残留检测，结果仅在注射后第2天PCR检测为阳性。用300微克rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白灌喂小鼠，然后用电泳和PCR扩增法检测消化道内降解动态，在小鼠的胃内，rhLYZ-Catesbeianin-1融合蛋白20分钟内即完全降解。

序列表

SEQ 1D NO.1

人溶菌酶氨基酸序列：

MKVFERCELARTLKRLGMDGYSGISLANWMCLAKWESGYNTRA

TNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQ

DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCG

V

SEQ 1D NO.2

抗菌肽Catesbeianin-1氨基酸序列：

MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID.

SEQ 1D NO.3

连接肽序列：GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ 1D NO.4

人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白氨基酸序列：

MKVFERCELARTLKRLGMDGYSGISLANWMCLAKWESGYNTRA

TNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQ

DNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCG

VAAA

MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSI

D

共175个氨基酸，分子量MW 17888.65 等电点PI 9.39，黑斜体为15个柔性氨基酸linker

SEQ 1D NO.5

人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1核苷酸序列(537bp)

GAATTCATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTC

TGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGTGGAATCAGCCTAGC

AAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACA

CGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATG

GGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAA

ACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGTGCTTT

GCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGG

GTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGA

GAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGT

TGTGGAGTGGCGGCCGCT

ATGATGAGGGTGATGAGGAGGAA

GACTAAAGTTATTTGGGAAAAAAAGGACTTTATTGGATTATACA

GTATTGATTGATCTAGA

黑斜体：linker，酶切位点：EcoR I(GAATTC)，Not I(GCGGCCGC)，Xba I(TCTAGA)

Claims (3)

1.一种人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白，其特征在于它是由人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1在基因水平融合后表达的重组蛋白：所述的人溶菌酶氨基酸序列如SEQ 1D NO.1所示，抗菌肽氨基酸序列为SEQ 1D NO.2序列所示，连接肽氨基酸序列为SEQ 1D NO.3序列所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白氨基酸序列为SEQ 1D NO.4所示，人溶菌酶与抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白通过人溶菌酶-15个柔性氨基酸的连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1的方式连接。

2.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)从人胎盘组织中克隆人溶菌酶基因至pMD18T载体，通过设计引物PCR，获得人溶菌酶基因；

2)采用人工合成方法获得抗菌肽Catesbeianin-1基因以及连接肽基因；

3)通过酶切连接的方法把人溶菌酶基因，连接肽基因和抗菌肽Catesbeianin-1基因连接，得到人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因；

4)人溶菌酶-连接肽-抗菌肽Catesbeianin-1基因与经过EcoR1和Xbal 1双酶切的pPICZαA载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α中，通过PCR和双酶切鉴定，筛选阳性克隆测序；

5)将测序正确的如图1所示的重组质粒pPICZαA-hlyz-linker-Catesbeianin-1电转化至酵母宿主菌GS115中，通过Zeocin抗生素的筛选获得高效酵母表达菌株；

6)挑取阳性酵母菌甲醇诱导表达，收获表达上清，经SDS-PAGE和western-blot鉴定，获得人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白。

3.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途。

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