CN101678088A - 修饰的突变体胶原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕减少中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种变异溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451 Asp)，当注射入身体指定位置时可以溶解脂肪组织。这种蛋白产品在肥胖大鼠实验中溶解脂肪垫非常有效，只有极少的副作用，观察到很少量的出血。我们还发明了一种新的ColH突变体，该突变体在ColH(Glu451 Asp)前连接有肽基序CKGGRAKDC－Gx(x为2－6个G)，称为表皮ColH－FM，能够靶向针对白色脂肪垫结构。结合新颖的透皮吸收技术(例如Hydroxysome技术)，我们开发了一种可以溶解脂肪的表皮蛋白霜剂。这种产品可以用作脂肪分解霜和化学吸脂剂。这种ColH－FM还可以注射入脂肪组织，作为脂肪抽吸术的替代手段或者辅助方法。因为凸起的疤痕是由胶原蛋白的过度生长形成的，本发明的变异ColH(Glu451 Asp)或ColH－FM霜剂可以用于减少疤痕。

Description

修饰的突变体胶原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕减少中的应用
技术领域
本发明涉及用于脂肪溶解和疤痕减少的修饰的突变体胶原蛋白酶。
背景技术
1)脂肪减少
肥胖日益成为影响美观和健康的重大问题。很多医药公司正在开发能够减轻人们体重的药物。脂肪抽吸是一种主要的摆脱过量脂肪的治疗方法，在美国每年有700,000例脂肪抽吸手术。然而，脂肪抽吸非常具有侵害性，造成严重的副反应。脂肪分解霜是一种非介入性的方法，用来改善含有过量脂肪的身体各区域的外观。但是市场上并没有有效的脂肪分解霜。现有的脂肪分解霜仅有可能暂时地缩小脂肪细胞，而不能清除它们。
脂肪抽吸是一种利用真空(在负压环境下)通过机械手段去除皮下脂肪的方法。美容行业运用脂肪抽吸术来去除男性和女性人体特定区域的过量脂肪。脂肪抽吸术很容易导致感染、瘀伤、外表变形和皮下组织的机械损伤。因此使用机械力作用的脂肪抽吸术不能令人满意。
皮下脂肪团对人们来说是个大问题。虽然目前自称能减少或消灭皮下脂肪团的产品正在迅速增加，但关于它们功效的研究却依然非常少。总的说来，这些研究清楚地表明这些产品没有效果，但是，很遗憾，人们很难抵抗这些药剂的诱惑。事实上，根据美国皮肤病学会的研究，皮下脂肪团是成年女性身体内储存脂肪的天然途径。对于一些妇女，尤其是非常瘦的妇女而言，只有箍缩皮肤才能看到皮下脂肪团，但是对于大多数妇女来说，总是可以看到一定数量的脂肪团。
皮下脂肪团被认为是由于脂肪细胞的累积形成的，这些脂肪细胞突出或交错于可能被衰弱了的皮肤层。很多出售抗-皮下脂肪团产品的公司将其称之为“被囚禁的脂肪”，这实际上是一种不错的类比。能够绝对肯定的是女性较之男性更加容易形成皮下脂肪团，很可能是因为她们的臀部和大腿部有更多的皮下脂肪细胞(来源：Journal of AppliedPhysiology，2002年4月，第1611-1618页)。
有一份很长的产品名单，声称将它们涂抹到皮肤上就能够以某种方式解离身体脂肪并改善肤色，以消灭或减少皮下脂肪团的出现。虽然这些洗液和药剂受到大众欢迎，但是有两个问题仍然没有解决：(1)不同产品之间缺乏处方的连贯性，和(2)没有证据表明这些产品的功效(来源：Skin Research and Technology，2002年5月，第118-124页)。欧洲皮肤病学杂志(The European Journal of Dermatology，2000年12月，第596-603页)研究了32种消脂产品，其分别含有4到31种成分，其间很少有相似点。“44种不同的植物性药材和39种不同的润肤剂被用于32种产品中。存在于14种产品中的咖啡因是最常用的添加剂，其似乎代表了一种‘活性’成分。在其它方面，这些产品的组分与护肤霜类似。”化妆品公司所做的是在没有证据表明它们能够起作用的情况下随机加入植物成分，但是那些暗示性的声明却在诱惑消费者来尝试一种又一种神奇的抗-皮下脂肪团药剂。
氨茶碱，一种支气管扩张处方药(打开肺部通道)，因为刊登于肥胖症研究(ObesityResearch，1995年11月，附页561S-568S)的一篇论文，作为脂肪分解霜的一种成分得以闻名。然而，刊登于塑料和重建外科(Plastic and Reconstructive Surgery，1999年9月，第1110-1114页)的一篇论文提出了对氨茶碱价值的怀疑，这篇论文描述了对于三组不同的妇女使用三种不同的皮下脂肪团处理方法的双盲研究。因此，氨茶碱看上去并不是能够解决脂肪团的答案，虽然它在一些脂肪分解霜中仍然存在。
咖啡因，由于是氨茶碱的“远亲”，而被用作脂肪分解霜的一种成分。有两组研究表明咖啡因对消脂有益处，但是其中一组研究是由Johnson&Johnson进行的，其拥有RoC和Neutrogena两个公司，二者均出售含咖啡因的脂肪分解霜；另一组研究是由出售抗-皮下脂肪团化合物的化妆品成分制造商进行的(来源：Journal of Cosmetic Science，2002年7-8月，第209-218页)。没有其他独立的研究表明咖啡因对于处理皮下脂肪团有益处，也没有研究指明需要多少咖啡因才能够产生效果。
2)疤痕减少
疤痕是由创伤愈合后胶原蛋白过度生长形成的。大多数除疤产品包含片状或凝胶状的硅胶，以及洋葱提取物(Mederma皮肤护理产品)。通常需要超过3个月才能看到一些效果，因为这些产品不包含有效地活性成分，例如任何形式的胶原蛋白酶，其靶向疤痕形成的原因。
发明内容
本发明涉及一种组合物，包括一种修饰的单一突变体胶原蛋白酶ColH-FM，其中的ColH-FM是一种溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451Asp)，并在ColH(Glu451Asp)前附加有肽基序CKGGRAKDC-G(x)，x等于2-6。所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载体，例如那些选自由生理盐水、葡聚糖水溶液、和羟乙基淀粉水溶液所组成的组。
在另一方面，本发明提供一种ColH(Glu451Asp)在制备减少身体指定位置脂肪组织数量的药物中的用途，其包括向所述药物引入有效量的单一ColH(Glu451Asp)，或附加有N-末端或C-末端标签的CKGGRAKDC-G(2-6个G)的相同的突变体胶原蛋白酶，或任何能够靶向人体和动物体内白色脂肪维管结构的其它肽类。进一步地，ColH(Glu451Asp)或被修饰的ColH(Glu451Asp)可以用于制备减少和消除脂肪瘤的药物，以及减少疤痕的药物。
