CN101899116B - 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及无创性高穿透性表皮生长因子及其应用。具体而言，本发明涉及一种蛋白转导肽融合人表皮生长因子活性片段的蛋白以及含有编码所述片段的核苷酸序列的核酸分子。本发明涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明的无创性高穿透性表皮生长因子可治疗病毒感染、特异性杀伤肿瘤细胞以及神经退行性疾病等。

Description

无创性高穿透性表皮生长因子及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白转导域融合人表皮生长因子的融合蛋白及其核酸，包括构建表达纯化等一系列的技术工艺。

技术背景

表皮生长因子是1962年Cohen和Montalcini教授在小鼠颌下腺中发现的一种热稳定蛋白，其具有促使新生小鼠眼睑早开、牙齿早萌的作用。将这一活性成分加入培养皮肤表皮的基质中，发现它可直接促进皮肤表皮的生长，因此，将这一活性组分命名为“表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)。表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸残基组成的单链多肽，含3个链内二硫键。等电点(PI)为4.6，分子量为6045Da。

1975年Gregory从人尿中提取得到一种物质，其可抑制胃酸分泌而被称为尿抑胃素(urogastrone，UG)。后来证明这两种物质在结构与生理功能上极为相似，于是人们把EGF和UG这两种多肽看成是同一类物质，称之为“表皮生长因子-尿抑胃素(EGF-UG)”。人尿中EGF含量很少(每10万公升尿液中只能提取1克)，并且存在污染和活性损失的可能性。近年来利用基因工程方法已有成功表达EGF的报道及相关专利。

但EGF在常温状态下非常不稳定，很容易降解而失去活性，很难越过细胞膜等结构，而使药效损失，限制了在临床上的应用。

发明内容

研究发现，在一些蛋白质上具有被称为蛋白转导区(proteintransduction domain，PTD)的小片段，又称为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPP)能够有效地通过生物膜，进入各种类型的细胞。外源蛋白质、DNA或复合物与PTD连接后，能够进入细胞和通过血脑屏障。因此，PTD在运送蛋白质、DNA或复合物，并进而在治疗病毒感染，特异性杀伤肿瘤细胞及神经退行性疾病等方面有巨大的潜力。

人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)反义激活转录(trans-activator transcription，TAT)蛋白PTD(TAT-PTD)是目前PTD的一种来源。TAT中的11个氨基酸(第47-57位氨基酸)是具有蛋白转导功能的肽段，其序列为YGRKKRRQRRR(SEQID NO.1)。TAT-PTD可以将与之相连的多肽和全长蛋白在数分钟内转导进入细胞，而且可以通过血液循环运输至脑组织，从而可跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。

本发明人通过将表皮生长因子与PTD融合获得了表皮生长因子变构体。实验证明，本发明的表皮生长因子变构体可通过粘膜吸收，无创性地穿透粘膜进入体内，进而可用于治疗病毒感染、特异性杀伤肿瘤细胞以及神经退行性疾病等。因此，本发明的表皮生长因子变构体也称为无创性高穿透性表皮生长因子。

所以，本发明一方面提供了一种无创性高穿透性表皮生长因子，其包含选自如下的序列：

a)SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列；或

b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。

优选地，本发明的无创性高穿透性表皮生长因子为：

a)SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列；或

b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。

本发明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1个或几个的氨基酸，是指在序列中的任意且1个或几个氨基酸序列中的位置上取代、缺失、插入或添加1个或几个氨基酸残基(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)，并且取代、缺失、插入和添加中的2种或两种以上可同时发生。

本发明所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1个或几个的氨基酸可通过使用《Molecular Cloning 3》(分子克隆3)和《Current Protocols in Molecular Biology》(现代分子生物学操作规程)等记载的定点诱变法获得。

