KR20050016333A - 프로트롬빈 활성화 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사고 또는 다른 타입의 부상 또는 외상에 의한 수술 또는 상처의 치료 동안에 지혈을 향상시키고 혈액 손실을 예방하기 위해 뱀 독 프로테아제를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로트롬빈 활성화 단백질{PROTHROMBIN ACTIVATING PROTEIN}

본 발명은 신규한 뱀 독 프로테아제(snake venom protease) 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 사고 및 다른 유형의 부상 또는 외상의에 의한 상처 수술 또는 치료하는 동안 지혈을 증가시키고, 혈액 손실을 예방하기 위해 뱀 독 프로테아제를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

흔히 혈액의 응결 또는 혈액 응고로 불리는 지혈은 과도한 혈액 손실을 예방하는 상처 또는 부상에 대한 중요한 생물학적 반응이다. 포유류에서 지형을 조절하는 생화학적 연속 단계는 잘 알려져 있다. 이 경로에서 중요한 단계는 안정한 덩어리를 형성하기 위해 피브린과 가교되는 인자 XIIIa를 활성화 시키는 트롬빈을 생성하는 프로트롬비나아제 착물에 의한 프로트롬빈의 활성화이다(스튜브 & 보드, 1994, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 823-32).

포유류에서, 일반적으로 프로트롬빈 활성제 착물은 생체내에서 칼슘 이온의 존재하에서 인지질 막 상에 형성되는 혈청 프로테아제 인자 Xa 및 보조인자 Va로 이루어진다(수티 & 잭슨, 1997, Physiol. Rev. 57 1). 포유류 프로트롬빈 착물은 보조인자, 인자 Va 및 혈청 프로테아제, 인자 Xa로 이루어진다. 인자 Xa 혼자는 프로트롬빈을 매우 천천히 활성화 시키나, 비효소적 보조인자 인자 Va, 칼슘 이온(Ca²⁺) 및 인지질을 함유하는 보조 단백질의 존재하에서, 프로트롬빈 활성화는 여러 배 향상된다. 생체내에서, 인자 Xa는 감마-카복시글루탐산 잔여물에 의해 혈소판의 인지질 막을 결합하고 트롬빈을 형성하기 위해 프로트롬빈에서의 Arg 323-Ile 324 결합 후에 Arg 274-Thr 275 에 대해 차별적으로 분해된다.

수술 동안의 혈액 손실 또는 뒤이은 부상 또는 외상의 조절의 중요성을 고려하면, 혈액 응결을 향상시키거나 덩어리의 용해를 막는 조절자들(섬유소 용해 플라스민/플라스미노겐 경로; 로이스톤 등., 1990, Blood Coagul. Fibrinol.1 53: 오차드 등., 1993, 브라운. 제이. Haematol. 85 596)의 동정이 중요한 관심 분야가 되었다.

특히, 뱀 독은 수술 동안의 혈액 손실, 포유류의 외상에 의한 혈전용해작용을 예방하거나 혈액 응고를 향상시킬 수 있는 단백질의 유용한 공급원이 되었다.

예를 들어, 혈전용해작용의 억제제들은 호주의 일반적인 브라운 스네이크(brown snake) pseudonaja textilis의 독으로부터 분리되었다(국제 공개 WO 99/58569). 스네이크 독-유도 프로트롬빈 활성제에 관해서는, 태국 뱀 Oxyuranus scutellatus의 독으로부터 분리된 프로트롬빈 활성제; 프로트롬빈 활성화 효소(Os-II로 지정됨)를 기술하는 중국 특허 1298017을 참조한다. 중국 단체는 피를 흘리는 상처의 경우에 지혈을 향상시키기 위해서, Os-II가 인자 Xa의 첨가 1시간 전에 적절하게 첨가되어 프로트롬빈을 활성화시켜야 한다고 주장하였다. 이들은 두 개의 동시적 작용이 프로트롬빈을 활성화 시킬 수 있고 트롬빈의 수율을 향상시킨다고 주장하였다.

호주 러프 스케일 스네이크(rough scaled snake) Tropidechis carinatus의 독으로부터 분리된 인자 Xa 유사 프로트롬빈 활성제(트로카린)를 기술하는 요셉 등., 1999, Blood 94 621을 참조하였다. 트로카린은 인지질, 인자 Va 및 칼슘 이온의 존재하에서 생체내에서 프로트롬빈으로부터 트롬빈의 형성을 촉매화하는 프로트롬빈 활성제 착물을 형성한다.

현재의 지혈제들은 수술 동안의 혈액 손실, 포유류의 외상에 의한 혈전용해작용을 예방하거나 혈액 응고를 향상시키는 다양한 인자들을 대체하기 위해 소 또는 인간 유래 혈액 산물 성분을 사용한다. 소 또는 인간 유래 혈액 생성물 성분을 사용하면 환자들에게 혈액 감염 또는 다른 악영향을 잠재적으로 미치게 할 수 있다.

표 1: 세파크릴 S-300을 사용하는 브라운 뱀 독 프로테아제의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 2: 슈퍼덱스 200을 사용하는 브라운 뱀 독 프로테아제의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 3: 브라운 뱀 독 프로테아제, 프로토콜 1의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 4: 브라운 뱀 독 프로테아제, 프로토콜 2의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 5: 브라운 뱀 독 프로테아제, 프로토콜 3의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 6: 브라운 뱀 독 프로테아제, 프로토콜 4의 정제 동안의 샘플의 특징.

표 7: 보조 성분을 갖거나 갖지 않은 뱀 독 프로테아제 착물(뱀 독 프로테아제 착물 단독, 10mM CaCl₂를 가진 뱀 독 프로테아제 착물, 10mM CaCl₂ 및 인지질을 가진 뱀 독 프로테아제 착물)에 의한 S-2222의 가수분해.

표 8: 뱀 독 프로테아제 착물 단독, 10mM CaCl₂를 가진 뱀 독 프로테아제 착물, 10mM CaCl₂ 및 인지질을 가진 뱀 독 프로테아제 착물에 의한 시트르화된 혈장의 응고.

표 9: P. textilis(브라운 스네이크)로부터 유래된 분리된 뱀 독 프로테아제를 첨가한, 시트르화된 혈장 응고 분석법 ± Ca²⁺의 응고 시간.

표 10: 브라운 뱀 독 프로테아제에 의한 시트르화된 혈장의 응고.

표 11: 10mM Ca²⁺를 첨가하거나 첨가하지 않은 P. textilis로부터 유래된 분리된된 뱀 독 프로테아제에 의한 S-2222의 가수분해의 초기 속도.

표 12: 40mM CaCl²와 함께 및 없이 브라운 스네이크 독 프로테아제 및 40 mM CaCl² 단독으로 사용하여 인간 시트르화된 형장에서 생성된 덩어리의 대략적 응고 시간.

표 13: 다양한 방법에 의한 브라운 스네이크 독 프로테아제의 분자량의 결정.

표 14: 브라운 스네이크 독 프로테아제로 치료한 쥐 꼬리-정맥 출혈 모델의 혈액 손실.

표 15: 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 혈액 손실(검사) 및 함염물(대조표준) 치료 쥐. 개별 검사 쥐에 대한 데이타와 평균 혈액 손실 ± 표준 편차(SD)를 볼 수 있다.

표 16: 다양한 호주 및 외국 뱀 독에 의한 시트르화된 인간 혈장의 응고.

도 1은 0.05M Tris-HCl, pH 7.4에서 ConA-Sepharose 4B의 컬럼(2.5 x 16cm) 상의 P. textilis 독(10mL; 233mg)의 크로마토그래피 후의 용리 그래프이다. A는 크로마토그래피 패턴의 자리를 나타낸다. 용리 버퍼(0.05 M Tris-HCl 속의 0.02 M 메틸 α-D 만노파이라노시드)가 화살표 B에서의 컬럼에 사용되었다. S-2222 가수분해 활성을 가진 단편을 통합하였고 농축하였다(A에서 직선으로 나타냄).

도 2는 ConA-Sepharose 4B 크로마토그래피에 의한 통합되고 농축된 피크의 SDS PAGE이다. 레인 1은 분자량 마커(크기는 kDa)이다. 레인 2는 β-머캡토에탄올이 없는 브라운 스네이크 프로테아제 착물이다. 레인 3은 β-머캡토에탄올이 있는 브라운 스네이크 프로테아제 착물이다.

도 3은 0.8M NaSCN으로 치료한 P. textilis로부터 유래한 스네이크 독 프로테아제 착물에 의한 S-2222의 가수분해 및 시트르화된 혈장 응고 시간에 대한 효과를 나타낸다.

도 4는 브라운 스네이크 세린 프로테아제의 HPLC 데이타를 나타낸다.

도 5는 SDS PAGE ± β-Me를 나타낸다. 레인 1은 10㎕ BIO-RAD 마커이고, 라인 2는 20㎕ P. textilis 독이고, 레인 3은 20㎕ intact Pt-PA이고, 레인 4는 20㎕ 세파크릴 S-300(1) 통합 단편 30-43이고, 레인 5는 20㎕ 세파크릴 S-300(2) 통합 단편 25-29이고, 레인 6,7 및 8은 10㎕ 세파크릴 S-300(3) 통합 단편 25-29이고, 레인 9는 20㎕ 세파크릴 S-300(3) 통합 단편 25-29 + β-Me이고 레인 10은 20㎕ 손상되지 않은 혈청 독 프로테아제 착물 + β-Me이다.

도 6은 β-Me를 갖거나 갖지 않는 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 SDS-PAGE이다. 레인 1은 BIO-RAD 마커이고, 레인 2는 전체 P. textilis 독이고, 레인 3은 세파크릴 S-300(3) 통합 단편 30-43이고, 레인 4는 세파크릴 S-300(#3)이고, 레인 5는 S-300(#3) + β-Me이고, 레인 6은 S300(#3)이고, 레인 7은 세파크릴 S-300(#3) + β-Me이고, 레인 8은 세파크릴 S-300(3) 통합 단편 30-43 + β-Me이고, 레인 9는 손상되지 않은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착물 + β-Me이고 레인 10은 BIO-RAD 마커이다. #는 상기한 브라운 스네이크 독 프로테아제 착물의 세파크릴 S-300 크로마토그래피의 통합되고 농축된 피크를 나타낸다. 모든 샘물은 10㎕ 분취량으로 이루어진다.

도 7a는 0.8M NaSCN를 가진 0.05M Tris-HCl, pH 7.4에서 슈퍼덱스 200의 컬럼(2.5 x 90cm) 상의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착물(18mL; 50.4mg)의 크로마토그래피 단계 1 후의 용리 그래프이다. S-2222 활성을 가진 단편은 통합되고 농축되어, A에서의 직선으로 나타내었다.

도 7b는 도 10a의 상태에 따른 크로마토그래피 단계 2 이다.

도 7c는 슈퍼덱스 200을 가진 브라운 스네이크 독 프로테아제의 정제에 의한 샘플의 SDS PAGE이다. 레인 1 및 2는 β-머캡토에탄올와 함께(2) 및 없이(2) 크로마토그래피 단계 1에 의한 통합된 농축물이다. 레인 3 및 4는 β-머캡토에탄올와 함께(5) 및 없이(4) 크로마토그래피 단계 2에 의한 통합된 농축물이다. 레인 5는 분자량 마커(크기는 kDa)이다. 화살표 A, B 및 C는 레인 4에서의 불순물을 나타낸다.

도 8a는 보조 구성성분(데이타 점은 복제 측정을 의미한다)없이 브라운 스네이크 독 프로테아제(Pt-PA 프로테아제)에 의한 시트르화된 혈장의 응고를 나타낸다.

도 8b는 10mM CaCl₂와 브라운 스네이크 독("Pt-PA") 프로테아제에 의한 시트르화된 혈장의 응고를 나타낸다.

도 8c는 10mM CaCl₂ 및 인지질와 브라운 스네이크 독("Pt-PA") 프로테아제에 의한 시트르화된 혈장의 응고를 나타낸다.

도 9a는 보조 구성성분(데이타 점은 복제 측정을 의미한다)없이 브라운 스네이크 독 프로테아제(Pt-PA 프로테아제)에 의한 S-2222의 가수분해를 나타낸다.

도 9b는 10mM CaCl₂와 보조 구성성분(데이타 점은 복제 측정을 의미한다)없이 브라운 스네이크 독 프로테아제(Pt-PA 프로테아제)에 의한 S-2222의 가수분해를 나타낸다.

도 9d는 도 12a, 12b 및 12c에서의 개별 플롯의 기울기 및 R₂ 값을 나타낸다. R₂ 값은 직선에 대한 상관계수이다.

도 10은 X-축에 나타낸 시간에 대한 500㎕의 총 부피에서 브라운 스네이크 독 프로테아제(1.3mg/mL 제제의 20㎕)에 의해 트롬빈으로 변형된다. 각 반응의 분취량은 시트르화된 혈장 응고 분석법에 첨가되어 응고 시간을 측정하였다(Y-축).

도 11a는 브라운 스네이크 독 프로테아제로 배양한 후의 프로트롬빈의 감소가 없는 SDS PAGE이다. 브레운 스테이크 프로테아제는 0분(시간, t=0)에서 프로트로빈에 첨가되고, 레인 1은 분자량 마커(크기는 kDa)이고, 레인 2, t=0이고, 레인 3, t=6분, 레인 4, t=24시간, 레인 5, t=48시간이다. PT, 프로트롬빈, PT₁, 프리트롬빈 1; T, 트롬빈; F₁₂, 절편 1.2; PT₂, 프리트롬빈 2; F1, 절편 1.

도 11b는 브라운 스네이크 독 프로테아제-유발 트롬빈에 의한 S-2238의 가수분해이다.

도 12는 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈 활성화의 제안된 모델이다.

도 13은 β-머캡토에탄올의 존재하에서 피브린 덩어리의 SDS PAGE이다. 레인 1은 분자량 마커(크기는 kDa)이고 레인 2는 시트르화된 혈장에 대한 22㎍ 브라운 스네이크 독 프로테아제의 작용에 의한 피브린 응고이고, 레인 3은 시트르화된 혈장에 대한 40mM CaCl₂와 22㎍ 브라운 스네이크 독 프로테아제의 작용에 의한 피브린 응고이고, 레인 4는 40mM CaCl₂로 생성된 피브린 응고이고, 레인 5는 인간 피브리노겐이다. 겔의 오른편 위의 그리스 문자는 Aα(α모노머 및 피브리노펩타이드 A), Bβ(피브리펩타이드를 가진 β) 및 γ 사슬을 포함하는 인간 피브리노겐의 사슬을 나타낸다.

도 14는 프로테아제 활성 부위를 매핑한 것이다. DNS-GGACK 치료를 받거나 받지 않은 정제된 브라운 스네이크 독 프로테아제의 SDS PAGE이다. 레인 1 및 레인 2는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착물은 β-머캡토에탄올을 갖거나(2) 갖지 않은(1) DNS-GGACK에 의한 억제이고, 레인 3 및 4는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착물은 β-머캡토에탄올을 갖거나(4) 갖지 않은(3) DNS-GGACK에 의한 억제이고, 레인 5-8은 DNS-GGACK가 없거나 코마시 블루로 염색된 레인 1-4의 반복이고, 레인 9는 분자량 마커이다(크기는 kDa).

도 15는 브라운 스네이크 프로테아제, 트로카린 및 굵은 글씨로 나타낸 히스티딘과 제안된 상호작용을 갖는 정제된 활성 부위를 포함하는 인간 인자 Xa의 단백질 절편의 핵산 서열 배열을 나타낸다.

도 16은 예상된 브라운 스네이크 독 프로테아제 중사슬 및 트로카린의 부분의 아미노산 서열 배열을 나타낸다. 예상(E) 값은 NCBI 데이타베이스에서 검색을 수행할 때 우연히 예상되는 충돌 수를 나타내는 변수이다. E 값이 0에 가까우면 가까울 수록, 보다 현저한 서열 동일성이 있게 된다. E 값은 두 서열 사이의 동일성에 대해 나타낸 스코어에 따라 증가되어 감소하고 비교된 서열의 길이에 의존한다. 예상 값 1은 데이타베이스내에서 하나의 일치는 우연히 유사한 스코가 예상되는 것을 의미한다. 스코어 = 9.7, 예상 = 0.004; 동일성 = 11/11(100%), 양성 = 11/11(100%)

도 17은 예상된 브라운 스네이크 프로테아제 중사슬 및 인간 인자 Xa의 일부의 핵산 서열 배열을 나타낸다.

도 18은 예상된 브라운 스네이크 프로테아제 경사슬 및 트로카린의 일부의 핵산 서열 배열을 나타낸다.

도 19는 예상된 브라운 스네이크 독 프로테아제 경사슬 및 쥐 인자 X의 일부의 서열 배열을 나타낸다. 스코어 = 24.8, 예상 = 116; 동일성 = 9/12(75%), 양성 = 9/12(76%).

도 20a는 P. textilis(보통 브라운 스네이크)의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 뉴클레오티드 산 서열[SEQ ID NO: 1]을 나타낸다.

도 20b는 P. textilis(보통 브라운 스네이크)의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 뉴클레오티드 산 서열[SEQ ID NO: 2]을 나타낸다.

도 21은 다음의 호주 뱀: P. textilis(브라운)[SEQ ID NO: 2], O. scutellatus(코스탈 타이판)[SEQ ID NO:5], P. porphyriacus(레드 밸리 블랙)[SEQ ID NO:11], N. scutatus(메인랜드 타이거)[SEQ ID NO: 14], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 17] 및 트로카린[SEQ ID NO: 31]의 독 샘으로부터 분리된 뱀 독 프로테아제 사이의 아미노산 서열 배열을 나타낸다.

도 22는 인간 Xa를 가진 분리된 뱀 독 프로테아제의 핵산 서열 배열[SEQ ID NO: 27]을 나타낸다. 브라운[SEQ ID NO: 2] 코스탈 타이판[SEQ ID NO:5], 레드 밸리)[SEQ ID NO:11], 러프 스케일"러프히(Roughie)"[SEQ ID NO: 14], 메인랜드 타이거 [SEQ ID NO: 17]의 뱀으로부터 유래된 뱀 독 프로테아제의 핵산 서열을 나타낸다.

도 23은 P. textilis(브라운)[SEQ ID NO: 2], O. scutellatus(코스탈 타이판)[SEQ ID NO:5], O. microepidotus(인랜드 타이판)[SEQ ID NO:8], P. porphyriacus(레드 밸리 블랙)[SEQ ID NO: 11], N. scutatus(메인랜드 타이거)[SEQ ID NO: 14], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 17]의 뱀으로부터 유래된 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 24는 호주 뱀 P. textilis(브라운)[SEQ ID NO: 2], O. scutellatus(코스탈 타이판)[SEQ ID NO:5], O. microepidotus(인랜드 타이판)[SEQ ID NO:8], P. porphyriacus(레드 밸리 블랙)[SEQ ID NO:11], N. scutatus(메인랜드 타이거)[SEQ ID NO: 14], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 17], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 17] 및 보존 서열[SEQ ID NO:]의 독 샘으로부터 분리된 뱀 독 프로테아제 사이의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다.

도 25는 호주 뱀 P. textilis(브라운)[SEQ ID NO: 1], O. scutellatus(코스탈 타이판)[SEQ ID NO:4], O. microepidotus(인랜드 타이판)[SEQ ID NO:7], P. porphyriacus(레드 밸리 블랙)[SEQ ID NO: 10], N. scutatus(메인랜드 타이거)[SEQ ID NO: 13], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 16]의 뱀으로부터 유래된 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산의 뉴클레오티드 서열의 배열을 나타낸다.

도 26은 호주 뱀 P. textilis(브라운)[SEQ ID NO: 1], O. scutellatus(코스탈 타이판)[SEQ ID NO:4], P. porphyriacus(레드 밸리 블랙)[SEQ ID NO: 10], N. scutatus(메인랜드 타이거)[SEQ ID NO: 13], T. carinatus(러프 스케일)[SEQ ID NO: 16] 및 인간 인자 Xa[SEQ ID NO: 26]으로부터 유래된 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산의 뉴클레오티드 서열의 배열을 나타낸다.

도 27은 브라운 스네이크 독 프로테아제(프로테아제 치료로 큰 덩어리 형성됨을 주목)로 치료하거나 치료하지 않은 쥐 꼬리를 나타낸다.

도 28은 쥐 출혈 결과의 박스 플롯을 나타낸다. 각 박스는 50%의 값을 포함하는 범위를 나타낸다. 휘스커(whisker)는 박스로부터 최고 및 최저 값까지 연장된 선이다. 박스를 가로지른 선은 중앙값을 나타낸다.

본 발명은 부분적으로 인자에 독립적인 본 명세서에서 "뱀 독 프로테아제 또는 SVP's"로 불리는 폴리펩타이드를 활성화하는 프로트롬빈의 발견에 기초한다. 뱀 독 프로테아제는 활성화에 필요한 칼슘, 인지질 및 인자 Va를 필요로하는 프로트롬빈 활성제인 인자 Xa 및 트로카린의 아미노산 서열과 유사한 특정한 아미노산 서열을 공유한다. 그러나, 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제이어서 인간 인자 Xa 또는 트로카린의 보조인자가 필요하지 않다. 다시 말하자면, 이들은 칼슘, 인지질 및/또는 인자 Va와 같은 보조인자 없이 트로트롬빈을 트롬빈으로 처리할 수 있다. 예를 들어, 브라운 코스탈 타이판(brown coastal taipan) 및 인랜드 타이판(inland taipan) 독으로부터의 뱀 독 프로테아제는 완전 프로트롬빈 인자인데, 이는 이들이 칼슘, 인지질 및 인자 Va 없이 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리할 수 있기 때문이다. 이들 SVP's는 이들을 숙주 공급 인자 Va와 독립적이게 만드는 내부 도메인, 도 23의 잔기 292-305를 포함하는 것처럼 보인다. 예를 들어, 레드 밸리, 타이거 및 러프 스케일 스네이트 독에서 얻은 뱀 독 프로테아제는 부분 완전 프로트롬빈 활성제인데, 이는 이들이 칼슘 및 인지질 없이 프로트롬빈을 처리할 수 있으나 인자 Va는 필요로하기 때문이다. 또한, 본 발명의 바람직한 SVP's는 인간 인자 X에 대한 나쁜 기질인 디스카복시(descarboxy) 프로트롬빈을 분할할 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제이고 지혈을 증가시키는 시약으로서 유용한 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 및 이의 생물학적으로 활성이거나 항원성인 절편이 특징이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 프로트롬빈 활성화 작용을 가진 뱀 독 프로테아제를 제공한다.

한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 하나 이상의 경사슬 및 중사슬 또는 이의 생물학적으로 활성인 절편들을 포함한다. 바람직한 경사슬 및 중사슬 단백질은 천연적으로 발생한 종들과 동일 또는 매우 유사(1 또는 2 잔기 차이남)하다. 다른 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 프로펩타이드, 경사슬, 활성제 폴리펩타이드 및 중사슬을 포함한다. 모든 처리 중간체는 자연계에 존재하던 하지 않던 본 발명 내에 있다. 따라서, 또 다른 실시예에서, 본 발명의 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 경사슬, 활성제 펩타이드 및 중사슬을 포함한다. 바람직한 실시예는 프로펩타이드 도메인 및 활성제 펩타이드 또는 펩타이드들로부터 분할된 경사슬 및 중사슬을 포함한다. 정제된 제제는 절단된 프로펩타이드 도메인 및 정제된 분할 절편을 포함하거나 가질 수 있다.

바람직한 실시예에서, 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성 SVP는 하나 이상의 다음 도메인 및 부분의 경우에는 다음 도메인 전부를 포함한다(번호는 도 23의 일치된 번호를 의미한다):

도 23의 잔기 1-40에 상응하는 제 1 도메인 또는 폴리펩타이드 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 도 29에 제공된 5개 서열의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 31, 40, 80, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 물론 바람직한 활성 산물은 프로펩타이드 도메인이 없을 것이다. 일부 경우에는 인간 인자 X의 프로펩타이드와 더욱 유사하게 만드는 뱀 프로펩타이드 도메인을 변형시키거나 뱀 프로펩타이드 도메인을 인간 프로펩타이드 도메인으로 교환하는 것이 바람할 수 있다. 프로펩타이드 도메인은 적색 배 흑색에서 단일 아미노산 변화 V→E를 제외하고 모든 6개 뱀들에서 100% 보존되었다. 상응하는 인간 서열과 비교하여 12/40 동일한 잔기(30% 동일성)를 나타냈다. 보존된 잔기의 대다수는 소수성이다;

도 23의 잔기 40 내지 41 사이의 경사슬 분할 위치;

도 23의 잔기 41-85에 상응하는 도메인. 이 도메인은 인간 인자 X의 GLA(감마 카복시 글루탐산) 도메인과 기능적으로 유사할 수 있다. 일부 실시예에서, 이 부위에서 11개 글구탐산 잔기의 하나 이상이 보존되는 것이 바람직할 수 있다. 이들 중 10개는 인간 인자 X 서열 및 잔기 46/47, 54, 56, 59/60 65/66, 69, 72를 포함하는 모든 6개의 뱀 서열 사이에서 보존된다. 79는 인간에서 감마-카복실화되고 잔기 76 및 78에서 도 23의 모든 6개 뱀 서열에서 2개의 다른 잠재적인 위치가 있다. 많은 실시예에서, 이 도메인의 최초 잔기는 산물의 경사슬의 최초 잔기이다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 85% 서열 동일성을 가진다;

도 23의 잔기 86-122에 상응하는 도메인. 이 도메인은 인간 인자 X의 제 1 EGF에 기능적으로 유사할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 도 23에 제공된 6개 서열의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 36, 50, 75, 80, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 뱀 보존 서열과의 일치는 15/43이었다. 인간 서열과 35% 동일한 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 50% 서열 동일성을 가진다;

도 23의 6개 뱀 서열들 중에서 잔기 166-179에 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 도 23에 제공된 6개 서열의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 17, 50, 75, 80, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 뱀 보존 서열과의 일치는 8/51이었다. 인간 서열과 16% 일치한다. 이것이 프로테아제의 경사슬 및 중사슬을 처리할 때분해되는 부위이고, 바람직하게는 활성 산물에 존재하지 않는다. 서열은 인간 인자 X에 대해서는 51개 아미노산이고 뱀들 각각에 대해서는 27개이다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 50% 서열 동일성을 가진다;

도 23의 잔기 210-467(브라운, 코스탈 타이판, 인랜드 타이판 또는 레드 밸리 블랙 서열의 경우) 또는 456(타이어 및 로프 스케일 서열의 경우)과 상응하는 중사슬. 이 도메인은 인간 인자 X의 중사슬과 기능적으로 유사할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 도 23에 제공된 6개 서열의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 50, 75, 80, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 뱀 보존 서열과의 일치는 인간 서열과 50% 동일한 135/268이다. 인간 인자 X의 촉매 도메인은 필수 활성 위치 트라이에드 H₂₃₆, D₂₈₂ 및 S₃₇₉를 포함한다. 이 3개 잔기는 도 23의 H₂₅₁, D₃₀₉ 및 S₄₀₆으로 모든 6개 뱀들에서 보존되고 본 발명의 SVP's의 바람직한 실시예에서 보존된다. 아미노산 292-305는 활성과 인자 Va에 영향을 미치고 및 서열 또는 292-305의 서열의 잔기와 불과 1, 2, 3, 4 또는 5 잔기 차이가 나는 서열은 완전 SVP's에 존재해야 한다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 75% 서열 동일성을 가진다.

상기한대로, 바람직한 실시예는 프로펩타이드 도메인 및 할성화 또는 분해 도메인으로부터 분리된 완전히 처리된 경사슬 및 중사슬의 이합체 분자를 포함할 것이다. 바람직한 실시예에서, 경사슬은 경사슬의 57 및 62, 90 및 101, 95 및 110, 112 및 121, 129 및 140, 및/또는 151 및 164 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합, 중사슬의 216 및 221, 236 및 252, 377 및 391, 및/또는 402 및 430 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합 및 경사슬의 172 및 중사슬의 329 사이의 사슬 간 Cys-Cys 결합을 포함한다. 바람직한 실시예에서, SVP는 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제인데 이는 이것이 불완전 활성제, 즉, 인간 인자 X 또는 트로카린보다 보조인자 없이 현저하게 더 큰 활성을 보여주기 때문이다. 바람직하게는, 완전 또는 부분 완전 트롬빈 활성제의 활성은 적어도 불완전 활성제, 즉, 인간 인자 Xa 또는 트로카린 단독보다 더 높은 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50 또는 100배(크기의 2배 순서)이다. 이 비교는 칼슘 및 인지질이 없는 동일 또는 유사한 상태하에서 측정된 뱀 독 프로테아제 및 불완전 활성제 사이에서 이루어졌다. 바람직한 실시예에서, 보체 또는 부분 보체의 활성의 %(즉 칼슘 및 인지질 하에서 동일 또는 유사한 상태하에서 나타난 것의 %로 칼슘 및 인지질이 없이 완전 또는 부분 완전 활성체의 활성)는 인간 인자 X 또는 트로카린인 불완전 활성제에 의해 나타난 동일한 % 보다 적어도 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 또는 4000배 더 크다. 바람직한 완전 또는 불완전 활성제들은 약 10^-10 내지 10^-06M의 농도, 즉 10^-8 또는 10^-7 M에서 시트르산화 혈장을 응고하여, 약 50 내지 15분의 응고 시간이 소요되고, Ca²⁺과 인지질 독립성을 나타내었다. 따라서, 프로트롬빈 활성제는 혈액 손실을 줄이는데 적절한 작업 범위가 되는 약 10^-10 내지 10^-06M 농도의 범위에서 보조인자 독립성(칼슘 및/또는 인지질)의 보조인자의 동역학 특성을 나타낸다.

바람직한 실시예에서, SVP 활성화 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈은 다음 도메인(번호는 도 22에서의 교감 일치를 의미한다)의 하나 이상 및 일부 경우 전부를 포함한다:

도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열) 중에서 잔기 1-40와 상응하는 제 1 또는 프로펩타이드 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 31, 40, 80, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다를 수 있다. 물론 바람직한 산물들은 프로펩타이드 도메인이 없을 것이다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 67, 90, 95 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 41-129와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 90% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 43, 60, 80, 85, 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 121-132와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 60% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80, 85, 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 133-182와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 17, 30, 50, 95, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 183-233과 상응하는 도메인. 물론 바람직한 활성 산물은 활성 도메인이 없을 것이다. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 60% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80, 85, 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 234-378과 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 39, 30, 50, 80, 85, 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 379-394와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 50% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80, 85, 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 395-456와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 80% 서열 동일성을 가진다;

도 22에 제공된 5개 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 어느 하나의 상응하는 도메인 및 특히 완전 SVP's, 즉 브라운, 코스탈 타이판 또는 인랜드 타이판 서열 또는 부분 완전 SVP's, 즉 레드 밸리 블랙, 타이거 또는 러프 스케일의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 90, 96 또는 98% 서열 유사성을 가질 수 있거나 불과 1, 2, 3, 5 또는 10개 아미노산 잔기가 다른 도 22의 5개 뱀 서열(또는 인랜드 타이판의 상응하는 서열)의 잔기 457-467와 상응하는 도메인. 바람직한 실시예에서, 이 도메인은 본 명세서에 기술된 6개 뱀 독 프로테아제의 하나의 상응하는 도메인과 적어도 90% 서열 동일성을 가진다;

상기한대로, 바람직한 실시예는 프로펩타이드 도메인 및 할성화 또는 분해 도메인으로부터 분리된 완전히 처리된 경사슬 및 중사슬의 이합체 분자를 포함할 것이다. 바람직한 실시예에서, 경사슬은 경사슬의 57 및 62, 90 및 101, 95 및 110, 112 및 121, 129 및 140, 및/또는 151 및 164 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합, 중사슬의 216 및 221, 236 및 252, 377 및 391, 및/또는 402 및 430 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합 및 경사슬의 172 및 중사슬의 329 사이의 사슬 간 Cys-Cys 결합을 포함한다. 바람직한 실시예에서, SVP는 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제인데 이는 이것이 불완전 활성제, 즉, 인간 인자 X 또는 트로카린보다 보조인자 없이 현저하게 더 큰 활성을 보여주기 때문이다. 바람직하게는, 완전 또는 부분 완전 트롬빈 활성제의 활성은 적어도 불완전 활성제, 즉, 인간 인자 Xa 또는 트로카린 단독보다 더 높은 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 또는 4000배(크기의 2배 순서)이다. 이 비교는 칼슘 및 인지질이 없는 동일 또는 유사한 상태하에서 측정된 뱀 독 프로테아제 및 불완전 활성제 사이에서 이루어졌다. 바람직한 실시예에서, 보체 또는 부분 보체의 활성의 %(즉 칼슘 및 인지질 하에서 동일 또는 유사한 상태하에서 나타난 것의 %로 칼슘 및 인지질이 없이 완전 또는 부분 완전 활성체의 활성)는 인간 인자 X 또는 트로카린인 불완전 활성제에 의해 나타난 동일한 % 보다 적어도 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 또는 4000배 더 크다. 바람직한 완전 또는 불완전 활성제들은 약 10^-10 내지 10^-06M의 농도, 즉 10^-8 또는 10^-7M에서 시트르산화 혈장을 응고하여, 약 50 내지 15분의 응고 시간이 소요되고, Ca²⁺과 인지질 독립성을 나타내었다. 따라서, 프로트롬빈 활성제는 혈액 손실을 줄이는데 적절한 작업 범위가 되는 약 10^-10 내지 10^-06M 농도의 범위에서 보조인자 독립성(칼슘 및/또는 인지질)의 보조인자의 동역학 특성을 나타낸다.