本发明还涉及一种减少体内指定位置的脂肪组织数量的方法，其包括向所述组织引入有效量的突变体胶原蛋白酶，或附加有N-末端或C-末端标签CKGGRAKDC-G(2-6个G)的相同的突变体胶原蛋白酶，或任何能够靶向人体和动物体内白色脂肪维管结构的其它肽类。在一个实施方式中，所述的脂肪组织是皮下的。优选的，突变体全长ColH来自于溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)。在一个实施方式中，所述的突变体ColH是突变于E451D。具体的，在展开的序列中ColH第451位的谷氨酸被突变成天冬氨酸(440DRLTWYEEGGAE451)，其中ColH突变体的活性是野生型ColH的20％。或者所述的突变体ColH是在Glu451处突变为其它20种氨基酸残基的任何一种，特别是E451A和E451Q。在一个实施方式中，所述在药学上可接受的载体中的突变体胶原蛋白酶被注射到所述脂肪组织中，优选的，使用液体的药学上可接受的载体中的突变体胶原蛋白酶溶液进行注射，优选的，所述载体为水溶液，更加优选的，所述脂肪组织是皮下的，所述溶液透过皮肤在一个位置或多个相近位置进行注射。在另一个实施方式中，所述修饰的突变体胶原蛋白酶在表皮的药学上可接受载体中，其可以通过透皮给药技术，例如Hydroxysome技术，被送到皮下的白色脂肪细胞或凸起的疤痕中。在另一个实施方式中，突变体胶原蛋白酶的用量为每克待治疗的脂肪组织大约1到30ABC单位的突变体胶原蛋白酶(肥胖大鼠中1-50单位每脂肪垫)。胶原蛋白酶ABC活性单位在37℃下使用Worthington Biochem的胶原蛋白酶分析流程(保温5小时)进行计算。优选的，突变体胶原蛋白酶在液体的药学上可接受载体中以浓度为5到大约500ABC单位每毫升被引入。此外优选的，突变体胶原蛋白酶在表皮霜剂的药学上可接受载体中以浓度为5到大约500ABC单位每毫升被引入。在另一个实施方式中，所述药学上可接受载体中的突变体胶原蛋白酶被注射入所述脂肪瘤中。所述药学上可接受载体中的突变体胶原蛋白酶作为一种化学的脂肪抽吸剂被注射入脂肪垫。
根据本发明，本发明的突变体胶原蛋白酶可以伴随透皮技术用作脂肪分解霜，或替代脂肪抽吸术的表皮霜剂，或可用于疤痕减少的霜剂。
换言之，本发明提供一种新的方法来减少过量的不美观和/或冗余的皮下脂肪组织，其为非-介入性的方法，例如注射或表皮霜剂。本产品可以通过注射或表皮脂肪分解霜被用作化学的脂肪抽吸剂。当生物工程突变体ColH被引入活体动物的皮下脂肪组织中的时候，在该部位脂肪组织发生分解和减少。该方法既温和又精确，其不会对人体造成外伤，也不会产生感染。
本发明还致力于脂肪瘤的减少和清除，不论脂肪瘤是发现于皮肤表面、皮肤内部、皮下、或是身体的任何其它部位。脂肪瘤一般地是脂肪组织的良性肿瘤。目前，脂肪瘤通过手术进行去除，其潜在地造成被手术的病人的疼痛和血肿。本发明通过向脂肪瘤引入有效量的突变体ColH而避免了这些问题。该突变体蛋白比野生型ColH更加稳定，而具有更低的活性。其以缓慢柔和的方式溶解脂肪，且在肥胖大鼠的解剖实验中很少观察到出血。ColH突变体可以被开发为药物，因为它是一种单一的物质，易于进行CMC(化学品生产控制)。
本发明额外的应用是疤痕减少，无论疤痕是否发现于皮肤表面。突变体胶原蛋白酶能够消化凸起的疤痕组织中过度生长的胶原蛋白，从而减少疤痕的高度和外观。
纯化自商业来源的胶原蛋白酶(包括来自溶组织梭状芽胞杆菌的)是由5-6种胶原蛋白酶组成的混合物。即使经过高度纯化，具有相似的分子量和等电点(PIs)的ColH和ColG也是很难进行分离的。因此，来自溶组织梭状芽胞杆菌的高度纯化版本的胶原蛋白酶仍然包括ColG和ColH的混合物。在我们进行的肥胖大鼠实验中，通过常规过程纯化的野生型胶原蛋白酶诱导了大量出血。
本发明还可以被用于治疗脂肪瘤和其它脂肪组织，其可以在人和动物体内、在野生动物中、在人类家庭中、或在动物园里。
人类含有一层脂肪组织，其主要由我们皮下相互连接的脂肪细胞组成。本发明通过向脂肪组织中引入有效量的单一突变体ColH(溶组织梭状芽胞杆菌)，能够减少我们皮下脂肪组织的数量。在来自于“组织进展(Advance Tissues公司)”的专利中，他们使用了一种来自于溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶混合物，其在我们进行的大鼠实验中诱导了大量出血。
1)为了降低胶原蛋白消化活性的ColH突变基础
因为溶组织梭状芽胞杆菌胶原蛋白酶广泛的底物专一性和在培养物滤液中的大量存在，它已经被普遍地用于可联结组织的分解和组织培养细胞的分离(Seglen，P.O.1976，Preparation of isolated rat liver cells.Methods Cell Biol.13：29-83)。然而，至少六种具有分子量范围为68-125kD的不同形式(胶原蛋白酶)存在于商业制备的产品中(Bond，M.D.，和Van Wart，H.E.，1984，Characterization of individualcollagenases from Clostridium histolyticum.Biochemistry 23：3085-3091)。将单一的酶进行分离的困难和市售胶原蛋白酶制备中不同批次的差异限制了它的实际应用。化学品生产控制(CMC)在药物开发中是非常重要的。每一批次的制备都应当是一致的。因此，这种纯化困难导致将直接纯化自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶作为药物施用于人体的过程出现了潜在的问题。
ColH基因编码116kD的胶原蛋白酶(Yoshihara，K.，Matsushita，O.，Minami，J.，和Okabe，A.Cloning and nucleotide sequence analysis of the colH gene fromClostridium histolyticum encoding a collagnease and a gelatinase.J.Bacteriol.176：6489-6496)。在ColH的C-末端含有110个残基的胶原蛋白-结合域(Wilson，J.J.，Matsushita，O.，Okabe，A.，和Sakon，J.，A bacterial collagen-binding domain withnovel calcium-binding motif controls domain orientation，EMBO J.2003，22(8)：1743-1752)，其在体外结合不溶性的I型胶原蛋白(Matsushita，O.，Yoshihara，K.，Katayama，SA.，Minami，J.，和Okabe，A.1994.Purification and characterizationof a Clostridium histolyticum 120-kilodalton collagenase and nucleotide sequenceof the corresponding gene.J.Bacteriol.176：149-156)，并在体内结合胶原纤维(Nishi，N.，Matsushita，K.，Yuube，H.，Miyanaka，A.，Okabe，A.