对于本发明所述的取代，优选在下列各组之内进行氨基酸残基的相互取代：

1：亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、甘氨酸；

2：天冬氨酸、谷氨酸；

3：天冬酰胺、谷氨酰胺；

4：赖氨酸、精氨酸；

5：脯氨酸、羟基脯氨酸；

6：丝氨酸、苏氨酸；和

7：苯丙氨酸、酪氨酸。

对于本文中所述的保守取代、缺失、插入或添加前活性，可表示在取代、缺失、插入或添加后的蛋白质或氨基酸序列的活性是取代、缺失、插入或添加前的10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％或更高。

上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还可以为：蛋白质，其具有与序列号5的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有序列号5所具有的无创性高穿透性表皮生长因子活性。上述同源性的数值一般优选大的数值。

优选地，上述取代、缺失、插入或添加发生在SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列第12位及其以后氨基酸残疾。

本发明的无创性高穿透性表皮生长因子除通过基因工程方法(如下述实施例所述)来获得之外，也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，或通过肽合成仪进行化学合成。

本发明的另一方面还提供了编码本发明的无创性高穿透性表皮生长因子的核苷酸序列。

优选地，编码本发明的无创性高穿透性表皮生长因子的核苷酸序列包含：

a)SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列；

b)在严紧条件下与由序列号6的核苷酸序列进行杂交、且编码具有无创性高穿透性表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或

c)上述a)或b)的互补序列。

本文中，具有无创性高穿透性表皮生长因子活性是指某一蛋白质或氨基酸序列的活性是SEQ ID NO.5的10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％或更高。

进一步优选地，编码本发明的无创性高穿透性表皮生长因子的核苷酸序列为：

a)SEQ ID NO.6中所示的核苷酸序列；

b)在严紧条件下与由序列号6的核苷酸序列进行杂交、且编码具有无创性高穿透性表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或

c)上述a)或b)的互补序列。

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(AltschulSF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和GappedBLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列的载体，例如质粒载体。另外，本发明还提供了导入本发明所述的载体的微生物，例如大肠杆菌和酵母。

本发明还提供了制备本发明所述的无创性高穿透性表皮生长因子的方法，其包括培养本发明所述的微生物。

本发明的再一方面提供了一种药物组合物或药物制剂，其包含本发明的无创性高穿透性表皮生长因子或其核苷酸序列。优选地，其进一步含有选自如下的辅料：粘合剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、乳化-增溶剂、甜味剂、包衣材料和抗菌防腐剂，例如磺丁基-β-环糊精和聚乙二醇。对于本发明的药物组合物或药物制剂，其可用于治疗神经退行性疾病，如阿尔兹海默病、帕金森氏综合症及黑质退行性病变等。

本发明的又一方面提供了本发明的无创性高穿透性表皮生长因子及其核苷酸序列在制备用于神经退行性疾病(如阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、黑质退行性病变)的药物中的用途。

对于本发明的药物组合物或药物制剂，其可通过注射、舌下含服、肺吸入、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收、滴眼液等多种方式进行施用。其施用剂量优选地为30mg无创性高穿透性表皮生长因子/kg体重-35mg无创性高穿透性表皮生长因子/kg体重。

附图说明

图1：NcoI和EcoR I双酶切载体pUC57，2％低熔点胶回收目的片段OmpA-PTD-hEGF。其中：

泳道M，DNA Marker；泳道1，pUC57-OmpA-PTD-hEGF。

图2：NcoI和EcoR I双酶切载体pET-28a(+)，回收5400bp的载体片段。泳道M，DNA Ma rker；泳道1，pET-28a(+)。

图3：菌落PCR鉴定图。其中：

泳道M，DNA Marker；泳道1-5，5个单菌落。

图4：PTD-hEGF分泌表达图。其中：

泳道M，肽Ma rker；泳道1，PTD-h EGF；泳道2，未诱导。

图5：分泌表达PTD-hEGF融合蛋白的蛋白质印迹鉴定图，其中：

1，PTD-hEGF融合蛋白；2，阴性对照。

图6：NcoI和BamHI双酶切载体pET-28a(+)，回收5400bp的载体片段。其中：

泳道M，DNA Ma rke r；泳道1，pET-28a(+)。

图7：PCR方法钓取PTD-hEGF基因，片段用NcoI和BamHI双酶切，并用低熔点琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体和目的基因片段。其中：