본 발명의 SVP's는 도 21에 나타낸 트로카린을 포함하지 않는다. 바람직한 실시예에서, 완전 SVP의 처리된 경사슬은 트로카리의 처리된 중사슬과 적어도 1, 3, 5, 10, 15 또는 20 잔기가 달라질 것이다. 바람직한 실시예에서, 완전 SVP의 처리된 경사슬은 트로카린의 처리된 중사슬과 적어도 5, 10, 15, 20 또는 30 잔기가 달라질 것이다.(다르게 나타내지 않으면 동일성에서 차이 또는 삽입 또는 결실을 의미한다).

바람직한 실시예에서, 본 발명의 완전 SVP의 서열은 하나 이상의 다음 특성을 가질 것이다; 잔기 41에서 세린(모든 참조문헌은 도 21의 일치하는 번호이다), 잔기 48에서 아이소루신, 잔기 50에서 프로린, 잔기 74에서 아스파라기닌, 잔기 104에서 프롤린, 잔기 105에서 아스파라기닌, 잔기 123에서 리신, 잔기 127에서 글루타민, 잔기 142에서 아르기닌, 잔기 145-7에서 세린, 글루탐산, 트레오닌, 잔기 154에서 세린, 잔기 156에서 아르기닌, 잔기 159에서 발린, 잔기 167에서 글루탐산, 잔기 169에서 아스파라트산, 잔기 178에서 알라닌일 것이다; 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 어떤 것의 서열 181-208의 적어도 하나(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)를 포함할 것이다; 잔기 228에서 아이소루신, 잔기 229에서 아스파라기닌, 잔기 233에서 글리신, 잔기 232에서 글루탐산, 잔기 245에서 히스티딘, 잔기 258-9에서 세린, 발린일 것이다; 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 어떤 것의 서열 260-270의 적어도 하나(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)를 포함할 것이다; 잔기 274에서 아르기닌, 잔기 286에서 트레오닌, 잔기 292-300에서 아스파라기닌-티로신-티로신-트로신-발린-히스티딘-글구타민-아스파라긴, 잔기 303에서 아르기닌, 잔기 305에서 알라린, 잔기 314에서 아르기닌, 잔기 338에서 글루탐산, 잔기 345에서 세린, 잔기 353-360에서 RIQFKQPT, 잔기 367에서 아이소루신, 잔기 368에서 트레오닌, 잔기 389에서 아스파라기닌, 잔기 424에서 아이소루신, 잔기 342에서 아르기닌, 잔기 451에서 리신, 잔기 454-455에서 세린, 루신일 수 있다; 또는 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 어떤 것의 서열 457-467의 적어도 하나(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)를 포함할 것이다;

바람직한 실시예에서, 부분 완전 SVP의 처리된 경사슬은 적어도 1, 3, 5, 10, 또는 15 잔기가 트로카린의 처리된 경사슬과 다를 것이다. 바람직한 실시예에서, 완전 SVP의 처리된 중사슬은 적어도 5, 10, 15, 20 또는 30 잔기가 트로카린의 처리된 경사슬과 다를 것이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 부분 완전 SVP의 서열은 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 어떤 것의 서열 181-208의 적어도 하나 (또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)를 포함할 것이다; 또는 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 어떤 것의 서열 260-270의 적어도 하나 (또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)를 포함할 것이다.

바람직한 실시예에서, SVP는 완전 프로트롬빈 활성제이고 도 24의 일치된 서열과 적어도 87, 89 또는 90% 서열 동일성을 갖는 경사슬의 하나 또는 모두를 포함하거나 불과 16, 14 또는 13 잔기와 다르다 또는 도 24의 일치된 서열과 적어도 82, 85 또는 84% 서열 동일성을 갖는 경사슬의 하나 또는 모두를 포함하거나 불과 45, 39 또는 40 잔기와 다르다.

바람직한 실시예에서, 완전 SVP는 도 24에 나타낸 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일과 동일하거나 적어도 84, 85 또는 86% 서열 동일성를 갖는 경사슬 및 중사슬을 포함하거나 불과 61 또는 53 잔기와 다르다.

바람직한 실시예에서, SVP는 부분 완전 프로트롬빈이고 도 24의 서열과 적어도 84% 서열 동일성을 갖는 경사슬의 하나 또는 모두를 포함하거나 불과 61 또는 53 잔기와 다르다.

바람직한 실시예에서, 완전 SVP는 도 24에 나타낸 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일과 동일하거나 적어도 84, 80 또는 82% 서열 동일성을 갖는 경사슬 및 중사슬을 포함하거나 불과 61, 76 및 68 잔기와 다르다.

다른 실시예에서, 본 발명은 뱀 독 프로테아제 경사슬 폴리펩타이드, 즉, SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 잔기 41 내지 179(번호는 도 23의 일치된 번호를 의미한다) 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13 ,15, 16 또는 18의 핵산에 의해 암호화되는 아미노산의 아미노산 잔기 41 내지 179; SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17에 나타낸 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13 ,15, 16 또는 18의 핵산에 의해 암호화되는 아미노산의 아미노산 잔기 41 내지 179와 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 또는 상기 아미노산 서열의 하나와 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 불과 1, 2, 5, 10, 15 또는 20 잔기와 다른 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 뱀 독 프로테아제 중사슬 폴리펩타이드, 즉, SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 ,14 또는 17로 나타난 아미노산 서열의 아미노산 잔기 235 내지 적어도 453 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13 ,15, 16 또는 18의 핵산에 의해 암호화되는 아미노산의 아미노산 잔기 235 내지 적어도 453: SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17에 나타낸 아미노산 서열에 나타낸 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6 ,7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 아미노산 잔기 235 내지 적어도 453과 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 또는 상기 아미노산 서열의 하나와 적어도 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 불과 1, 2, 5, 10, 15 또는 20 잔기가 다른 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

관련 양태에서, 본 발명은 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제 및 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조를 더 제공한다.

관련 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 형성하기 위해 비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드와 결합되어 작동하는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 절편을 제공한다. 한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제의 하나 이상 또는 경사슬, 활성제 폴리펩타이드, 중사슬 독 프로테아제를 암호화하는 서열은 비-뱀 독 프로트롬빈 활성화 폴리펩타이드의 프로펩타이드를 암호화하는 서열, 즉, 인간 인자 Xa 프로펩타이드 암호화 서열과 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 뱀 독 프로테아제의 경사슬을 암호화하는 서열 및 뱀 독 프로테아제의 중사슬을 암호화하는 서열은 비-뱀 독 프로트롬빈 활성화 폴리펩타이드의 활성제 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 즉, 인간 인자 Xa 활성제 펩타이드 암호화 서열에 의해 각각 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, SVP 서열은 바람직하게는 쉽게 분해되어 분리되는 서열과 융합, 예를 들어, GST 모이어티(moiety) 또는 에피토프 태그와 융합될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어진 그룹의 부분 또는 전부에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 단백질을 특징으로 한다:

KREASLPDFVQS [SEQ ID NO:19];

LKKSDNPSPDIR [SEQ ID NO:20]; 및

SVX₁VGELX₂X₃SR[SEQ ID NO:21].

X₁, X₂ 및 X₃는 임의의 아미노산일 수 있다.

바람직하게는, X₁은 발린 또는 아이소루신이고, X₂는 아스파라기닌 또는 아스파라트산 및 X₃는 아르기닌, 리신 또는 아이소루신이다.

한 실시예에서, 분리된 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 더 포함한다:

MAPQLLLCLILTFLWSLPE질SNVFLKSK [SEQ IN NO:22] 및

ANRFLQRTKR [SEQ ID NO:23]

특정 실시예에서, 본 발명의 상기 프로트롬빈 활성화 단백질은 뱀 독으로부터 분리된다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 프로트롬빈 활성화 단백질은 통상의 브라운 스네이크(Psuedonaja textilis)를 포함하는 브라운 스네이트(Psuedonaja sp.), 타이판(Oxyuranus scutellatus), 메인랜드 타이거(Notechis scutatus), 러프 스케일드(Tropidechis carinatus) 및 레드-밸리 블랙 스네이크(Pseudechis porphyriacus)로 이루어진 한정되지 않은 그룹으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 기술한대로 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적으로 활성인 절편을 암호화하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 바람직한 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18 전체 보체를 갖는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18에 나타난 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 동일한 핵산 분자(예를 들어, 자연스럽게 발생하는 대립 변형체)를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 극한 조건하에서 잡종화시키는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 핵산 분자는 전장 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 활성 절편을 암호화한다.

관련 양태에서, 본 발명은 상기한대로 뱀 독 프로테아제 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조를 더 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자는 천연 또는 이형 조절 서열에 연결되어 작동한다. 다른 실시예에서, 핵산 분자는 프로펩타이드를 암호화하는 핵산, 뱀 독 프로테아제의 경사슬을 암호화하는 핵산 서열, 활성제 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 뱀 독 프로테아제 의 중사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 프로펩타이드를 암호화하는 서열 및 활성제 펩타이드를 암호화하는 서열의 하나 이상은 뱀 독 프로테아제로부터 얻은 것이 아니다. 예를 들어, 프로펩타이드 및 활성제 펩타이드를 암호화하는 서열의 하나 이상은 포유류 프로트롬빈 활성제, 예를 들면, 인간 프로트롬빈 활성제, 인간 인자 Xa로부터 얻을 수 있다. 벡터 및 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 숙주, 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 핵산 분자 및 폴리펩타이드를 생성하는데 적절한 벡터 및 숙주 세포도 포함된다.

다른 관련 양태에서, 본 발명은 프라이머로서 적절한 핵산 절편 또는 뱀 독 프로테아제-암호화 핵산의 탐지 또는 증폭용 잡종 프로브를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 전장 뱀 독 프로테아제, 예를 들어, 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제, 또는 뱀 독 프로테아제의 임의의 도메인 또는 부위의 증폭을 위해 분리된 프라이머를 포함한다.

또 다른 관련 양태에서, 뱀 독 프로테아제-암호화 핵산 분자에 안티센스인 분리된 핵산 분자가 제공된다.

본 발명은 또한 상기 분리된 단백질의 생물학적으로 활성인 절편, 변형체, 유도체 및 동족체 및 본 발명의 핵산을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 분리된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드, 예를 들어 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드를 결합하는 항체를 특징으로 한다. 한 실시예에서, 항체는 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 절편, 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 경사슬 또는 이의 절편, 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 활성제 폴리펩타이드 또는 이의 절편, 또는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 중사슬 또는 이의 절편과 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 항체는 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 경사슬 및 중사슬 모두를 포함하는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 부분을 결합할 수 있다. 항체는 예를 들어, 샘플에서 뱀 독 프로테아제를 분리하기 위해 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 분리된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적으로 활성인 절편, 예를 들어, 명세서에 기재된 분리된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 한 실시예에서, 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물은 약 5 내지 9, 바람직하게는 약 6.5 내지 7의 pH를 가진다. 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물은 폴리올과 같은 안정제를 더 포함할 수 있다. 이런 실시예에서, 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물은 약 5%, 10%, 20% 또는 그 이상의 폴리올(또는 폴리올들)을 포함할 수 있다. 조성물에 사용될 수 있는 폴리올의 예는 글리세롤이다. 일부 실시예에서, 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물은 보조인자를 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물은 하나 이상의 보조인자, 예를 들어, 하나 이상의 칼슘, 인지질 및 인자 Va를 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 지혈 반응 및/또는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 처리를 조절하는 화합물인 뱀 독 폴리펩타이드의 활성을 조절시킬 수 있는, 예를 들어, 보조인자와 같은 화합물을 검색하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 방법은 프로트롬빈과 뱀 독 프로테아제, 예를 들어, 명세서에 기재된 뱀 독 프로테아제의 혼합물을 제공하는 단계 및 반응 혼합물을 하나 이상의 보조인자(예를 들어, 하나 이상의 칼슘, 인지질, 인자 Va 및 비타민, 예를 들어, 비타민 K)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 반응 혼합물은 프브리노겐을 더 포함할 수 있다. 방법은 보조인자와 같은 물질의 부존재 및 존재하에서 프로트롬빈 처리에 대한 뱀 독 프로테아제의 활성을 비교하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)을 제공하는 단계 및 이 샘플을 보조인자와 같은 물질의 부존재 및 존재하에서 뱀 독 프로테아제와 접촉시키는 단계, 및 뱀 독 프로테아제에 의한 지혈에 대한 보조인자의 효과를 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 방법은 혈소판 활성화에 대한 약물의 효과를 결정하기 위해서, 보조인자와 같은 물질의 부존재 및 존재하에서 혈소판과 뱀 독 프로테아제를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명은 고체 덩어리를 형성하는 시간을 측정함으로써 뱀 독 폴리펩타이드(프로테아제)의 활성을 측정하는데 사용될 수 있는 시트르산염 항지혈된 전혈 또는 이의 혈장 부분에 의한 활성의 레벨을 측정하는 방법을 특징으로 한다. 측정법은 수동적으로 또는 자동 지혈 측정 장치를 통해 수행될 수 있다. 또한, 프로테아제의 활성은 이의 기질(프로트롬빈)의 특정 도메인과 유사한 연결 p-나이트로아닐라이드(색원체 기질)과 테트라펩타이드를 사용함으로써 측정될 수 있다. 이 방법은 기질 독립 혼합물 속의 용액 속의 p-나이트로아닐린의 형성 속도의 단순 비색 측정법(colormetric measurement)이다.

다른 바람직한 실시예에서, 피험자는 피험자의 신체의 한 부위 또는 전체에서 출혈을 억제하도록 치료된다. 치료법은 의학적 치료, 예를 들어 수술과 관련되어 발생할 수 있는 출혈을 억제하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상처, 외상 또는 다른 사고가 치료된다.

일부 실시예에서, 피험자는 혈액 덩어리를 형성하거나 유지하는 능력이 부족하다. 이 부족은 유전적 결함때문 일 수도 있고 의학적 치료, 예를 들어, 코우마딘(coumadine) 또는 와파린(Warfarin)과 같이 혈액 덩어리를 형성 또는 유지하는 피험자의 능력을 감소시키는 약물의 투여 때문일 수도 있다.

한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 피험자 이외의 사람에게 투여되는 반면에, 다른 실시예에서는 뱀 독 프로테아제가 자가 투여된다. 피험자 이외의 사람은 주치의 일 수 있고 다른 경우에는 주치의가 아닐 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 산물은 전쟁터 외상을 치료에 사용될 것이고 주치의 이외의 사람에게 투여될 것이다.

일부 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 피험자가 혈액 덩어리를 형성 또는 유지하는 능력이 부족한 경우 또는 군인, 위험한 기계로 일하는 사람과 같이 외상의 위험에 놓여 있는 사람의 경우 또는 농부 또는 광부와 같이 위험한 직업에 종사하는 사람들에 사용할 필요에 앞서서 제공된다. 뱀 독 프로테아제는 사용시에 문서, 기록 오디오 또는 비디오, 또는 구강 장치로 공급될 수 있다.

일부 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 사용자(피험자 또는 피험자에게 투여하는 사람)가 측정된 복용량을 투여하게 하는 형태로 제공될 것이다. 따라서, 뱀 독 프로테아제는 액체, 방울, 에러로졸, 분말 등을 바람직하게는 측정된 복용량으로 분배하는 장치와 같은 분배 장치에서 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 프로트롬빈을 활성화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 프로트롬빈을 본 발명의 뱀 독 프로테아제와 접촉시켜 상기 프로트롬빈을 활성화시키는 것을 포함한다. 프로트롬빈은 생체외 또는 생체내에서 활성화될 수 있다. 한 실시예에서, 프로트롬빈은 데스카복시프로트롬빈을 포함할 수 있다.

특정한 실시예에서, 약학적 조성물 및 지혈 및/또는 프로트롬빈 활성의 유도 방법은 상처에 의한 혈액 손실을 예방하는데 사용될 수 있다. 이런 실시예에서, 조성물은 조직 밀봉제 및/또는 피브린 접착제의 것일 수 있다. 용해제는 이런 실시예의 일부 형태라고 생각된다. 용해제는 혈장의 작용의 억제 또는 혈장의 활성제에 의한 혈액 덩어리의 용해를 예방하는데 첨가될 수 있는 텍스틸리닌(textilinin)(국제 공개 WO 99/58569), 아프로티닌 및 EACA를 포함하는 한정되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 단백질, 핵산 또는 라이브러리 또는 핵산 또는 단백질 서열 정보를 얻는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 명세서에 기술된 SVP와 같은 뱀 단백질 또는 SVP를 암호화하는 핵산과 같은 뱀 단백질을 암호화하는 핵산 또는 임의의 라이브러리를 얻는 것. 이들은 본 명세세에서 "수집-기초 방법(collection-based methods)"라고 불린다. 이 방법은 Pseudonaja textilis, Pseudonaja muchalis, Pseudonaja affinis, Pseudonaja inframacula, Oxyuranus scutellatus, Oxyuranus microlepidotus, Notechis scutatus, Notechis ater niger, Notechis ater serventyi, Hoplocephalus stephansii, Pseudechis prophiracus, Australaps surperba, Tropedechis carinatus(또는 달걀 또는 벗은 껍질과 같은 버려진 조직과 같이 뱀에서 얻거나 생성된 조직 수집)으로 이루어진 한정되지 않는 그룹에서 선택된 호주산 뱀을 수집하는 단계 및 이 뱀 또는 이 뱀의 선조로부터 단백질, 핵산, 라이브러리를 얻는 단계 또는 이 뱀 또는 이 뱀의 선조로부터 얻은 단백질 또는 핵산으로부터 서열 데이타를 얻는 단계를 포함한다.

이 방법은 죽은 호주 뱀을 수집하거나 산 호주 뱀 또는 상처 입은 산 뱀을 포획하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 이 방법은 뱀으로부터 샘플을 얻는 단계, 예를 들어, 뱀으로부터 독 샘플을 얻는 단계, 및 독 샘플로부터 단백질 또는 단백질의 라이브러리를 얻는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예들은 뱀에 대한 샘플을 얻는 단계 및 독 샘(gland)과 같은 샘플로부터 핵산 또는 핵산의 라이브러리를 얻는 단계를 포함한다.

이 방법은 뱀 또는 이의 자손으로부터 얻은 물질로부터 핵산 또는 단백질 서열을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이 방법은 수집된 뱀 또는 이의 자손으로부터 단백질 또는 핵산 라이브러리를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이 방법은 동물, 인간 또는 식물 건강, 산업 공정 또는 진단을 위한 폴리펩타이드를 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, 이 방법은 뱀 또는 샘플을 수집하는 단계 및 뱀 또는 샘플을 이 방법의 연속 단계를 수행하기 위해 다른 지역 속의 한 무리와 같은 제 2 무리에 뱀 또는 샘플을 보내는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기한 수집 방법의 하나와 같은 방법에 의해 제조되거나 생성된 단백질, 핵산 또는 라이브러리 또는 핵산 또는 단백질 서열 정보를 특징으로 한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 명세서에 기술된 SVP와 같은 뱀 단백질 또는 명세서에 기술된 SVP를 암호화하는 핵산과 같은 뱀 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이의 라이브러리 또는 명세서에 기술된 임의의 핵산 또는 단백질의 서열 정보는 상기한 수집 방법과 같이 기술된 방법에 의해 제조되거나 생성될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 다음 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 특징으로 한다:

여기서, X₁, X₁₀, X_12-13, X_15-16, X_19-23, X₂₅ , X_27-30, X_33-34, X₃₇, X₃₉, X_42-47, X ₅₀, X_53-56, X_58-62, X₆₄, X₇₉, X_81-83, X_85-94 , X₉₆, X_99-105, X_108-109, X_113-115 및 X_117-119 는 임의의 아미노산 잔기로부터 각각 독립적으로 선택된다;

X₂, X₆, X₁₁, X₁₄, X₂₆, X₃₁, X₄₈ , X₅₇ 및 X₆₃의 각각은 소형 아미노산 잔기이다;

X₃, X₄, X₈, X₁₇, X_35-36, X₃₈, X_51-52 , X₇₈, X₈₀, X₈₄, X₉₅, X₉₈, X_106-107 , X_111-112 및 X₁₁₆의 각각은 소수성 아미노산 잔기이다;

X₅, X₇ 및 X₁₁₀의 각각은 염기 아미노산 잔기이다;

X₉, X_40-41 및 X₄₉는 대전된 아미노산 잔기이다;

X₂₄는 산성 아미노산 잔기이다;

X₃₂는 중성/극성 아미노산 잔기이다;

X_65-67, X_70-72 및 X₇₅는 각각 독립적으로 없거나 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된다;

X₆₈ 및 X₇₄는 각각 독립적으로 없거나 산성 아미노산 잔기로부터 선택된다;

X₆₉, X₇₃ 및 X₇₉는 각각 독립적으로 없거나 소수성 아미노산 잔기로부터 선택된다;

X₇₇은 없거나 소형 아미노산 잔기이다; 및

Z는 없거나 1-20 아미노산의 펩타이드이다.

일부 실시예에서, X₁은 소수성 또는 산성 아미노산 잔기, 예를 들어, Val 또는 이의 변형 형태 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂는 Ala 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃는 Tyr 또는 Phe 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄는 Phe 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅는 Lys 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆는 Pro 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇은 Arg 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈은 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉는 Glu 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₁₀는 중성/극성 또는 산성 아미노산 잔기, 예를 들어, X10은 Asp 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁은 Thr 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₂는 작거나 염기성 아미노산 잔기 또는 이의 변형 형태, 예를 들어, Gly 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₃은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기 또는 이의 변형 형태이고, 예를 들어, X₁₃은 Ile 또는 Thr 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₁₄는 Pro 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₅는 작거나 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₅는 Gly 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₆은 염기 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, X₁₆은 Ala 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₇은 Val 또는 Leu 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₁₈은 Tyr 또는 Phe 또는 Leu 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₁₉는 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₉는 Lys 또는 Gln 또는 이의 변형 형태이다.

일부 실시예에서, X₂₀은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₀은 Val, Phe 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₁은 산성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₁은 Asp 또는 Phe 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₂는 소형 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₂는 Pro, Asp 또는 Phe 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₃은 중성/극성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₃은 Asn 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₄는 Asp 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₅는 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₅는 Ile 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₆은 산성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₈은 Glu, Asp 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₂₉는 소형 또는 산성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₂₉는 Gly 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₃₀은 중성/극성 또는 산성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₃₀은 Asn 또는 Asp 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₁은 Thr 또는 Ala 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₃₃은 중성/극성 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₃₃은 Asn 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₄는 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₃₄는 Thr 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₅는 Leu 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₆은 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₇은 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₃₇은 Ala 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₈은 Val, Leu 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₃₉는 산성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₃₉는 Asp 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₄₀은 Asp, Glu 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₁은 Lys 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₂는 대전 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₂는 Lys, Glu 또는 Gly 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₃은 대전 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₃은 Gly, Asp 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₄는 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₄는 Ala 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₅는 소수성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₅는 Tyr 또는 His 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₆은 소형 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₆은 Thr 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₇은 산성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₄₇은 Glu 또는 Gln 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₄₈은 Thr 또는 Ser 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₄₉는 Glu 또는 Lys 또는 이의 변형 형태이다.

일부 실시예에서, X₅₀은 작고, 소수성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₀은 Thr, Met, His 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₁은 Ile 또는 Val 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₅₂는 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태이다. 일부 실시예에서, X₅₃은 산성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₃은 Asp 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₄는 염기성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₄는 Arg 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₅는 소형 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₅는 Ala 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₆은 산성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₆은 Glu 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₇은 Pro 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₈은 소형 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₈은 Gly 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₉는 작고, 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₅₉는 Pro, Arg 또는 His 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₆₀은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₀은 Val, Ile 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₁은 염기성, 중성/극성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₁은 Lys, Gln 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₂는 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₂는 Pro 또는 Leu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₃은 Pro 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₅₄는 염기성, 소형 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₄는 Lys, Thr 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₅는 염기성, 소형 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₅는 Lys, Ser 또는 Tyr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₆은 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₆은 Ser, Gly 또는 Tyr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₇은 중성/극성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₆₇은 Gln 또는 Tyr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₈은 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₆₉는 Phe 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₇₀은 소수성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₇₀은 Tyr 또는 His 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₁은 산성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₇₁은 Glu 또는 Gln 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₂는 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₇₂는 Lys 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₃은 Phe 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₄는 Asp 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₅는 소수성 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₇₅는 Leu 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₆은 Val 또는 Phe 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₇은 Ser 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₈은 Ile 또는 Leu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₇₉는 중성/극성 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₇₉는 Gln 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₈₀은 Met 또는 Leu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₁은 중성/극성 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₁은 Asn 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₂는 중성/극성 또는 산성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₂는 Gln 또는 Glu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₃은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₃은 Phe 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₄는 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₅는 소형, 염기성 또는 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₅는 Gly, Arg 또는 His 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₆은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₆은 Ile 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₇은 소수성, 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₇은 Phe, Arg 또는 Gln 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₈은 산성, 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₈은 Glu, Ser 또는 Phe 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₈₉는 염기성, 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₈₉는 Arg, Lys, Gly 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₉₀은 소형 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₀은 Gly 또는 Gln 또는 Ile이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₁은 소형, 중성/극성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₁은 Pro, Gln 또는 Tyr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₂는 중성/극성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₂는 Asn, Gln 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₃은 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₃은 Lys 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₄는 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₄는 Thr 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₅는 Leu, Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₆은 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₆은 Lys 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₇은 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₈은 Leu 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₉₉는 중성/극성 또는 산성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₉₉는 Asn, Glu 또는 Asp 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₁₀₀은 소수성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₀은 Phe 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₁은 소형 도는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₁은 Pro 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₂는 소형 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₂는 Pro 또는 Gln 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₃은 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₃은 Thr 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₄는 중성/극성 또는 염기성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₄는 Gln 또는 Arg 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₅는 염기성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₅는 Arg 또는 Gly 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₇은 Val 또는 Ile 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₈은 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₈은 Arg, Gln 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₀₉는 염기성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₀₉는 Lys 또는 Thr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X₁₁₀은 Arg 또는 Lys 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₁은 Ile 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₂는 Leu 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₃은 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₃은 Lys 또는 Asn 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₄는 소형 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₄는 Pro 또는 Leu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₅는 염기성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₅는 Arg, Lys 또는 Ala 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₆은 Ile 또는 Val 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₇은 염기성 또는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₇은 Arg 또는 Ser 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₈은 중성/극성, 염기성 또는 소수성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₈은 Gln, Lys 또는 Leu 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다. 일부 실시예에서, X₁₁₉는 염기성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₉는 Lys 또는 His 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, Z는 존재하고 서열 X₁₁₈PSTESSTGRL을 포함하고, 여기서 X₁₁₈은 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 실시예에서, X₁₁₈은 소수성 또는 중성/극성 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₈은 Leu 또는 Gln 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

일부 실시예에서, X_65-77은 아미노산의 서열을 나타내고, 여기서 n은 0 내지 13의 아미노산 잔기이고, 예를 들어, 서열은 KX₁₁₉X₁₂₀EFYEKFDLVS, SYYQNIDRFA 또는 YYYVHQNFDRVA으로부터 선택되고, 여기서 X₁₁₉는 소형 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₁₉는 Ser 또는 Gly 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다; X₁₂₀은 임의의 아미노산 잔기이고, 예를 들어, X₁₂₀은 Gln 또는 Tyr 또는 이의 변형 형태로부터 선택된다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 청구항에서 명확해질 것이다.

뱀 독은 혈소판 결합, 혈전용해 및 지혈 다단의 경로 내에서 억제 및/또는 활성 인자를 통해 포유류의 항생성 작용기작에 영향을 미치는 단백질 및 다른 성분들의 풍부한 공급원이다. 호주산 독사 종류에 독특한 뱀 독 프로테아제가 특히 주목할 것이다. 일반적으로, 프로트롬빈이 이의 활성 형태인 트롬빈으로의 단백질 분해는 포유류 체내에서 프로트롬비나아제 착체에 의해 촉매화된다. 프로트롬비나아제 내의 기능성 프로테아제는 인자 Xa이다. 그러나, 최적 활성을 위해서, Xa 효소는 칼슘 및 인지질의 존재하에서 보조인자로 인자 Va를 필요로 한다.

본 발명은 부분적으로, 호주산 뱀의 독으로부터 뱀 독 프로테아제를 분리하는 것을 기초로한다. 호주산 뱀들의 예는 호주 일반 브라운 스네이크 (Pseudonaja textilis), 코스탈 타이팬(Oxyuranus), 인랜드 타이팬(Oxyuranus microlepidotus), 메인랜드 타이거(Notechis scutatus), 러프 스케일드(Tropidechis carinatus) 및 레드-밸리 블랙 스네이크(Pseudechis porphyriacus) 및 속 Elapidae의 다른 스네이크를 포함한다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 프로트롬빈을 트롬빈으로 분해하는 생체내 인자 Xa의 효과를 모방하나, 이는 인자 Va, 인지질 및 칼슘과 같은 보조인자 없이 모방한다. 따라서, 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제는 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제로 작용한다. 본 명세서에서 사용된 "완전 프로트롬빈 활성제"라는 용어는 칼슘, 인지질 및 인자 Va 없이 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리하는 뱀 독 프로테아제를 의미한다. 완전 프로트롬빈 활성제로 작용하는 뱀 독 프로테아제의 예는 브라운 스네이크 및 타이팬 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "부분 완전 프로트롬빈 활성제"라는 용어는 칼슘 및 인지질 없이 그러나 인자 Va의 존재하에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리하는 뱀 독 프로테아제를 의미한다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명은 호주 일반 브라운 스네이크 (Pseudonaja textilis), 코스탈 타이판(Oxyuranus), 인랜드 타이팬(Oxyuranus microlepidotus), 메인랜드 타이거(Notechis scutatus), 러프 스케일드(Tropidechis carinatus) 및 레드-밸리 블랙 스네이크(Pseudechis porphyriacus)의 독으로부터 분리된 분리된 뱀 독 프로테아제를 제공한다.

본 발명의 뱀 독 프로테아제는 본 명세세에서 "뱀 독 프로테아제 착물"로 불리는 프로트롬빈 착물로부터 분리될 수 있다. 뱀 독 프로테아제 착물은 여러 단백질 및/또는 보조인자를 포함할 수 있다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 예를 들어, 도 23에 나타낸 단백질 및 이의 단백질 분해적으로 대사된 서브-절편을 포함한다. 도 23은 브라운 스네이크의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2); 코스탈 타이판의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:5); 인랜드 타이판 스네이크의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8); 레드 밸리 블랙 스네이크의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:11); 타이거 스네이크의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:14); 및 러프 스케일 스네이크의 뱀 독 프로테아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)을 나타낸다.