，和Wada，F.1998.Collagen-binding growth factors：production and characterization of functionalfusion proteins having a collagen-binding domain.Proc.Natl.Acad.，Sci.USA95：7018-7023)。因此ColH非常专一性地切断脂肪细胞之间的胶原蛋白。ColH能够切断PXGP序列中甘氨酸残基的氨基一侧的肽键(Peterkofsky，B.，1982.Bacterialcollagenase.Methods Enzymol.82：453-471)。原子吸收分光光度测定法和螯合剂金属置换等研究已经表明，每分子ColH包含一个催化所必需的锌原子(Angelton，E.L.，和Van Wart，H.E.1988.Preparation and reconstitution with divalent metal ionsof class I and class II Clostridium histolyticum appocollagenases.Biochemistry27：7406-7412)，因此ColH被认为是一种锌金属蛋白酶。
N-末端的80kD包括ColH的活性位点(Matsushita，O.，Jung，C-M.，Minami，J.，Katayama，S.，Nishi，N.和Okabe A.1998.A study of the collagenase-binding domainof a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase.J.Biol.Chem.273：3643-3648)。这一肽段包括序列HEXXH，其为锌金属蛋白酶(zincin)的共有基序，存在于大多数锌金属蛋白酶中。锌金属蛋白酶超家族包括脊椎动物胶原蛋白酶(基质金属蛋白酶(MMPs))作为基质金属蛋白酶亚家族。对同工型胶原蛋白酶ColA、ColG和ColH的氨基酸序列比对表明，它们保守于序列E446(ColG为D)E447XXXE451的锌金属蛋白酶基序C-末端序列。这可能是另一个锌结合位点。因此当我们寻找一种较野生型活性降低的ColH时，我们将目标定位于HEXXXH和E446EXXXE451。
根据Jung等人的研究(Jung，C-M.等.Identification of metal ligands in theClostridium histolyticum ColH collagnease，J.Bacteriology，1999 May：2816-2822)，作为所有Glu446和Glu451突变体中酶活性降低最多的两个突变体，E446A和E451A突变的ColH的Km值没有发生显著变化(分别为0.957和0.91)，这表明它们的底物结合(例如与胶原蛋白)没有被削弱。因此，看起来突变没有改变酶的球状三维结构。另一方面，它们的Kcat值显著下降，这表明催化作用被削弱了。因此我们选择的突变体ColH E451D按照正常的方式与底物结合。其具有降低的催化活性，这意味着它比野生型ColH较慢地剪切胶原蛋白。(注：Km定义为真实的酶底物复合体解离常数；Kcat定义为酶-底物复合物化学转化为酶-产物复合物的一级反应速率常数)。推测的ColH催化中心的结构如图2所示。
2)突变体ColH注射入脂肪细胞
选择药学上可接受的载体，包括对突变体ColH呈惰性的载体，是本领域的常规技术手段。例如生理盐水、葡聚糖水溶液和羟乙基淀粉水溶液等，优选适合缓冲至中性pH。可以使用纤维蛋白胶作为载体，其包括纤维蛋白或纤维蛋白前体，例如纤维蛋白原加凝血酶；参见美国专利No.5,279,825。此外，载体的选择和剂型制备的方法也是本领域的常规技术手段。虽然水和钙离子是酶的激活所必需的，但是存在于皮下组织中的含水的组织间隙液已经足够做到这一点。上述载体适合权利要求1中的突变体ColH的注射输送。
医师首先选择他/她所想要治疗的身体的部位。为了限制一次注入体内的酶的数量，以及允许对结果进行初步评定，可以在初步治疗的时候选择有限的区域-其可以小于全部区域。治疗用的溶液透皮注射到皮下脂肪组织，如果医师或病人强烈要求的话，在注射前实行轻度局部麻醉。为了一定数量的酶溶液能够发挥其最大功效，其应当在区域内的多个相邻点位处分别进行少量注射，优选间距不大于大约2厘米，甚至更小。要获得最佳效果需要分时注射，例如每3天注射一次或每周注射2到3次。
本发明的突变体ColH来自于生物工程化的ColH菌株，使用E.coli作为宿主。突变体ColH的效能测定是根据其在pH 7.2和37℃下对于非变性胶原蛋白(来自牛筋)消化5小时的结果得到的。所裂解的肽键数量通过与茚三酮的反应测得。胰蛋白酶消化对照所释放的氨基被从中扣除。一个净的ABC单位的胶原蛋白酶能够溶解的茚三酮反应物质相当于每分钟1.09纳摩尔亮氨酸。
可接受载体中的浓度根据下述原则进行选择：含有足够多的液体以能够在皮下的脂肪组织中充分扩散，而不多于足够携带所需数量的活性物进入待治疗的区域。每毫升大约50到500ABC单位胶原蛋白酶的浓度范围是合适的，而特定环境下选择在此范围内和相当多地超出该范围也是可能的。因为扩散进入脂肪组织和由此带来的脂肪解离很少是彻底的，一般需要重复该治疗至少一次。其可以在几天以后进行，例如3天或一周后。
注射权利要求1中的突变体胶原蛋白酶可以替代脂肪抽吸术或被用于脂肪抽吸术的辅助手段。该治疗导致脂肪组织的充分破坏，使之更容易被抽吸清除。脂肪抽吸阶段将在施用本发明的1到3天后实施。
脂肪瘤一般通过手术或脂肪抽吸进行清除。通过使用突变体ColH，脂肪瘤的肿块可以被彻底清除。以上所述的流程、载体、剂量和浓度可应用到脂肪瘤的治疗中。
3)表皮抗-皮下脂肪团和疤痕减少霜剂
权利要求1中的修饰的突变体ColH可以通过合适的透皮传递方法通过表皮被送到脂肪细胞中。定位突变体胶原蛋白酶到脂肪细胞维管结构的信号肽有助于绕开皮肤内的所有胶原蛋白(Nature Medicine 10(6)，p625-632，2004)。70％的人体蛋白是由胶原蛋白组成。因此该信号肽能够消除表皮胶原蛋白酶变体干扰皮肤结构的副作用。
迄今为止只有很少的透皮技术能够递送大的蛋白质进入皮肤，特别是当它大于40kD的时候。本发明的修饰的突变体胶原蛋白酶大小为120kD。然而，一种新的透皮技术使用Hydroxysome，或陶瓷羟基磷灰石(化学纯磷酸钙，美国专利号#6,096,324和专利号#6,120,782)，能够递送大的蛋白质，例如900KD的胶原蛋白进入表皮层、真皮层和脂肪细胞区域。因此结合恰当的透皮传递方法，本发明中的修饰的突变体胶原蛋白酶是一种有效的抗-皮下脂肪霜剂，其能够到达脂肪细胞并有效地溶解脂肪。
另外，结合恰当的透皮吸收方法，本发明中的修饰的突变体胶原蛋白酶是一种有效的伤痕减少霜剂，其能够慢慢地消化疤痕组织中过度生长的胶原蛋白。
附图说明
图1描述了突变体ColH和修饰的突变体ColH蛋白和DNA序列，使用Xa因子进行酶切。
图2描述了推测的ColH活性位点。锌-配位键和氢键分别使用粗箭头和点线标注。细箭头表示反应机理的第一步(来自J.Bacteriology，May 1999，p.2816-2822).