泳道M，DNA Marker；泳道1，PTD-hEGF基因。

图8：包涵体表达PTD-h EGF图。其中：

1，2，3泳道，分别诱导1、3、5h；M，肽Marker；泳道4，未诱导。

图9：包涵体表达PTD-h EGF的蛋白质印迹鉴定图。其中：1，PTD-hEGF融合蛋白；2，阴性对照。

图10：融合蛋白血脑屏障穿透实验，其中：1，PTD-hEGF；2，hEGF；3，阴性对照。

图11：水迷宫实验，其中：A，AD模型鼠静脉给药；B，自然老化鼠静脉给药；C，AD模型鼠直肠给药；D，自然老化鼠直肠给药。

图12：穿梭箱实验，其中：A，AD模型鼠静脉给药；B，自然老化鼠静脉给药；C，AD模型鼠直肠给药；D，自然老化鼠直肠给药。

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1分泌型表达载体OmpA-PTD-hEGF的构建

根据人表皮生长因子序列在氨基酸序列不变的情况下调整核酸序列，在EGF序列N端直接融合PTD序列(中间不加任何碱基)，在PTD前再加OMPA序列(SEQ ID NO.7)，为了连接在pET-28a(+)原核表达载体上，再在OMPA序列前加入NcoI酶切位点(CCATGG)，利用NcoI酶切位点内的ATG起始密码子，为了不移码在CAATGG后加碱基GC，也就是在OMPA前加了蛋氨酸和甘氨酸。hEGF的C末端加入了TAA TAA(终止密码子序列)，终止密码子后面接EcoRI酶切位点(GAATTC)。整体基因序列是CAATGGGC+OMPA序列(SEQ ID NO.7)+PTD(SEQ IDNO.3)+hEGF序列(SEQ ID NO.4)+TAA TAA+GAATTC(该整体基因序列由上海生物工程公司合成)，并构建于pUC57载体上。转化DH5α大肠杆菌，挑取单菌落，摇菌提质粒。pUC57质粒载体用NcoI和EcoR I双酶切回收目的基因片段。其中，所述的回收是使用如下反应体系：

NcoI                  1μl

EcoRI                 1μl

NcoI和EcoR I通用缓冲液2μl

BSA                   0.2μl

Puc 57(pET-28a(+))    8μl

H₂O                   7.8μl

总的反应体系为20μl，于37℃温浴3小时。

酶切产物OmpA-PTD-hEGF经2％低熔点琼脂糖凝胶电泳(见图1)，回收泳道1中的220bp左右的基因片段。pET-28a(+)载体片段用1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳(见图2)，回收5400bp左右的基因片段，在紫外灯下确定目的片段的位置，用刀片切下该位置的凝胶。将胶块放于1.5ml离心管中，用低熔点琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

将pET-28a(+)载体也用NcoI和EcoR I进行双酶切，并回收目的载体片段。为了将目的基因片段连接到pET-28a(+)载体上，进行在如下反应体系下进行反应。

反应体系如下：

DNA(目的基因片段)5μl

DNA(pET-28a(+)载体片段)2μl

T4连接酶               1μl

10×连接酶缓冲液       1μl

H₂O                    1μl

总的反应体系为10μl，于4℃过夜。

将连接产物(即连接后的pET-28a(+)载体)转化大肠杆菌DH5α，并对其进行培养。然后挑取单菌落，并对其进行PCR鉴定，挑取了5个单菌落，图3是鉴定结果(均完全正确)。对PCR鉴定正确的基因进行DNA序列测定。从测序正确的大肠杆菌中提取质粒以用于转化BL21(DE3)大肠杆菌。

本实施例中所用的各种酶以及相关菌种，其来源信息如下：Nco I和EcoR I酶购自赛百盛公司，pET-28a(+)载体购自Novagen公司，T4连接酶购自Promega公司，DH5α和BL21(DE 3)菌种购自天为时代公司。

实施例2分泌型表达载体的诱导表达

液体培养基(LB配方)