본 발명의 뱀 독 프로테아제는 서로 공통의 많은 구조적 특성을 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 핵산 분자를 의미할 때 "집단(family)"이라는 용어는 동일한 구조 도메인 또는 모티프를 갖고 명세서에 정의된 충분한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 둘 이상의 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 이런 집단의 구성원은 천연 또는 비천연적으로 발생할 수 있는 종들 및 동일하거나 다른 종들일 수 있다. 집단의 구성원들은 동일한 기능적 특성들을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "뱀 독 프로테아제 활성", "뱀 독 프로테아제의 생물학적 활성" 또는 "뱀 독 프로테아제의 기능적 활성"이란 용어는 뱀 독 프로테아제, 폴리펩타이드 또는 핵산 분자에 의해 유발된 활성을 의미한다. 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 활성은 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리하는 능력(예를 들어, 프로트롬빈의 아르기닌 잔기 274 및 트레오닌 잔기 275 사이의 프로트롬빈을 분해하는 능력, 예를 들어, 프로트롬빈의 아르기닌 잔기 274 및 트레오닌 잔기 275 사이의 프로트롬빈 및 프로트롬빈의 아르기닌 잔기 323 및 트레오닌 잔기 324 사이의 프로트롬빈을 분해하나 아르기닌 잔기 155 및 세린 잔기 156 및/또는 아르기닌 잔기 286 및 트레오닌 잔기 287 사이의 프로트롬빈은 분해하지 않는 능력); 시트르산염-처리된 혈장에 덩어리를 형성시키는 능력; 칼슘 및 인지질 없이 프로트롬빈을 처리하는 능력 및 덩어리를 형성하는 능력의 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 분리된 뱀 독 프로테아제는 표 8-12에 나타낸 주로 칼슘에 무관한 프로트롬비나아제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제인 뱀 독 폴리펩타이드 및 이의 생물학적으로 활성인 절편을 특징으로 한다. 완전 또는 부분 활성제는 보조인자 없이 불완전 활성제, 예를 들어, 인간 인자 X 또는 트로카린이 나타내는 활성보다 훨씬 더 큰 활성을 나타낸다. 본 발명의 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제의 실시예는 Ca2+ 및 인지질과 조합하여 완전 프로트롬빈 활성제의 활성의 약 0.4%인 활성을 가진다. 바람직하게는, 완전 또는 부분 완전 프로트롬빈 활성제 단독의 활성은 적어도 불완전 활성제, 즉, 인간 인자 Xa 또는 트로카린 단독의 활성보다 더 높은 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 또는 4000배(크기의 2배 순서)이다. 이 비교는 칼슘 및 인지질이 없는 동일 또는 유사한 상태하에서 측정된 뱀 독 프로테아제 및 불완전 활성제 사이에서 이루어졌다. 바람직한 실시예에서, 보체 또는 부분 보체의 활성의 %(즉 칼슘 및 인지질 하에서 동일 또는 유사한 상태하에서 나타난 것의 %로 칼슘 및 인지질이 없이 완전 또는 부분 완전 활성체의 활성)는 인간 인자 X 또는 트로카린인 불완전 활성제에 의해 나타난 동일한 % 보다 적어도 1.5, 2, 4, 10, 15, 20, 50, 100, 1000 또는 4000배 더 크다. 바람직한 완전 또는 불완전 활성제들은 약 10^-10 내지 10^-06M의 농도, 즉 10^-8 또는 10^-7M에서 시트르산화 혈장을 응고하여, 약 50 내지 15분의 응고 시간이 소요되고, Ca²⁺과 인지질 독립성을 나타내었다. 따라서, 프로트롬빈 활성제는 혈액 손실을 줄이는데 적절한 작업 범위가 되는 약 10^-10 내지 10^-06M 농도의 범위에서 보조인자 독립성(칼슘 및/또는 인지질)의 보조인자의 동역학 특성을 나타낸다.

뱀 독 프로테아제 단백질, 이의 절편, 및 SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 및 17에서 서열의 유도체 및 다른 변형체는 일괄해서 "본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질" 또는 "뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 단백질" 또는 "뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 단백질"로 불린다. 이런 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 일괄해서 "본 발명의 핵산" 또는 "뱀 독 프로테아제-암호화 핵산"으로 불린다. 뱀 독 프로테아제 분자는 뱀 독 프로테아제 핵산, 폴리펩타이드, 및 항체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 DNA 및 RNA의 유사체를 포함한다. DNA 및 RNA의 유사체는 핵산 유사체로부터 합성될 수 있다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 도 26은 브라운 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO: 1, 암호화 부위 SEQ ID NO:3); 코스탈 타이판 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:4, 암호화 부위 SEQ ID NO:6); 인랜드 타이판 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:7, 암호화 부위 SEQ ID NO:9); 레드 밸리 블랙 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:10, 암호화 부위 SEQ ID NO:12); 타이거 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:13, 암호화 부위 SEQ ID NO:15); 및 러프 스케일 스네이크의 뱀 독 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:16, 암호화 부위 SEQ ID NO:18)을 나타낸다.

"분리된 핵산 분자" 또는 "정제된 핵산 분자"라는 용어는 핵산의 천연 원료에 존재하는 다른 핵산 분자에서 분리된 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 게놈 DNA에 관해, "분리된"이란 용어는 게놈이 천연적으로 관련된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "분리된" 핵산은 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 핵산을 천연적으로 우회하는 서열(즉, 핵산의 5' 및/또는 3' 말단에 위치한 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 핵산을 천연적으로 우회하는 5' 및/또는 3' 핵산 서열의약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 이하를 포함할 수 있다. 또한, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합 기술로 생성될 때 다른 세포질 물질 또는 배양 배지가 거의 없거나 화학적으로 합성될 때 화학적 선구체 또는 다른 화합물들이 없을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "낮은 극한, 중간 극한, 높은 극한, 또는 매우 높은 극한 상태에서 잡종화한다"라는 용어는 잡종화 및 세척의 상태를 기술한다. 잡종화 반응을 수행하기 위한 지침은 본 명세서에 참고로 포함된 존 월리 및 선, N.Y.(1989) Current Protocols in Molecular Biology 에서 찾을 수 있다. 수용성 및 비수용성 방법이 이 참고문헌에 기재되어 있고 각각을 사용할 수 있다. 구체적인 잡종화 상태는 다음과 같다: 1) 낮은 극한 상태는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC), 뒤이어 적어도 약 50℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 두 번 세척된다(세척 온도는 낮은 극한 상태 동안 55℃로 증가될 수 있다); 2) 중간 극한 상태는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC), 뒤이어 적어도 약 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 한 번 이상 세척된다; 3) 높은 극한 상태는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC), 뒤이어 적어도 약 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 한 번 이상 세척된다; 바람직하게는 4) 매우 높은 극한 상태는 약 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS, 뒤이어 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 한 번 이상 세척된다. 매우 높은 극한 상태(4)가 바람직한 상태이고 달리 특정하지 않으면 사용되는 상태이다.

바람직하게는, 본 명세서에 기술된 극한 상태하에서 SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 서열과 잡종화되는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 천연적으로 발생하는 핵산 분자와 상응한다.

본 명세서에서 사용된 "천연적으로 발생하는" 핵산 분자라는 용어는 자연에서 발생하는 핵산 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 천연적으로 발생하는 핵산 분자는 천연 단백질을 암호화할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "유전자" 및 "재조합 유전자"라는 용어는 뱀 독 프로테아제 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 적어도 하나 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 이 유전자는 선택적으로 비-암호화 서열, 예를 들어, 조절 유전자 및 인트론을 더 포함할 수 있다.

"분리된" 또는 "정제된" 폴리펩타이드 또는 단백질은 세포질 물질 또는 단백질이 유래된 세포 또는 조직원의 다른 감염 단백질이 실질적으로 없거나 화학적으로 합성될 때 화학적 선구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. "실질적으로 없다"라는 의미는 뱀 독 프로테아제 단백질의 조합제가 적어도 10% 순수하다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 단백질의 조합제는 비-뱀 독 프로테아제 단백질(본 명세서에서 "감염 단백질"로 불림) 또는 화학적 선구체 또는 비-뱀 독 프로테아제 화학물질의 약 30%, 20%, 10% 및 보다 바람직하게는 5%(건중량) 이하를 가진다. 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합하여 제조될 때, 배양 배지가 실질적으로 없는 것, 즉, 배양 배지가 단백질 조합제의 부피의 약 20%이하, 보다 바람직하게는 약 10% 이하, 및 가장 바람직하게는 약 5% 이하를 나타내는 것이 바람직하다. 본 발명은 건중량으로 적어도 0.01, 0.1, 1.0 및 10mg의 분리 또는 정제된 조합제를 포함한다.

"비-필수" 아미노산 잔기는 뱀 독 프로테아제 활성을 소멸 또는 실질적으로 변형시키지 않고 뱀 독 프로테아제의 야생형(wild-type) 서열로부터 변형될 수 있는 잔기이다. 바람직하게는, 변형은 뱀 독 프로테아제 활성을 실질적으로 변화시키지 않는데, 예를 들어, 활성은 야생형의 적어도 20%, 40%, 60%, 70% 또는 80%이다. "필수" 아미노산 잔기는 뱀 독 프로테아제의 야생형 서열로부터 변형될 때, 뱀 독 프로테아제 활성을 소멸시켜 야생형 활성의 20% 이하가 존재하는 잔기이다. 예를 들어, 뱀 독 프로테아제들 , 예를 들어, 도 24에 나타낸 뱀 독 프로테아제들 사이에 보존된 아미노산 잔기는 특히 변형될 수 없는 것으로 예상된다.

"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기와 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 집단은 당업계에 정의 되어 있다. 이들 집단은 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파리트산, 글루탐산, 비대전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파리기닌, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 아이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소루신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 뱀 독 프로테아제 단백질 내의 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 집단으로부터의 다른 아미노산 잔기와 치환된다. 선택적으로, 다른 실시예에서, 돌연변이는 포화 돌연변이에 의해 뱀 독 프로테아제 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 유도될 수 있고, 최종 돌연변이는 활성을 보유하는 돌연변이를 동정함으로써 뱀 독 프로테아제 생물학적 활성에 대해 검색될 수 있다. SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 돌연변이 후에, 암호화된 단백질은 무작위로 발현될 수 있고 단백질의 활성이 결정될 수 있다.

아미노산 잔기는 일반적으로 다음과 같은 주요 서브클래스로 세분화될 수 있다:

산성: 잔기는 생리적 pH에서 수소 이온의 손실에 의해 음전하를 띄고 잔기는수용액에 의해 당겨져서 펩타이드가 생리적 pH에서 수용액 배지에 있을 때 포함되는 펩타이드의 형태에서 표면 위치를 찾으려고 한다. 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 글루탐산과 아스파라트산을 포함한다.

염기성: 잔기는 생리적 pH 또는 이의 하나 또는 둘의 pH 단위에서 수소 이온와 결합하여 양전하를 띄고 잔기는 수용액에 의해 당겨져서 펩타이드가 생리적 pH에서 수용액 배지에 있을 때 포함되는 펩타이드의 형태에서 표면 위치를 찾으려고 한다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다.

대전: 잔기는 생리적 pH에서 대전되고, 산성 또는 염기성 측쇄(즉, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.

소수성: 잔기는 생리적 pH에서 대전되지 않고 잔기는 수용액에 의해 멀어져서 펩타이드가 수용액 배지에 있을 때 포함되는 펩타이드의 형태에서 내부 위치를 찾으려고 한다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 티로신, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 포함한다.

중성/극성: 잔기는 생리적 pH에서 대전되지 않고 잔기는 수용액에 의해 충분히 멀어지지 않아서 펩타이드가 수용액 배지에 있을 때 포함되는 펩타이드의 형태에서 내부 위치를 찾으려고 한다. 중성/극성 측쇄를 갖는 아미노산은 아스프라기닌, 글루타민, 시스테인, 히스티딘, 세린 및 트레오닌을 포함한다.

본 설명은 일정한 아미노산을 "소형"으로 특징짓는데, 이는 만일 극성 그룹이 부족하면, 소수성을 부여하기 위해서 측쇄가 충분히 크지 않기 때문이다. 프롤린을 제외하고, "소형" 아미노산은 적어도 하나의 극성 그룹이 측쇄 위에 있을 때 4개 이하의 탄소, 그렇치 않을 때는 3개 이하의 탄소를 갖는 것이다. 소형 측쇄를 갖는 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌을 포함한다. 유전자-암호화 2차 아미노산 프롤린은 펩타이드 사슬의 2차 형태에 대한 공지된 효과 때문에 특별한 경우이다. 프롤린의 구조는 그 측쇄가 α-아미노 그룹의 질소뿐만 아니라 α-탄소에 결합하는 점에서 천연적으로 발생하는 모든 다른 아미노산과 차이가 난다. 그러나, 여러 아미노산 유사 매트릭스(예를 들어, 데이호프 등에 의해 기술된 PAM 120 매트릭스 및 PAM 250 매트릭스(1978) A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determing distance relationships in M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; 및 고넷 등, 1992, Science 256(5062): 144301445)는 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌으로 동일한 그룹 내에 프롤린을 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해서, 프롤린은 "소형" 아미노산으로 분류된다.

극성 또는 비극성으로 분류하기 위해 필요한 인력 또는 척력의 정도는 임의적이고 따라서, 본 발명에서 구체적으로 고려하는 아미노산은 하나 또는 다른 것으로 분류되었다. 구체적으로 명명되지 않은 대부분의 아미노산은 공지된 성질에 기초하여 분류될 수 있다. 아미노산 잔기들은 고리형 또는 비-고리형 및 방향족 또는 비-방향족, 잔기의 측쇄 치환 그룹에 관한 자체 설명 분류 및 소형 또는 큰으로 더 세분화될 수 있다. 만일 추가의 극성 치환체가 존재한다면 카보닐 탄소를 제외하고 총 4개 이하의 탄소, 그렇치 않으면 3개 이하를 포함하면 잔기는 소형 것으로 생각된다. 물론 소형 잔기들은 항상 방향족이 아니다.

천연적으로 발생하는 단백질 아미노산의 경우, 하기 체계에 따른 하부-분류는 다음 표에 제공된다.

아미노산 하부-분류

하부-분류	아미노산
산성염기성대전됨소형극성/중성극성/대형소수성	아스파라트산, 글루탐산비고리형: 아르기닌, 리신; 고리형:히스티딘아스파라트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 히스티딘글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌아스파라긴, 히스티딘, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌아스파라긴, 글루타민티로신, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판

유전자-암호화 2차 아미노산 프롤린은 펩타이드 사슬의 2차 외형에 대한 공지된 효과 때문에 특별한 경우이고, 따라서 그룹 내에 포함되지 않는다.

SVPs 내에 포함될 수 있는 "변형" 아미노산은 유전자의 번역 후에 예를 들어, 메틸 그룹의 첨가 또는 다른 치환체에 대한 공유 결합을 통한 유도화 또는 산화 또는 환원 또는 다른 공유 변형에 의해 처리되는 유전자-암호화 아미노산이다. 최종 변형된 아미노산이 해당되는 분류는 변형 형태의 특징에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 만일 리신이 ε-아미노 그룹을 아실화함으로써 변형된다면, 변형 형태는 염기성이 아닌 극성/대형으로 분류될 것이다.

유전자 코드에 의해 암호화도지 않는 임의의 통상적으로 보게되는 아미노산은 예를 들어, β-알라닌(β-Ala), 또는 3-아미노프로피오니산, 2,3-다이아미노프로피오니산(2,3-diaP), 4-아미노부틸산 등과 같은 다른 ω-아미노산, α-아미노아이소부틸산(Aib), 사코신(Sar), 오르니틴(Orn), 시트룰린(Cit), t-뷰틸알라닌(t-BuA), t-뷰틸글리신(t-BuG), N-메틸아이소루신(N-Melle), 페닐글리신(Phg) 및 사이클로헥실알라닌(Cha), 놀루신(Nle), 2-나프틸알라닌(2-Nal); 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산(Tic); β-2-티에닐알라닌(Thi); 메티오닌 설폭사이드(MSO); 및 호모아르기닌(Har)을 포함한다. 이들은 편리하게 특정 부류에 해당된다.

상기 정의를 기초로하여, Sar, β-Ala 및 Alb는 소형이다; t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle, Mvl, Cha, Phg, Nal, Thi 및 Tic는 소수성이다; 2,3-diaP, Orn 및 Har는 염기성이다; Cit, Acetyl Lys 및 MSO는 중성/극성/대형이다. 다양한 ω-아미노산은 크기에 따라 소형(β-Ala 및 3-아미노프로피오니산) 또는 대형 또는 소수성(다른 모든 것)으로 분류된다.

유전자 내에 암호화된 것에 대한 다른 아미노산 치환은 본 발명의 범위 내의 SLEs에 포함될 수 있고 이들의 구조에 따라 일반적인 체계 내에서 분류될 수 있다.

본 발명의 모든 SVPs에서, 하나 이상의 아마이드 결합(--CO--NH--)은 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂CH₂--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH₂--, --CH(0H)CH₂-- 및 --CH₂SO--와 같은 등량흡착곡선인 다른 결합과 선택적으로 치환될 수 있다. 이 치환은 당업계에 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 다음 참고문헌은 교대-결합 모이어티를 포함하는 펩타이드 유사체의 제조를 기술한다: 스파톨라, 에이. 에프., Vega Data(1983년 3월), Vol 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modificaions"(general review); 스파톨라, 에이. 에프., "Chemistry and Biochemisty of Amino Acids Peptides and Proteins", 비. 웨인스테인, eds., 마셀 덱커, 뉴욕, p. 267(1983)(general review); 몰리, 제이. 에스., Trends Pharm Sci(1980) pp. 463-468(general review); 허드슨, 디 등., Int J Pept Prot Res(1979) 14:177-185(--CH₂NH)--, --CH₂CH₂--); 스파톨라, 에이. 에프 등, Life Sci(1986) 38:1243-1249(--CH₂--S); 한, 엠.엠., J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(--CH--CH--, 시스 및 트랜스); 알미퀴스트, 알. 쥐 등., J Med Chem(1980)23:1392-1398(--COCH₂--); 제닝스-화이트, 씨., 등, Tetrahedron Lett(1982)23:2533(--COCH₂--); 스젤크, 엠 등., 유럽 특허 EP 45665(1982) CA:97:39405(1982)(--CH(OH)CH₂--); 할리데이, 엠, 더불유, 등, Tetrahedron Lett(1983)24:4401-4404(--CH(OH)CH₂--); 및 후루비, 브이. 제이., Life Sci(1982)31:189-199(--CH₂--S--).

본 명세서에 사용된 뱀 독 프로테아제 단백질의 "생물학적으로 활성인 단백질"이란 용어는 상호작용, 예를 들어, 분자내 또는 분자간 상호작용에 참여하는 뱀 독 프로테아제 단백질의 절편을 포함한다. 분자간 상호작용은 특정한 결합 상호작용 또는 효소적 상호작용(예를 들어, 상호작용은 일시적이고 공유결합은 형성되거나 깨진다)일 수 있다. 분자간 상호작용은 뱀 독 프로테아제 분자 및 비-뱀 독 프로테아제 분자, 예를 들어, 프로트롬빈 사이 또는 제 1 뱀 독 프로테아제 분자, 예를 들어, 뱀 독 프로테아제의 경사슬 및 제 2 뱀 독 프로테아제 분자(예를 들어, 이합체화 상호작용) 사이에서 일어날 수 있다. 뱀 독 프로테아제 단백질의 생물학적으로 활성인 부분은 뱀 독 프로테아제 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어, 전장 뱀 독 프로테아제 단백질 이하의 아미노산을 포함하고 뱀 독 프로테아제 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타내는 SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17에 나타난 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 생물학적으로 활성인 부분은 뱀 독 프로테아제 단백질의 적어도 하나의 활성에 대한 능력, 예를 들어, 칼슘 및/또는 인지질 없이 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리하는 능력을 가진 도메인 또는 모티프를 포함한다. 뱀 독 프로테아제 단백질의 생물학적으로 활성인 부분은 예를 들어, 길이가 10, 25, 50, 100, 200 또는 그 이상의 아미노산인 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직하게는, 상기 절편은 상기한 뱀 독 프로테아제의 프로트롬빈 처리 활성의 1%이하, 바람직하게는 10%이하, 보다 바람직하게는 25% 및 보다 더 바람직하게는 50%이하를 갖는 "생물학적으로 활성인 부분"이다.

본 발명은 본 발명의 뱀 독 프로테아제의 "절편"을 포함한다. "절편"이란 용어는 뱀 독 프로테아제의 중사슬 및 경사슬의 범위 내에 포함된다. 한 실시예에서, 절편은 아래 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다(도 27에 나타낸 잔기 수):

KREASLPDFVQS(잔기 181-192)[SEQ ID NO:19]

LKKSDNPSPDIR(잔기 198-209)[SEQ ID NO:20]

SVXVGELXXSR(잔기 260-270)[SEQ ID NO:21]

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK (잔기 1-29)[SEQ ID NO:22]

ANRFLQRTKR(잔기 31-40)[SEQ ID NO:23]

KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR(잔기 181-209)[SEQ ID NO:24]

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR(잔기 1-40)[SEQ ID NO:25]

X는 임의의 아미노산일 수 있다.

상기 펩타이드 절편의 펩타이드 하부-절편, 예를 들어, SEQ ID NO:19 및 20인 펩타이드는 SEQ ID N0:24인 펩타이드의 개별 하부-절편인 것으로 생각될 것이다. 다른 절편 및 하부-절편은 당업자에 의해 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, "절편"은 소형 펩타이드, 예를 들어, 길이가 적어도 6, 바람직하게는 적어도 10 및 보다 바람직하게는 적어도 20개 아미노산이다. 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 더 큰 절편 또한 관찰하며, 표준 재조합 핵산 기술을 사용하여 얻어지거나 통상의 액체상 또는 고체상 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 선택적으로, 펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드와 endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C 및 스타필로코커스 V8-프로테아제와 같은 프로티나아제의 소화에 의해 생성될 수 있다. 소화된 절편은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HLPC) 기술에 의해 정제될 수 있다.

상동관계 또는 서열들 사이의 서열 동일성의 계산(용어는 상화교환하여 사용된다)은 다음과 같이 이루어진다.

2개 아미노산 서열 또는 2개 핵산 서열의 백분율 동일성을 결정하기 위하여, 서열들은 최적의 비교를 위해 배열된다(예를 들어, 갭이 최적 배열을 위한 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 모두에 유도될 수 있고 동일하지 않은 서열은 비교를 위해 무시될 수 있다). 바람직한 실시예에서, 비교를 위해서 배열된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 50%, 60% 및 보다 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 상응하는 위치로 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 채워질 때, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 발명에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동관계"와 동일하다).

2개 서열들 사이의 백분율 동일성은 2개 서열의 최적 배열을 위해 필요한 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.

2개 서열 사이의 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 완성될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 2개 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com) 속에 포함된 니들만 및 운스치(Needleman and Wunsch) 알고리즘((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)을 사용하여 결정된다. 다른 바람직한 실시예에서, 2개 뉴클레오티드 서열들 사이의 백분율 동일성은 NWSgapdna CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com)을 사용하여 결정된다. 변수들의 특히 바람직한 집단(및 달리 구체화하지 않으면 사용되어야 하는 집단)은 12의 갭 패널티, 4의 갭 확장 패널티 및 5의 프레임이동 갭 패널티를 가진 Bloosum 62 스코어링 매트릭스이다.

2개 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 백분율 동일성은 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 길이 패널티를 사용하여 ALIGN 프로그램(버젼 2.0) 속에 포함된 이. 메이어 및 더블유. 밀러(E. Meyers and W. Miller(1989))CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

상기한 핵산 및 단백질 서열은 공개된 데이타베이스에 대한 조사를 수행, 예를 들어, 다른 집단 구성원 또는 관련 서열을 동정하는데 "퀴어리 서열(query sequence)"로서 사용될 수 있다. 이런 조사는 알트슐 등(1990) J. Mol. Boil. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 본 발명의 53010 핵산 분자와 유사한 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 점수=100, 단어길이=12인 NBLAST 프로그램으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 조사는 본 발명의 53010 핵산 분자와 유사한 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 점수=50, 단어길이=3인 XBLAST 프로그램으로 수행될 수 있다. 비교를 위해서 갭(gapped) 배열을 얻기 위해, 갭 BLAST는 알트슐 등(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기술된대로 사용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때, 개별 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참조.

본 발명의 특히 바람직한 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17열 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 아미노산 서열의 내용에서, "실질적으로 동일한" 이란 용어는 제 2 아미노산 서열과 i)동일, 또는 ii) 제 2 아미노산 서열에 배열된 아미노산 잔기의 보존성 치환인 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기를 포함하는 제 1 아미노산을 의미하고 제 1 및 제 2 아미노산 서열은 동일한 구조적 도메인 및/또는 동일한 기능적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17과 적어도 약 60%, 또는 65% 동일성, 약 75% 동일성, 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 동일한 구조적 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 실질적으로 동일하다고 불린다.

뉴클레오티드 서열의 내용에서, "실질적으로 동일한" 이란 용어는 제 2 핵산 서열에 배열된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 또는 최소 수의 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 핵산 서열을 의미하고 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 동일한 기능적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하거나 구조적 폴리펩타이드 도메인 또는 동일한 기능적 폴리펩타이드 활성을 암화화한다. 예를 들어, SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, , 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18과 적어도 약 60% 또는 65% 동일성, 약 75% 동일성, 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 동일한 구조적 도메인을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다고 불린다.

본 명세서에서 사용된 "피험자"는 인간 및 인간이 아닌 동물을 의미한다. 본 발명의 용어 "인간이 아닌 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 인간이 아닌 영장류(특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 생쥐 또는 쥐), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소 및 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비포유류를포함한다. 바람직한 실시예에서, 피험자는 인간이다. 다른 실시예에서, 피험자는 실험 동물 또는 질병 모델로 적절한 동물이다.

본 명세서에 사용된 "세포의 정제된 제조"는 세포의 생체내 제조를 의미한다. 다세포 유기체(예를 들어, 식물 및 동물)의 세포의 경우, 세포의 정제된 제조는 전체 온전한 유기체가 아닌 유기체로부터 얻은 세포의 하부세트이다. 단세포 미생물(예를 들어, 배양 세포 및 미생물 세포)의 경우, 피험자 세포의 적어도 10% 및 보다 바람직하게는 50%의 제조로 이루어진다.

변형체는 본 발명의 뱀 독 프로테아제 단백질의 "동족체"라는 용어의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 일반적으로 사용된대로, "동족체"는 본 발명의 핵산 또는 아미노산 서열과 정의할 수 있는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 관계를 공유한다. 다른 뱀들로부터 유래된 본 발명의 뱀 독 프로테아제 단백질은 서로의 동족체이다.

동족체의 범위 내에 포함되는 것은 Pseudonaja textilis, Oxyuranus scutellatus, Notechis scutatus,Tropedechis carinatus 및 Pseudechis prophiracus 이외의 유기체로부터 분리한 뱀 독 프로테아제 단백질 및 이들을 암호화하는 핵산인 "정형체(orthologs)"이다. 또한, 상기 종의 하나로부터 얻은 뱀 독 프로테아제 단백질은 다른 상기 종들의 임의의 정형체이다. 예를 들어, P.textilis의 뱀 독 프로테아제 단백질은 O. scutellatus의 뱀 독 프로테아제 단백질의 정형체이다.

본 발명에 의해 고려되는 다른 유도체들은 측쇄에 대한 변형, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성 동안의 비천연 아미노산 및/또는 이들의 유도체의 포함 및 가교제의 사용 및 본 발명의 폴리펩타이드, 절편 및 변형체에 대한 형태적 압박을 부여하는 다른 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 고려되는 측쇄 변형의 예는 무수 아세트산에 의한 아미노 그룹의 아실화; 무수 숙신산 및 무수 테트라하이드로프탈산에 의한 아미노 그룹의 아실화; 메틸아세트이미데이트에 의한 이미디화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카바모일화(carbamoylation); 피리독살-5-포스페이트에 의한 리신의 피리독실화에 이은 NaBH₄에 의한 환원;알데하이드와의 반응에 의한 환원성 알킬화에 이은 NaBH₄에 의한 환원; 2, 4, 6-트라이나이트로벤젠 술폰산(TNBS)에 의한 아미노 그룹의 트라이나이트로벤질화를 포함하는 아미노산의 변형을 포함한다.

카복시 그룹은 O-아실리소우레아(O-acylisourea) 형성을 통한 카보다이이미드 활성화에 이은 상응하는 아마이드에 대한 뒤이은 유도화에 의해 변형될 수 있다.

아르기닌 잔기의 구아니딘 그룹은 2, 3-부타다이온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약에 의한 이형고리 응축 산물의 형성에 의해 변형될 수 있다.

설피드릴(sulphydryl) 그룹은 사이스테산(cysteic acid)에 대한 과포름산 산화; 4-클로로머큐리페닐술폰산, 4-클로로머큐리벤조에이트; 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀, 페닐머큐리 클로라이드, 및 다른 수은 화합물을 사용하는 수은 유도체의 형성; 다른 티올 화합물에 의한 혼합된 이황화물의 형성; 말레이미드, 무수 말레산 또는 다른 치환 말레이미드와의 반응; 아이도아세트산 또는 아이도아세트아마이드와의 카복시메틸레이션; 및 알칼리 pH에서 시아네이트와의 카바모일화 또는 아이도아세트산 유도체와의 알킬화에 의해 변형될 수 있다.

펩타이드 합성 동안 비천연 아미노산 및 유도체를 포함시키는 예는 4-아미노 부티르산(butyric acid), 6-아미노헥사노산(aminohexanoic acid), t-부틸글리신, 노르루신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-아이소머의 사용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 분리된 프로트롬빈 활성화 단백질(절편, 변형체, 유도체 및 동족체 포함)은 당업자에게 공지된 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 다양한 양태가 다음에 상세하게 기술된다.

분리된 핵산 분자

한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드, 예를 들어, 전장 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 이의 절편, 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 암호화하는 분리된 또는 정제된 핵산 분자를 제공한다. 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 뱀 독 프로테아제 mRNA 및 프라이머로 사용하기에 적절한 절편, 예를 들어, 핵산 분자의 증폭 또는 변형을 위한 PCR 프라이머를 암호화하는 핵산 분자를 동정하기 위해 사용될 수 있는 잡종화 프로브로 사용하기에 적절한 핵산 절편이 포함된다.

한 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18, 또는 임의의 이들 뉴클레오티드 서열의 부분에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시예에서, 핵산 분자는 뱀 독 프로테아제 단백질을 암호화하는 서열(즉, 각각 SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 또는 16, SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15 또는 18의 "암호화 부위") 뿐만 아니라 5'의 번역되지 않은 서열을 포함한다. 선택적으로, 핵산 분자는 각각 SEQ ID NO:1, 4, 7, 10, 13 또는 16(예를 들어, SEQ ID NO:3, 6, 9, 12, 15 또는 18)의 암호화 부위 및 정상적으로 대상 서열과 함께 하는 우회하는 서열을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 핵산 분자는 단백질의 절편에 상응하는 서열을 암호화한다. 예를 들어, 핵산 분자는 하나 이상의 뱀 독 프로테아제 프로펩타이드, 경사슬, 활성화 펩타이드 및 중사슬을 암호화한다. 다른 실시예에서, 핵산 분자는 상기한 하나 이상의 도메인 또는 부위를 암호화할 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 보체, 예를 들어, SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18 또는 임의의 이들 뉴클레오티드 서열의 부분, 예를 들어, 상기한 도메인 또는 부위를 암호화하는 임의의 것의 부분에 나타낸 뉴클레오티드의 보체인 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 충분하게 상보적이어서, SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 또는 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 잡종화(상기한 극한 상태하에서)될 수 있어, 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성한다.

한 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 서열은 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 또는 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장, 또는 부분, 바람직하게는 임의의 이들 뉴클레오티드 서열의 동일한 길이와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

뱀 독 프로테아제 핵산 절편

본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 또는 18의 핵산 서열의 단지 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이런 핵산 분자는 뱀 독 프로테아제의 부분, 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 단백질의 면역성 또는 생물학적으로 활성인 부분, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 뱀 독 프로테아제의 면역성 또는 생물학적으로 활성인 부분을 암호화하는 프로브 또는 프라이머 또는 절편으로 사용될 수 있다. 절편은 뱀 독 프로테아제의 프로펩타이드, 경사슬, 활성제 펩타이드, 중사슬, GLA 도메인, EGF-1 도메인, EGF-2 도메인, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 도메인 또는 부위를 암호화하는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뱀 독 프로테아제 유전자의 복제로부터 얻은 뉴클레오티드 서열은 다른 뱀 독 프로테아제 집단 구성원 또는 이의 절편뿐만 아니라 다른 종들의 뱀 독 프로테아제 동족체 또는 이의 절편을 동정 및/또는 복제하는데 사용되도록 설계된 프로브 및 프라이머를 발생시킨다.

한 실시예에서, 핵산은 암호화 부위의 부분 또는 전부를 포함하고 5' 또는 3' 각각(또는 모두)의 비암호화 부위 속으로 연장된다. 다른 실시예는 본 명세서에서 기술된 아미노산 절편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 절편을 포함한다. 핵산 절편은 본 명세서에서 기술된 특정한 도메인 또는 위치 또는 이의 절편, 특히 길이가 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 550 아미노산인 절편을 암호화할 수 있다. 또한 절편은 상기한 특정 아미노산 서열 또는 이의 절편에 상응하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 절편은 본 발명 전에 기술된 절편들을 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

핵산 절편은 본 명세서에서 기술된 도메인, 부위, 또는 기능적 위치에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 절편은 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 도메인, 부위, 또는 기능적 위치를 포함할 수 있다. 따라서, 뱀 독 프로테아제 핵산 절편은 GLA 도메인, EGF 도메인 또는 인자 Va-유사 도메인과 상응하는 서열을 포함할 수 있다.