图3是纯化的ColH(E451D)的7.5％PAGE凝胶电泳图，以及野生型ColH和突变体ColH(E451D)的稳定性结果。第1道(lane 1)为天然的ColH(10ug)加入胰蛋白酶(1ug)进行保温，第2道为加入胰蛋白酶(2ug)保温，二者均在4℃下保温1小时。第3道ColH(E451D，10ug)加入胰蛋白酶(0.5ug)进行保温，第4道加入胰蛋白酶(1ug)保温，第5道加入胰蛋白酶(2ug)保温，均在4℃下保温1小时。在1小时的保温后，使用0.5ul的0.1M PMSF终止消化反应。每个保温结果通过7.5％SDS-PAGE进行检测。
图4表示使用ColH(E451D)注射的脂肪组织分解。所处理的脂肪垫位于大鼠后腿的后部。左侧的脂肪垫注射用生理盐水稀释的5个单位的E451D，右侧只注射生理盐水。
图5表示使用ColH-FM和Hydroxysome表皮霜剂的大鼠脂肪垫的减少，解剖结果。
图6表示使用ColH(E451D)和Hydroxysome表皮霜剂的疤痕的减少。
具体实施方式
1.ColH的克隆(GST-ColH，使用pGEX5T-3质粒)
1)ColH的DNA，来自日本可川医学校(Kagawa Medical School)的Dr.Matsushita(2ug，pCHCII)
2)使用下列引物、ColH的DNA(来自Dr.Matsushita)作为模板进行PCR，得到2.95kb DNA片段。
YO181：AAAGGATCCGTACAAAATGAAAGT
YO182：AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC
3)使用限制性内切酶(来自New England Biolabs)BamHI和Xhol酶切A87片段和pGEX-5T-3载体。连接酶切得到的载体和片段。转化TOP10细胞，涂布于氨苄青霉素(0.1mg/ml)琼脂糖平板。
4)经过小型制备和DNA测序确认平板上的一个菌落携带有野生型ColH的正确序列。
5)使用pGEX5T-3-ColH(野生型)转化BL21(E3)/pLysS(来自Invitrogen)。
2)引入E451D突变体。
a)PCR
片段4：使用下列引物、ColH野生型cDNA作为模板进行PCR：
YO181：AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGT
YO208：CCTGCAAATAAATCTGCTCCACCTTCTTCATACCAAG
片段5：使用下列引物、ColH野生型cDNA作为模板进行PCR：
YO209：GTGGAGCAGATTTATTTGCAGGTTCTACTAGAACTTC
YO182：AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC
片段6：使用下列引物、片段1和2作为模板进行PCR：
YO181：AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGT
YO182：AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC
b)使用限制性内切酶(来自New England Biolabs)BamHI和Xhol酶切片段6和pGEX-5T-3载体。连接酶切得到的载体和片段。转化TOP10细胞，涂布于氨苄青霉素(0.1mg/ml)琼脂糖平板。
c)经过小型制备和DNA测序确认平板上的一个菌落携带有ColH E451D的正确序列。
d)使用pGEX5T-3-ColH(E451D)转化BL21(E3)/pLysS(来自Invitrogen)，涂布于含氨苄青霉素(0.1mg/ml)和氯霉素(0.1mg/ml)的琼脂糖平板。
结论：对野生型和突变体ColH质粒进行测序，确认序列的可靠性。
3)在突变体ColH(E451D)N-末端引入CKGGRAKDC-GG〔命名ColH-FM)
1)使用下列引物、pGEX5T-3-ColH(E451D)作为模板(见上一节)进行PCR，得到2.95kb DNA片段。
LH1：AAAGGATCCTGTAAGGGAGGAAGAGCTAAGGATTGTGGAGGAGTACAAAATGAAAGT
LH2：AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC
2)使用限制性内切酶(来自New England Biola2s)BamHI和Xhol酶切片段LH12和pGEX-5T-3载体。连接酶切得到的载体和片段。转化DH5α细胞，涂布于氨苄青霉素(0.1mg/ml)琼脂糖平板。
3)挑选菌落，进行小型制备获得DNA，测序
4)使用pGEX4T-3-修饰的ColH(E451D)转化BL21(E3)/pLysS(来自Invitrogen)。
2.纯化
试剂：
PGEX5T-3-ColH 451突变体和pGEX5T-3-修饰的ColH(E451D)
LB肉汤(高压灭菌)
IPTG，氨苄青霉素，氯霉素，DTT，PMSF。
谷胱甘肽琼脂糖珠(50％乙醇浆，Pharmacia)
Xa因子(Amershan Bioscience，400单位，用水稀释至1单位/ul，4度)
细胞裂解液：PBS+0.1％ NP40+5mM DTT+0.1mM PMSF
洗涤缓冲液：PBS+5mM DTT
裂解缓冲液：50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，2.5mM CaCl2+1mM DTT
方法：
1)在新制的LB+氨苄青霉素(0.1mg/ml)+氯霉素(0.1mg/ml)琼脂糖平板上划线接种用甘油保藏的pGEX5T-3-ColH 451。37℃培养过夜。
2)挑一个菌落，开始5ml的LB+氨苄青霉素(Amp)+氯霉素培养，37℃振荡4小时。
3)将5ml培养液转移到100ml LB+Amp+氯霉素的摇瓶中，37℃振荡过夜。
4)使用4×25ml过夜的培养物接种4×1L LB+Amp+氯霉素的摇瓶(在2.8L的大摇瓶中)，37℃振荡，O.D.600＝0.6-1的时候使用IPTG(0.2mM)进行诱导。
5)室温下振荡过夜大约16小时。
6)500rpm下离心10分钟收获细胞。
7)4℃下用40ml细胞裂解液重悬。
8)4℃超声打碎细胞。
9)4℃、17000rpm下离心30分钟。将上清液保存在50ml的Falcon管中。
10)在上清液管中添加4ml 50％的谷胱甘肽琼脂糖珠。4℃保温过夜。
11)将所有上清液和珠粒倾入小柱子。4℃下使用每次10ml洗涤缓冲液洗涤，共三次。
12)4℃下使用10ml裂解缓冲液洗涤柱子一次。
13)封闭柱子底部，4℃下向柱子中加入4ml裂解缓冲液，其中加入200ul(Xa因子，1单位/1ul)。4℃保温过夜。Xa因子：4℃下在裂解缓冲液中过夜，1单位裂解大约100ug GST标签蛋白。
14)打开柱子底部，洗脱蛋白，将洗脱液保存在15ml falcon管中。再用2ml裂解缓冲液洗涤柱子1次，将洗脱液保存在同一根15ml falcon管中。