2～15g胰蛋白胨，2～10g酵母提取物，2～8g NaCl，10g

NaH₂PO₄.12H₂O，0.33g Na₂HPO₄.2H₂O溶于1000ml双蒸水中，15磅灭菌25分钟；

配制5～30％葡萄糖，8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中；

卡那霉素采用50～60μg/ml工作浓度；

诱导剂IPTG母液1M/L。

将实施例1中重组构建的质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌并进行培养。挑选单菌落并接种至LB培养基(葡萄糖0.2％+卡那霉素50-60μg/ml)中，并于25～35℃下摇床培养5至15小时。取种子液加至液体LB培养基(加葡萄糖至终浓度0.2％，卡那霉素50-60μg/ml)，并在25～37℃下培养至OD₆₀₀为0.5～1.0左右。然后添加IPTG至终浓度0.1-1mM/L，同时再补充一次新的卡那霉素至50-60μg/ml，并于25～35℃下诱导表达2～10小时(见图4)。图4是表达蛋白的SDS-Page电泳图，从图上可以看出，表达蛋白的大小与理论值是一致的。

实施例3分泌表达蛋白的纯化

1)、从实施例2中诱导表达的培养基中通过离心收集菌体，用溶液(10～30mM Tris-HCl、10～30％蔗糖0.5～1mM EDTA pH7.0～9.0，按每克菌体50～100毫升计算)悬浮，冰浴，轻轻振荡10分钟；

2)、4℃下8000g离心，去除上清，沉淀用MgSO₄溶液悬浮，冰浴，轻轻振荡；

3)、12000g离心15分钟，取上清，上清即为蛋白粗产品；

4)、苯基疏水层析

将溶涨好的苯基疏水介质装入层析柱，用溶液(1～5M硫酸铵，20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡苯基疏水介质，将上一步得到的上清(即蛋白粗产品)上样，再用溶液(0.5～5M硫酸铵，20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡苯基疏水介质至电导稳定，用溶液(50mMTris-HCl pH pH7.0～9.0)洗脱，收集洗脱峰；

5)、透析

上步收集的洗脱峰装入透析袋，放入透析液(20～70mMTris-HClpH7.0～9.0)中透析过夜；

6)、DEAE阴离子交换层析

首先用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡DEAE阴离子介质；接着在透析液中加入一倍体积的溶液(20～70mMTris-HCl pH7～9.0)并上样，再用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡，然后用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0，0.5～2MNaCl)梯度洗脱，收集洗脱峰，即为目的蛋白样品。纯化蛋白通过蛋白质印迹鉴定，表明是正确的(见图5)。

实施例4包涵体表达载体pET PTD-hEGF的构建

在上述实施例1中构建的分泌表达质粒的基础上，利用PCR方法钓取PTD-hEGF基因片段。在其前端加NcoI酶切位点(CCATGG)及其保护性碱基，利用NcoI位点内的ATG起始密码子，为了不移码加碱基GC，也就是在PTD前加了两个氨基酸(蛋氨酸和甘氨酸)。在hEGF后加TAA TAA两个终止密码子之后加BamHI酶切位点及其保护碱基序列。

引物设计如下：

P 15’-CCCATGGGCTACGGTCGTAAGAAACG-3’(SEQ ID NO.8)

P25’-CGGGATCCTTATTAACGCAGTTCCCAC-3’(SEQ ID NO.9)

PCR反应体系：

P1    1μl

P2    1μl

模板(OmpA-PTD-hEGF)0.5μl(来源于实施例1中所述的连接后的pET-28a(+)载体)

2×DNAMix    10μl

H2O          7.5μl

总体系20μl

反应条件：

95℃预变性7min

72℃      7min

4℃       延伸∞

将pET-28a(+)载体和PCR片段分别用NcoI和BamHI进行双酶切，用低熔点琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天为时代公司)回收载体和目的基因片段。图6是pET-28a(+)载体用NcoI和BamHI双酶切图，回收5400bp左右基因片段。图7是PCR片段用NcoI和BamHI双酶切图，回收220bp左右的基因片段。