뱀 독 프로테아제 프로브 및 프라이머가 제공된다. 일반적으로, 프로브/프라이머는 분리된 또는 정제된 올리고뉴클레오티드이다. 일반적으로 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18 또는 SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18의 천연적으로 발생하는 대립 형질 변형체 또는 돌연변이의 센스 또는 안티센스 서열의 적어도 약 7, 12 또는 15, 바람직하게는 약 20 또는 25, 보다 바람직하게는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 75 연속적 뉴클레오티드를 극한 상태하에서 잡종화시키는 뉴클레오티드 서열의 부위를 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 200, 150, 120 또는 100 뉴클레오티드 이하이다. 바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 프로브 또는 프라이머는 뱀 독 프로테아제-암호화 핵산의 부위와 잡종화되나 인간 인자 Xa 및/또는 트로카린의 부위와 잡종화하지 않는다.

한 실시예에서, 프로브 또는 프라이머는 고체 지지체, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 고체 지지체에 부착된다.

프라이머의 한 예시적 키트는 암호화 가닥에 연결된 포워드 프라이머 및 비-암호화 가닥에 연결된 리버스 프라이머를 포함한다. 포워드 프라이머는 개시 코돈, 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 아미노산 잔기Ⅰ를 암호화하는 핵산 서열과 연결될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 포워드 및 리버스 프라이머의 연결 온도는 단지 5, 4, 3 또는 2℃이다.

바람직한 실시예에서, 핵산은 길이가 적어도 10, 12, 15, 18, 20 및 200 이하, 보다 바람직하게는 100 이하, 50 이하인 뉴클레오티드인 프로브이다. 이는 본 명세서에 기술된 서열과 동일하거나 1 또는 2 또는 5 또는 10 이하의 뉴클레오티드 차이가 나야 한다. 만일 비교를 위해서 배열이 필요하다면, 서열은 최대 동족체에 대해 배열되어야 한다. 결실 또는 삽입 또는 불일치에 의한 루프 아웃(Looped out) 서열은 다른 것으로 생각된다.

프로브 또는 프라이머는 프로펩타이드, 경사슬, 활성제 펩타이드, 중사슬 또는 이의 부분(또는 이런 부위 내의 도메인)을 암호화하는 핵산의 센스 또는 안티센스 가닥으로부터 유래될 수 있다.

다른 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 서열, 예를 들어, 도메인, 부위, 위치 또는 본 명세서에 기술된 다른 서열의 선택된 부위를 증폭하는데 사용될 수 있는PCR에서 사용하기에 적절한 프라이머의 집단이 제공된다. 프라이머는 길이가 적어도 5, 10 또는 50 염기쌍 및 100 이하 또는 200 이하 염기쌍이어야 한다. 프라이머는 본 명세서에서 기술된 서열 또는 천연적으로 발생하는 변형체와 동일하거나 하나의 염기가 차이가 나야 한다. 예를 들어, 다음의 부위의 임의의 것의 전부 또는 부분을 증폭시키는데 적절한 프라이머가 제공된다: 프로펩타이드, 경사슬, 활성제 펩타이드, 중사슬(또는 이런 부위 내의 도메인 및 위치).

핵산 절편은 본 명세서에서 기술된 폴리펩타이드의 에피토프 함유 부위를 암호화할 수 있다.

"뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 부위"를 암호화하는 핵산 절편은 뱀 독 프로테아제 생물학적 활성(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 뱀 독 프로테아제 생물학적 활성)을 갖고, 뱀 독 프로테아제 단백질의 암호화 부분을 발현(예를 들어, 생체내 재조합 발현에 의함)시키고 뱀 독 프로테아제 단백질의 암호화된 부분의 활성을 평가하는 폴리펩타이드를 암호화하는 SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18의 부분을 분리시킴으로써 제조될 수 있다. 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 부분을 암호화하는 핵산 절편은 길이가 300 또는 그 이상의 뉴클레오티드보다 큰 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 실시예에서, 핵산은 길이가 약 300, 400, 500 ,600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 그 이상의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 본 명세서에 기술된 극한 상태하에서 SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18의 핵산 분자와 잡종화한다.

뱀 독 프로테아제 핵산 변형체

본 발명은 SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 또는 18에 나타낸 뉴클레오티드와차이가 나는 핵산 분자를 더 포함한다. 유전자 코드의 겹침에 의해 이런 차이가 발생될 수 있고 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것들과 동일한 뱀 독 프로테아제 단백질을 암호화하는 핵산을 만든다. 다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17에 나타낸 적어도 1, 5, 10, 20, 50 또는 100이하의 아미노산이 차이가 나는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 만일 비교를 위해서 배열이 필요하다면, 서열은 최대 동족체에 대해 배열되어야 한다. 암호화된 단백질은 단지 5, 4, 3, 2, 또는 1개 아미노산이 차이가 난다. 결실 또는 삽입 또는 불일치에 의한 루프 아웃(Looped out) 서열은 다른 것으로 생각된다.

본 발명의 핵산은 특정한 발현 시스템에 바람직하거나 바람직하지 않은 코돈을 갖는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 적어도 하나, 바람직하게는 코돈의 적어도 10% 또는 20%이 변형되어 서열이 대장균, 효모, 인간, 곤충 또는 CHO 세포에서 발현에 최적화되는 것이 될 수 있다.

대립 유전자 변형체(동일 좌위), 동족체(다른 좌위) 및 정형체(다른 유기체)와 같은 핵산 분자 변형체들은 천연적으로 발생할 수 있거나 천연적으로 발생하지 않을 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 변형체들은 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 유기체에 사용된 것을 포함하는 형질변환 기술에 의해 만들어질 수 있다. 이 변형체들은 뉴클레오티드 치환, 결실, 변환 및 삽입을 포함할 수 있다. 변형은 코딩 및 암호화 부위의 각각 또는 전부에서 발생할 수 있다. 이 변형은 보존성 및 비보존성 아미노산 치환(암호화된 산물과 비교) 모두를 만들어낼 수 있다. 한 실시예에서, 핵산 동족체는 Psuedonaja textilis, Oxyuranus scutellatus, Notechis scutatus, Tropidechis carinatus 및 Pseudechis porphyriacus 이외의 뱀들로부터 분리된 정형 핵산이다.

바람직한 실시예에서, 핵산은 예를 들어, 대상 핵산에서 적어도 하나가 10, 20, 30, 또는 40 뉴클레오티드; 적어도 하나가 1%, 5%, 10%, 또는 20%의 뉴클레오티드로 SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 핵산과 다르다. 핵산은 단지 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드 차이가 날 수 있다. 만일 분석을 위해 필요하다면, 서열은 최대 동일성을 위해 배열되어야 한다. 결실 또는 삽입 또는 불일치에 의한 루프 아웃 서열은 다른 것으로 생각된다.

정형체, 동족체, 대립 유전자 변형체들은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 동정될 수 있다. 이들 변형체들은 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17인 뉴클레오티드 서열 또는 이 서열의 절편과 일반적으로 적어도 약 70-75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80-85%, 및 가장 일반적으로 적어도 약 90-95% 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 바람직하게는 뱀 독 프로테아제 활성을 가진다. 이런 핵산 분자들은 본 명세서에 기술된 극한 상태하에서 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17 또는 이의 절편인 뉴클레오티드 서열과 잡종화되는 것으로 쉽게 동정될 수 있다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제 cDNAs의 정형체, 동족체, 및 대립 유전자 변형체와 상응하는 핵산 분자는 뱀 독 프로테아제 유전자와 같이 동일한 염색체 또는 좌위에 대해 매핑(mapping)함으로써 더 분리될 수 있다.

바람직한 변형체들은 칼슘, 인지질 및 인자 Va의 하나 이상이 없이 응고를 유발시키는 능력과 같은 뱀 독 프로테아제 활성을 갖는 것들을 포함한다.

뱀 독 프로테아제의 대립 유전자 변형체들은 기능적 및 비기능적 단백질을 포함한다. 기능적 대립 유전자 변형체들은 프로트롬빈을 처리할 수 있는 능력을 유지하는 군 내의 뱀 독 프로테아제 단백질의 천연적으로 발생하는 아미노산 서열 변형체이다. 기능적 대립 유전자 변형체들은 일반적으로 단백질의 중요하지 않은 부위에서 SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 또는 17의 하나 이상의 아미노산의 보존성 치환 또는 중요하지 않은 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 것이다. 비기능적 대립 유전자 변형체는 프로트롬빈을 처리할 능력이 없는 군 내의 뱀 독 프로테아제 단백질의 천연적으로 발생하는 아미노산 서열 변형체들이다. 비기능적 대립 유전자 변형체는 일반적으로 SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 또는 17의 아미노산 서열의 비보존성 치환, 결실 또는 삽입 또는 미성숙 절단 또는 단백질의 중요 잔기 또는 중요 부위에서의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.

또한, 다른 뱀 독 프로테아제 집단 구성원을 암호화하여 SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 뱀 독 프로테아제 서열과 차이가 나는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 분리된 핵산 동족체는 핵산 서열 증폭 기술을 사용하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

한 실시예에서, 이 방법은:

(i) 숙주 세포 또는 동물로부터 핵산 추출물을 얻는 단계;

(ii) 선택적으로 겹치는 하나 이상의 프라이머를 생성하는 단계, 여기서 각 프라이머는 본 발명의 분리된 핵산의 일부에 상응한다; 및

(iii) 핵산 증폭 기술을 통해 상기 핵산 추출물의 하나 이상의 증폭 산물을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 사용하는 단계.

바람직하게는, 상기 하나 이상의 프라이머는 결합 및 일반적으로 증폭에 사용되는 프라이머 연장 상태하에서 본 발명의 이중 가닥 핵산의 하나 또는 다른 가닥과 결합할 수 있도록 설계된다. 겹친 프라이머의 경우에, 프라이머 및 분리된 핵산 서열 사이의 서열 차이는 동족 암호화 서열에서의 겹침에 의한 것과 같이 가능한 서열 변이를 증명하기 위해 의도적으로 도입된다.

적절한 핵산 증폭 기술들은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 어스벨 등. supra의 15장에 기술된 폴리머라제 연쇄 중합 반응(PCR) 및 리가아제 연쇄 중합 반응(LCR); 미국 특허 제 5,422,252호에 기술된 가닥 치환 증폭(SDA); 국제 출원 WO 92/01813호 및 WO 97/19193호에 기술된 회전 원형 복제(RCR); 수크나난 등., 1994, Biotechinques 17 1077에 기술된 핵산 서열-기초 증폭(NASBA); 및 타이기 등1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 93 5395에 기술된 Q-β 복제 증폭 복제를 포하하나, 이에 한정되지 않는다.

바람직한 핵산 서열 증폭 기술은 PCR이다.

본 명세서에 사용된 "증폭 산물"은 본 명세서에 널리 정의된 핵산 증폭 기술에 의해 발생된 핵산 산물을 의미한다.

핵산 동족체는 단백질 동족체를 암호화할 수 있다. 따라서, 핵산 동족체에 대한 상기의 방법들은 단백질 동족체를 분리하는데 사용될 수 있다.

분리된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드

다른 양태에서, 본 발명은 항-뱀 독 프로테아제 항체를 발생 또는 검사(또는 보다 일반적으로 결합)하는 면역원 또는 항원으로 사용하기 위한 분리된 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 절편, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 부분을 특징으로 한다. 뱀 독 프로테아제 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 Psuedonaja textilis, Oxyuranus scutellatus, Notechis scutatus, Tropidechis carinatus 및 Pseudechis porphyriacus의 그룹으로부터 선택된 뱀으로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 뱀 독 프로테아제는 호주 뱀, 예를 들어, 상기한 호주 뱀의 독 샘으로부터 분리된다. 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 이의 절편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 화학적으로 합성하여 제조될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 선택적 번역 및 번역 후 사건의 결과로 발생하는 것들을 포함한다. 폴리펩타이드는 예를 들어, 발현 폴리펩타이드가 고유 세포 내에서 발현될 때 실질적으로 동일한 번역 후 변형을 초래하는 배양 세포와 같은 시스템 또는 폴리펩타이드가 고유 세포에서 발현될 때 존재하는 당화 또는 분리와 같은 번역 후 변형이 변화 또는 생략을 초래하는 시스템에서 발현될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 다음의 특징들의 하나 이상을 가진다:

(i) 프로트롬빈을 처리하는 능력을 가진다;

(ii) 번역 후 변형, 아미노산 조성물 또는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드, 예를 들어, SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 다른 물리적 특성의 어떤 영향을 무시한 유도 분자량인 분자량을 가진다;

(iii) 예를 들어, SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 폴리펩타이드인 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드와 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70, 80, 90 또는 95%의 전체 서열 유사성을 가진다;

(iv) 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 도메인 또는 부위와 실질적인 서열 동일성을 가진다.

바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 이의 절편은 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17에서의 상응하는 서열과 다르다. 한 실시예에서, 적어도 하나가 15, 10 또는 5개 아미노산 잔기 이하가 다르다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17에서 상응하는 서열과 다른 잔기의 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하로 적어도 하나가 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17에서 상응하는 서열과 다르다.(만일 분석을 위해 필요하다면, 서열은 최대 동일성을 위해 배열되어야 한다. 결실 또는 삽입 또는 불일치에 의한 루프 아웃 서열은 다른 것으로 생각된다). 바람직하게는, 이 차이는 비-필수 잔기 또는 보존성 치환에서의 차이 또는 변화이다.

다른 실시예는 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서의 변화와 같은 아미노산 서열에서의 하나 이상의 변화를 포함하는 단백질을 포함한다. 이런 뱀 독 프로테아제 단백질은 아미노산에서 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17과 다르나, 생물학적 활성을 보유한다.

한 실시예에서, 단백질은 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고 뱀 독 프로테아제 생물학적 활성을 가진다.

한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 단백질의 생물학적으로 활성인 부분은 하나 이상의 GLA 도메인, EGF-1 도메인, EFG-2 도메인 및 인자 Va-양 도메인을 포함한다. 또한, 단백질의 다른 부위들이 결실된 다른 생물학적으로 활성인 부분은 재조합 기술으로 제조될 수 있고 고유 뱀 독 프로테아제 단백질의 하나 이상의 기능성 활성에 대해 평가된다.

바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 단백질은 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17인 아미노산 서열을 가진다. 다른 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17과 실질적으로 동일하고 상기한 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 단백질의 기능성 활성을 보유한다. 바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 단백질은 칼슘, 인지질 및 인자 Va의 하나 이상 없이 프로트롬빈을 처리하는 능력을 보유하고, 바람직하게는 칼슘 및 인지질 모두 없이 프로트롬빈을 처리하는 능력을 보유한다.

뱀 독 프로테아제 키메라 또는 융합 단백질

다른 양태에서, 본 발명은 뱀 독 프로테아제 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 뱀 독 프로테아제 "키메라 또는 융합 단백질"은 비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드와 연결된 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드를 포함한다. "비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드"는 뱀 독 프로테아제 단백지롸 다르고 동일하거나 다른 유기체로부터 유도된 단백질과 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 융합 단백질의 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 뱀 독 프로테아제 아미노산 서열의 상기한 절편의 전부 또는 일부와 상응할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 뱀 독 프로테아제 융합 단백질은 뱀 독 프로테아제 단백질의 적어도 하나(또는 둘)의 생물학적으로 활성인 부분을 포함한다. 비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있다. 한 실시예에서, "비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드"는 뱀 독 프로테아제이외의 프로트롬빈 활성화 단백질의 프로-펩타이드(pro-peptide), 예를 들어, 포유류 인자 Xa, 예를 들어, 인간 인자 Xa의 프로펩타이드이다. 다른 실시예에서, "비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드"는 뱀 독 프로테아제이외의 프로트롬빈 활성화 단백질의 활성화 펩타이드, 예를 들어, 포유류 인자 Xa, 예를 들어, 인간 인자 Xa의 활성화 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 키메릭 또는 융합 폴리펩타이드는 "비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드", 예를 들어, 포유류 인자 Xa 폴리펩타이드, 예를 들어, 인간 인자 Xa 폴리펩타이드의 프로펩타이드 및 활성화 펩타이드를 포함한다.

융합 단백질은 리간드에 대한 높은 친화력을 가진 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 뱀 독 프로테아제 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST-뱀 독 프로테아제 융합 단백질일 수 있다. 이런 융합 단백질은 재조합 뱀 독 프로테아제의 정제를 용이하게 할 수 있다. 선택적으로, 융합 단백질은 이의 N-말단에서 이형 신호 서열을 포함하는 뱀 독 프로테아제 단백질일 수 있다. 일정한 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에서, 뱀 독 프로테아제의 발현 및/또는 분비가 이형 신호 서열을 사용하여 증가될 수 있다.

융합 단백질은 혈청 단백질, 예를 들어, IgG 불변 부위 또는 인간 혈청 알부민의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 뱀 독 프로테아제 융합 단백질은 약학적 조성물에 포함될 수 있고 생체내에서 피험자에게 투여될 수 있다. 뱀 독 프로테아제 융합 단백질은 뱀 독 프로테아제 기질의 생체이용율에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 뱀 독 프로테아제 융합 단백질은 피험자에서 항-뱀 독 프로테아제 항체를 만들어내고, 뱀 독 프로테아제 리간들 정제하고 검색 방법에서 뱀 독 프로테아제와 뱀 독 프로테아제 기질과의 상호작용을 막기 위해 면역원으로 사용될 수 있다.

발현 벡터는 이미 융합 모이어티(예를 들어, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 상업적으로 이용가능한 것이다. 뱀 독 프로테아제-암호화 핵산은 이런 발현 벡테에 복제될 수 있어 융합 모이어티는 뱀 독 프로테아제 단백질의 인-프레임(in-frame)으로 연결된다.

뱀 독 프로테아제 단백질의 변형체

다른 양태에서, 본 발명은 아고니스트(모방체) 또는 안타고니스트로 기능하는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 변형체를 특징으로 한다. 뱀 독 프로테아제 단백질의 변형체는 예를 들어, 불연속점 돌연변이와 같은 돌연변이, 서열의 삽입 또는 결실 또는 뱀 독 프로테아제 단백질의 절단에 의해 발생될 수 있다. 뱀 독 프로테아제 단백질의 아고니스트는 뱀 독 프로테아제 단백질의 천연적으로 발생하는 형태의 생물학적 활성의 실질적으로 동일 또는 하부세트를 보유할 수 있다. 뱀 독 프로테아제 단백질의 안타고니스트는 뱀 독 프로테아제 단백질의 뱀 독 프로테아제-중재 활성을 경쟁적으로 조절함으로써 뱀 독 프로테아제 단백질의 천연적으로 발생하는 형태의 하나 이상의 활성을 막을 수 있다. 따라서, 특정한 생물학적 효과는 제한된 기능의 변형체에 의한 치료로 유발될 수 있다.

N-말단, C-말단 또는 내부 절편과 같은 뱀 독 프로테아제 단백질 암호화 서열의 절편의 라이브러리는 뱀 독 프로테아제 단백질의 검색 및 변형체의 뒤이은 선택을 위한 반문상 군(variegate population)을 발생시키는데 사용될 수 있다. 시스테인 잔기가 첨가 또는 결실되고, 칼슘 결합 잔기, 예를 들어, 카복시글루탐산 잔기 또는 아르파리기닌이 첨가 또는 결실되거나 글리코실화된 잔기가 첨가 또는 결실되는 변형체가 특히 바람직하다.

점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전 산물을 검색하고 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 검색하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이런 방법들은 뱀 독 프로테아제 단백질의 재조합 돌연변이에 의해 발생된 유전자 라이브러리의 빠른 검색에 적합하다. 라이브러리의 기능성 돌연변이의 주기를 향상시키는 새로운 기술인 재발성 조화 돌연변이(REM)는 뱀 독 프로테아제 변형체를 동정하기 위해 검색 방법과 조합해서 사용될 수 있다(아르킨 및 유반(1992) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 89 7811-7815; 델그라브 등(1993) Protein Engineering 6:327-331).

다른 양태에서, 본 발명은 천연적으로 발생한 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 갖는 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 절편 또는 유사체를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드의 하나 이상의 잔기의 치환 또는 결실에 의한 서열의 변화, 예를 들어, 상기한 비-보존 부위 또는 도메인 또는 잔기의 서열을 변화시키는 단계 및 원하는 활성에 대해 변화된 폴리펩타이드를 검사하는 단계를 포함한다.

항-뱀 독 프로테아제 항체

다른 양태에서, 본 발명은 항-뱀 독 프로테아제 항체 또는 이의 절편(예를 들어, 이의 항원-결합 절편)을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 면역 글로불린 분자 또는 이의 면역학적 활성 부분, 즉 항원-결합 부분을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 중(H)사슬 변형 부위(VH) 및 적어도 하나 및 바람직하게는 두 개의 경(L)사슬 변형 부위(VL)를 포함하는 단백질을 의미한다. VH 및 VL 부위는 "프레임워크 부위"(FR)라 불리는 더욱 보존된 부위에 산재된 "보충성 결정 부위"("CDR")로 불리는 과변이(hypervariability)의 부위 속으로 더욱 세분화될 수 있다. 프레임워크 부위 및 CDR의 크기는 상세하게 정의되었다(본 명세서에 참고로 포함된 카바트, 이. 에이 등(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 및 초티아, 씨. 등(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 참조). VH 및 VL 각각은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다.

항-뱀 독 프로테아제 항체는 중사슬 및 경사슬 불변 부위를 더 포함하여, 각각 중면역글로블린 사슬과 경면역글로블린 사슬을 형성한다. 한 실시예에서, 항체는 2개의 중면역글로블린 사슬과 2개의 경면역글로블린 사슬의 사량체(tetramer)이고, 중 및 경면역글로블린 사슬은 이황화 결합에 의해 서로 결합된다. 중사슬 불변 부위는 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 경사슬 불변 부위는 1개의 도메인, CL로 이루어진다. 중사슬 및 경사슬의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 부위는 일반적으로 항체의 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 작동 세포) 및 전통적 보충 시스템의 제 1 성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 중재한다.

본 명세서에 사용된 "면역글로블린"이란 용어는 면역글로블린 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 의미한다. 인식된 인간 면역글로블린 유전자는 카파, 람다, 알파(IgA1 및 IgA2), 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 입실론 및 뮤 불변 부위뿐만 아니라 무수한 면역글로블린 가변 부위 유전자를 포함한다. 전장 면역글로블린 "경사슬"(약 25KDa 또는 214 아미노산)은 NH2-말단(약 110 아미노산)에서 가변 부위 유전자 및 COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 부위에 의해 암호화된다. 전장 면역글로블린 "중사슬"(약 50KDa 또는 446 아미노산)은 가변 부위 유전자(약 116 아미노산) 및 상기의 다른 불변 부위의 하나, 예를 들어, 감마(약 330 아미노산을 암호화)에 의해 유사하게 암호화된다.

본 명세서에 사용된 항체의 "항원-결합 절편"(또는 간단히 "항체 부분" 또는 "절편")이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 절편, 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드 또는 이의 절편을 의미한다. 항-뱀 독 프로테아제 항체의 항원-결합 절편의 예들은 (i) Fab 절편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 단가 절편; (ii) F(ab')2 절편, 힌지(hinge) 부위에 이황화 브리지에 의해 결합된 2개의 Fab 절편으로 이루어진 이량체 절편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 절편; (iv) 항체의 싱글 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 절편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 절편(워드 등 (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 보충성 결정 부위(CDR)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 비록 Fv 절편의 2개의 도메인, VL 및 VH이 분리된 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 단가 분자(단일 사슬 Fv(scFv); 버드 등(1988) Science 242:423-426; 및 허스튼 등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)를 형성하는 VL 및 VH 부위 쌍에서 이들을 단일 단백질 사슬로 제조할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이런 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 절편"이란 용어에 포함된다. 이들 항체 절편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술들을 사용하여 얻어지고, 절편은 접촉 항체와 같이 동일한 방식으로의 용도를 위해 검색된다.

항-뱀 독 프로테아제 항체는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 다른 실시예에서, 항체는 재조합하여 제조될 수 있는데, 예를 들어, 파아지 디스플레이(phage dispaly) 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.

항-뱀 독 프로테아제 항체를 발생시키기 위한 파아지 디스플레이 및 재조합 방법은 당업계에 공지되어 있다(본 명세서에 참고로 전문이 포함된 란더 등. 미국 특허 제 5,223,409호; 강 등 국제공개공보 WO 92/18619; 다우워 등 국제공개공보 WO 92/20791호; 마크랜드 등. 국제공개공보 WO 92/15679; 브레이트링 등. 국제공개공보 WO 93/01288; 맥카퍼티 등. 국제공개공보 WO 92/09690; 라드너 등. 국제공개공보 WO 90/02809; 푸치 등.(1991) Bio/Tehchnology 9:1370-1372; 하이 등.(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; 휴스 등.(1989) Science 246:1275-1281; 그리피스 등.(1993) EMBO J 12:725-734; 하우킨 등.(1992) J Mol Biol 226:889-896; 클락슨 등.(1991) Nature 352:624-628; 그람 등.(1992) PNAS 89:3576-3580; 가라드 등.(1991) Bio/Technology 19:1373-1377; 후겐붐 등(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 바르바스 등.(1991) PNAS 88:7978-7982 참조).

바람직한 실시예에서, 항체는 정제된 뱀 독 프로테아제 항원 또는 이의 절편, 예를 들어 본 명세서에서 기술된 절편, 조직, 예를 들어, 미가공 세포 제제, 전세포, 바람직하게는 생세포, 용해 세포 또는 세포 단편으로 면역화함으로써 제조될 수 있다.

전장 뱀 독 프로테아제 단백질 또는 뱀 독 프로테아제의 항원성 펩타이드 절편은 면역원으로 사용될 수 있거나 다른 면역원, 예를 들어, 세포, 막제제 등으로 제조된 항-뱀 독 프로테아제 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 뱀 독 프로테아제의 항원성 펩타이드는 SEQ ID NO:2, 5, 8, 11, 14 또는 17인 아미노산 서열의 적어도 8개 아미노산 잔기를 포함해야 하고 뱀 독 프로테아제의 에피토프를 포함해야 한다. 바람직하게는, 항원성 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 적어도 15개 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 항-뱀 독 프로테아제 항체는 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제의 부위, 도메인 또는 위치와 결합한다. 본 명세서에 기술된 부위들의 어느 것 또는 다른 부위 또는 도메인과 반응하거나 특이적인 항체가 제공된다.

오직 고유 뱀 독 프로테아제 단백질, 또는 비-고유 뱀 독 프로테아제 단백질과 결합하는 항체 또는 둘 다와 결합하는 항체가 본 발명에 포함된다. 선형 또는 입체적 에피토프를 가진 항체들이 본 발명에 포함된다. 입체적 에피토프는 때때로 변형된 뱀 독 프로테아제가 아닌 고유 뱀 독 프로테아제와 결합하는 항체들을 동정함으로서 동정될 수 있다.

항원성 펩타이드에 둘러싸인 바람직한 에피토프는 경사슬 또는 중사슬, 친수성 부위뿐만 아니라 높은 항원성을 가진 부위에 위치한 뱀 독 프로테아제의 부위이다.

바람직한 실시예에서, 항체들은 하나 이상의 정제된 항원, 조직, 예를 들어, 조직 섹션, 전세포, 바람직하게는 생세포, 융해 세포 또는 세포 단편과 결합될 수 있다.

항-뱀 독 프로테아제 항체는 단일 사슬 항체일 수 있다. 단일-사슬 항체(scFV)는 가공될 수 있다(예를 들어, 콜쳐, 디. 등(1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; 및 레이터, 와이.(1996) Clin Cancer Res 2:245-52). 단일 사슬 항체는 동일한 표적 뱀 독 프로테아제 단백질의 다른 에피토프에 대해 특이성을 가진 다가 항체를 발생시키는데 이합화 또는 다합화될 수 있다.

항체는 화합물, 예를 들어, 방사성 핵 또는 이미징 시약, 예를 들어, 방사성, 효소적 또는 다른, 예를 들어, 이미징 시약, 예를 들어, NMR 콘트라스트 시약과 같은 레이블과 결합할 수 있다. 탐지가능한 방사성 방출 또는 형광을 나타내는 레이블이 바람직하다.

항-뱀 독 프로테아제 항체(예를 들어, 단클론 항체)는 친화 크로마토그래피 또는 면역 침전과 같은 표준 기술들에 의해 뱀 독 프로테아제를 분리하는데 사용될 수 있다. 또한, 항-뱀 독 프로테아제 항체는 단백질의 발현의 풍부함 및 패턴을 평가하기 위해 뱀 독 프로테아제 단백질(예를 들어, 세포 상등액 또는 세포 상청액)을 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 항-뱀 독 프로테아제 항체들은 치료적 검사 방법의 일환으로 조직에서 뱀 독 프로테아제의 레벨을 진단적으로 관찰하는데 사용될 수 있다. 탐지는 항체를 탐지가능한 물질(즉, 항체 레이블링)과 결합(즉, 물리적 결합)함으로써 용이해진다. 탐지가능한 물질들의 예는 다양한 효소, 보결분자군, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적절한 효소들의 예는 호세라디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase), 알칼린 포스포타아제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 또는 아세틸콜린스테아라제(acetylcholinesterase)를 포함한다; 적절한 보결분자군 착물의 예는 스트렙타비딘/바이오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/바이오틴(avidine/biotin)을 포함한다; 적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 아이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 다이클로로트라이아지밀아민 플루오레세인(dichlorortriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함한다; 발광 물질의 예는 루미놀(luminol)을 포함한다; 생발광 물질의 예는 루시페라린 및 아귀오린, 및 적절한 방사성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H를 포함한다. 레이블은 발색단, 촉매, 효소, 형광발색단, 화학발광 분자, 유로퓸(Eu³⁴)과 같은 란타나이드 이온, 방사성 동이원소 및 직접 시각 레이블을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 직접 시각 라이블의 경우에, 콜로이드 금속성 또는 비금속성 입자, 염색 입자 또는 기질, 유기 고분자, 라텍스 입자, 리포솜 및 다른 기질 또는 신호 발생 물질을 포함하는 다른 소포로 제조될 수 있다.

레이블로 유용한 다수의 효소는 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제 4,366,241호, 미국 특허 제 4,843,300호 및 미국 특허 제4,849,338호에 기술되어 있다. 본 발명에 유용한 효소 레이블은 호세라디쉬 퍼록시다아제, 루시페론, β-갈락토시다아제, 글루코스 옥사다아제, 리소자임, 말레이트 디하이드로지나아제 등을 포함한다. 효소 레이블은 용액에서의 보조 효소와 조합해서 또는 단독으로 사용될 수 있다.

재조합 발현 벡터, 숙주 세포 및 유전적으로 처리된 세포

다른 양태에서, 본 발명은 벡터, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드 암호화 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 이것은 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하고 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스성 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 자동 복제를 할 수 있거나 숙주 DNA 속에 통합될 수 있다. 바이러스성 벡터는 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함한다.

벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적절한 형태로 벰 독 프로테아제 핵산을 포할할 수 있다. 바람직하게는 재조합 발현 벡터는 발현되는 핵산 서열에 연결되어 작동하는 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는 프로머터, 인핸서 및 다른 발현 제어 원소(예를 들어, 폴리아데실화 신호)를 포함한다. 조절 서열은 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 조직 특이적 조절 및/또는 유도성 서열의 구성 발현을 주도하는 것들을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 변형될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 레벨 등과 같은 인자에 의존할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 속에 유도될 수 있어 본 명세서에 기술된 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 뱀 독 프로테아제 단백질, 융합 단백질 등)를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 제조한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 뱀 독 프로테아제 단백질의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 대장균, 곤충 세포(예를 들어, 바쿨로바이러스(baculovirus)), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 고에델, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA에서 더 논의된다. 선택적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 생체내에서 전사 및 번역될 수 있다.

원핵 생물에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질 각각의 발현을 유발하는 구성 또는 유도 프로모터를 함유하는 벡터에 의해 대장균에서 가장 빈번이 수행될 수 있다. 융합 벡터는 여러 아미노산을 암호화된 단백질, 주로 재조합 단백질의 아미노산 말단에 첨가된다. 일반적으로 이런 융합 벡터는 3개의 목적: 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 것; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키는 것; 및 3) 친화 정제에서 리간드로서 작용함으로서 재조합 단백질의 정제에 도움을 주는 것을 수행한다. 주로, 단백질 분해 위치가 융합 모이어티와 재조합 단백질의 접합점에 유도되어 융합 단백질의 정제 후에 융합 모이어티로부터의 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이런 효소, 및 이들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔터로키나아제를 포함한다. 일반적인 유합 발현 벡터들은 글루타티온 S-트렌스페라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질을 표적 재조합 단백질과 융합시키는 pGEX(Pharmacia Biotec Inc; 스미스, 디. 베이. 및 존슨, 케이.에스(1988) Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 포함한다.