结论：在一步亲和纯化后纯度大约90％。
3.突变体ColH和修饰的突变体ColH的活性检测
试剂
·0.05M TES(三羟甲基氨基甲烷(羟甲基)-甲基-2-氨基乙烷磺酸盐)缓冲液添加0.36mM氯化钙，pH 7.5
·4％茚三酮的甲氧基乙醇溶液
·0.2M柠檬酸钠缓冲液添加0.71mM氯化亚锡，pH 5.0
·茚三酮-柠檬酸混合物：通过将50ml 4％茚三酮的甲氧基乙醇溶液和50ml pH 5.0的添加0.71mM氯化亚锡的0.2M柠檬酸盐缓冲液混合而成。混合物搅拌5分钟。
·50％正丙醇
·底物：Worthington牛跟腱胶原蛋白(编码：CL)和不含维生素的酪蛋白流程
1)称重5份25mg Worthington牛胶原蛋白分别放入5个试管。包括至少2个试管用于空白对照，其中不含酶。
2)将5.0ml 0.05M TES缓冲液加入试管中，37℃保温15分钟。向目标试管中加入0.1ml商业的胶原蛋白酶或突变体ColH酶稀释物(不同浓度)开始反应。
3)5小时后，将0.2ml溶液(剩下胶原蛋白)转移到含有1.0ml茚三酮-柠檬酸混合物的试管中停止胶原蛋白酶反应。包括一个酶空白对照(用0.1ml TES缓冲液代替酶，与胶原蛋白保温)。
4)在沸水浴中加热20分钟。冷却后，用5ml 50％正丙醇进行稀释。放置15分钟，读取600nm处的吸光度。根据L-亮氨酸标准曲线测定氨基酸微摩尔数相当于释放的亮氨酸的量。
结论：E451D为来自Worthington-biochem胶原蛋白酶活性的20％。
4.ColH变体的稳定性实验
使用蛋白酶胰蛋白酶来评价ColH的稳定性。
1)制备1ug/ul胰蛋白酶(来自Sigma)
2)将10ug野生型或突变体ColH置于Eppendorf管中，用PBS稀释到1ug/ul。
3)对于每种蛋白，在管1中，加入0.5ul 1ug/ul胰蛋白酶；在管2中，加入1ul1ug/ul胰蛋白酶；在管3中，加入2ul 1ug/ul胰蛋白酶。
4)在冰上保温1小时。
5)7.5％ SDS PAGE检测。
结论：E451D的稳定性是野生型ColH的两倍。
5.突变体ColH(E451D)溶脂(注射)的肥胖大鼠实验
a)肥胖大鼠喂养流程
购买大约50g的S.D.大鼠。按照以下方式喂养：
食物：每100g主食中，加入猪油10g，奶粉125g，蛋60g，鱼油10滴。在开始的1-2周，每只大鼠每天供给13g食物。在第3周，每只大鼠每天供给15g。在第4周，每只大鼠每天供给17g。等等诸如此类。第8周后，大鼠重量大约200-300g，准备进行实验。
b)注射流程
将0.1ml的液体注射入后腿的每个脂肪垫上。
一般地，可以观察到对于每脂肪垫进行透皮注射大约3到大约50ABC单位的胶原蛋白酶的剂量，能够在24小时后有效地溶解注入端的脂肪垫，而只伴随着极少量的出血。可以看出随着剂量的增加，溶脂效果和空隙的出血量也趋向于增加。超过50ABC单位和更高的剂量导致相当多的局部出血，但是在剂量为5到50ABC单位下出血量非常小，甚至没有。
动物模型
S.D.大鼠，雄性和雌性。
使用的突变体E451D ColH材料
每克胶原蛋白酶的ABC单位：163,000
溶剂：灭菌的生理盐水
麻醉，通过腹部注射(I.P.)
实验过程
通过腹膜内注射麻醉大鼠。对于每只雄性大鼠，在一条腿后面的一个脂肪垫被注射入生理盐水，在另一条腿后面的一个脂肪垫被注射入5个单位的突变体胶原蛋白酶ColHE451D。在2天或3天后额外注射相同的活性单位。
20只S.D.肥胖大鼠，10只雌性，10只雄性(自50g开始进行8周的喂养)，重量为200-300g。使用5u的ColH E451D按照5种不同的方案对它们进行注射。每种方案使用4只大鼠，2只雌性2只雄性。
实验A
大鼠的数量：4只S.D.大鼠，两只雌性两只雄性。
大鼠1：雄性，261g；大鼠2：雄性，312g；大鼠3：雌性，232g；大鼠4：雌性，239g。
测试液：5u ColH E451D溶于0.1mL生理盐水
使用22标准直径(gauge)，8″的针
注射：将溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第1天
结果：在第3天对四只大鼠进行解剖。
位置1(后腿后面的一侧)：生理盐水：观察到正常的脂肪垫。
位置2(后腿后面的另一侧)：5u。
注射区域的大多数脂肪被溶解。只观察到非常少的出血。没有影响到肌肉膜。在注射位点观察到数量可观的油状物，其反映了脂肪细胞的减少或破坏。
实验B
大鼠的数量：4只S.D.大鼠，两只雌性两只雄性。
大鼠1：雄性，256g；大鼠2：雄性，249g；大鼠3：雌性，221g；大鼠4：雌性，250g。
测试液：5u ColH E451D溶于0.1mL生理盐水
使用22标准直径(gauge)，8″的针
注射：第1天，将溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针
结果：在第4天对四只大鼠进行解剖。
位置1(后腿后面的一侧)：生理盐水：观察到正常的脂肪垫。
位置2(后腿后面的另一侧)：5u。
注射区域附近的脂肪被彻底溶解。周围的脂肪容易破碎和分解。没有影响到肌肉膜。只观察到非常少的出血。
实验C
大鼠的数量：4只S.D.大鼠，两只雌性两只雄性。
大鼠1：雄性，252g；大鼠2：雄性，249g；大鼠3：雌性，255g；大鼠4：雌性，206g。
测试液：5u ColH E451D溶于0.1mL生理盐水
使用22标准直径(gauge)，8″的针
注射：
将5u的溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第1天
将5u的溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第3天
结果：在第5天对四只大鼠进行解剖。
位置1(后腿后面的一侧)：生理盐水：观察到正常的脂肪垫。
位置2(后腿后面的另一侧)：5u。
注射区域的大多数脂肪(大于50％)被溶解。观察到少量的出血。在注射位置观察到数量可观的油状物。剩余的脂肪是分离的、易碎的和不活泼的。
实验D
大鼠的数量：4只S.D.大鼠，两只雌性两只雄性。
大鼠1：雄性，240g；大鼠2：雄性，253g；大鼠3：雌性，244g；大鼠4：雌性，266g。
测试液：5u ColH E451D溶于0.1mL生理盐水
使用22标准直径(gauge)，8″的针
注射：
将5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第1天
将5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第4天
结果：在第6天对四只大鼠进行解剖。
位置1(后腿后面的一侧)：生理盐水：观察到正常的脂肪垫。
位置2(后腿后面的另一侧)：5u。
注射区域附近的脂肪被彻底溶解。没有影响到肌肉膜。观察到痕量的血液。
大鼠1：
盐水注射区域脂肪的重量：1.46g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.09g。