在如下反应体系下将载体片段和目的基因片段连接。

反应体系：

pET-28a(+)载体片段      1μl

目的基因片段PTD-hEGF    1μl

T4连接酶                1μl

连接酶缓冲液            1μl

H₂O                     6μl

总的反应体系为10μl，于4℃连接过夜。

将连接产物(即连接后的pET-28a(+)载体)转化大肠杆菌DH5α，并对其进行培养。然后挑取单菌落，并对其进行PCR鉴定和DNA序列测定。从测序正确的大肠杆菌中提取质粒以用于转化BL21(DE 3)大肠杆菌。

本实施例中所用的各种酶以及相关菌种，其来源信息如下：NcoI和BamHI酶购于赛百盛公司，pET-28a(+)载体购于Novagen公司，T4ligase购于Promega公司，DH5α和BL21(DE3)菌种购于天为时代公司。

一、工程菌的发酵

1.种子菌培养

甘油保存的菌种按1％的接种量接入LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素)，于25～37℃和200rpm下培养一天，再按0.5％的接种量接入LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素)，于25～37℃和200r pm下培养过夜。

2.发酵及诱导表达

将上步种子培养物按1～10％接入LB培养基，并于37℃和200rpm下开始培养。当OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.1～1.0mM的IPTG诱导，继续发酵3-5小时。之后停止发酵，离心收集菌体并称重。SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。

3.包涵体的收集、洗涤和变性

破碎菌体，将菌体用TE(Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.0～9.0)溶解加入适量PMSF和TritonX-100，充分混匀后超声破菌(超声强度为70％×500赫兹，超声时间30min)。在12000r pm和4℃下离心30min，收集沉淀(图8显示了不同时间点包涵体表达情况，1，2，3泳道分别是表达1，3，5小时的包涵体)。用尿素溶液(2M尿素，50mMTris-HCl，pH7.0～9.0)充分悬浮沉淀，并于12000rpm和4℃下离心30min，从而去除其它杂蛋白，以获得较纯的目的蛋白沉淀。用变性溶液(8～10M尿素，50mMTris-HCl，2mM EDTA pH7.0～9.0)溶解沉淀包涵体(即所获得的沉淀)，再加入1M DTT至终浓度20mM，室温搅拌至全部溶解，然后于12000rpm和4℃下离心30mi n，收集上清。

二、稀释复性

1.制复性液(0.5～2.5M尿素，20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0，1～10％甘油，0.1～5％甘氨酸，1.5～2.5mM氧化型谷胱甘肽，1～5mM还原型谷胱甘肽)。

2.上步包涵体上清中滴加复性液充分混匀，直至刚要出现沉淀停止滴加，4℃放置至少20小时。

三、苯基疏水层析

1.将上步溶液在12000rpm和4℃下离心30min，然后在上清中加入硫酸铵至终浓度为2M，再于12000rpm和4℃下离心30min，以收集上清。

2.将溶涨好的苯基疏水介质装入层析柱，用溶液(1～5M硫酸铵，20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡苯基疏水介质，将上一步得到的上清上样，再用溶液(0.5～5M硫酸铵，20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡苯基疏水介质至电导稳定，用溶液(50mMTris-HCl pH7.0～9.0)洗脱，收集洗脱峰。

3.透析

上步收集的洗脱峰装入透析袋，放入透析液(20～70mMTris-HClpH7.0～9.0)中透析过夜。

4.DEAE阴离子交换层析

4.1.用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡DEAE阴离子介质。

4.2.透析液中加入一倍体积的溶液(20～70mMTris-HCl pH7～9.0)，上样。再用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0)平衡，然后用溶液(20～70mMTris-HCl pH7.0～9.0，0.5～2MNaCl)梯度洗脱，收集洗脱峰，即为目的蛋白样品。将纯化蛋白通过蛋白质印迹鉴定，结果是完全正确的(见图9，1是目的蛋白，2是阴性对照)。