대장균에서 재조합 단백질의 발현을 최대화하는 것은 재조합 단백질을 단백질분해적으로 분해하는 손상된 능력을 가진 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시키는 것이다(코트스맨, 에스.(1990) Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 119-128). 다른 전략은 발현 벡터에 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변화시켜 각 아미노산에 대핸 개별 코돈이 대장균에서 바람직하게 사용되는 것들이 되게 하는 것이다(와다 등,(1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 발명의 핵산 서열의 이런 변형은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.

뱀 독 프로테아제 발현 벡터는 효모 발현 벡터, 곤충 세포에서의 발현을 위한 벡터, 예를 들어, 바큘로바이러스 발현 벡터 또는 포유류 세포에서의 발현에 적절한 벡터일 수 있다.

포유류 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 바이러스성 제어 성분에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터들은 폴리요마(polyoma), 아데노바이러스 2, 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus) 및 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40)으로부터 유도된다.

다른 실시예에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 예를 들어, 스테로이드 호르몬, 폴리펩타이드 호르몬(예를 들어, 신호 변환 경로의 의함) 또는 이형 폴리펩타이드(예를 들어, 테트라사이클린-유도성 시스템, "Tet-On" 및 "Tet-Off"; Clontehc Inc, CA, 고센 및 뷰자드(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, 및 필라드(1989) Human Gene Therapy 9:983)에 의해 제어되는 프로모터이다.

다른 실시예에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 타입에서 핵산의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 조직 특이적 제어 성분은 핵산을 발현하는데 사용된다). 적절한 조직-특이적 프로모터의 제한되지 않는 예는 알부민 프로모터(간-특이적; 핑커드 등(1987) Genes Dev. 1:268-277), 림프-특이적 프로모터(카라미 및 이톤(1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(윈노토 및 발티모어(1989) EMBO J 8:729-733) 및 면역글로블린(반너지 등(1983) Cell 33:729-740; 퀸 및 발티모어(1983) Cell 33:741-748), 뉴론-특이적 프로모터(예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; 바이린 및 루들(1989) Proc.Natl. Acad. Sci USA 86:5473-5477), 이자-특이적 프로모터(에들런드 등.(1985) Science 230:912-916), 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316호 및 유럽 특허 제 264, 166호)를 포함한다. 발육적으로 제어되는 프로모터는 예를 들어, 설치류-혹스(murine hox) 프로모터(케셀 및 구르스(1990) Science 249:374-379) 및 α-페토프로테인 프로모터(캠페스 및 틸그만(1989) Genes Dev 3:537-546)를 포함한다.

일부 실시예에서, 포유류 세포에서 사용될 때, 발현 벡터는 뱀 독 프로테아제 경사슬 및 중사슬의 발현 및 비-뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드, 예를 들어, 비-뱀 독 프로테아제 프로트롬빈 활성화 단백질, 예를 들어, 포유류 인자 X, 예를 들어, 인간 인자 X의 프로펩타이드 및/또는 활성화 펩타이드의 프로펩타이드 도메인 및/또는 활성화 펩타이드의 발현을 위해 제공될 수 있다.

본 발명은 안티센스 방향에서 발현 벡터 속에 복제된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 안티센스 방향에서 복제된 핵산에 연결되어 작동하는 조절 서열(예를 들어, 바이러스성 프로모터 및/또는 인핸서)은 여러 세포 타입에서 안티센스 RNA의 구조, 조직 특이적 또는 세포 타입 특이적 발현을 유도하도록 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 플라스미드, 파아지미드(phagemid) 또는 약화된 바이러스의 형태일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 핵산 분자, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내의 핵산 분자 또는 숙주 세포 게놈의 특정 위치 속에 균일하게 재조합되게 하는 서열을 함유하는 뱀 독 프로테아제 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 혼용한다. 이런 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손 도는 잠재적인 자손을 의미한다. 이런 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 사실, 이런 자손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본 명세서에 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.

숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 뱀 독 프로테아제 단백질은 박테리아 세포(대장균), 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포(중국 햄스터 난소 세포(CHO)) 또는 COS 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 CV-1 오리진 SV40 세포; 글루즈만(1981) Cell 123:175-182)) 속에 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당업자들에게 공지되어 있다.

벡터 DNA는 통상적인 트랜스포메이션(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection) 기술을 통해 숙주 세포로 유도될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "트랜스포메이션" 및 "트랜스펙션"이란 용어는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션(lipofection) 또는 일렉트로포레이션(electroporation)을 포함하는 숙주 세포 속에 외부 핵산(예를 들어, DNA)를 도입하는 여러 공지된 기술을 의미한다.

본 발명의 숙주 세포는 뱀 독 프로테아제를 생산(즉, 발현)하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 뱀 독 프로테아제 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제 단백질을 생산하는 방법을 더 제공한다. 한 실시예에서, 이 방법은 적절한 배지에서 (뱀 독 프로테아제 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 유도된)본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 뱀 독 프로테아제 단백질을 생산한다. 다른 실시예에서, 이 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 뱀 독 프로테아제 단백질을 분리하는 단계를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 인간 세포, 예를 들어, 대상 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 변형된 조혈줄기세포를 특징으로 한다.

정보과학

뱀 독 프로테아제의 서열은 이의 사용을 용이하게 하는 여러 배지에 제공된다. 단백질 또는 핵산과 반대로 기록된 서열은 제품으로 제공될 수 있다. 이런 제품은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열, 예를 들어, 이들이 천연 또는 정제된 형태로 존재하기 때문에 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 또는 이의 하부세트를 검사하는데 직접 적용할 수 없는 방법, 서열 분석 프로그램 또는 직접 검사를 사용하여 제조를 검사하게 하는 형태의 오픈 리딩 프레임인 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 제공할 수 있다. 서열 정보는 SVP 전장 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 잔기, 부분 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)를 ㅗ함하는 다형성 서열, 에피토프 또는 도메인 서열 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시예에서, 제조는 기계-판독가능 매체, 예를 들어, 자기적, 광학적, 화학적 또는 기계적 정보 저장 장치이다.

본 명세서에 사용된 "기계-판독가능 매체"라는 용어는 기계에 의해 직접 판독하거나 접근할 수 있는 임의의 매체, 예를 들어, 디지털 컴퓨터 또는 아날로그 컴퓨터를 의미한다. 컴퓨터의 제한되지 않은 예는 데스크탑 PC, 랩탑, 미니프레임, 서버(예를 들어, 웹 서버, 네트워크 서버 또는 서버 팜), 개인휴대정보단말기, 종이, 이동전화 등을 포함한다. 컴퓨터는 단독으로 사용하거나 통신 네트워크, 예를 들어, 근거리 네트워크(VPN 또는 인트라넷), 광거리 네트워크(엑스트라넷 또는 인터넷) 또는 전화 네트워크(무선, DSL, 또는 ISDN 네트워크)와 연결될 수 있다. 기계-판독가능 매체는 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프와 같은 자기적 저장 매체; CD-ROM과 같은 광학적 저장 매체; RAM, ROM, EPROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 등과 같은 전기적 저장 매체; 자기적/광학적 저장 매체의 혼합형을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 데이타 저장 구조를 본 발명의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 기록한 기계-판독가능 매체를 만드는 당업자가 사용할 수 있다. 일반적으로 데이타 저장 구조의 선택은 저장된 정보를 접근하는데 선택된 방법을 기초로 할 것이다. 또한, 다양한 데이타 처리 프로그램 및 포맷이 컴퓨터 판독가능 매체에 본 발명의 뉴클레오티드 서열 정보를 저장하는데 사용될 수 있다. 서열 정보는 워드페팩드 및 MS 워드와 같이 상업적으로 이용가능한 소프트웨어에 저장된 워드 프로세싱 텍스트 파일 또는 DB2, 사이베이스, 오라클 등과 같은 데이타베이스 장치에 저장된 ASCII 파일의 형태로 나타낼 수 있다. 당업자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능 매체를 얻기 위하여 여러 개의 데이타 프로세서 구조 형식(예를 들어, 텍스트 파일 또는 데이타베이스)를 쉽게 채택할 수 있다.

바람직한 실시예에서, 서열 정보는 관련 데이타베이스(사이베이스 또는 오라클)에 저장된다. 데이타베이스는 서열(핵산 및/또는 아미노산 서열) 정보를 저장하기 위한 제 1 표를 가질 수 있다. 서열 정보는 표 행의 한 필드(예를 들어, 첫번째 열)에 저장될 수 있고 서열의 식별자는 표 행의 다른 필드(예를 들어, 제 2 열)에 저장될 수 있다. 데이타베이스는 제 2 표, 예를 들어, 저장 주석을 가질 수 있다. 제 2 표는 서열 식별자를 위한 필드, 설명자 또는 주석 문서를 위한 필드(예를 들어, 설명자는 서열의 기능성을 의미할 수 있다), 주석이 의미하는 서열 내의 최초 위치를 위한 필드 및 주석이 의미하는 서열 내의 최종 위치를 위한 필드를 가질 수 있다. 아미노산 서열에 대한 주석의 제한되지 않는 예는 폴리펩타이드 도메인, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 도메인; 활성 위치 및 다른 기능성 아미노산; 및 변형 위치를 포함한다.

본 발명의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 컴퓨터 판독가능 형태로 제공함으로써, 당업자는 다양한 목적을 위해 서열 정보를 일상적으로 접근할 수 있다. 예를 들어, 한 당업자는 표적 서열 또는 표적 구조 모티프를 데이타베이스 저장 장치에 저장된 서열 정보와 비교해보기 위해 컴퓨터 판독가능 형태로 본 발명의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 특정 표적 서열 또는 표적 모티프와 일치하는 본 발명의 서열의 절편 또는 부위를 동정하는데 검색이 사용된다. 이 검색은 BLAST 검색 도는 다른 일상적인 서열 비교, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 검색일 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 SVP 서열을 분석, 예를 들어, 하나 이상의 다른 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 구조, 기능 또는 관련성을 분석하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 SVP 핵산 또는 아미노산 서열을 제공하는 단계; SVP 서열을 제 2 서열, 예를 들어, 서열의 집단, 예를 들어, SVP를 분석하기 위한 핵산 또는 단백질 서열 데이타베이스로부터 하나 이상의 바람직한 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 이 방법은 기계, 예를 들어, 컴퓨터로 수행되거나 당업자가 직접 수행할 수 있다.

이 방법은 SVP 서열과 제 2 서열, 예를 들어, 데이타베이스 서열 사이의 서열 동일성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 제 2 위치에서 데이타베이스를 접근, 예를 들어 인터넷을 통해 접근함으로써 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "표적 서열"이란 용어는 6개 이상의 뉴클레오티드 또는 2개 이상의 아미노산의 임의의 DNA 또는 아미노산 서열일 수 있다. 당업자는 표적 서열이 길면 길수록 표적 서열이 데이타베이스 내에서 무작위로 덜 존재할 것이라는 것을 쉽게 알 수 있다. 표적 서열의 일반적인 서열 길이는 약 10 내지 100 아미노산 도는 약 30 내지 300 뉴클레오티드 잔기이다. 그러나, 유전자 발현 및 단백질 처리에 관여되는 서열 절편과 같이 상업적으로 중요한 절편은 길이가 더 짧다는 것을 잘 알 것이다.

컴퓨터 소프트웨어는 당업자가 분석 및 다른 서열과의 비교를 위한 컴퓨터 판독가능 매체에 제공된 서열 정보에 접근하게 하도록 공개적으로 이용 가능하다. 다양한 공지된 알고리즘은 공개되어 있고 검색 장치를 작동시키는 다양한 상업적으로 이용가능한 소프트웨어가 본 발명의 컴퓨터-기초 시스템이고 이 시스템에 사용될 수 있다. 이런 소프트웨어의 예는 MacPattern(EMBL), BLASTN 및 BLASTX(NCBI)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명은 컴퓨터 판독가능 매트릭스 상에 서열을 레코딩하는 것을 포함하여 SVP 서열의 서열의 컴퓨터 판독가능 기록을 만드는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 실시예에서, 기록은 ORF의 동정; 도메인, 부위 또는 위치의 동정; 전사의 시작의 동정; 전사 종결자의 동정; 단백질의 전장 아미노산 서열 또는 이의 성숙한 형태; 번역된 부위의 5'말단의 하나 이상을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열을 분석하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 SVP 서열 또는 기계-판독가능 형태로 기록을 제공하는 단계; 제 2 서열을 SVP 서열과 비교하는 단계, 예를 들어 특정 모티프 또는 도메인이 존재 또는 부존재에 대한 SVP 서열의 분석하는 단계; 서열을 분석하는 단계를 포함한다. 비교는 서열 동일성에 대해 서열을 비교하는 단계 또는 한 서열이 다른 서열 내에 포함되어 있는 지를 결정, 예를 들어, SVP 서열이 비교되는 서열을 포함하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에서, SVP 또는 제 2 서열은 제 1 컴퓨터, 예를 들어, 제 1 위치에 저장되고 비교는 제 2 컴퓨터, 예를 들어, 제 2 부위에서 수행되고, 판독되거나 저장된다. 예를 들어, SVP 또는 제 2 서열은 한 컴퓨터의 대중 또는 개인 데이타베이스에 저장될 수 있고 비교의 결과는 제 2 컴퓨터에서 수행되고, 판독되거나 저장된다. 바람직한 실시예에서, 기록은 ORF의 동정; 도메인, 부위 또는 위치의 동정; 전사의 시작의 동정; 전사 종결자의 동정; 단백질의 전장 아미노산 서열 또는 이의 성숙한 형태; 번역된 부위의 5'말단의 하나 이상을 포함한다.

라이브러리

본 발명은 본 명세서에 기술된 뱀, 예를 들어, 브라운, 타이판 인랜드, 타이판 코스트, 레드 밸리, 타이거 또는 러프 스케일 스네이크의 하나로부터 유래된 핵산 또는 단백질의 라이브러리를 포함한다. 핵산 라이브러리는 게놈 또는 cDNA 라이브러리일 수 있다. cDNA 라이브러리는 특정 조직, 예를 들어, 독 샘 조직으로부터 유래될 수 있다. 라이브러리는 일반적으로 적어도 10², 10³, 10⁴, 10⁵ 또는 그 이상의 다양한 구성원을 포함할 것이다. 핵산 라이브러리 구성원은 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 유도성 발현 벡터 속에 삽입될 수 있다.

단백질 라이브러리 구성원은 다양한 방식, 예를 들어, 파아지 디스플레이 또는 세포 디스플레이 시스템으로 전시될 수 있다.

분석법 및 이의 용도

다른 양태에서, 본 발명은 여러 어드레스를 가진 기질을 포함하는 에레이를 특징으로 한다. 이 어레이는 핵산 어레이 또는 단백질 어레이일 수 있다. 핵산 어레이는 본 명세서에서 언급한 뱀의 하나 이상으로부터의 핵산 라이브러리를 전시할 것이다. 단백질 어레이는 본 명세서에서 언급한 뱀의 하나 이상으로부터의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 라이브러리의 구성원을 전시할 수 있다. 단백질 또는 핵산 구성원은 어레이 상에 동정가능한 어드레스에 위치한다. 어레이는 적어도 10, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000 또는 10,000 또는 그 이상의 어드레스/cm² 및 그 사이의 밀도를 가질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 여러 어드레스는 적어도 10, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000 어드레스를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 여러 어드레스는 10, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 또는 50,000 어드레스 또는 그 이하를 포함한다. 기판은 유리 슬라이드, 웨이퍼(예를 들어, 실리콘 또는 플라스틱), 질량 분석기 판과 같은 2차원 기판 도는 겔 패드와 같은 3차원 기판일 수 있다. 여러 어드레스 이외에 어드레스가 어레이 위에 배치될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 여러 어드레스의 적어도 하나는 핵산 라이브러리의 구성원, 예를 들어, 센스 또는 안티-센스 가닥과 특이적으로 잡종화하는 핵산 캡쳐 프로브를 포함한다. 한 바람직한 실시예에서, 여러 어드레스의 어드레스 하부세트는 핵산 라이브러리 구성원을 위한 핵산 캡쳐 프로브를 가진다. 하부세트의 각 어드레스는 라이브러리 구성원의 다른 부위와 잡종화하는 캡쳐 프로브를 포함할 수 있다.

어레이는 다양한 방법, 예를 들어, 사진석판법(미국 특허 제 5,143,854호; 5,510,270호; 및 5,527,681호 참조), 기계적 방법(미국 특허 제 5,384,261호에 기술된 직접-흐름 방법), 핀-기초 방법(미국 특허 제 5,288,514호) 및 비드-기초 기술(PCT US/93/04145)에 의해 발생될 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 여러 어드레스의 적어도 하나는 SVP 폴리펩타이드 또는 이의 절편과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 캡쳐 프로브를 포함한다. 폴리펩타이드는 SVP 폴리펩타이드의 천연적으로 발생하는 상호작용 파트너일 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 단클론 항체 또는 단일-사슬 항체와 같은 본 명세서에서 기술된 항체(상기의 "항-SVP 항체")이다.

약학적 조성물

본 발명은 본 발명의 뱀 독 프로테아제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 약학적 투여와 혼용가능한 용매, 확산 매체, 코팅, 항박테리아 및 항곰팡이제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이 담체는 설탕, 전분, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 맥아, 겔라틴, 활석, 황화칼슘, 식물유, 합성유, 폴리올, 알기니산, 인산염 버퍼 용액, 유화제, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 다른 분자량, 등장함염물 및 염산, 브롬산, 황산과 같은 미네랄 산염과 같은 염, 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트와 같은 유기산 및 발열원-제거수를 포함하는 한정되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 기술하는 유용한 참조문헌은 본 명세서에 참조로 포함된 리밍톤의 Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)이다. 보충 활성 화합물은 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 혈액 응고를 향상 또는 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 사용예는 수술 또는 손상 또는 외상 후와 같은 출혈 상처에 투여를 포함한다. 한 양태에서, 뱀 독 프로테아제 폴리펩타이드는 약학적 조성물에 존재하는 유일한 혈액-응고 성분이다. 본 발명의 약학적 조성물의 한 장점은 혈액 응고가 보조 인자와 같은 여러 성분의 연속적 또는 조합적 작용에 대한 요구 없이 빠르게 발생한다는 것이다. 예를 들어, 칼슘 이온, 인자 Va 및 인지질과 같은 추가 성분이 필요하지 않다. 따라서, 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 칼슘, 인지질, 인자 Va 또는 비타민 K의 어느 것과 같은 임의의 보조 인자가 포함되지 않는다. 다른 실시예에서, 약학적 조성물은 칼슘, 인지질 및 인자 Va의 전부가 아닌 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 약학적 조성물은 추가의 성분 또는 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 항생제, 항바이러스 작용제 및 항곰팡이 작용제, 항기생충제, 항염증제, 항히스타민제, 항-박테리아제, 항섬유소용해제(antifibrolytic agent)와 같은 항균제 및 성장 인자의 하나 이상을 포함할 수 있다. 항생물질의 예는 테트라사이클린(tetracycline), 사이프로플록사신(ciprofloxacin), 젠타마이신(gentamycin), 사이클로스포린 세포타심(cyclosporin cefotaxim) 등을 포함한다. 항바이러스제의 예는 강사이클로비르(gangcyclovir), 지도부딘(zidovudine), 아만티딘(amantidine), 비다라빈(vidaravbine), 리바라빈(ribaravin), 트라이플루리딘(trifluridine), 아실클로비르(acyclovir), 디데옥시유리딘(dideoxyuridine) 등을 포함한다. 항곰팡이제는 다이플루칸(diflucan), 케타코니졸(ketaconizole), 나이스타틴(nystatin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 펜타미딘과 같은 항기생충제가 포함될 수 있다. 조성물은 I-1-항-트립신, I-1-항키모트립신 등과 같은 항염증제를 더 포함한다. 조성물 내에 포함될 수 있는 성장 인자의 예는 안지오케닌스(angiogenins); 엔도티린스(endothelins); 헤파토사이트(hepatocyte) 성장 인자 및 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자, 피브로블라스트 성장 인자-1(FGF-1), 피브로블라스트 성장 인자-2(FGF-2), 및 피브로블라스트 성장 인자-4(FGF-4)를 포함하는 피브로블라스트 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자(PDGF); 인슐린-결합 성장 인자-1 및 인슐린-결합 성장 인자-2를 포함하는 인슐린-결합 성장 인자(IGF); 표피성 성장 인자(EGF); 변형 성장 인자-1 및 변형 성장 인자-9를 포함하는 변형 성장 인자(TGF); CIP-A 및 CIP-B를 포함하는 연골-유도 인자(CIF); 골-유도 인자(OIF); 오스테오거닌(osteogenin) 및 다른 골 성장 인자; BMP-1 및 BMP-2를 포함하는 골형성 성장 인자(BMP); 콜라겐 성장 인자; 헤파린-결합 성장 인자-1 및 헤파린-결합 성장 인자-2를 포함하는 헤파린-결합 성장 인자; 시토키닌; 인터페론; 호르몬을 더 포함한다. 조성물에 포함될 수 있는 다른 화합물은 아드레날린과 같은 혈관수축제 또는 국부 마취제와 같은 마취제를 포함한다.

약학적 조성물은 뱀 독 프로테아제의 자동 소화를 감소시키는 뱀 독 프로테아제의 안정성을 향상시키도록 제제화될 수 있다. 뱀 독 프로테아제의 안정성은 약 5 내지 9, 바람직하게는 약 6.5 내지 7의 pH를 갖는 약학적 조성물에 뱀 독 프로테아제를 제공하도록 제조함으로써 향상될 수 있다. 뱀 독 프로테아제의 안정성은 폴리올과 같은 안정제를 더 포함하는 약학적 조성물에 뱀 독 프로테아제를 제공함으로써 안정화될 수 있다. 이런 실시예에서, 약학적 조성물은 약 5%, 10%, 20% 또는 그 이상의 폴리올을 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 사용될 수 있는 폴리올의 예는 글리세롤이다. 다른 양태에서, 뱀 독 프로테아제의 안정성은 결정화되고, 냉동 건조 또는 동결 건조 형태로 뱀 독 프로테아제를 제공함으로써 증가될 수 있다. 만일 조성물이 응고되면, 조성물은 사용하기 전에 해동시켜야 한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 뱀 독 프로테아제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제를 포함하고 약 5 내지 9의 pH, 바람직하게는 약 6.5 내지 7의 pH를 갖는 조성물을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제를 포함하고 폴리올인 글리세롤과 같은 안정화제를 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 폴리올은 약 5%, 10%, 또는 20%로 존재할 수 있다.

뱀 독 프로테아제를 포함하는 조성물의 복용량은 뱀 독 프로테아제의 특정한 용도에 의존하나, 복용량은 조성물이 의도된 용도로 사용되는데 유효한 양이어야 한다. 세포 배양 분석법으로 얻은 데이타 및 동물 연구는 인간에 사용하기 위한 복용량의 범위를 만드는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 수용액인 뱀 독 프로테아제를 포함하는 조성물의 경우, 이런 조성물의 약 1ml 내지 약 50ml가 피브린 덩어리 형성을 증가시키는데 충분하다고 생각된다. 그러나, 조성물의 용도에 따라, 복용량은 약 1ml 내지 약 200ml의 범위일 수 있다.

일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 상처, 외과 절개 또는 혈액 손실을 예방해야 하는 상황에 국부적으로 투여된다. 이를 위해서, 붕대, 패치, 거즈, 외과용 테이프, 면봉 또는 다른 흡수 물질 또는 지지체가 국부 투여를 위해 본 발명의 뱀 독 프로테아제를 포함하는 조성물로 코팅, 침지 또는 화학적으로 결합될 수 있다. 또한 약학적 조성물의 피브린 풀 또는 외과용 봉합제의 형태도 고려된다. 본 발명의 조성물은 복강경 또는 외과 또는 외상적 상처 폐쇄를 위해 크림, 로션, 겔, 스프레이 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 국부 투여는 이런 활용 중에서 바람직하다. 또한, 봉합사 및 뱀 독 프로테아제를 포함하는 조성물과 코팅 또는 화학적으로 결합된 스테이플이 사용될 수 있다.

약학적 조성물은 투여를 위한 장치와 함께 컨테이너, 팩 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.

항섬유소용해제가 국제공개공보 WO 99/58569에 기술된 텍스틸리닌, 아프로티닌 및 EACA와 같은 조직 플라스미노겐 활성제의 작용을 통한 혈액 덩어리의 용해를 방지하기 위해 첨가될 수 있다.

또한 본 발명의 범위에 본 명세서에서 기술된 뱀 독 프로테아제 또는 이의 부분을 포함하는 키트가 포함된다. 이 키트는 사용 지침; 하나 이상의 보조 인자와 같은 다른 시약(예를 들어, 하나 이상의 칼슘, 인지질 및 인자 Va) 및/또는 다른 치료제(예를 들어, 하나 이상의 항생제, 항바이러스 작용제 및 항곰팡이 작용제, 항기생충제, 항염증제, 항히스타민제, 항-박테리아제, 항섬유소용해제와 같은 항균제 및 성장 인자); 희석제; 장치, 예를 들어, 컨테이너, 예를 들어, 살균 컨테이너 또는 투여를 위한 뱀 독 프로테아제를 제조하기 위한 다른 물질; 약학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 안정제); 및 장치 또는 피험자에게 투여하기 위한 다른 재료(예를 들어, 주사기, 도포 주걱, 붕대, 스프레이 또는 에어로졸 장치)를 포함하는 하나 이상의 다른 원소들을 포함할 수 있다. 지침은 제안된 복용량 및/또는 투여 형태, 예를 들어, 피험자의 외부 및/또는 내부 출혈을 포함하는 치료적 활용에 대한 지침을 포함할 수 있다. 일부 활용에서, 뱀 독 프로테아제는 다른 성분, 예를 들어, 하나 이상의 보조 인자와 투여 전에 반응될 것이다. 다른 활용에서, 뱀 독 프로테아제는 다른 구성성분, 예를 들어, 하나 이상의 보조 인자와 조합하여 투여될 수 있고 키트는 뱀 독 프로테아제 및 다른 구성성분의 투여 양, 복용량 및 시기에 대한 지침을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 뱀 독 프로테아제는 동결 건조 또는 응고 건조 형태로 공급될 수 있다. 이런 실시예에서, 키트는 해동 및/또는 가수분해에 대한 지침 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 희석제 또는 희석제의 예측된 양에 대한 지침을 포함할 수 있다.

용도

본 발명의 뱀 독 프로테아제는 프로트롬빈을 트롬빈으로 처리하여 프로트롬빈을 효과적으로 활성화시키는 것으로 발견되었다. 트롬빈은 피브린을 생성하기 위해 피브리노겐을 절단하는 세린 프로테아제이고 피브린 모노머들 사이의 상호작용을 안정화하여 덩어리 형성을 향상시키기 위해 인자 V, VIII 및 XIII를 포함하는 여러 혈액 인자에 대해 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제를 투여함으로써 프로트롬빈을 활성화하고 상처 치유를 증가시키는 벙법을 특징으로 한다. 이 방법은 피브린 덩어리 형성을 증가 또는 향상시키는데 유효량을 피험자의 바람직한 위치에 뱀 독 프로테아제를 투여하는 단계를 포함하여, 덩어리 형성의 증가 및/또는 혈액 또는 유체 손실을 감소시킨다. "바람직한 위치"라는 용어는 피브린 덩어리의 형성이 바람직한 위치를 의미한다. 조성물은 상처 또는 다른 조직 또는 다른 바람직한 위치에 직접 도포될 수 있다. 일반적으로 외상의 경우, 상처에 분사하는 것을 포함하는 임의의 방법에 의해 직접 도포될 수 있다. 또한 외과 수술 동안과 같이 내부적으로 도포될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 피험자는 포유류, 예를 들어, 인간이다. 본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제가 혈액으로부터 얻은 것이 아니기 때문에, 혈액의 구성성분으로부터 얻은 봉합제, 접착제 및 지혈제에서 발견될 수 있는 혈액 유발 병원균 또는 다른 감염제들의 위험에 관한 염려는 감소된다.

본 명세서에 기술된 뱀 독 프로테아제를 포함하는 뱀 독 프로테아제 및 조성물은 외과용 봉합제, 접착제(예를 들어, 국부적 또는 외과용 접착제) 또는 지혈제를 포함하는 다양한 활용에서 사용될 수 있다.

본 발명의 방법, 키트 또는 약학적 조성물은 예를 들어, 조직 또는 기관을 연결하고, 출혈을 멈추게 하거나 감소시키고, 출혈을 예방 또는 억제하고, 상처를 치유하고 및/또는 상처를 봉합하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법, 키트 및 약학적 조성물은 신경계 수술; 코, 입 또는 인두 수술; 호흡계 수술; 심혈관계 수술; 혈액 또는 림프계 수술; 소화계 수술; 비뇨계 수술; 재생계 수술; 근골격계 수술; 피부계 수술; 성형 수술; 정형외과 수술; 및 이식 수술을 포함하는 다양한 외과적 환경에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 뱀 독 프로테아제는 말초 관상 동맥 문합의 바늘 구멍 출혈; 좌심실 봉합 라인; 대동맥절개술 및 도관술 위치; 재수술시 나타나는 분산 축옆 출혈; 동맥, 대정맥 또는 우심실과 같은 정맥혈 출혈 부위로부터의 분비에 지혈을 제공하는 것을 포함하여 혈관계 수술에 사용될 수 있다. 본 발명은 신체 외부의 조직을 이식, 봉합하기 전에 데이크론 동맥 조직편의 봉합, 손상된 비장, 간 및 다른 실질 기관(parenchymatous organ)으로부터의 출혈 멈춤(기관을 구함); 기관 및 기관지 문합술 및 폐의 공기 유출 또는 열상의 봉합; 기관지 토막, 기관지 구멍 및 식도 구멍의 봉합; 및 무봉합 무흉터 치료("집퍼" 기술)에 유용하다. 본 발명은 각막 이식, 코피, 편도선수술후(post tonsillectomies), 치아 뽑기 및 다른 활용에 지혈을 제공하는데 더 유용하다. 쥐. 에프. 게스트링 및 알. 레머; Vascular Surgery, 294-304, 1983 9/10 참조. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 혈우병(예를 들어, 혈우병 A 및 혈우병 B)과 같은 응고 결함을 가진 사람에게 특히 적합하다.

인자 Xa 및 트로카린과는 다르게, 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 데스카복시프로트롬빈을 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 데스카복시프로트롬빈은 코우마딘(coumadin)과 같은 항응고제로 치료된 피험자에게 발견된다. 따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 약학적 조성물은 프로트롬빈을 활성화하고 코우마딘과 같은 항응고제로 치료된 피험자에 지혈을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 코우마딘 치료를 억제 또는 감소시킬 필요가 없는 수술 또는 외상인 피험자들에게 사용될 수 있다.

상기한대로, 뱀 독 프로테아제는 상처 드레싱, 붕대, 패치, 거즈, 외과용 테이프, 면봉 또는 다른 흡수 재료 또는 지지체의 일부로 제제화될 수 있다. 드레싱과 붕대는 사용에 전문 지식이나 기술이 필요없이 쉽게 사용할 수 있다. 이들은 응급 처치로 혼자서 사용할 수 있다. 이런 상처 드레싱 및 붕대는 군인, 구조요원, 구급/위생팀, 소방관 및 병원 및 의원 응급실 특히 재해 상황에서의 초기 외상 및 응급 처치와 같은 다양한 분야의 활용에서 사용될 수 있다. 이런 드레싱은 일반 대중 또는 의사에 의해 사용되는 응급 처치 키트에 유용성을 가질 수 있다. 상처 드레싱 또는 붕대를 함유하는 뱀 독 프로테아제는 칼슘, 인지질, 안정화제 또는 본 명세서에 기술된 것과 같은 다른 화합물 또는 물질의 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상처 드레싱 또는 붕대는 진통제, 항바이러스제, 항곰팡이제, 항기생충제, 항염증제, 항히스타민제, 항섬유소용해제 및 성장 인자를 더 포함할 수 있다.

뱀 독 프로테아제 이외의 하나 이상의 화합물이 조성물에 첨가될 수 있고, 동시에 배출되거나 각각이 예정된 시간-배출 방식으로 배출될 수 있다. 조성물에 추가된 추가 화합물(또는 화합물들)이 농축되어 첨가되고 의도된 목적, 예를 들어, 항생제가 병원균의 성장을 억제하고, 진통제가 통증을 완화하는 등에 효과적일 것이다. 일부 실시예에서, 드레싱 또는 붕대는 접착층 및/또는 보강층을 포함할 수 있다. 드레싱 또는 붕대의 보강은 통상적이고, 재흡수되지 않은 재료, 예를 들어, 실리콘 패치 또는 플라스틱 재료일 수 있고; 또는 생체적합하고, 재흡수가능한 재료, 예를 들어, 키틴질 또는 이의 유도체일 수 있다.