大鼠2：
盐水注射区域脂肪的重量：1.28g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.17g。
大鼠3：
盐水注射区域脂肪的重量：1.43g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.16g。
大鼠4：
盐水注射区域脂肪的重量：1.47g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.23g。
实验E
大鼠的数量：4只S.D.大鼠，两只雌性两只雄性。
大鼠1：雄性，240g；大鼠2：雄性，266g；大鼠3：雌性，216g；大鼠4：雌性，238g。
测试液：5u ColH E451D溶于0.1mL生理盐水
使用22标准直径(gauge)，8″的针
注射：
将5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第1天
将5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第3天
将5u的ColH E451D溶液慢慢地注入脂肪垫，抽针。第5天
结果：在第6天对四只大鼠进行解剖。
位置1(后腿后面的一侧)：生理盐水：观察到正常的脂肪垫。
位置2(后腿后面的另一侧)：5u。
注射区域附近的脂肪被彻底溶解。没有影响到肌肉膜。剩余痕量的血液。
大鼠1：
盐水注射区域脂肪的重量：0.925g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：0.75g。
大鼠3：
盐水注射区域脂肪的重量：1.12g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.04g。
大鼠4：
盐水注射区域脂肪的重量：1.56g；
ColH E451D注射区域脂肪的重量：1.38g。
6.突变体ColH(E451D)霜剂(N-末端引入CKGGRAKDC-GG，ColH-FM)与hydroxysome透皮吸收方法结合使用溶解脂肪(表皮)的肥胖大鼠实验
实验材料
1.1实验动物：
雄性大鼠，重85-95g，断乳后1周
1.2食物：
基本膳食由动物中心提供。高脂肪饮食成分：55％基本膳食，12％猪油，10％蛋，全脂奶粉8％，蔗糖5％，花生5％，芝麻油3％，和盐2％。
1.3肥胖大鼠模型构建：
购买了35只大鼠，喂养一周，使其熟悉生存环境。接下来将这些大鼠分为2组：1)对照大鼠组(5只大鼠)，喂给基本膳食；和2)肥胖大鼠组(30只大鼠)，喂给高脂肪饮食，另皮下注射15％MSG盐水溶液3g/kg(每天1次)，持续5天。在MSG注射后的第21天，肥胖大鼠组被分成6组，a)肥胖大鼠模型组，b)注射高剂量组，c)注射中等剂量组，d)表皮高剂量组，e)表皮中等剂量组，f)表皮低剂量组。
这些大鼠生活在干净环境中，每天有12小时的黑暗和12小时的日光，并具有舒适的温度和良好的通风。大鼠可以自由地吃食物和喝水。
1.4观测参数：
常规参数：食物摄入，排尿和面部分泌，以及日常活动。
生长参数：重量，体长，尾巴长度，和Lee参数(Lee’s parameters)。
1.5测试药物：
1.5.1HAX(hydroxysome)溶液：0.1g/ml，新鲜制备，将0.5g HAX溶于5ml实验用蒸馏水制得。
1.5.2测试药物溶液：2.3ml HAX溶液(0.1g/ml)与2ml Oulian蛋白样品(ColH-FM)混合。
5u Oulian样品(ColH-FM)＝18ul混合的溶液
1.5.3对照溶液：2.3ml HAX溶液(0.1g/ml)与2ml PBS或生理盐水溶液混合。
实验方法
2.1分组：
将30只肥胖大鼠随机分为6组，每组5只大鼠。对生殖器官的脂肪垫施用测试药物溶液1.5.2和对照溶液。
2.2剂量和持续时间：
对于每个剂量，连续9天对动物进行注射或表皮施用测试药物溶液，每天一次。对照组每天对表皮只施用对照溶液，共9天。在第10天，杀死大鼠用于鉴定。
2.3鉴定：
脂肪减少的功效鉴定是通过肉眼观察和对受测区域脂肪垫的称重来完成的。
结果
脂肪减少的解剖图如图5所示。
表1.ColH-FM溶脂产品对于肥胖大鼠模型的效果(X±S)
组 大鼠数量(No.) 剂量单位/大鼠 大鼠初始重量(g) 大鼠结束重量(g) Lee参数 脂肪垫重量(g)   脂肪去除量(％)
  1)大鼠对照组 5 95.5±3.2 222.8±16.5 291.2±11.6 0.99±0.24 -
  2)肥胖大鼠对照组 5 92.3±3.7 253.6±28.5 315.0±16.3 1.24±0.36 -
  3)注射高剂量组 5 15 96.2±2.9 253.1±8.1 316.6±14.2 0.46±0.11 62.9
  4)注射中剂量组 5 10 94.5±4.2 253.8±21.5 315.8±17.5 0.65±0.19 47.6
  5)表皮高剂量组 5 15 96.5±4.3 258.5±25.3 316.6±14.2 0.63±0.21 49.2
  6)表皮中剂量组 5 10 97.5±3.6 256.4±16.9 317.6±14.2 0.65±0.19 47.6
  7)表皮低剂量组 5 5 94.6±4.1 255.2±16.5 316.6±14.2 0.77±0.29 37.9
结论：
1)表皮施用ColH-FM(修饰的突变体胶原蛋白酶)与Hydroxysome透皮技术的结合能够有效地清除动物的皮下脂肪。
2)在中等剂量(10单位/大鼠)下，注射和表皮施用ColH-FM的溶脂效果是相似的。
7.突变体ColH(E451D)霜剂(ColH-FM)与hydroxysome透皮传递方法结合使用溶解脂肪(表皮)的人体实验
ColH-FM霜剂的人体实验是2005年10月在中国北京进行的。医师是Dr.Yu，HaiZhou。对15名肥胖对象进行不同活性单位的CoH-FM霜剂的测试，每天夜间针对肥胖的腹部区域施用一次霜剂，持续2周。用超声波检验脂肪组织的厚度，得到如下结果。
表2.ColH-FM溶脂产品对于受试人的影响
表皮施用突变体胶原蛋白酶的人体实验小结
中国，2005年10月
结论：
1)表皮施用ColH-FM(修饰的突变体胶原蛋白酶)结合Hydroxysome透皮技术能够有效地清除人皮下脂肪。
2)表皮产品是安全的，不会诱导过敏反应或增加血脂。
8.突变体ColH(E451D)霜剂与hydroxysome透皮传递方法联合使用减少疤痕(表皮)的人体实验
用法：
·对疤痕区域每天两次施用霜剂(少量)，一早一晚。
结果：
1)疤痕历史
男性，38岁。手上的伤疤是1999年由尖刀造成的。当时对伤口进行的唯一处理是止血，没有进行缝合。后来形成的伤疤大小：长度5cm，宽度：0.8cm。
2)结果
·使用霜剂前，伤疤为白色，其颜色与正常皮肤完全不同。伤疤是凸起的。
·使用霜剂6天后，伤疤颜色与正常皮肤接近，伤疤大小减少40％。
·使用30天后，伤疤几乎变平，且有清晰的皮肤纹理。请参见图6.