实施例5血脑屏障穿透活性

将实施例3和4纯化获得的的PTD-hEGF和hEGF(购自Sigma，以下实施例与此相同)按等摩尔数配制成溶液。对小鼠尾静脉分别注射PTD-hEGF和hEGF，其中将注射生理盐水的小鼠作为对照。注射4h后引颈处死，取脑立即放入甲醛溶液中固定。组织切片、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、免疫组化分析均按常规方法进行，结果见附图10。

尾静脉注射PTD-hEGF的小鼠脑切片的组化实验显示很深的着色，而hEGF小鼠及对照组切片着色浅。表明PTD-hEGF能够穿越血脑屏障进入小鼠脑中，而hEGF未能进入脑内。

实施例6对AD模型鼠及自然老化鼠的治疗作用

(1)水迷宫实验

本实验使用的水迷宫是中国医学科学院药物研究所生产的Morris水迷宫。

实验前将水槽灌以清水至预定的水池高度。实验室温度保持在23℃～25℃，Morris水槽中加入水(温度调至23±1℃)至高过安全平台1cm，水温保持在23±1℃。将站台放置在水池的第II象限预定部位，作为老鼠入水后搜索的目标。将安装好的摄像装置与计算机、监视器及打印机连接。先打开计算机，再打开其它设备，开始实验。每只老鼠每天训练2次。老鼠入水点在第I和IV象限。计算机自动记录动物自入水到找到站台所需时间，作为潜伏期。老鼠爬上站台后，让老鼠在站台上站立30s。如果老鼠在入水120s以内未能找到水池中的站台，可将老鼠放置于站台上休息30s，之后再进行下一次训练。共训练5天。将老鼠从入水至找到平台的时间(即潜伏期)为定量标准来衡量其空间记忆能力。潜伏期小于120s为正常鼠。

结果显示，对AD模型小鼠和自然老化小鼠静脉注射实施例3和4所纯化获得的PTD-hEGF(hEGF净含量4～40μg/只/天，连续5～10天)能显著缩短其小鼠找到平台的时间(潜伏期)，且与AD模型组和自然老化未给药组比较差异极为显著(p＜0.01)；而hEGF组未能改善AD模型小鼠和自然老化小鼠的潜伏期，与AD模型组和未给药自然老化鼠比较无显著性差异(p＞0.05)(图11A和B)。

同时，经直肠给予实施例3和4所纯化获得的PTD-hEGF(hEGF净含量40～400μg/只/天，连续5～10天)也能显著缩短AD模型小鼠和自然老化小鼠的潜伏期，且与AD模型组和未给药自然老化鼠相比差异极显著(p＜0.01)，而hEGF组未能改善AD模型小鼠和自然老化小鼠的潜伏期，与AD模型组和未给药自然老化鼠比较无显著性差异(p＞0.05)，(图11C和D)。

(2)穿梭箱实验

穿梭箱实验的原理是动物接受刺激的同时给予蜂鸣音信号，通过反复刺激，动物产生声音条件反射，再听到蜂鸣音，主动逃避刺激，比水迷宫实验增加了中枢反应过程。

本实验采用了10次循环，通过电击时间或主动逃避时间来评价动物学习记忆和反应能力。电击时间短，主动逃避时间长，证明药物有效，否则无效。结果显示，实施例3和4中所制备的PTD-hEGF无论是静脉注射或直肠施用，也无论对AD模型小鼠或自然老化小鼠均有明显的治疗作用，且与未给药的AD模型小鼠或未给药的自然老化小鼠相比差异均非常显著(P＜0.01)，结果见附图12。

水迷宫实验和穿梭箱实验表明，PTD-hEGF能够改善阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型鼠和自然老化鼠学习和记忆能力，对AD具有治疗作用。对中枢神经系统其它进行性退行性疾病也具有治疗作用。

另外，本发明的发明人通过对SEQ ID NO.5中所示的氨基酸序列进行取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸后所获得氨基酸序列或具有相应的同一性氨基酸序列的活性也进行了如实施例5和6的实验，结果均证实了其相应的活性。在此，本申请的发明人示例性从其中列举了如下的SEQ ID NO.5的突变体：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14。其对应的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.15，因此，也相当于例举了本文中所述的严紧条件下与序列号6的核苷酸序列进行杂交或具有相应的同一性、且编码具有无创性高穿透性表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所