외과용 봉합체 또는 외과용 접착제로서 사용하기 위한 다른 활용을 위해서, 약학적 조성물은 피브린 풀의 형태일 수 있거나 크림, 로션, 겔, 스프레이, 폼(foam) 또는 에어로졸의 형태일 수 있는 외과용 봉합제일 수 있다. 폼, 스프레이 및 에어로졸의 경우, 조성물은 압축된 추진체를 가진 깡통 또는 탱크에 저장될 수 있어서, 구성성분은 확장되는 발포 또는 스프레이로서 상처 위치에 전달된다. 바람직한 실시예에서, 스프레이, 발포 또는 에어로졸은 계량된 양으로 제공된다. 이런 실시예에서, 방법은 피험자에게 계량된 양으로 스프레이, 에어로졸 또는 폼을 제공하는 단계 및 스프레이, 에어로졸 또는 폼을 피험자에게 투여하기 위한 지침을 제공하는 단계를 포함한다. 이 지침은 자가 투여 또는 타인 투여일 수 있다.

비록 조성물이 덩어리를 형성하는 속도는, 예를 들어 동맥 상처 및 출혈 조직 손상에 대한 빠른 설정, 뼈 조직에 대한 상처 치료의 느린 설정과 같은 활용에 의해 어느 정도 예상할 수 있다.

바람직하게는, 도포 후 10분 내에 응고되는 것은 분명하다. 가장 바람직하게는, 도포 후 2 내지 8분 내에 응고되는 것이 분명해질 것이다.

본 발명은 하기의 예들로 더 예시되어 있으나, 제한되는 것으로 이해해서는 않된다. 본 출원을 통해서 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허출원들의 내용은 본 명세서에서 참조로 합체되어 있다.

실시예

재료 및 방법

재료

본 명세서에서 참조로 합체된, 마스키 등(Masci et al. 1988, Biochem. Int. 17 825)의 논문에 기술한 바와 같은 방법으로 브라운 스네이크(Brown Snake)의 독(毒) 프로테아제 착체를 제조하였다. 프로트롬빈 활성제 4㎎/㎖를 -20℃의 50% 글리세롤에 저장하였다. 스웨덴의 웁살라(Uppsala)에 있는 아머샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech.) 사(社)로부터 세파크릴(sephacryl) S-300을 구하였고, 스웨덴의 스톡홀름에 있는 크로모제넥스(Chromogenex.) 사(社)로부터 합성 발색기질(synthetic chromogenic substrates) S-2222를 구하였다. 프린세스 알렉산드라(Princess Alexandra) 병원 혈액은행에서 구매한 정상적인, 바이러스에 걸리지 않은 지원자로부터 기한이 넘은 시트레이트 플라즈마(citrated plasma)를 구하였다. 미국의 햄톤 연구소(Hampton Research)로부터 햄톤 1 및 2 스크린 키트(screen kit)를 구하였다. 영국의 에머랄드 바이오스트럭쳐(Emerald Biostructures) 사(社)로부터 위저드(Wisard) 1 및 2 스크린 키트를 구하였다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 정화

콘 에이-세파로즈 4B(ConA-Sepharose 4B)

피. 텍스틸리스(P. textilis)- 뱀 독 프로테아제의 정화에서 제 1 단계는 상기 마스키 등(Masci et al. 1988)의 논문에 기술한 바와 같은 천연의 독으로부터 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체를 분리하는 것이었다. 콘 에이-세파로즈 4B를 2.5×16㎝ 컬럼에 실장하였고, 제조회사가 추천한 바와 같이 세척하였으며, 스타팅 버퍼(0.05M Tris-HCl, pH 7.4)로 평형을 맞추었다. P. textilis 독(건조 중량 233㎎)을 10㎖의 스타팅 버퍼에 다시 만들고 용해될 때까지 37℃ 수조에 두었다. 샘플을 컬럼에 넣고 기저선(baseline)이 0으로 복귀할 때까지 컬럼 버퍼로 세척하였다. 콘 에이-세파로즈 4B로부터 결합 단백질(브라운 스네이크 독 프로테아제 착체)을 용출하기 위해 용출버퍼(0.05M Tris-HCl에 0.02M 메틸 알파-디 만노피라노시드(methyl α-D mannopyranoside))를 컬럼에 사용하였다. 컬럼의 유속은 52㎖/hr였다. 0.32 및 0.64 AUFS(absorbance unit full scale)의 감쇠를 갖는 UV 2파장 검출기를 280㎚로 설정하였다. S-2222 가수분해 작용(hydrolytic activity)을 갖는 비율로 풀(pool)시켰고 유속이 48㎖/hr인 YM3 막(membrane)을 갖는 아미콘 농축기(Amicon concentrator)에 농축시켰다. 정화된 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체를 -20℃의 50% 글리세롤에 저장하였다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체로부터 브라운 스네이크 독 프로테아제의 정화

세파크릴 S-300 크로마토그래피

제조회사가 추천한 바와 같이 세파크릴 S-300 크로마토그래피 젤을 세척하였다. 세파크릴 S-300의 87㎝×2.5㎝ 컬럼을 6℃로 실장하였고, 스타팅 버퍼(0.05M Tris-HCl, pH 7.4)로 평형을 맞춘 후, 샘플의 적용 전에 0.8M NaSCN으로 동일한 버퍼의 2개 컬럼 용량으로 평형을 맞추었다. 4㎎/㎖ 프로트롬빈 활성제 10㎖와 1.6M NaSCN 10㎖를 10분간 배양한 후 컬럼에 올렸다. 40㎖/hr의 유속을 제공하기 위해, 길손 유량자동제어펌프(Gilson peristaltic pump)를 자주색/검은색 챔버와 함께 설치하였다. 1㎝/hr의 속도로 설정된 콜 팔머(Cole Palmer) 2 펜 차트 레코더(pen chart recorder)와 함께, 0.32 AUFS의 감쇠를 갖는 A₂₈₀으로 설정된 알텍스(Altex) UV 2파장 검출기를 사용하였다. 초기에, 10min/tube의 시간간격의 시간 베이스를 사용하여 단편들(fractions)을 수집한 후, 12min/tube로 바꾸어서, LKB 7000 단편 수집기를 사용하여, 각각 6.5 및 8㎖ 단편들을 제공하였다. 상술한 바와 같이, 가수분해 작용을 갖는 단편들을 평가하기 위해 발색분석을 수행하였으며, 상기 단편들은 YM3 막을 갖는 모델 42의 아미콘 농축기에 풀되고 농축되었다. 이 절차를 3회 반복하였다.

슈퍼덱스(Superdex) 200 젤 크로마토그래피

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체로 부터 프로테아제를 정화시키기 위해 슈퍼덱스 200의 고해상도 젤 크로마토그래피를 또한 사용하였다. 제조회사가 추천한 바와 같이 슈퍼덱스 200을 세척하였고, 2.5㎝×90㎝ 컬럼에 실장하였으며, 컬럼버퍼(0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.8 M NaSCN)로 평형을 맞추었다. 5.6㎎/㎖ 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 9㎖와 1.6M NaSCN 9㎖를 포함한 용액을 30분간 배양한 후, 컬럼에 올렸다. 유속은 48㎖/hr였다. 280㎚의 파장 검출기의 감쇠는 0.32 또는 0.64 AUFS였다. S-2222 활성을 갖는 단편들을 YM3 막을 갖는 모델 42의 아미콘 농축기에 풀시키고 농축시켰다. 그런 후, 동일한 컬럼상에 풀된 농축 샘플(5㎖)을 재크로마토그래피하였다. 용액으로부터 NaSCN을 제거하기 위해 0.05M Tris-Hcl, pH 7.4에 상기 최종 프로테아제 조제물을 하루동안 투석시켰다. 이 (-20℃의 10% 글리세롤/Tris 버퍼에 저장된) 조제물을 모든 기능적 및 구조적 특성 연구에 사용하였다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)

6000A 이중 피스톤 펌프와 M45A 펌프, A₂₈₀㎚로 설정된 490 파장 검출기 및 위스프 샘플 인젝터(Wisp sample injector)와 페모네넥스 쥬피터(Phemonenex Jupiter) C₁₈-컬럼(KHO-4151)(1.4㎜×250㎜)으로 구성된 워트(Water)(TM) 시스템을 사용하여, 역위상 HPLC를 25℃에서 실행하였다. (A)증류수에 0.1% TFA와 (B)80% 아세토니트릴(acetonitrile)로 (A)에 용출된 스타팅 용액으로 60분에 걸쳐 선형 그래디언트 모드(linear gradient mode)를 사용하여 크로마토그래피를 실행하였다. 시스템을 관리하고 데이터를 통합하기 위해 워터 밀레니엄 버젼 1.01 소프트웨어를 사용하였다.

소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PAGE)

래어늘리의 논문(Laernlli, 1970, Nature 227, 680)에 기술된 바와 같이 SDS PAGE를 필연적으로 실행하였다. β-메캅토에탄올(β-Me)의 유무상태에서 SDS-PAGE 샘플을 SDS 샘플 버퍼에 10분간 끓였다. 젤을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였고 메탄올, 아세트산 및 물(45:10:45)로 탈색하였다.

N-말단 아미노산 서열화(N-terminus amino acid sequencing)

에드먼 감성법(Edman degradation method)을 사용하여 시퀀싱을 실행하였다. 브라운 스테이크 독 세린 프로테아제를 서열화하기 위해 어플라이드 바이오시스템 프로신(Applied Biosystem Procine) 492cLC 프로틴 서열화 시스템을 사용하였다. 어플라이드 바이오시스템사의 매뉴얼 장비의 세부설명을 위한 개정판 D의 파트 제904 244를 참조하라. 그런 후, 연구원들은 파충류 세린 프로테아제와 인자 Xa 및 티. 카리나투스(T.carinatus) 인자 Xa-유사 세린 프로테아제 사이의 서열 상동성(homology)을 동정하기 위해 ExPAsy/NCBI 블라스트(blast)를 사용하여 실행되었다.

제 1 스트랜드 cDNA 합성 및 cDNA 말단들의 증폭

cDNA 합성을 위해 뱀의 독분비선(snake gland)으부터 분리된 토탈(total) RNA 1㎍을 사용하였다. 5'RACE-Ready cDNA의 제조를 위해, SMART RACE cDNA 증폭 키트로부터 5'-CDS[5'-(T)₂₅N_-1N-3'; N = A, C, G 또는 T; N_-1 = A, G, 또는 C][SEQ ID NO:32] 및 SMART Ⅱ A 올리고머[5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'][SEQ ID NO:33] 프라이머를 사용하였고, 3'RACE-Ready cDNA의 제조를 위해, 동일한 키트로부터 3'-CDS 프라이머 A[5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀N_-1N-3'; N = A, C, G 또는 T; N_-1 = A, G, 또는 C][SEQ ID NO:34]와 파워스크립터(PowerScript) 역전사 효소(reverse transcriptase)를 사용하였다. cDNA 모두는 물 100㎕를 더하여 희석시켰고 사용자 매뉴얼(SMART RACE cDNA 증폭키트, 클론텍사(社))에 설명된 프로토콜에 따라 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)법을 사용하였다.

3'RACE PCR에 대해: 3'RACE cDNA는 UPM[유니버셜 프라이머 믹스(Universal Primer Mix) A 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(장(long)[SEQ ID NO:35]와 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(단(short))[SEQ ID NO:36]을 사용하였고, N말단 아미노산 서열 IVNGMD를 기초로 한 GSP-2(포워드) 프라이머[AAYGGWATGGAYTGYAA; Y=C+T, W=A+T][SEQ ID NO:37]를 변형시켰다. 반응을 촉발하기 위해 어드밴티지 2 폴리머라제 믹스(Advantage 2 Polymerase Mix, 클론텍사(社))를 사용하였다. 열 싸이클에서: 1 싸이클은 95℃에서 1분; 25 싸이클은 95℃에서 30초, 65℃에서 1분, 68℃에서 3분; 1 싸이클은 68℃에서 3분이다. QIA 빠른 젤 추출기 키트(QIA quick Gel Extraction Kit, 퀴아겐(Qiagen)사(社))를 사용하여 젤로부터 주 PCR 생성물(1.5kbp)을 분리시켰고, pGEN-T 이지 벡터(Easy Vector)에 클론시켰다. 35 콜로니(colonies)로부터 콜로니 미니프렙(colony minipreps)을 스크린한 후에 QIA프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)(퀴아겐사(社))를 사용하여 분리시켰다.

DNA 시퀀싱

pGEN-T 이지 벡터(GTTTTCCCAGTCACGAC)[SEQ ID NO:38]에 대한 포워드 프라이머(forward primer)와 빅다이(BigDye) 종료자(terminator)를 사용하여 DNA 시퀀싱을 실행하였다. ca 500bp내의 정지코돈(stop codon)을 포함하지 않는 2개의 클론만이 발견되었다. 이들 클론들을 For2 프라이머(ATCGTTAGTGGATTTGG)[SEQ ID NO:39]로 서열화하였다. 정지코돈을 발견하였다. 이들 2개 클론의 전체 서열은 유사했으며, GSP-2로부터 제 1 정지코돈까지 3'DNA의 길이는 776bp였다.

3'cDNA 서열을 사용하여, 리버스 프라이머(reverse primer) GSP-1(GAAATCGTCTCGGTCTCATTA)[SEQ ID NO:40]를 설계했다. 5'RACE PCR에 대해, 5'cDNA, UPM(상기 참조), GSP-1 및 어드밴티지 2 폴리머라제 믹스(클론텍사)를 사용하였다. PCR조건은 3'RACE PCR과 동일했다. 주 PCR 생성물(1kbp)을 분리하였고 pGEN-T 이지 벡터에서 클론시켰다. 시퀀싱을 위해 선택된 15개의 클론들로부터 6개는 동일했으며, 정지코돈을 포함하지 않았다. 2개의 시퀀싱 프라이머, 즉, pGEN-T 이지 벡터에 대한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 GSP-1을 사용하였다. 6개의 클론들 모두는 ATG를 포함하였고 시작부터 GSP-2 프라이머 서열에 해당하는 위치까지 628bp였다. 전장(全長) cDNA용의 포워드 프라이머(SE(포워드) ATGGCTCCTCAACTACTCCTCTG[SEQ ID NO:41] 및 리버스 프라이머(SE(리버스) TTAGAGCCGACCAGTGCTTGACTC[SEQ ID NO:42]를 설계하기 위해 3' 및 5'cDNA 서열을 사용하였다. 시퀀싱하기 위해 PCR 생성물(1,407bp)을 pGEN-T 이지 벡터에서 클론시켰다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 대한 발색 프로트롬빈 활성분석

S-2222 가수분해 대 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 또는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 비에 대한 기준곡선을 얻기 위해 일련의 분석을 수행하였다. 0.05M Tris-HCl, pH 7.4에 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(4㎎/㎖)와 1/10에서 1/10,000까지 변하는 프로테아제(1㎎/㎖)의 각각의 희석제를 제조하고 얼음에 저장하였다.

S-2222상의 P. textilis 세린(serine) 프로테아제 또는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 가수분해 작용은 25℃의 히타치(Hitachi) 557 분광광도계(spectrophotometer)의 1㎖ 셀에 10mM CaCl₂와 3.0mM S-2222 50㎕가 있거나 없는 0.05M Tris-HCl 버퍼, pH 7.4의 0.93㎖ 평형에 의해 결정된다. 프로테아제(0.4㎎/㎖)의 가변농도 20㎕를 추가함으로써 반응을 개시하였다. 405㎚에서 p-니트로아닐린(nitroanniline)의 방출을 감시하였다. 0, 1, 2, 5 및 10분의 시간간격으로 0.8M NaSCN, S-2222 50㎕ 및 0.4㎎/㎖ 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 40㎕를 포함하는 0.05M Tris-HCl 버퍼, pH 7.4의 0.91㎖의 분석을 수행하였다. 작용의 한 유닛은 기질/min의 1μ몰의 가수분해와 동등하다.

브라운 스네이크 독 프로테아제에 대한 프로트롬빈 활성분석

브라운 스네이크 독 프로테아제(5㎍)를 (0.05M Tris-HCl, pH 7.4의) 2㎖ 0.25㎎/㎖ 프로트롬빈에 첨가하였다. 이 용액의 분취량(aliguots)(20㎕)을 여러 시간간격에서 취하였고 트롬빈선택 기질 S-2238을 갖는 발색분석을 수행하였다. 이들 분석은 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 930㎕, S-2238 50㎕ 및 샘플 20㎕로 구성된다. 405㎚에서 기질 가수분해의 비를 측정하였다. SDS PAGE 분석 ± β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)에 대한 각각의 시간간격에서 2개의 20㎕ 분취량을 또한 취하였다.

응고 분석(Clotting Assay)

오스틴 & 리메스 연구소(Austen & Rhmes In)의 혈액응고의 실험 매뉴얼 (Blackwell Scientific Publishers, Oxford UK 1975)에 의해 기술된 바와 같은 하이랜드-크로텍(Hyland-Clotek) 장치를 사용하여 시트레이트(citrated) 플라즈마(plasma) 응고분석을 수행하였다. 분석은 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 100㎕, 시트레이트 인간 플라즈마 100㎕ 및 프로테아제의 가변된 농도 20㎕로 구성되었다. 시간간격으로 분취량을 취하며 0.04M CaCl₂가 있거나 없이 그리고 0.8M NaSCN으로, 동일한 분석을 또한 수행하였다.

브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 시트레이트 플라즈마에서의 피브린 형성

인간 시트레이트 플라즈마(970㎕)를

(1) 20㎕의 1.16㎎/㎖ 프로테아제;

(2) 20㎕의 1.16㎎/㎖ 프로테아제 및 40mM의 최종 Ca²⁺ 농도(자유 Ca²⁺ ~ 10mM 농도)를 제공하기 위한 10㎕의 4M CaCl₂;

(3) 10㎕의 4M CaCl₂와 함께 혼합하였다.

0.05M Tris-HCl, pH 7.4를 추가함으로써 각각의 용액을 1㎖까지 만들었다. 3개의 용액을 4시간동안 두었고, 발생한 응고물에 압력을 가하여 피브린 응고물로부터 다른 플라즈마 단백질을 제거하기 위해 dH₂O로 수회 세척하였다. 그런 후, 응고물을 β-메르캅토에탄올과 4M 요소(urea)를 갖는 4x SDS 샘플버퍼 500㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브(Eppendorf tubes)에 넣었다. 미량의 추가 β-메르캅토에탄올을 각각의 에펜도르프 튜브에 넣었고 하루밤두었다. 샘플을 5분간 끓였고 각각의 10㎕를 본 명세서에서 상술한 바와 같이 SDS PAGE 아크릴아미드상에서 진행시켰다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 및 브라운 스네이크 독 프로테아제의 활성지역 라벨링

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(4㎎/㎖) 및 브라운 스네이크 독 프로테아제(2㎎/㎖) 용액의 샘플(120㎕)을 1시간동안 15㎕ 40mM DNS-GGACK(0.05M Tris-HCl, pH 7.4에서의 4mM 최종 농도)와 반응시켰다. 그런 후, 과 저해제(excess inhibitor)를 제거하기 위해 샘플을 4℃의 0.05M Tris-HCl, pH 7.4에 자석 교반기로 하루밤동안 투석시켰다. 그리고 나서, 라벨된 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 및 브라운 스네이크 독 프로테아제와 라벨되지 않은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 및 브라운 스네이크 독 프로테아제 모두에 β-메르캅토에탄올과 함께 그리고 β-메르캅토에탄올 없이 SDS PAGE를 수행하였다. 활성지역 라벨된 단백질을 갖는 젤은 자외선하에서 보여지지만, 다른 젤들은 코마시 블루로 염색되었다.

피브린 글루(fibrin glue) 연구

37℃ 수조에서 20㎖ 원추형 플라스틱 바이알에 기간이 지난 시트레이트 플라즈마(3.5㎖)를 풀었다. 2㎎/㎖ 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제 20㎕를 양 바이알에 넣었다. 한 바이알에는 0.025M CaCl₂를 첨가하였고 다른 바이알에는 함염물(saline)을 첨가하였다. 눈으로 보고 응고시간을 감시하였으며 단단한 응고가 형성될 때 54번 필터 페이퍼에 두고 압축시켰다. 결과적으로 발생한 압축된 응고물을 증류수에 충분히 세척시켰고 4℃에서 하룻밤 저장하였다. 응고물들은 조직을 검사하기 위해 촬영되었다.

결과

본 명세서에 나타내고, P. textilis로 예를 든 바와 같이, 뱀 독 프로테아제 착체는 인자 Xa 유사 세린 프로테아제를 특징으로 하는 프로테아제와 미지의 기능을 가진 많은 다른 단백질들을 포함한다. P. textilis, O. scutellatus, N. scutauts, T. carinatus 및 P. porphyriacus로부터 분리된 뱀 독 프로테아제는 도국부 피브린 "글루" 또는 "실란트(sealant)" 형태의 약제 조성물의 조제를 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 몇몇 실험들은 P. textilis 도출된 샘플 및 단백질을 사용하여 수행되었다. 그러나, 이들 실험들은 본 발명의 다른 뱀 독 프로테아제에 적용될 수 있는 뱀 독 프로테아제 착체 및 뱀 독 프로테아제를 특징으로 하는 예들임이 당업자들에게는 명백해질 것이다.

뱀 독 프로테아제의 정화

브라운 스네이크 뱀 독 프로테아제 착체의 정화(ConA-Sepharose 4B)

P. textilis 스네이크 독 프로테아제의 정화에서 제 1 단계는 천연의 독으로부터 브라운 스네이크 뱀 독 프로테아제 착체를 분리하는 것이었다. 상기 마스키 등의 논문(1988)에 상술한 방법을 기초로 한 방법을 사용하였다. ConA-Sepharose 4B상에 천연의 P. textilis 독의 건조중량 233mg의 크로마토그래피로 나타난 280㎚에서의 용리 프로파일(elution profile)(원래의 크로마토그램의 자취)이 도 1에 도시되어 있다.

독을 2개의 주 단백질 피크로 분해하였는데, 한 피크는 ConA-Sepharose 4B에 속하고 (도 1의 A에서선으로 표시된) 인자 Xa 기질 S-2222에 반대의 활성을 가졌다. A₂₈₀측정을 기초로, 활성 피크는 전체 독 단백질의 약 30%를 나타내었다.

ConA-Sepharose 4B 크로마토그래피로부터의 풀된 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 농축물의 SDS PAGE의 결과가 도 2B에 도시되어 있다: 통로 1: 분자량 마커(크기는 kDa로 표시됨), 통로 2: β-메르캅토에탄올이 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체, 통로 3: β-메르캅토에탄올이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체.

화살표 A는 통로 2에서 본래의 브라운 스네이크 독 프로테아제 밴드를 나타내는 반면에, 화살표 B와 C는 통로 3에서 브라운 스네이크 독 프로테아제의 각각 중사슬과 경사슬을 나타낸다(하기를 참조).

β-메르캅토에탄올이 없는 상태에서(통로 2), 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체는 ~150-200kDa에서 하나의 선명한 폭넓은 단백질 밴드와, ~60, 50 및 45kDa의 분자량을 갖는 3개의 다른 주 밴드를 포함한다. 통로 2에서 3개의 주 밴드의 대략적인 질량의 합은 원래의 착체에 대해 300-350kDa의 예측 계산된 질량이다.

β-메르캅토에탄올이 있는 상태에서(통로 3), 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체는 각각 명백한 110, 93, 80, 55, 46, 40 분자량을 갖는 수개의 단백질 밴드와 ~32-34kDa에서 (아마도 한쌍) 하나의 폭넓은 밴드로 분리된다. 통로 2와 3 사이의 차이는 디설파이드 결합(disulfide bonds)이 착체에서 일부 폴리펩타이드를 함께 연결시키는 것을 나타낸다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 프로테아제 성분은, 화살표 A로 표시된 바와 같이, ~50-60kDa에서 통로 2에서 눈에 띄게 한쌍으로 존재한다. 프로테아제의 중사슬은 약 40kDa에서 밴드(화살표 B로 표시됨)로서 나타나고, 프로테아제의 경사슬은 약 32kDa의 근사질량(화살표 C로 표시됨)을 갖는다. 이러한 SDS PAGE 밴드 A, B 및 C의 지시는 본 명세서에서 상술한 분리 및 특징 실험에 의해 확인되었다. 도 2에서 일부 밴드들은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에서 독 불순물을 나타낼 수 있다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체로부터 프로테아제 성분의 정화

세파크릴 S-300 크로마토그래피

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 브라운 스네이크 독 인자 Xa 유사 세린 프로테아제 성분을 분리하기 위해, 상기 착체를 분리하는 것이 필수적이다. 스페이저 등(Speijer et al. 1986)의 논문은 0.8M NaSCN이 O. scutellatus-프로트롬빈(prothrombin) 활성제를 효율적으로 분리시킬 수 있으나, 크로마토그래피 절차에서 0.8M NaSCN으로는 결코 정화시키지 못했다고 진술하였다. 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체를 0.8M NaSCN으로 분해시킬 수 있는 능력을 예시하기 위해, 하기의 실험들을 수행하였고 결과들이 도 3에 제공되어 있다. 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 넣은 0.8M NaSCN는 10초 미만에서 60초 이상까지 시트레이트 플라즈마 응고활성에 급격한 감소를 야기하였으나, 대부분의 S-2222 활성은 본질적으로 유보되었다.

0.8M NaSCN로 처리된 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체를 버퍼를 함유한 0.8M NaSCN로 평형을 맞춘 세파크릴 S-300 컬럼상에서 젤 여과 크로마토그래피에 의해 각각의 성분들로 분리하였다.

단편 30-43은 S-2222 가수분해 작용을 보였다. 단편 부피는 단편의 수를 감소시키기 위해 6.5㎖/튜브 에서 8㎖/튜브까지 나머지 크로마토그래피 단계에 대해 증가되었다. 풀되고 농축된 단편 30-43으로 제 2 세파크릴 S-300 크로마토그래피를 수행하였다. 단편 25-29에서 S-2222 가수분해 작용을 관찰하였다. 풀되고 농축된 단편 25-29로 제 3 세파크릴 S-300 크로마토그래피를 수행하였다. 본래, 단편 25-29에서 S-2222 가수분해 작용을 갖는 하나의 단백질 피크를 제공하였다. HPLC에 의해 고도의 균질성을 확인하였다(도 4). HPLC를 기초로 한, 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제는 순도가 95% 이상이다.

표 1-6은 실험 세트로부터 샘플들의 정화결과 및 특징을 요약한 것이다.

세파크릴 S-300 젤 여과 생성물의 SDS PAGE ± β-Me

도 5에 도시된 모든 크로마토그래피 단계들로부터 풀된 단편으로 SDS PAGE를 수행하였다. 통로 4(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 1, 풀된 단편 30-43을 포함)는 풀된 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 균질한 조제는 오염물이 약 107kDa의 분자량에서 존재하기 때문에 얻어지지 못했음을 나타내고 있다. 통로 5(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 2, 풀된 단편 25-29를 포함)는 55-56kDa 성분의 더 큰 퍼센트를 도시하고 있으나 여전히 제 3 크로마토그래피를 필요로 하는 오염물을 포함하고 있다. 제 3 크로마토그래피 단계로부터 세파크릴 S-300의 풀된 단편 25-29의 가변 양을 갖는 통로 6-8은 균질한 조제를 나타내고 있다. 원래의 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 분자량은 통로 5-8에서 도시된 55 내지 56kDa로 나타난다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제는 전체 P. texillis 독(통로 2)와 β-Me가 있는 원래의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(통로 10) 및 β-Me가 없는 원래의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(통로 3) 모두와 비교되었다. 이는 착체내에서와 전체 독에서 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 위치를 나타내었다.

도 5에서 통로 9는 β-Me가 있는 크로마토그래피 단계 3으로부터 세파크릴 S-300의 풀된 단편 25-29의 감소를 도시한 것이다. 약 31kDa의 분자량을 갖는 하나의 밴드를 볼 수 있다. 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 감소로 인해 발생한 예상된 2개 밴드를 식별하기 위해 제 2 젤 분리를 수행하였다.이 젤은 도 6에 도시되어 있다.

β-Me가 있거나 없는 세파크릴 S-300의 풀되고 농축된 단편 25-29의 SDS PAGE를 도 6에서 볼 수 있다. 통로 3(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 3, 풀된 단편 25-29를 포함), 통로 4 및 통로 6(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 3, 풀되고 농축된 단편 25-29를 포함)은 균질한 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 조제가 달성되었음을 도시한 것이다. 그러나, 통로 3과 6 밴드는 매우 희미하게 나타난다. 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 분자량은 도 5에서의 결과에 상응하는 55 내지 56kDa로 나타난다.

통로 5(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 3으로부터 풀되고 농축된 단편 25-29 + β-Me를 포함)는 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제가 3개의 서브유닛을 포함하고 있으나, 마지막 밴드는 Laemmli법으로 종종 보여지는 다이 프론트(dye front)일 수 있거나, 자기소화(self-digestion) 생성물일 수 있다. 통로 7(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 3, 풀되고 농축된 단편 25-29 + β-Me를 포함)은 어떠한 밴드도 보이지 않으며 통로 8(세파크릴 S-300, 크로마토그래피 단계 3으로부터 풀되고 농축된 단편 25-29 + β-Me를 포함)은 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제가 중사슬과 경사슬로 구성되는 것을 나타낸다. 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제는 해당하는 인자 Xa 및 O. scutellatus 세린 프로테아제 구조에 기초한 중사슬 및 경사슬을 포함한다. 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제 중사슬의 분자량은 도 5에서의 결과에 해당하는 약 31kDa이며, 경사슬은 약 약 18kDa로 나타난다. P. texillis 전체 독(통로 2)과 β-Me가 있는 원래의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(통로 2)는 젤에 포함되어 있어 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제를 나타내는 밴드와 비교될 수 있다.

슈퍼덱스(superdex) 200 젤 여과

브라운 스네이크 독 프로테아제의 정화를 향상시키기 위한 시도에서, 세파크릴 S-300 대신에, 대안으로 고해상도의 젤 여과 매체(슈퍼덱스 200)를 사용하였다. 슈퍼덱스 200상에서 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 크로마토그래피 및 리크로마토그래피(rechromatography)후에 280㎚에서의 용리 프로파일이 도 10A 및 10B에 도시되어 있다. 도 10A 및 10B는 0.8M NaSCN을 갖는 0.05M Tris-HCl, pH 7.4에서 슈퍼덱스 200의 컬럼(2.5×90㎝)상에 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체(18㎖; 50.4㎎)의 크로마토그래피후의 용리 프로파일을 도시한 것이다. 도 7A는 크로마토그래피 단계 1을 도시한 것이고, 도 7B는 크로마토그래피 단계 2를 도시한 것이다. 각 단계에서, A에서 선으로 표시된 S-2222 활성을 갖는 단편들이 풀되고 농축되었다.

슈퍼덱스 200으로의 브라운 스네이크 독 프로테아제의 정화로부터 샘플들을 도 7C에 도시된 바와 같은 각각의 정화단계후에 SDS PAGE에 의해 분리하였다. 통로 1 및 2: β-메르캅토에탄올이 없는 크로마토그래피 단계 1로부터의 풀된 농축물(통로 1) 및 β-메르캅토에탄올이 있는 크로마토그래피 단계 1로부터의 풀된 농축물(통로 2); 통로 3 및 4: β-메르캅토에탄올이 없는 크로마토그래피 단계 2로부터의 풀된 농축물(통로 3) 및 β-메르캅토에탄올이 있는 크로마토그래피 단계 1로부터의 풀된 농축물(통로 4); 통로 5: 분자량 마커(크기는 kDa로 표시됨); 화살표 A, B, 및 C는 통로 4에서의 불순물을 나타낸다.

슈퍼덱스 200 정화에 사용된 시작 물질(starting material)의 특이 활성도(specific activity)는 실질적으로 세파크릴 S-300 크로마토그래피에 사용된 시작 물질의 특이 활성도보다 낮았다(표 2). 이는 다른 독 샘플의 다른 활성도를 반영할 수 있다. 슈퍼덱스 200 정화로부터의 최종 산물은 세파크릴 S-300 생성물의 2.4U/㎖/A₂₈₀의 절반 미만인 1.1U/㎖/A₂₈₀의 특이 활성도를 갖는다.

이온교환 크로마토그래피, 또 다른 용해제로서의 요소(urea), 한 단계의 ConA-Sepharose 4B 정화공정을 사용한 천연의 P.textilis 독으로부터 브라운 스네이크 독 프로테아제의 정화, 프로테아제의 기질 특이성(substrate specificity)에 기초한 친화성(affinity) 및 해당기술에 공지된 다른 방법들을 포함하는 다른 분리방법들이 고려된다. 다음은 브라운 스네이크 독 프로테아제의 분리를 예로 든 본 발명의 프로트롬빈 활성 단백질을 분리하기 위한 적절한 방법의 예이다. 표 3-6은 여러 단계에서의 정화동안 샘플들의 성질을 나타낸 것이다.