3)来自另两个测试对象的结果
·男性，10岁，前额凸起的伤疤，由车祸和低水平的治疗造成。施用40天后，凸起的伤疤几乎变平。
·男性，2岁，肘部凸起的伤疤。施用20天后，凸起的伤疤变平到一定程度。
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>n＝2-6
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是1-6个Gly
<400>1
Gly Ser Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys Gly Xaa Val Gln Asn
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Arg Tyr Thr Val Ser Tyr Leu Lys Thr Leu Asn Tyr Tyr
            20                  25                  30
Asp Leu Val Asp Leu Leu Val Lys Thr Glu Ile Glu Asn Leu Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Phe Gln Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Glu Phe Tyr Gly Asn Lys Thr
    50                  55                  60
Arg Met Ser Phe Ile Met Asp Glu Ile Gly Arg Arg Ala Pro Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Glu Ile Asp His Lys Gly Ile Pro Thr Leu Val Glu Val Val Arg
                85                  90                  95
Ala Gly Phe Tyr Leu Gly Phe His Asn Lys Glu Leu Asn Glu Ile Asn
            100                 105                 110
Lys Arg Ser Phe Lys Glu Arg Val Ile Pro Ser Ile Leu Ala Ile Gln
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Glu Val Gln Asp Lys Ile Val
    130                 135                 140
Ser Ala Thr Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu Thr Ala Pro Pro Glu Val
145                 150                 155                 160
Val Asn Asn Phe Thr Pro Ile Leu Gln Asp Cys Ile Lys Asn Ile Asp
                165                 170                 175
Arg Tyr Ala Leu Asp Asp Leu Lys Ser Lys Ala Leu Phe Asn Val Leu
            180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Tyr Asp Ile Thr Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Lys Glu
        195                 200                 205
Lys Pro Glu Asn Thr Pro Trp Tyr Gly Lys Ile Asp Gly Phe Ile Asn
    210                 215                 220
Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Gly Lys Ile Asn Asp Asn Asn Ser
225                 230                 235                 240
Trp Ile Ile Asp Asn Gly Ile Tyr His Ile Ala Pro Leu Gly Lys Leu
                245                 250                 255
His Ser Asn Asn Lys Ile Gly Ile Glu Thr Leu Thr Glu Val Met Lys
            260                 265                 270
Val Tyr Pro Tyr Leu Ser Met Gln His Leu Gln Ser Ala Asp Gln Ile
        275                 280                 285
Lys Arg His Tyr Asp Ser Lys Asp Ala Glu Gly Asn Lys Ile Pro Leu
    290                 295                 300
Asp Lys Phe Lys Lys Glu Gly Lys Glu Lys Tyr Cys Pro Lys Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Phe Asp Asp Gly Lys Val Ile Ile Lys Ala Gly Ala Arg Val Glu
                325                 330                 335
Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Lys Glu Val Asn Ser
            340                 345                 350
Gln Phe Phe Arg Val Tyr Gly Ile Asp Lys Pro Leu Glu Glu Gly Asn
        355                 360                 365
Pro Asp Asp Ile Leu Thr Met Val Ile Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr
    370                 375                 380
Lys Leu Asn Ser Val Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Asn Asn Gly Gly Met
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Glu Pro Glu Gly Thr Phe Phe Thr Tyr Glu Arg Glu Ala Gln
                405                 410                 415
Glu Ser Thr Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Phe Arg His Glu Tyr Thr His
            420                 425                 430
Tyr Leu Gln Gly Arg Tyr Ala Val Pro Gly Gln Trp Gly Arg Thr Lys
        435                 440                 445
Leu Tyr Asp Asn Asp Arg Leu Thr Trp Tyr Glu Glu Gly Gly Ala Asp
    450                 455                 460
Leu Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr Ser Gly Ile Leu Pro Arg Lys Ser
465                 470                 475                 480
Ile Val Ser Asn Ile His Asn Thr Thr Arg Asn Asn Arg Tyr Lys Leu
                485                 490                 495
Ser Asp Thr Val His Ser Lys Tyr Gly Ala Ser Phe Glu Phe Tyr Asn
            500                 505                 510
Tyr Ala Cys Met Phe Met Asp Tyr Met Tyr Asn Lys Asp Met Gly Ile
        515                 520                 525
Leu Asn Lys Leu Asn Asp Leu Ala Lys Asn Asn Asp Val Asp Gly Tyr
    530                 535                 540
Asp Asn Tyr Ile Arg Asp Leu Ser Ser Asn Tyr Ala Leu Asn Asp Lys
545                 550                 555                 560
Tyr Gln Asp His Met Gln Glu Arg Ile Asp Asn Tyr Glu Asn Leu Thr
                565                 570                 575
Val Pro Phe Val Ala Asp Asp Tyr Leu Val Arg His Ala Tyr Lys Asn
            580                 585                 590
Pro Asn Glu Ile Tyr Ser Glu Ile Ser Glu Val Ala Lys Leu Lys Asp
        595                 600                 605
Ala Lys Ser Glu Val Lys Lys Ser Gln Tyr Phe Ser Thr Phe Thr Leu
    610                 615                 620
Arg Gly Ser Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Lys Gly Lys Leu Glu Asp Gln
625                 630                 635                 640
Lys Ala Met Asn Lys Phe Ile Asp Asp Ser Leu Lys Lys Leu Asp Thr
                645                 650                 655
Tyr Ser Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr
            660                 665                 670
Lys Val Asp Ser Ser Asn Arg Val Thr Tyr Asp Val Val Phe His Gly
        675                 680                 685
Tyr Leu Pro Asn Glu Gly Asp Ser Lys Asn Ser Leu Pro Tyr Gly Lys
    690                 695                 700
Ile Asn Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Glu Ser Ser Val Ser Thr Thr Thr
705                 710                 715                 720
Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ser Glu Asn Lys Leu Pro Val Ile Tyr Met
                725                 730                 735
His Val Pro Lys Ser Gly Ala Leu Asn Gln Lys Val Val Phe Tyr Gly
            740                 745                 750
Lys Gly Thr Tyr Asp Pro Asp Gly Ser Ile Ala Gly Tyr Gln Trp Asp
        755                 760                 765
Phe Gly Asp Gly Ser Asp Phe Ser Ser Glu Gln Asn Pro Ser His Val
    770                 775                 780
Tyr Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Thr Val Thr Leu Arg Val Met Asp Ser
785                 790                 795                 800
Ser Gly Gln Met Ser Glu Lys Thr Met Lys Ile Lys Ile Thr Asp Pro
                805                 810                 815
Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys Glu Pro Asn Asn Ser Lys Glu Thr
            820                 825                 830
Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly Ile Pro Val Ser Gly Thr Ile Glu
        835                 840                 845
Asn Thr Ser Asp Gln Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Val Ile Thr Pro Gly
    850                 855                 860
Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys Leu Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Trp
865                 870                 875                 880
Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn Ala Val Ser Tyr Ala Thr Asp Asp
                885                 890                 895
Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Tyr
            900                 905                 910
Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg Ile
        915                 920                 925
Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg
    930                 935
序列表
<110>Yolare Dermaceuticals Inc.