<120>无创性高穿透性表皮生长因子及其应用

<130>IDC080125

<160>15

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PTD氨基酸序列

<400>1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5                   10

<210>2

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人表皮生长因子氨基酸序列

<400>2

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1               5                   10                  15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

            20                  25                  30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

        35                  40                  45

Trp Trp Glu Leu Arg

    50

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PTD核酸序列

<400>3

tacggtcgta agaaacgtcg ccagcgtcgc cgt                                  33

<210>4

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人表皮生长因子核酸序列

<400>4

aattccgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctacacga tggtgtttgc     60

atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcaactgtg ttgttggtta catcggtgaa    120

cgttgccagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt                           159

<210>5

<211>64

<212>PRT

<213>E.Coli

<400>5

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asn Ser Asp Ser Glu

1               5                   10                  15

Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met

            20                  25                  30

Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr

        35                  40                  45

Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg

    50                  55                  60

<210>6

<211>192

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>表皮生长因子的突变体的核苷酸序列

<400>6

tacggtcgta agaaacgtcg ccagcgtcgc cgtaattccg actctgaatg cccgctgtct     60

cacgacggtt actgcctaca cgatggtgtt tgcatgtata tcgaagctct ggacaaatac    120

gcgtgcaact gtgttgttgg ttacatcggt gaacgttgcc agtaccgtga cctgaaatgg    180

tgggaactgc gt                                                        192

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>OMPA序列

<400>7

aaaaagacag ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc     60

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1

<400>8

cccatgggct acggtcgtaa gaaacg    26

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物2

<400>9

cgggatcctt attaacgcag ttcccac   27

<210>10

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>10

Asn Ser Asp Ser Glu Ser Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Ser Leu His

1               5                   10                  15

Asp Gly Val Ser Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Ser Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

        35                  40                  45

Trp Trp Glu Leu Arg

    50

<210>11

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>11

aattccgact ctgaatcgcc gctgtctcac gacggttact cgctacacga tggtgtttcg     60

atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tcgaactcgg ttgttggtta catcggtgaa    120

cgttcgcagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt                           159

<210>12

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>12

Asn Ser Asp Ser Glu Ala Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Ala Leu His

1               5                   10                  15

Asp Gly Val Ala Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Ala Asn

            20                  25                  30

Ala Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Ala Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

        35                  40                  45

Trp Trp Glu Leu Arg

    50

<210>13

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>13

aattccgact ctgaagctcc gctgtctcac gacggttacg ctctacacga tggtgttgct     60

atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg gctaacgctg ttgttggtta catcggtgaa    120

cgtgctcagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt                           159

<210>14

<211>47

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>14

Asn Ser Asp Ser Glu Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Leu His Asp Gly

1               5                   10                  15

Val Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Asn Val Val Gly Tyr

            20                  25                  30

Ile Gly Glu Arg Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg

        35                  40                  45

<210>15

<211>141

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变体

<400>15

aattccgact ctgaaccgct gtctcacgac ggttacctac acgatggtgt tatgtatatc     60

gaagctctgg acaaatacgc gaacgttgtt ggttacatcg gtgaacgtca gtaccgtgac    120

ctgaaatggt gggaactgcg t                                              141

Claims (7)

1.编码无创性高穿透性表皮生长因子的核苷酸序列，其由如下的序列按如下的连接顺序组成：SEQ ID NO：7的OMPA序列+SEQ ID NO：3的PTD序列+SEQ ID NO：4的hEGF序列。

2.表达载体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

3.权利要求2的表达载体，其为质粒载体。

4.导入权利要求2-3中任一项所述表达载体的微生物。

5.权利要求4所述的微生物，其为大肠杆菌。

6.制备无创性高穿透性表皮生长因子的方法，其包括培养权利要求4或5所述的微生物。

7.一种药物制剂，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

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