프로토콜 1

ConA-Sepharose 4B(07-01-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4

·용리 버퍼, 0.05M Tris-HCl, 0.02M 메틸-α-D-만노피라노사이드(mannopyranoside)

·로딩 샘플: 독 공급장치로부터의 건조 독(중량: 541㎎)을 10㎖ 스타팅 버퍼에서 재구성하였다.

*1㎖ 용액의 A280: 13.5

*로드(load)된 총 A280 유닛: 135

*샘플의 활성도: 38U/㎖

*로드된 총 활성도 유닛: 377

·풀된 S-2222 활성을 갖는 단편

*농축된 풀의 A280은 6.8이었고 10㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 68

*풀의 활성도: 2.6U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 26.0

슈퍼덱스 200(12-01-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.8M NaSCN

·로딩 샘플: 첨가된 0.8M NaSCN(A280 8.9, 10㎖, 3.25U/㎖)를 갖는 상기 ConA-Sepharose 크로마토그래피로부터 풀되고 농축된 피크 부분

*로드된 총 A280 유닛: 89

*로드된 총 활성도 유닛: 32.5

·풀된 S-2222 활성을 갖는 단편

*농축된 풀의 A280은 0.350이었고 20㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 7

*농축된 풀의 활성도: 0.46U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 9.2

슈퍼덱스 200(14-01-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.8M NaSCN

·로딩 샘플: 이전 슈퍼덱스 200 크로마토그래피(A280 0.350, 20㎖, 0.46U/㎖)로부터 풀되고 농축된 단편

*로드된 총 A280 유닛: 7

*로드된 총 활성도 유닛: 9.2

·풀된 S-2222 활성을 갖는 단편

*농축된 풀의 A280은 0.076이었고 40㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 3.0

*농축된 풀의 활성도: 0.11U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 4.4

프로토콜 2

ConA-Sepharose (21-01-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4

·용리 버퍼, 0.05M Tris-HCl, 0.02M 메틸-α-D-만노피라노사이드(mannopyranoside) 그런 후, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.8M NaSCN

·로딩 샘플: 존 웨이겔(John Weigel)로부터의 건조 독(중량: 432㎎)을 10㎖ 스타팅 버퍼에서 재구성하였다.

*1㎖ 용액의 A280: 25.6

*로드된 총 A280 유닛: 256

*샘플의 활성도: 102.9U/㎖

*로드된 총 활성도 유닛: 1028

·풀된 S-2222 활성을 갖는 단편

*2풀은

1. (페닐-세파로즈 컬럼에 사용되는)메틸-α-D-만노피라노사이드와 함께 용리된 농축된 단편

*농축된 풀의 A280은 0.95이었고 22㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 20.9

*풀의 활성도: 5.0U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 110

2. NaSCN으로 용리된 농축된 단편

(이 중 절반만이 아래의 2개의 동일한 슈퍼덱스 200 크로마토그래피 단계에 사용됨)

하기에 기술한 바와 같이 200 컬럼

*농축된 풀의 A280은 1.85이었고 27㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 68

*풀의 활성도: 2.6U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 26.0

슈퍼덱스 200(29-01-03 및 30-01-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, 0.8M NaSCN

·로딩 샘플: ConA-Sepharose 크로마토그래피로부터 풀되고 농축된 피크 부분. 2개의 크로마토그래피 단계들을 수행하였다. 로딩 샘플들은 0.8M NaSCN 첨가된 상기 ConA-Sepharose 크로마토그래피로부터 풀되고 농축된 피크중의 16㎖ 로 구성되었다:

*1㎖ 용액의 A280: 1.2

*로드된 총 A280 유닛: 19.2

*샘플의 활성도: 15.7U/㎖

*로드된 총 활성도 유닛: 250.6

·각각의 크로마토그래피로부터의 높고 동일한 특이 활성도를 갖는 단편들이 풀되고 농축되었다(다른 단편들도 또한 S-2222 활성도를 가졌으나 특이 활성도는 더 낮았으며, 이들은 각각 풀되었다):

*농축된 풀의 A280은 1.9였고 9㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 17.1

*농축된 풀의 활성도: 25.7U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 231.3

슈퍼덱스 200(04-02-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4, (NaSCN 없음)

·로딩 샘플: 이전의 슈퍼덱스 200 크로마토그래피로부터 풀되고 농축된 단편(A280 1.9, 9㎖, 25.7U/㎖)

*로드된 총 A280 유닛: 17.1

*로드된 총 활성도 유닛: 231.3

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편(하기 결과는 가장 큰 S-2222 활성도를 갖는 단편을 포함하며, 다른 단편들도 또한 S-2222 활성도를 가지며, 이들은 각각 풀되었다)

*농축된 풀의 A280은 1.7이었고 9.5㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 16.2

*농축된 풀의 활성도: 17.7U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 168.2

프로토콜 3

ConA-Sepharose (10-02-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4

·용리 버퍼, 0.025M Tris-Acetate, pH 6.5, 4M 요소(urea)

·로딩 샘플: 25㎖ 스타팅 버퍼에서 재구성된 건조 독(중량: 557㎎)

*1㎖ 용액의 A280: 28

*로드된 총 A280 유닛: 700

*샘플의 활성도: 83.4U/㎖

*로드된 총 활성도 유닛: 2087

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편

*풀의 A280은 0.592였고 640㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 379

*농축된 풀의 활성도: 0.152U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 97.3

·일단 전체 샘플들이 컬럼상에 로드된 후에, 0.05M NaCl 그래디언트(gradient)가 적용되었다.

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편

*풀의 A280은 4.5였고 17.5㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 79

*농축된 풀의 활성도: 1.44U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 25

슈퍼덱스 200(13-02-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-Acetate, pH 6.5

·로딩 샘플: CM-Sepharose 크로마토그래피(A280 4.5, 17.5㎖, 1.44U/㎖)로부터 풀되고 농축된 단편

*로드된 총 A280 유닛: 79

*샘플의 활성도 유닛: 25

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편(하기 결과들은 풀된 대칭 피크를 나타내며, 다른 단편들도 또한 S-2222 활성도를 가졌다)

*농축된 풀의 A280은 0.330이었고 7.5㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 2.5

*농축된 풀의 활성도: 0.146U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 1

프로토콜 4

페닐-세파로즈(Phenyl-Sepharose)(15-02-03)

·스타팅 버퍼, 0.8M NaSCN-Phosphate, pH 6.5

·로딩 샘플: ConA-Sepharose 크로마토그래피(A280 0.95, 22㎖, 5.03U/㎖)로부터 풀되고 농축된 단편

*로드된 총 A280 유닛: 20.9

*로드된 총 활성도 유닛: 110

·일단 전체 샘플들이 컬럼상에 로드된 후에, 0.80M NaSCN 그래디언트(gradient)가 적용되었다.

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편

*농축된 풀의 A280은 0.485였고 9.5㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 4.6

*농축된 풀의 활성도: 1.4U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 13

슈퍼덱스 200(18-02-03)

·스타팅 버퍼, 0.05M Tris-Acetate, pH 6.5

·로딩 샘플: 페닐 세파로즈 크로마토그래피(A280 0.485, 10㎖, 1.4U/㎖)로부터 풀되고 농축된 단편

*로드된 총 A280 유닛: 4.85

*로드된 총 활성도 유닛: 14

·풀된 S-2222 활성도를 갖는 단편(2개의 풀이 제조되었고, 하기에 설명된 한 단편은 가장 큰 활성도를 갖는 단편들을 포함한다)

*농축된 풀의 A280은 0.327였고 3.5㎖로 구성되었다.

*풀된 총 A280 유닛: 1.14

*풀의 활성도: 1.83U/㎖

*풀된 총 활성도 유닛: 6.4

P. textilis - 스네이크 독 프로테아제 착체의 특징

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 S-2222 발색기질의 가수분해에 대한 Ca ²⁺ 의 효과

뱀 독 프로테아제 착체 인자 Xa 유사 절단 특이성(cleavage specificity)을 측정하기 위해, 인자 Xa 특이 발색기질 S-2222를 이용한 발색분석을 수행하였다. 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체는 S-2222를 Ca²⁺과 함께, 또는 Ca²⁺ 없이 가수분해한다. Ca²⁺ 없는 가수분해의 초기 비는 Ca²⁺이 있는 비율과 동일하지만, 농도에서만이 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 2㎍/㎖ 농도보다 더 크다(데이터 미도시).

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 S-2222 가수분해의 비는 분석에서 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 양과 대략적으로 선형적이었다(표 7에서 R2값으로 표시된 바와 같음: 그래프 미도시).

첨가된 Ca²⁺ 또는 Ca²⁺와 P_L은 실질적으로 분리된 브라운 스네이크 독 프로테아제와 유사한 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 S-2222 가수분해에 영향을 끼치치 않았다. 브라운 스네이크 독 프로테아제를 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 S-2222 가수분해의 비교는 단위 ㎍^-1에서의 비와 유사함을 보인다. 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 (질량에 기초한) 약 10-15%만이 프로테아제이므로, 몰(molar) 용어로 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에서 프로테아제에 의한 S-2222 가수분해의 비는 분리된 프로테아제 보다 약 10배이상이다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 시트레이트 플라즈마 응고

응고 성질과 분리된 브라운 스네이크 독 프로테아제를 비교하기 위해 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체로 시트레이트 플라즈마 응고 분석을 수행하였다. 이들 실험결과들이 표 8에 나타나있다. 표 8에 나타난 값들은 보조 성분들(즉, 단독의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체, 40mM CaCl₂를 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 및 40mM CaCl₂와 인지질(phospholipid)을 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체)이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체와 보조성분들이 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 의한 시트레이트 플라즈마의 응고에 대한 데이터로부터 도출된 것이다.

결과들은 Ca²⁺와 P_L은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 응고 효능에 영향을 끼치지 않는 것으로 나타난다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 시트레이트 플라즈마 응고 시간에 대한 Ca ²⁺ 의 영향

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체의 응고 성질을 조사하기 위해, Ca²⁺가 없는 시트레이트 플라즈마 응고시간과 Ca²⁺가 있을 때의 시트레이트 플라즈마 응고시간을 비교하였다. 표 9 및 10에서의 결과들은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체는 혈액을 응고시키는데 Ca²⁺를 필요로 하지 않음을 보여준다. 예를 들어, 39㎍/㎖의 분리된 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제는 Ca²⁺가 없을 때 30초 미만에서 시트레이트 플라즈마를 응고시키게 된다. Ca²⁺의 추가로 70초의 응고시간을 제공하는데 필요한 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 양이 200배 감소된다. 이는 브라운 스네이크 독 프로테아제가 프로테아제는 Ca²⁺가 없을 때 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킬 수 있으며, Ca²⁺는 프로트롬빈 절단을 용이하게 함을 나타낸다.

도 11A-11C는 보조 성분들이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 보조 성분들이 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 시트레이터 플라즈마의 응고를 도시한 것이다(데이터 점들은 중복측정의 평균임). 도 8A: 단독의 독 프로테아제, 도 8B: 10mM CaCl₂를 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제, 그리고 도 8C: 10mM CaCl₂와 인지질(플라테린(platelin))을 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제.

Ca²⁺는 또한 브라운 스네이크 독 프로테아제 산출 트롬빈(맨캐드와 코디스포티(Mankad and Codispoti), 2001, Am J Surg 182 21S)에 의한 피브리노겐의 활성을 강화하고 이에 따라 응고에 영향을 끼치는 Ca²⁺의 첨가는 프로트롬빈 활성에 부차적일 수 있다. P_L은 또한 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈 절단을 용이하게 작용할 수 있으며, 표 14에 도시된 바와 같이, 응고에 필요한 브라운 스네이크 독 프로테아제의 양을 10배 더 감소키게 한다.

프로트롬빈 활성 단백질에 의한 S-2222 발색기질의 절단에 대한 Ca ²⁺ 의 영향

브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 인자 Xa 유사 절단 특이성을 측정하기 위해, Xa 특이 발색기질 S-2222을 사용한 발색분석을 수행하였다. S-2222는 인자 Xa(아우렐 등(Aurell et al.) 1977, Thrombin Res 11 595)에 대해 발현된 합성 발색기질이다. S-2222의 가수분해는 405㎚에서 흡수도에서의 증가에 의해 검출될 수 있는 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)을 방출한다. 도 9A-9D에 도시된 바와 같이, 효소 활성 대 브라운 스네이크 독 프로테아제의 양의 도표는 본질적으로 선형적이었다. 결과들은 S-2222 가수분해의 비는 Ca²⁺ 또는 Ca²⁺와 P_L의 존재에 의해 영향받지 않았음을 나타내고, 이에 따라, 촉매지역은 Ca²⁺와 P_L에 의해 영향받지 않음을 나타낸다. 0.002U/㎍ 프로테아제의 기울기로부터, 정화된 조제의 특이 활성도는 2U/㎎이었다.

도 9A-9D는 보조성분들이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 보조성분들이 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 S-2222의 가수분해를 도시한 것이다(데이터 점들은 중복측정의 평균임). 도 9A: 단독의 브라운 스네이크 독 프로테아제, 도 9B: 10mM CaCl₂를 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제, 도 9C: 10mM CaCl₂와 P_L을 갖는 브라운 스네이크 독 프로테아제, 그리고 9D: 각각의 도 9A-9C에서 도시된 각 도표의 기울기와 R₂ 값. R₂ 값은 직선에 대한 상관계수이다.

표 11에 나타낸 바와 같이, Ca²⁺가 첨가되거나 첨가되지 않은 브라운 스네이크 독 프로테아제 가수분해 S-2222는, Ca²⁺가 없는 가수분해의 초기비보다 약간 더 낮기는 하지만, Ca²⁺가 있는 경우 가수분해의 초기비와 비교하였다.

대조적으로, 러프 스케일 스네이크 독으로부터 추출한 인자 Xa 유사 세린 프로테아제인 트로카린(Trocarin)에 의한 합성인자 Xa 기질의 가수분해와 같이, 텍스타린(Textarin)에 의한 합성인자 Xa 기질의 가수분해는 Ca²⁺와 P_L이 있는 경우에 강화되었다(스토커 등(Stocker et al.), 1994, Toxicon 32 1227).

프로트롬빈의 분리된 브라운 스네이크 독 프로테아제 활성

이론에 구속되지는 않으나, 응고는 2단계에 의해 발생하는 것으로 생각된다: (1) 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈을 트롬빈으로의 변환, 그런 후 (2) 피브리노겐을 피브린으로의 절단 및 트롬빈에 의한 인자 ⅩⅢ의 활성.

프로트롬빈의 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제 활성을 설명하는 도 10을 참조하면, 반응 10분 내에, 브라운 스네이크 독 프로테아제는 65초에서 12초 기저선까지 시트레이트 플라즈마 응고시간을 충분히 감소시키도록 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시키도록 작용한다.

브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈 활성

실험결과는 브라운 스네이크 독 프로테아제가 Ca²⁺, P_L 또는 인자 Va와 같은 보조 단백질이 없이 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시킬 수 있음을 나타낸다.

S-2222 분석 결과는 브라운 스네이크 독 프로테아제가 프로트롬빈에서 인자 Xa와 동일한 결합을 가수분해할 수 있음을 나타낸다. 5㎍의 브라운 스네이크 독 프로테아제(효소:기질이 1:100)와 반응되는 인간 프로트롬빈(2㎖ 0.05M Tris-HCl 버퍼에 0.5㎎)을 사용하여 프로트롬빈에 대한 브라운 스네이크 독 프로테아제의 영향을 측정하였다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 비환원 SDS PAGE에 의해 반응 생성물을 분석하였다. 추가적으로, 도 11B에 도시된 바와 같이, S-2238에 의해 트롬빈 형성비를 감시했다. S-2238은, 본 명세서에서 참조로 합체된, 코말릭과 블롬백((Komalik and Blomback), 1975, Nature 227 680)의 논문에 개시된 트롬빈의 효소활성을 측정하는데 통상적으로 사용된다.

도 11A는 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈 절단의 시간 경과의 SDS PAGE를 도시한 것이다. ~40kDa(통로 5)에서 단백질 밴드는 트롬빈(분자량36.7kDa)이 주 최종 생성물임을 나타낸다. 이 단백질 밴드는 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의해 프로트롬빈(PT)이 트롬빈(T)으로 변환되는 것을 도시한 것으로 시간에 따라 세기가 증가한다. 프로트롬빈은 48시간의 시간점(통로 5)에 의해 실질적으로 판단된다. 도 11B는 S-2238에 대한 초기 활성도는 매우 낮았으며 약 20배 증가되었음을 도시하고 있다. SDS PAGE 젤로부터, S-2238 활성도는 48시간에 최대에 도달될 수 있음이 예측되었다.

이 실험에 사용된 인간 프로트롬빈은, 도 11A의 통로 2에 도시된 밴드에 의해 나타난 바와 같이, 완전히 순수하지는 않았다. 72kDa에서의 프로트롬빈(PT) 밴드만이 보여진다(만(Mann), 1976, Methods Enzymol 1976 132). ~55kDa에서 희미한 단백질 밴드는, 도 12에 도시된 바와 같이, 가능하게는 트롬빈에 의한 프로트롬빈의 절단이 발생하는 일부 프리트롬빈(pretrombin)(1)(PT₁)이 있음을 나타낸다. 프리트롬빈 1은 활성효소가 아니며, t=0에서 프로트롬빈 용액상에서의 S-2238 분석에 의해 확인된다.

프리트롬빈 1 밴드는 시간에 따라 증가된 후 감소되는 것으로 나타난다. 가능하게는 트롬빈은 프로트롬빈 용액에 있었으나, S-2238 분석으로는 탐지될 수 없었다. 더 가능하기로, 배양동안 발생된 트롬빈은 프리트롬빈 1의 형성을 초래할 수 있다.

결과를 해석하는데 보조하기 위해, 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의한 프로트롬빈의 메카니즘이 제안되었고 개략적인 도표가 도 12에 도시되어 있다. 본 발명은 이 도표에 구속되지 않는다.

프로트롬빈의 분리된 브라운 스네이크 독 프로테아제 활성과 가교된 피브린의 형성

상기 결과로부터, 브라운 스네이크 독 프로테아제는 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킨다. 활성화된 트롬빈은 순차적으로 피브리노겐을 피브린으로 변환시킨다. 이를 조사하기 위해, Ca²⁺가 있거나 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제로 시트레이트 플라즈마를 배양시켰다. 이는 (Ca²⁺는 단독으로 응고 캐스캐이드(coagulation cascade)를 활성화시키므로 통상적인 인 비보(in vivo) 응고물의 형성을 나타내는) 시트레이트 플라즈마에 Ca²⁺만을 첨가함으로써 형성된 세척된 피브린 응고와 함께 세척된 후 SDS PAGE에 의해 분리된 응고물을 형성하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 이 실험의 결과는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 작용에 의해 생성된 피브린은 정상적인 피브린과 유사한 구조를 가지며, 가교된 피브린의 형성은 트롬빈과 합성인자 ⅩⅢ 활성의 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제 활성에 반응하여 나타남을 검증한다. 각 실험의 대략적인 응고시간도 또한 기록하였다(표 12).

기준 분자량(통로 1)과, 도 13으로부터 피브리노겐(통로 5)과 Ca²⁺ 생성 피브린 응고물(통로 4)의 양 사슬구조를 이용하여, 밴들들을 식별할 수 있다. 통로 2 및 3(각각 Ca²⁺가 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 Ca²⁺가 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제)에서 약 100kDa에서의 밴드는 γ-다이머(dimer)(γ-γ)로 표시된다. γ-다이머는 105kDa의 분자량을 가지며, 인자 ⅩⅢa에 의해 2개의 γ-모노머 사이에 이루어진 공유가교(covalent crosslinks)가 발생한다(맥키 등(McKee et al.), 1970, Proc Natl Acad Sci 66 738).

대략 70 및 60kDa의 밴드도 또한 피브린의 α-모노머(α) 사슬과 β-모노머(β) 사슬을 나타내는 이들 통로에서 볼 수 있다. α-모노머는 73kDa의 분자량을 가지는 반면에, β-모노머는 60kDa의 분자량을 갖는다(McKee et al., 1970, Proc Natl Acad Sci 66 738). 400kDa(젤 상단부)보다 더 큰 분자량을 갖는 밴드는 α-폴리머(α_P)로 표시되며, 인자 ⅩⅢa에 의해 α-모노머의 라이신-글루타민산 공유가교가 발생한다(가프니 및 브래셔(Gaffney and Brasher), 1974, Nature 251 53). α-사슬 변형 생성물(α1)도 또한 통로 2-4에서 ~38kDa에서 볼 수 있다.

브라운 스네이크 독 프로테아제의 활성으로부터 발생한 트롬빈은 정상적인 α-트롬빈과 동일한 방식으로 피브리노겐을 피브린으로 변환시키는 것을 나타낸다. 이는 통상적인 방식으로 (Ca²⁺를 시트레이트 플라즈마에 첨가함으로써) 생성된 응고물과 Ca²⁺가 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 Ca²⁺가 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제(각각 통로 3과 2)에 의해 생성된 응고물의 밴딩 패턴을 비교함으로써 도시된다. Ca²⁺가 있는 상태(통로 3)와 비교하면, 비가교 α-모노머의 더 많은 양이 브라운 스네이크 독 프로테아제만(통로 2)으로 생성된 응고물에 있다. 이는 인자 ⅩⅢa는 Ca²⁺가 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제로 생성된 응고물의 형성에 활성적이지 않았음을 나타내다. 이는 Ca²⁺가 있는 상태에서 활성화된 인자 ⅩⅢa는 Ca²⁺가 없는 상태에서 활성화된 동일한 효소보다 더 활성적이기 때문에 참조문헌과 일치한다(터너와 마우러(Turner and Maurer), 2002, Biochemistry 41 7947). 인자 ⅩⅢa에 의한 α-모노머의 가교는 γ사슬 가교보다 더 느리게 진행한다: 이는 왜 γ사슬 이 3개의 응고물 모두에서 완전히 가교되는 것으로 나타나는지를 설명해준다. 4시간 이상 응고물을 둠으로써 α-모노머가 완전히 가교되게 할 수 있었다.

Ca²⁺가 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 (Ca²⁺단독으로) 응고물을 나타내는 정상적인 인비보 형성을 사용하여 생성된 응고물에서 매우 유사한 밴딩 패턴을 관찰하였다. 그러나, 이들 2개의 응고물들은 응고시간에서 차이가 있다(표 12). 브라운 스네이크 독 프로테아제와 Ca²⁺로 인한 응고물은 Ca²⁺만이 있는 응고물보다 30배 더 빨리 응고되었다. 이는 응고가 시트레이트 플라즈마상에서 Ca²⁺의 작용보다는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 작용에 기인했기 때문임을 나타낸다. 첨가된 칼슘은 브라운 스네이크 독 프로테아제에 의해 시트레이트 플라즈마의 응고시간을 약간 줄였다(120초 에서 60초). 이는 브라운 스네이크 독 프로테아제와 첨가된 Ca²⁺를 갖는 시트레이트 플라즈마 응고 분석결과와 일치한다.

브라운 스네이크 독 프로테아제의 P. texilis 스네이크 독 프로테아제 활성 지역 라벨링의 구조적 특징

댄실-L-글루타밀-글리실-L-아르기닐 크로로메틸 케톤(Dansyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginyl chloromethyl ketone, DNS-GGACK)은 인자 Xa를 포함하는 세린 프로테아제의 활성지역 히스티딘을 특이적으로 알킬레이트함으로써, 불활성시키는 저해제이다(케트너와 샤우(Kettner and Shaw), 1981, Methods Enzymol 80 826). SDS PAGE 밴드 또는 밴드들이 촉매지역을 포함하는 것을 측정하기 위해, DNS-GGACK로 브라운 스네이크 독 프로테아제 및 원래의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체를 각각 배양시켰고 SDS PAGE에 의해 분리 시켰다. DNS-GGACK의 형광성질은 자외선을 사용하여 공유결합적인 결합 저해제를 포함하는 브라운 스네이크 독 프로테아제 밴드를 가시화시킨다. 이 실험의 결과가 도 14에 도시되어 있다.

원래의 브라운 스네이크 독 프로테아제(통로 7)에 해당하는 눈에 띄는 형광밴드가 통로 3에 보인다. β-메르캅토에탄올이 있는 상태에서(통로 4), 형광 저해제는 배타적으로 독 프로테아제의 중사슬(통로 8에서 약 37kDa에서의 밴드)에 포함되었다. 이는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 활성지역이 경사슬보다는 오히려 중사슬에 위치되는 것을 나타낸다. 이 결과와 또한 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체 밴딩 패턴내의 브라운 스네이크 독 프로테아제의 위치가 통로 1과 2, 및 7과 8에서 확인된다.

포유류 인자 Xa의 중사슬은 효소활성지역을 포함한다(복 등(Bock et al.) 1989, Arch Biochem Biophys 273 375). DNS-GGACK에 의해 불활성화된 인자 Xa의 펩타이드 다이제스트(peptide digests) 분석은 중사슬의 히스티딘(42)이 활성지역의 일부를 형성함을 나타낸다. 서열 정렬에 의해, 트로카린과 브라운 스네이크 독 프로테아제 모두의 활성지역 히스티딘 잔기(residues)들이, 도 15에 도시된 바와 같이, 인자 Xa의 활성지역 히스티딘에 대해 동일한 위치에 있도록 제안된다. 제안된 활성지역의 히스티딘이 볼드체로 나타나 있다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 N말단 아미노산 시퀀싱과 인자 Xa 및 T.carinatus 인자 Xa 유사 세린 프로테아제를 갖는 서열 상동성.

브라운 스네이크 독 프로테아제의 추정되는 경사슬 및 중사슬의 N말단 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. 짧은 서열들도 또한 P.textilis 독샘(gland) cDNA 라이브러리로부터 브라운 스네이크 독 프로테아제에 대한 cDNA의 클로닝을 용이하게 하는데 필요했다.

β-메르캅토에탄올이 있는 상태에서 SDS PAGE에 의해 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체와 브라운 스네이크 독 프로테아제를 분리하였고, PVDF 막으로 옮겼다. 이 막으로부터, 단백질 밴드의 시퀀싱을 수행하였다.

초기에, 브라운 스네이크 독 프로테아제의 중사슬로부터 부분적인 아미노산 서열(IVNGMD(C)KLGE [SEQ ID NO:43])을 얻었다. (C)는 이 싸이클이 공백이고 시스테인은 있었으나 확실하지 않은 것을 나타냄을 유의하라. 이 시스테인 잔기의 존재는 실질적으로 해당하는 cDNA의 시퀀싱후에 확인되었다.

브라운 스네이크 독 프로테아제의 중사슬은 PVDF막으로 옮겨져 서열화된 제 1 단백질 밴드였다. 중사슬 단편의 N말단은 아미노산 서열 IVNGMDCKLGE [SEQ ID NO:43]를 포함한다. 상동성 검사는 이 서열이 트로카린의 중사슬의 N말단 서열과 100% 동일함을 보였다(도 16 참조). 이 서열은 브라운 스네이크 독 프로테아제 cDNA를 증폭시키는데 성공적으로 사용되었다. 도 17에 도시된 바와 같이, 브라운 스네이크 독 프로테아제와 인간 인자 Xa 중사슬의 N말단 서열 사이의 유사성이 또한 발견되었다.

브라운 스네이크 독 프로테아제의 경사슬도 또한 아미노산 서열이었다. 경사슬에 해당하는 밴드로부터의 N말단 서열은 ANSLVXXFKSGNI[SEQ ID NO:44]였다. "X"는 6번째와 7번째 시퀀싱 싸이클에서 공백이 있음을 나타낸다. 이는 아미노산이 시퀀싱동안 감성된 시스테인(cysteines)이였거나, 잔기가 번역후 수정(post-translational modification)을 포함했음을 나타낸다. 대응하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열로부터 유추되는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 아미노산 서열은 "X" 아미노산 잔기가 양 글루타민산에 있음을 나타내었다. 아미노산 서열에서 "X"는 이들 잔기들로 대체된다. 본 발명의 경사슬의 서열화된 N말단의 상동성은 도 18에 도시된 트로카린(Trocarin)과 정렬되었다. 도 19에 도시된 바와 같이, 부분적인 브라운 스네이크 독 경사슬 서열과 쥐 인자 Xa 경사슬의 N말단 서열을 정렬함으로써 유사성도 또한 발견되었다. 도 18-23에 도시된 정렬은 브라운 스네이크 독이 트로카린과 인자 Xa와 상동성을 공유함을 나타낸다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제와 인자 Xa에 대한 또 다른 2차 서열로 서열 상동성이 또한 발견되었다. 상동성은 55%이상이다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제로부터 얻은 트로카린 아미노산 서열과 N말단 서열 사이의 비교

상술한 바와 같이 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제의 전장 cDNA와 부호화된 단백질 서열을 얻었고, 양 서열들은 도 25-30에 도시되어있다.

브라운 스네이크 독 세린 프로테아제와 트로카린의 완전한 아미노산 서열의 비교가 도 26 및 도 27에 도시되어 있다. 전반적인 서열 동일성 수준은 81%였으나, 트로카린에서는 있지 않는 N말단 프로펩타이드 서열(40 아미노산)에서 시작하는 브라운 스네이크 독 프로테아제에서는 많은 독특한 특징들이 있다. 프로펩타이드는 도 29에 도시된 바와 같이 프로펩타이드의 말단에서 R과 A 사이의 지역을 절단하는 것으로 예측되었다. 이는 인자 Ⅹ, Ⅸ, Ⅶ 및 다른 인자들을 포함하는 일련의 지혈성(haemostatic) 인자들 및 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제와 관계있는 이들의 전구체를 나타내는 BLAST 검색에 의해 지지된다. 프로펩타이드 KRANS---EE---EREC의 말단에서 이 서열과 Ca²⁺를 결합시키는 기능에 중요한 부가적인 글루타민산 잔기들이 잘 보존된다. 게다가, 아미노산 잔기 200의 바로 말단부의 중사슬과 경사슬 RIVNGMD[SEQ ID NO: 45] 사이에 절단지역 또는 절단부를 포함하는 보존된 수개의 서열 블록들이 있다.

정렬에서 명백한 트로카린과의 또 다른 차이는 트로카린에 없는 브라운 스네이크 독 프로테아제(잔기 182-209)에서 28개의 아미노산의 존재이다. 이 서열은 도 27A 및 도 29에 도시된 바와 같이 경사슬과 중사슬 사이의 예상된 절단지역까지 이끈다. 트로카린의 경사슬은 141개의 잔기들로 구성되고 아미노산 서열 KARNK[SEQ ID NO:46](조셉 등(Joseph et al.), 1999, Blood 94 621)로 끝난다. 브라운 스네이크 독 프로테아제 경사슬의 예상된 아미노산 서열은 도 29의 아미노산 176에서 시작하는 유사한 서열(KTRNK)[SEQ ID NO: 47]을 포함한다.

브라운 스네이크 독 프로테아제 경사슬은 이 지점에서 절단될 수 있으므로, 중사슬의 시작전에 최종 28 아미노산을 제거한다. 브라운 스네이크 독 프로테아제의 분자량은 43,587Da로 계산되었고, 상기 표시된 저점에서의 절단이 추정되며, 각각의 중사슬 및 경사슬은 분자량 27,952 및 15,652Da를 갖는 것으로 예상된다(표 13 참조).

SDS PAGE에 의해 분리된 단백질의 이동거리도 또한 브라운 스네이크 독 프로테아제의 분자량과 그 성분 사슬(데이터 미도시)을 측정하는데 사용하였다. 본래의 브라운 스네이크 독 프로테아제의 대략적인 분자량과 그 경사슬 및 중사슬은 SDS PAGE 데이터에 각각 기초한 53kDa, 35kDa 및 29kDa인 것으로 측정하였다(표 13 참조).

cDNA 뉴클레오티드 서열은 단백질이 절단되는지 또는 번역후 수정이 있는 지를 나타내지 않는다. 이로 인해, 트로카린은 (단백질 시퀀싱에 의해 측정된) 원래의 트로카린 아미노산 서열과 브라운 스네이크 독 프로테아제의 번역된 cDNA 뉴클레오티드 서열이 매우 유사하므로 모델로서 사용되었다. 원래의 트로카린의 분자량은 46,515Da인 것으로 측정되었다(조셉 등(Joseph et al.), 1999, Blood 94 621). 임의의 번역후 수정없이(post-translational modifications) 트로카린 아미노산 서열로부터 계산된 분자량은 약 42,455Da이다. 따라서, Glu 잔기, N-글리코실화(glycosylation) 및 O-글리코실화를 포함하는 번역후 수정의 약 4,060Da이다. 트로카린과 브라운 스네이크 독 프로테아제는 매우 유사하며, 따라서, 브라운 스네이크 독 프로테아제는 트로카린과 같은 유사한 번역후 수정을 가지는 것으로 예상될 수 있다. 이런 가정을 기초로, 번역후 수정의 브라운 스네이크 독 프로테아제와 절단된 경사슬의 분자량은 47,647Da이며, 이는 실험적으로 측정된 값 53 및 48kDa와 일치하다. 인자 Xa는 46kDa의 분자량을 갖는다(디 스키피오 등(Di Scipio et al.), 1977, Biochemistry 67 99). 이러한 계산된 분자량 47,647Da은 용액에서 브라운 스네이크 독 프로테아제의 농도를 측정하는데 사용되었다.