<120>修饰的突变体胶原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕减少中的应用
<130>rimeng-002
<150>US60/901,145
<151>2007-02-14
<160>1
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>936
<212>PRT
<213>溶组织梭状芽胞杆菌
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>n＝2-6
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是1-6个Gly
<400>1
Gly Ser Cys Lys GIy GIy Arg Ala Lys Asp Cys GIy Xaa Val Gln Asn
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Arg Tyr Thr Val Ser Tyr Leu Lys Thr Leu Asn Tyr Tyr
            20                  25                  30
Asp Leu Val Asp Leu Leu Val Lys Thr Glu Ile Glu Asn Leu Pro Asp
        35                  40                  45
Leu Phe Gln Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Glu Phe Tyr GIy Asn Lys Thr
    50                  55                  60
Arg Met Ser Phe Ile Met Asp Glu Ile GIy Arg Arg Ala Pro Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Glu Ile Asp His Lys GIy Ile Pro Thr Leu Val Glu Val Val Arg
                85                  90                  95
Ala GIy Phe Tyr Leu Gly Phe His Asn Lys Glu Leu Asn Glu Ile Asn
            100                 105                 110
Lys Arg Ser Phe Lys Glu Arg Val Ile Pro Ser Ile Leu Ala Ile Gln
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Glu Val Gln Asp Lys Ile Val
    130                 135                 140
Ser Ala Thr Gly Leu Leu Ala GIy Asn Glu Thr Ala Pro Pro Glu Val
145                 150                 155                 160
Val Asn Asn Phe Thr Pro Ile Leu Gln Asp Cys Ile Lys Asn lle Asp
                165                 170                 175
Arg Tyr Ala Leu Asp Asp Leu Lys Ser Lys Ala Leu Phe Asn Val Leu
            180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Tyr Asp Ile Thr Glu Tyr Leu Arg Ala Thr Lys Glu
        195                 200                 205
Lys Pro Glu Asn Thr Pro Trp Tyr GIy Lys Ile Asp Gly Phe Ile Asn
    210                 215                 220
Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Gly Lys Ile Asn Asp Asn Asn Ser
225                 230                 235                 240
Trp Ile Ile Asp Asn Gly Ile Tyr His Ile Ala Pro Leu Gly Lys Leu
                245                 250                 255
His Ser Asn Asn Lys Ile Gly Ile Glu Thr Leu Thr Glu Val Met Lys
            260                 265                 270
Val Tyr Pro Tyr Leu Ser Met Gln His Leu Gln Ser Ala Asp Gln Ile
        275                 280                 285
Lys Arg His Tyr Asp Ser Lys Asp Ala Glu Gly Asn Lys Ile Pro Leu
    290                 295                 300
Asp Lys Phe Lys Lys Glu Gly Lys Glu Lys Tyr Cys Pro Lys Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Phe Asp Asp Gly Lys Val Ile Ile Lys Ala Gly Ala Arg Val Glu
                325                 330                 335
Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Lys Glu Val Asn Ser
            340                 345                 350
Gln Phe Phe Arg Val Tyr Gly Ile Asp Lys Pro Leu Glu Glu Gly Asn
        355                 360                 365
Pro Asp Asp Ile Leu Thr Met Val Ile Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr
    370                 375                 380
Lys Leu Asn Ser Val Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Asn Asn Gly Oly Met
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Glu Pro Glu Gly Thr Phe Phe Thr Tyr Glu Arg Glu Ala Gln
                405                 410                 415
Glu Ser Thr Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Phe Arg His Glu Tyr Thr His
            420                 425                 430
Tyr Leu Gln Gly Arg Tyr Ala Val Pro Gly Gln Trp Gly Arg Thr Lys
        435                 440                 445
Leu Tyr Asp Asn Asp Arg Leu Thr Trp Tyr Glu Glu Gly Gly Ala Asp
    450                 455                 460
Leu Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr Ser Gly Ile Leu Pro Arg Lys Ser
465                 470                 475                 480
Ile Val Ser Asn Ile His Asn Thr Thr Arg Asn Asn Arg Tyr Lys Leu
                485                 490                 495
Ser Asp Thr Val His Ser Lys Tyr Gly Ala Ser Phe Glu Phe Tyr Asn
            500                 505                 510
Tyr Ala Cys Met Phe Met Asp Tyr Met Tyr Asn Lys Asp Met Gly Ile
        515                 520                 525
Leu Asn Lys Leu Asn Asp Leu Ala Lys Asn Asn Asp Val Asp Gly Tyr
    530                 535                 540
Asp Asn Tyr Ile Arg Asp Leu Ser Ser Asn Tyr Ala Leu Asn Asp Lys
545                 550                 555                 560
Tyr Gln Asp His Met Gln Glu Arg Ile Asp Asn Tyr Glu Asn Leu Thr
                565                 570                 575
Val Pro Phe Val Ala Asp Asp Tyr Leu Val Arg His Ala Tyr Lys Asn
            580                 585                 590
Pro Asn Glu Ile Tyr Ser Glu Ile Ser Glu Val Ala Lys Leu Lys Asp
        595                 600                 605
Ala Lys Ser Glu Val Lys Lys Ser Gln Tyr Phe Ser Thr Phe Thr Leu
    610                 615                 620
Arg GIy Ser Tyr Thr Gly GIy Ala Ser Lys GIy Lys Leu Glu Asp Gln
625                 630                 635                 640
Lys Ala Met Asn Lys Phe Ile Asp Asp Ser Leu Lys Lys Leu Asp Thr
                645                 650                 655
Tyr Ser Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr
            660                 665                 670
Lys Val Asp Ser Ser Asn Arg Val Thr Tyr Asp Val Val Phe His GIy
        675                 680                 685
Tyr Leu Pro Asn Glu Gly Asp Ser Lys Asn Ser Leu Pro Tyr Gly Lys
    690                 695                 700
Ile Asn GIy Thr Tyr Lys Gly Thr Glu Ser Ser Val Ser Thr Thr Thr
705                 710                 715                 720
Ala Glu lle Lys Asp Leu Ser Glu Asn Lys Leu Pro Val Ile Tyr Met
                725                 730                 735
His Val Pro Lys Ser Gly Ala Leu Asn Gln Lys Val Val Phe Tyr Gly
            740                 745                 750
Lys Gly Thr Tyr Asp Pro Asp Gly Ser Ile Ala Gly Tyr Gln Trp Asp
        755                 760                 765
Phe Gly Asp Gly Ser Asp Phe Ser Ser Glu Gln Asn Pro Ser His Val
    770                 775                 780
Tyr Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Thr Val Thr Leu Arg Val Met Asp Ser
785                 790                 795                 800
Ser Gly Gln Met Ser Glu Lys Thr Met Lys Ile Lys Ile Thr Asp Pro
                805                 810                 815
Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys Glu Pro Asn Asn Ser Lys Glu Thr
            820                 825                 830
Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly Ile Pro Val Ser Gly Thr Ile Glu
        835                 840                 845
Asn Thr Ser Asp Gin Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Val Ile Thr Pro Gly
    850                 855                 860
Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys Leu Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Trp
865                 870                 875                 880
Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn Ala Val Ser Tyr Ala Thr Asp Asp
                885                 890                 895
Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Tyr
            900                 905                 910
Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg Ile
        915                 920                 925
Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg
    930                 935

Claims (18)

1、一种包含一种修饰的单一突变体胶原蛋白酶ColH-FM的组合物，其中ColH-FM是一种溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451Asp)、并在ColH(Glu451Asp)前附加有肽基序CKGGRAKDC-G(x)，其中x等于2-6。
2、权利要求1的组合物，其中的胶原蛋白酶ColH-FM具有序列SEQ ID NO.1。
3、权利要求1和2任意一项的组合物，进一步包括药学上可接受的载体。
4、权利要求3的组合物，其中所述载体选自由生理盐水、葡聚糖水溶液、和羟乙基淀粉水溶液组成的组。
5、权利要求1-2的ColH-FM在制备靶向减少脂肪组织数量的药物中的用途。
6、权利要求1-2的ColH-FM在制备用于减少和/或消除脂肪瘤的药物中的用途。
7、权利要求5-6任意一项的用途，其中的用途是注射或表皮施用。
8、权利要求7的用途，其中的表皮施用包括使用剂型为霜剂、浆液或液体形式的透皮吸收系统。
9、权利要求1-2的ColH-FM在制备用于疤痕减少的药物中的用途。
10、一种减少体内指定位置的脂肪组织数量的方法，包括向所述组织引入有效量的突变体胶原蛋白酶，或附加有N-末端或C-末端标签CKGGRAKDC-G(x)(其中x是2-6)的相同的突变体胶原蛋白酶，或任何能够靶向人体和动物体内白色脂肪维管结构的其它肽类。
11、权利要求10的方法，其中所述的脂肪组织是皮下组织。
12、权利要求10的方法，其中突变的全长ColH来自溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridiumhistolyticum)。
13.包含溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制备靶向减少脂肪组织数量的药物中的用途。
14.包含溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制备用于减少和/或消除脂肪瘤的药物中的用途。
15.包含溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)胶原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制备用于疤痕减少的药物中的用途。
16.权利要求13，14或15的用途，其中的用途是注射或表皮施用。
17.权利要求16的用途，其中的表皮施用包括使用剂型为霜剂、浆液或液体形式的透皮吸收系统。
18.突变体ColH是在Glu451处突变为其它20种氨基酸残基的任何一种，特别是E451A和E451Q。
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