뱀에서 도출된 독 프로테아제 단백질들의 비교

살아있는 뱀에게 물린 종(road damaged specimens)들로부터 코스트 파이판, 인랜드 타이판, 브라운, 타이거, 레드 벨리 블랙 및 러프 스케일 스네이크로부터의 독(venom glands)을 제거하였고, 토탈 RNA를 RNA 추출을 위한 TRI Reagentⓒ법(시그마(Sigma), 캐슬 힐(Castle Hil), 오스트렐리아)을 통해 추출하였다. 그런 후, 제 1 스트랜드 cDNA를 RNA로부터 합성하였다. 그리고 나서, 브라운 스네이크 독 프로테아제로부터 추론된 예비 아미노산 서열로부터 설계된 변형 프라이머를 사용한 PCR을 통해 인자 Xa 유사 뱀 독 프로테아제 진(gene)에 대해 cDNA를 스크린하였다. 프로테아제 다른 영역들은 인자 Xa 유사 성분의 중사슬에 초점을 갖는, 다른 프라이머 세트를 사용하여, 증폭되었음을 유의하라. 모든 PCR 생성물은 1.5% TAE 아가로즈 젤에서 진행되었고, QIAEX Ⅱ 젤 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출되었으며, pGEM-T벡터 시스템(Promega, Annandale, Austrelia)에서 클론되었고, 뒤이어 ABI 프리즘 염색 종료자 싸이클 서열 준비 반응 키트(Prism Big Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit) (Perkin-Elmer, Boston, U.S.A)를 사용하여 서열화되었다. 그런 후, 5개 종 모두로부터 분리된 프로테아제들 사이의 서열 정렬을 수행하였다. 도 27은 본 발명의 브라운, 코스트 타이판, 레드 벨리 블랙, 타이거 및 러프 스케일 스네이크 프로테아제와 트로카린의 아미노산 정렬을 도시한 것이다. 도 28은 본 발명의 이들 프로테아제와 인간 인자 Xa의 아미노산 정렬을 도시한 것이다. 도 29는 본 발명의 모든 브라운, 코스트 타이판, 인랜드 타이판, 레드 벨리 블랙, 타이거 및 러프 스케일 스네이크 프로테아제와 나타낸 프로펩타이드, 경사슬 및 중사슬 도메인의 정렬을 도시한 것이다.

타이판, 타이거, 러프 스케일 및 레드 벨리 블랙 스네이크 독 프로테아제 단백질들을 부호화하는 핵산의 클로닝과 시퀀싱

뱀 독 프로테아제 단백질들을 부호화하는 각각의 전장 핵산들을 클론하였고, 타이판, 타이거, 러프 스케일 및 레드 벨리 블랙 스네이크로부터 서열화하였다. 상기 뱀 유도 핵산의 뉴클레오티드 서열와 공통 브라운 스네이크로부터의 뱀 독 프로테아제의 정렬은 많은 관심 지점들을 드러내었다. 이는, 레드 벨리 블랙 스네이크내에 하나의 아미노산 변경에 내성이 없는, 40 아미노산 프로펩타이드 아미노산 서열(도 29 및 도 30에서 도시된 잔기 1-40)내에서 거의 100%의 상동성을 포함한다. 프로펩타이드와 경사슬, 및 경사슬과 중사슬 사이의 절단지역의 영역내에서 고도의 보존이 또한 관찰된다(도 29 참조). 전반적으로 5개의 뱀들 사이에는 72% 정도의 상동성이 있다. 타이판 스네이크로부터의 프로테아제는 통상의 브라운 스네이크의 프로테아제와 가장 유사한 관계가 있으며 92% 상동성이 있고, 모두는 그룹C 프로트롬빈 활성제인 것으로 예측된다. 마찬가지로, 메인랜드 타이거 스네이크와 러프 스케일 스네이크로부터의 그룹 D 프로트롬빈 활성제들 사이에는 95%의 상동성을 갖는 고도의 유사성이 있다. 레드 벨리 블랙 스네이크 프로테아제가 5개의 뱀들중에 가장 뚜렸하다. 하나의 최종 관심 지점은 중사슬내에서 저 상동성 영역인데, 이 영역에서 삭제가 타이거, 레드 벨리 블랙 및 러프 스케일 스네이크내에서 관찰되고 이에 더하여 타이거와 러프 스네이크의 말단으로부터 프로테아제 11 아미노산의 미성숙(premature) 종결도 관찰된다.

트로카린과 인간 인자 Xa 및 모든 다른 알려진 단백질 모두로부터 명백한 뱀 독 프로테아제의 보존된 신규 영역들이 있다. 이들 영역들은 보존 서열로서 도 27-29에 또한 도시되어 있는 하기 사항을 포함한다.

KREASLPDFVQS (잔기 181-192) [SEQ ID NO:19]

LKKSDNPSPDIR (잔기 198-209) [SEQ ID NO:20]; 및

SVX₁VGELX₂X₃SR (잔기 260-270) [SEQ ID NO:21]

X₁, X₂ 및 X₃는 임의의 아미노산일 수 있으나, 바람직하기로, X₁ 은 V 이거나 I이고, X₂는 D 이거나 N이며, X₃는 R 이거나 I이다.

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK (잔기 1-29) [SEQ ID NO:22];

ANRFLQRTKR (잔기 31-40) [SEQ ID NO:23];

KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR (잔기 181-209) [SEQ ID NO:24]

여기서 X는 임의의 아미노산임; 그리고

MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR (잔기 1-40) [SEQ ID NO:25],

여기서 X는 임의의 아미노산임.

SEQ ID NO: 23, 24 및 25는 도 29에 도시된 바와 같이 아미노산 1-40을 포함하는 예상된 프로펩타이드에 해당되고 이에 따라 일실시예에서는 단백질 분해 소화 성숙 단백질(mature protein)의 일부를 형성할 수 없는 것이 명백해진다.

당업자는 도 27-29에 제공된 정렬 데이터를 기초로 한 본 발명의 프로트롬빈 활성 단백질의 다른 신규한 보존 영역을 식별할 수 있다.

유사하게, 본 발명의 프로트롬빈 활성 단백질을 부호화하는 신규한 보존 핵산은 도 30에 제공된 정렬 데이터로부터 결정될 수 있다. 이러한 신규한 핵산은 본 발명의 핵산을 증폭, 서열화 및/또는 식별하기 위해, 예를 들어, 특이 핵산 프라이머 및/또는 프로브를 소화하는데 유용할 수 있다.

피브린 글루

첨가된 브라운 스네이크 독 세린 프로테아제가 있는 시트레이트 플라즈마는 10mM Ca²⁺가 있는 상태와 없는 상태 모두에서 매우 빨리 응고되었다. 2개의 응고물의 매크로스코픽 조직(macroscopic texture)은 2개의 조제물에 대해 다른 것으로 나타난다.

쥐 꼬리정맥 출혈모델(Mouse Tail-Vein Bleeding Model)

꼬리정맥 출혈모델을 이용한 쥐에 항출혈제로서 작용하는 정화된 브라운 스네이크 독 프로테아제의 효과를 검사하였다. 이들 실험결과들이 표 14 및 15 그리고 도 32-33에 도시되어 있다.

약간의 변형으로 마스키 등(Masci et al. 2000)에 의해 본질적으로 기술된 바와 같은 쥐 꼬리정맥 출혈연구를 수행하였다. 결과들이 도 32 및 33과 표 14 및 15에 나타나 있다. P. textilis 프로테아제(250㎕; 0.02M Tris-HCl, pH7.4에 65㎍/㎖ P. textilis 프로테아제, 10mM CaCl₂)를 3분간 절단된 꼬리의 개방된 상처에 국부적으로 도포하였다. 사전에 무게를 잰 에펜도르프 관을 사용하여 혈액손실을 측정하였다. 정확도는 용량보다는 중량으로 혈액손실을 측정한 것으로 했다. 프로테아제로 국부적으로 처리된 모든 쥐들은 도 27에 도시된 바와 같은 상처지역에서 큰 응고를 보였다. 쥐들은 경추탈골을 통해 안락사시켰다.

절단된 쥐꼬리의 개방된 상처를 3분간 65㎍ 브라운 스테이크 독 프로테아제가 있거나 없이 250㎕ 0.9% 소듐 클로라이드(함염물 조절)에 담근 실험으로부터 표 15 및 도 28의 데이터를 얻었다. 중량으로 혈액손실을 측정하였다. 표 15 및 도 28에서 도시된 바와 같이, 공통인자는 응고혈액에 필요로 하지 않는다.

표 14와 15 및 도 28에서 도시된 바와 같이, 브라운 스네이크 독 프로테아제는 기술적 오차(Mann Whitney U test, p=0.02)가 교정되는 경우 대조동물(0.542±0.160)과 비교되는 쥐에서의 혈액손실(0.169g±0.086)을 상당히 감소시켰다.

실시예

종을 번갈은(cross-species) 비교를 위한 마이크로어레이 칩을 도입하고 약물수송에 사용하기 위한 P. textilis 의 독샘으로부터 cDNA 라이브러리의 생성

SMART cDNA 라이브러리 합성키트(클론텍사, 팔로알토, U.S.A)를 사용하여 λTriplEx2 벡터에서 클론된 cDNA와 크기가 600bp보다 더 큰 단편으로 타겟 스네이크의 독샘으로부터 추출된 메신저 RNA를 증폭시켰다. 타이판과 브라운 스네이크 모두로부터 이러한 cDNA 라이브러리를 생성하였고, 각 라이브러리로부터 약 30개의 전사(transcripts)상에서 사전 서열 분석을 수행하였다. 이 공정은 삽입물의 존재 및 크기를 검출하기 위해 PCR 증폭을 포함한 후, λTriplEx2를 pTriplEx2 플라스미드로의 변환 및 순차적인 시퀀싱을 수행하였다.

평균 증가된 삽입크기와 돌연변이로 인해, 마이크로칩의 도입을 위한 타이판 cDNA 라이브러리를 선택하기로 결정되었다. 연속해서, 큰 스케일의 PCR증폭과 정화를 위해 4800 cDNA 클론들을 무작위로 분리하였다. 그런 후, Queensland Institute of Medical Research내에서 이용가능한 GMS 417 어레이 스포터(spotter)를 사용하여 코팅된 유리 슬라이드상에 중복 스폿하였다. 그런 후, 칩에 혼성화를 기다리면서 (RNA 농도의 70배 증가에 까지 산출하는) 변형된 에버와인 안티센스(Eberwine antisense) RNA 증폭 프로토콜을 사용하여 상술한 스네이크의 독선으로부터의 RNA를 선형형태로 증폭시켰다.

논의

본 발명의 뱀 독 프로테아제들은 독특한 구조와 기능적 성질들을 갖는다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제들은 또한 일부 유사성을 인자 Xa와 O.scutellatus-프로트롬빈 활성제와 공유한다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제들은 Ca²⁺의 존재 없이 시트레이트 플라즈마를 응고시킨다. 인 비보, 인자 Xa는 또한 정상적인 응고를 위해 Ca²⁺의 존재를 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 인지질, 인자 Ⅴa 또는 Ca²⁺와 같은 인자들의 존재 없이도 혈액을 응고시킬 수 있다는 것이 신규하고 놀라운 관찰이다.

인자 Xa 특이 발색기질, S-2222는 본 발명의 뱀 독 프로테아제에 의해 절단된다. 이는 뱀 독 프로테아제가 인자 Xa에 매우 유사한 절단 특이성을 가짐을 나타낸다. 또한, Ca²⁺만이 2㎍/㎖의 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체보다 더 낮은 농도에서 S-2222 가수분해의 비를 높인 것이 흥미있다. 또한, NaSCN이 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체에 첨가되는 경우, S-2222 활성 모두가 유지되는 것은 아니다. 이들 관찰들은 O.scutellatus-프로트롬빈 활성제에 대한 스페이저 등(Speijer et al. 1986)에 의한 연구로부터 명백하다.

세파크릴 S-300을 사용한 간단한 젤 여과방법은 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체로부터 세린 프로테아제 성분의 분리에 상대적으로 열등한 것으로 증명되었다. 이는 정화에 필요한 크로마토그래피의 횟수로부터 명백하다. 지속적인 정화에도 불구하고, β-Me가 없는 상태에서 HPLC와 SDS PAGE에 의해 측정된 균질의 조제물을 최종적으로 얻었다.

SDS PAGE 결과는 브라운 스네이크 독 프로테아제가 본래 55 내지 65kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타난다. 브라운 스네이크 독 프로테아제는 60kDa O.scutellatus 인자 Xa 유사 프로테아제(스페이저 등, 1987, J. Biol. Chem. 261 13258)보다 54kDa 포유류 인자 Xa(만 등(Mann et al.), 1987)와 더 큰 유사성을 공유한다. 또한, 브라운 스네이크 독 프로테아제 사슬 구조는 O.scutellatus 인자 Xa 유사 세린 프로테아제보다 인자 Xa에 더 큰 유사성을 나타낸다.

SPS PAGE(+β-Me)는 디설파이드 브릿지(disulfide bridge)에 의해 함께 연결되는 브라운 스네이크 독 프로테아제가 2개의 펩타이드 사슬을 포함함을 나타낸다. 이는 브라운 스네이크 독 프로테아제의 시퀀싱으로부터 2개의 N말단 아미노산의 발견에 의해 더 지지된다. 그 결과로부터, 중사슬과 경사슬의 크기는 각각 약 31과 18kDa이나, 이는 총 프로테아제 분자량 55-56kDa과 일치하지 않는다. 본 발명의 브라운 스네이크 독 프로테아제와는 대조적으로, O.scutellatus 인자 Xa 유사 세린 프로테아제는 각각 30kDa로 구성된 2개의 사슬로 구성되는 것으로 발견되었다(스페이저 등, 1987, J. Biol. Chem. 261 13258).

T.carinatus 인자 Xa 유사 세린 프로테아제와 본 발명의 브라운 스네이크 독 프로테아제의 첫번째 11 아미노산 사이에 100%의 서열 상동성이 있다는 것은 흥미있는 관찰이었다. 이는 어느 정도의 (브라운 스네이크 독 프로테아제의 완전한 아미노산 서열로 나타난) 아미노산 서열 보존이 2개의 오스트렐리아산 뱀 독 프로트롬빈 활성제의 진화를 통해 발생했음을 보여준다. 서열 상동성이 또한 인자 Xa와 브라운 스네이크 독 프로테아제 사이에도 있으며, 몇몇 아미노산들은 뱀들과와 포유류의 진화에 보존되었음을 나타낸다. 그러나, 도 27 및 도 28에도 또한 도시된 바와 같이, 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 인자 Xa와 트로카린 및 본 출원인에게 알려진 다른 모든 단백질로부터 명백한 신규한 보존 영역들을 갖는다.

인자 Xa는 2개의 유사한 구조의 도메인, 인트라도메인(intradomain) 디설파이드 결합 및 그밖의 것들을 갖는 세린 프로테아제의 모든 전형적인 특징들을 갖는다(상기 스터브와 보드(Stubbs & Bode), 1944). 그러나, 세린 프로테아제들의 차는 그들의 특이 기능을 준다. 예를 들어, 인자 Xa 활성지역 틈이 트롬빈 틈보다 훨씬 더 벌어지며(상기 스터브와 보드(Stubbs & Bode), 1944), Arg274-Thr275과 Arg323-Ile324에 대한 인자 Xa 절단 특이성에 기여할 수 있다.

본 발명의 뱀 독 프로테아제에 대한 신규한 치료법은 국부 피브린 글루 제조용 시약과 같다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제는 현재 방법보다는 더 효율적인 피브린 글루 제조용 치료법을 제공할 수 있다. 본 발명의 뱀 독 프로테아제로 제조된 국부 피브린 글루는 외상에서 겪게되는 출혈을 크게 감소시킬 수 있으며, 따라서 가능하게는 많은 사람과 사람이 아닌 동물의 생명을 구할 수 있다. 예를 들어, 응급의료기구들은 사고시에 출혈을 막기 위해 본 발명의 뱀 독 프로테아제를 포함하는 피브린 글루가 스며든 밴드 등이 갖추어질 수 있다.

약어

A405 - 405㎚에서의 흡수도

Arg - 아르기닌(arginine)

AUFS - 405㎚에서의 흡수단위 풀 스케일

C - 시스테인(cystein)

Ca²⁺ - 칼슘이온

CaCl₂ - 칼슘 클로라이드

cm - 센티미터

D - 아스파르트산(aspartic acid)

E - 글루타민산(glutamic acid)

F - 페닐알라닌(phenylalamie)

G - 글리신(glycine)

HPLC - 고성능 액체 크로마토그래피

hr - 시간

I - 이소류신(Isoleucine)

Ile - 이소류신(Isoleucine)

K - 라이신(lysine)

kDa - 킬로 달톤(kilo Dalton)

L - 류신(leucine)

M - 메티오닌(methionine)

M - 몰

mg - 밀리그램

min - 분

㎖ - 밀리리터

mM - 밀리 몰

N - 아스파라긴

NaSCN - 소듐 티오시아네이트(sodium thiocyanate)

㎚ - 나노미터

O.scutellatus - 옥시우라누스 스쿠텔라투수(Oxyuranus scutellatus)

P.textilis - 쉐도나자 텍스틸리스(Pseudonaja textilis)

PAGE - 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel elecrophoresis)

PEG - 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)

Q - 글루타민

S - 세린

SDS - 소듐 도데실 설파이드

sec - 초

T - 트레오닌(threonine)

T.cariniatus - 트로피데키스 카리나투스(Tropidechis carinatus)

TFA - 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)

Thr - 트레오닌(threonine)

TOF - 비행시간(time of flight)

V - 발린(valine)

Y - 트리오신(tryosine)

β-Me - β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)

㎕ - 마이크로 리터

μmol - 마이크로 몰

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
NaSCN이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체	20.0	80.0	106.5	1.3	100
단계 1	15.0	25.7	51.2	2.0	48.1	1.5
단계 2	8.0	13.0	27.3	2.1	25.6	1.6
단계 3	5.5	7.3	17.2	2.4	16.1	1.8

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
NaSCN이 있는 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체	18.0	50.4	40.1	0.8	100
단계 1	5.0	13.0	13.1	1.0	32.6	1.2
단계 2	3.5	10.4	10.9	1.1	27.2	1.3

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
NaSCN + 브라운 스네이크 독 프로테아제 착체	10.0	89.0	32.5	0.4	100
슈퍼덱스200(단계 1)	20.0	7.0	9.2	1.3	28.3	3.25
슈퍼덱스200(단계 2)	40	3.0	4.4	1.5	13.5	3.75

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
브라운 스네이크 독 프로테아제 착체	32.0	38.4	501.2	13.1	100
슈퍼덱스200(단계 1)	9.0	17.1	231.3	13.5	46.1	1.0
슈퍼덱스200(단계 2)	9.5	16.2	168.2	10.4	33.6	0.8

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
독	25.0	700	2087	2.97	100
ConA 4B	640.0	379.0	97.3	0.257	4.6	0.09
CM-세파로즈	17.5	79.0	25.0	0.32	1.2	0.12
슈퍼덱스200	7.5	2.5	1	0.442	0.05	0.15

단계	샘플 용량(㎖)	총 A280	총 활성도(유닛)	특이 활성도(유닛/㎖/A280)	수율(%)	정화
브라운 스네이크 독 프로테아제 착체	22.0	20.9	110	5.3	100
페닐 세파로즈	10	4.85	14	2.9	12.7	0.55
슈퍼덱스200	3.5	1.14	6.4	5.6	5.8	1.1

조건	기울기	R2
A-브라운 SVP 착체 만	0.0022	0.9965
B-10mM CaCl2이 있는 브라운 SVP 착체	0.0025	0.9884
C-10mM CaCl2이 있는 브라운 SVP 착체 + 인지질	0.0041	0.9852

응고시간(초)	B SVP 착체(㎍)±보조성분
	단독	Ca2+	Ca2+와 PL
20	0.5	0.5	0.6
10	2.5	3	3

브라운 SVP(㎍/㎖)	응고시간(초) - Ca2+	응고시간(초) + Ca2+
39.000	27.3	14.9
26.000	35.1	18.7
13.000	38.4	23.4
6.500	51.6	24.0
2.600	>100	27.6
1.300	>100	34.5
0.650	>100	34.7

응고시간(초)	B SVP 착체(㎍)±보조성분
	단독	Ca2+	Ca2+와 PL
70	4	0.02	0.002
50	11	0.05	0.004

브라운 SVP(㎍/㎖)	ΔA405/분 - Ca2+	ΔA405/분 + Ca2+
39	0.70	1.11
19.5	0.33	0.90
13	0.26	0.36
6.5	0.15	0.24
2.6	0.12	0.11
1.3	0.06	0.09
0.65	0.03	0.05
0.33	0.01	0.01

응고형태	시간(초)
브라운 SVP	120
40mM CaCl2가 있는 브라운 SVP	60
CaCl2단독	1800

질량측정방법	분자량(DA)
	중사슬	경사슬	본래의 단백질
SDS PAGE	35000	29000	53000
질량 분석기			48000
프로펩타이드없이(잔기 1-40) cDNA 서열로부터의 계산	27952	18789	46723
프로펩타이드없이 그리고 경사슬은 트로카린의 잔기와 같이 141 잔기를 갖는 것으로 가정하고 cDNA로부터의 계산	27952	15652	43587
프로펩타이드, 141 잔기 경사슬, Gla 잔기 및 트로카린과 동일한 수준의 당질화가 없는 cDNA로부터의 계산			47647

처리	혈액손실(그램)(n=2)	상대적인 보존된 혈액(%)
함염물	0.4335
프로테아제/10mM Ca2+	0.0166	96.17

테스트	혈액손실(g)	대조	혈액손실(g)
1	0.12	1	0.64
2	0.16	2	0.71
3	0.29	3	0.42
4	0.10	5	0.39
평균혈액손실(g)±SD	0.169g±0.086	평균혈액손실(g)±SD	0.542±0.160

뱀 독	독 농도(㎎/㎖)	응고시간(초±0.5초)
A
Pseudonaja textilis-Qld	2.0	3.9
Pseudonaja textilis-SA	2.0	5.4
Pseudonaja textilis-Goyder Lagoon	2.0	8.4
Pseudonaja nuchalis	2.0	8.7
Pseudonaja affinis	2.0	5.5
Pseudonaja inframacula	2.0	7.9
Oxyuranus scutellatus	200.0	24.1
Oxyuranus microlepidotus	500.0	19.7
Nothechis scutatus	500.0	34.9
Nothechis ater niger	500.0	27.7
Nothechis ater serventyi	1,000.0	31.1
Hoplocephalus stephansii	1,000.0	36.2
Pseudechis porphiracus	500.0	48.6
Australaps surperba	1,000.0	38.7
Tropedechis carninatus	500.0	34.9
B
Australaps ramsayii	1,000.0	250>응고<600
Pseudechis guttatus	1,000.0	250>응고<600
Pseudechis australis	1,000.0	>100; 응고없음
Pseudechis colletti	1,000.0	>100; 응고없음
Acanthopis antarcticus	1,000.0	>100; 응고없음
Cryptophis nigrescens	1,000.0	>100; 응고없음
C
Bothrops jararaca	100.0	11.7
Agkistradom rhodasroma	100.0	6.3
Vipera russelli	500.0	>200
Naja naja	500.0	>200
Naja naja miolepis	500.0	>200
Echis carinatus	200.0	10.4
Bothrops atrox	100.0	5.3
Bungarus fasciatus	50.0	12.6
Ophiophagus hannah	100.0	>200; 약한 응고

명세서 전체를 통해 본 목적은 임의의 한 실시예 또는 특징들의 특이성 수집에 본 발명을 제한함이 없이 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하는 것이다. 따라서, 본 명세서에서 비추어, 여러 변형들 및 변경들이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 예로 든 구체적인 실시예들에서 이루어짐이 당업자들에게는 명백할 것이다.

본문의 내용 중에 있음.

Claims (56)

1. SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 경사슬 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 가진 경사슬 및 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 중사슬 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 갖고, 활성을 위해 칼슘을 필요로 하지 않는 중사슬의 하나 이상을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
2. 제 1 항에 있어서,

   SVP가 활성을 위해 인자 Va를 필요로 하지 않는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
3. 제 1 항에 있어서,

   SVP가 활성을 위해 인지질을 필요로 하지 않는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
4. 제 1 항에 있어서,

   SVP가 프로펩타이드 도메인을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
5. 제 1 항에 있어서,

   SVP가 활성 도메인을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
6. 제 1 항에 있어서,

   경서열 및 중서열이 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에 있는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
7. 제 1 항에 있어서,

   경서열 및 중서열이 다른 폴리펩타이드 사슬 상에 있는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
8. 제 1 항에 있어서,

   경사슬 및 중사슬 단백질이 존재하고 천연적으로 발생하는 종들과 길이가 동일하거나 매우 유사한 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
9. 제 1 항에 있어서,

   도 23의 6 SVP's의 임의의 것의 잔기 1-40과 적어도 31% 서열 동일성을 갖는 제 1 또는 프로펩타이드 도메인,

   도 23의 6 SVP's의 임의의 것의 잔기 40 및 41 사이의 경사슬 절단 부위;

   도 23의 SVP's의 임의의 것의 잔기 41-85와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 도메인;

   도 23의 SVP's의 임의의 것의 잔기 86-122와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 도메인;

   도 23의 SVP's의 임의의 것의 잔기 123-165와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 도메인;

   도 23의 SVP's의 임의의 것의 잔기 166-179와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 도메인;

   도 23의 잔기 180-182와 상응하는 도메인;

   도 23의 SVP's의 임의의 것의 잔기 183-209와 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 도메인; 및

   도 23의 잔기 210-467(브라운, 코스탈 타이판, 인랜드 타이판 또는 레드 밸리 블랙 서열의 경우) 또는 잔기 210-456(타이거 및 러프 스케일 서열의 경우)과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 도메인의 하나 이상을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
10. 제 1 항에 있어서,

    도 23의 잔기 H₂₅₁, D₃₀₉ 및 S₄₀₆을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
11. 제 1 항에 있어서,

    도 23의 SVP's의 임의의 것의 아미노산 292-305의 서열과 동일하거나 불과 5개 잔기가 차이나는 서열을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
12. 제 1 항에 있어서,

    완전히 가공된 경사슬 및 중사슬의 이합체 분자를 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
13. 제 1 항에 있어서,

    경사슬의 57 내지 62, 90 내지 101, 95 내지 110, 112 내지 121, 129 내지 140, 및 151 내지 164 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합, 중사슬의 216 내지 221, 236 내지 252, 377 내지 391, 및 402 내지 430 사이의 내부 사슬 Cys-Cys 결합, 및 경사슬의 172 및 중사슬의 329 사이의 사슬 간 Cys-Cys 결합을 갖는 경사슬 및 중사슬의 이합체 분자를 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
14. 제 1 항에 있어서,

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 1-40과 적어도 30% 서열 동일성을 갖는 제 1 또는 프로펩타이드 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 41-120과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 121-132와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 133-182와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 183-233과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 234-378과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 395-456과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 도메인;

    도 22의 SVP's의 임의의 것의 잔기 457-467과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 도메인의 하나 이상 또는 어떤 경우 전부(도 22에 일치 넘버링을 의미하는 넘버링)를 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
15. 제 1 항에 있어서,

    상기 SVP는 프로트롬빈의 완전 활성제이고,

    서열이 잔기 41(모든 참조는 도 21의 일치 넘버링이다)에서의 S, 잔기 48에서의 I, 잔기 50에서의 P, 잔기 74에서의 N, 잔기 104에서의 P, 잔기 105에서의 N, 잔기 123에서의 K, 잔기 127에서의 Q, 잔기 142에서의 R, 잔기 145-7에서의 SET, 잔기 154에서의 S, 잔기 156에서의 R, 잔기 159에서의 V, 잔기 167에서의 E, 잔기 169에서의 D, 잔기 178에서의 A 이외의 것이고; 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 임의의 것(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)의 서열 181-208의 적어도 하나의 잔기를 포함하고; 잔기 228에서의 I, 잔기 229에서의 N, 잔기 232에서의 G, 잔기 232에서의 E, 잔기 245에서의 H, 잔기 258-9에서의 SV이외의 것이고; 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 임의의 것(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)의 서열 260-270의 적어도 하나의 잔기를 포함하고; 잔기 274에서의 R, 잔기 286에서의 T, 잔기 292-300에서의 NYYY-VHQN, 잔기 303에서의 R, 잔기 305에서의 A, 잔기 314에서의 R, 잔기 339에서의 E, 잔기 345에서의 S, 잔기 353-360에서의 RIQFKQPT, 잔기 367에서의 I, 잔기 368에서의 T, 잔기 382에서의 D, 잔기 384에서의 R, 잔기 387에서의 Q, 잔기 389에서의 N, 잔기 424에서의 I, 잔기 342에서의 R, 잔기 451에서의 K, 잔기 454-455에서의 SL이외의 것이고; 또는 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 임의의 것(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)의 서열 457-467의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 특징들의 하나 이상을 갖는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
16. 제 1 항에 있어서,

    SVP가 프로트롬빈의 부분 완전 활성제이고,

    서열이 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 임의의 것(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)의 서열 181-208의 적어도 하나의 잔기를 포함하고; 또는 도 21의 브라운, 타이판, 레드 밸리, 타이거, 러프 스케일의 임의의 것(또는 타이판 인랜드의 상응하는 잔기)의 서열 260-270의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 특징들의 하나 이상을 갖는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
17. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 경사슬 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경사슬을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
18. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 경사슬 서열과 10 또는 그 이하의 잔기가 다른 경사슬을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
19. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 경사슬 서열을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
20. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 중사슬 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경사슬을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
21. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 중사슬 서열과 10 또는 그 이하의 잔기가 다른 중사슬을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
22. 제 1 항에 있어서,

    제제가 SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 임의의 것의 중사슬 서열을 포함하는 뱀 독 프로테아제(SVP)의 분리된 제제.
23. a) SEQ ID NOs:2, 5, 8, 11, 14 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;

    b) SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18인 핵산 서열 또는 SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 전체 보체를 포함하는 핵산 분자;

    c) SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 분자;

    d) 도 23의 6개 SVPs의 임의의 것의 아미노산 잔기 41 내지 179를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

    e) 도 29의 브라운, 코스탈 타이판, 인랜드 타이판 또는 레드 밸리 서열의 경우, 아미노산 잔기 210 내지 467 또는 도 23의 타이거 또는 러프 스케일 서열의 경우, 아미노산 잔기 210 내지 456를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

    f) 도 23의 6개 SVPs의 임의의 것의 아미노산 잔기 1 내지 40개를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

    g) 도 23의 6개 SVPs의 임의의 것의 아미노산 잔기 180 내지 209 또는 아미노산 잔기 183 내지 209를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리된 핵산.
24. 제 23 항에 있어서,

    벡터 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 분자.
25. 제 23 항에 있어서,

    이형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 분자.
26. 제 23 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
27. 제 23 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
28. 핵산 분자가 발현되는 상태하에서 제 27 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 SVP 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
29. 조성물의 pH가 약 5 내지 9인 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
30. 제 29 항에 있어서,

    조성물의 pH가 약 6.5 내지 7인 조성물.
31. 제 1 항의 폴리펩타이드 및 폴리올을 포함하는 조성물.
32. 제 31 항에 있어서,

    폴리올이 글리세롤인 조성물.
33. 제 1 항의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
34. 제 1 항의 폴리펩타이드, 및 사용을 위한 지침; 다른 시약; 희석제; 투여를 위한 뱀 독 프로타아제를 제조하기 위한 장치 또는 다른 물질; 약학적으로 허용가능한 담체; 및 피험자에게 투여하기 위한 장치 또는 다른 물질의 하나 이상을 포함하는 키트.
35. 제 34 항에 있어서,

    키트가 보조 인자, 항생제, 항바이러스 작용제 및 항곰팡이 작용제, 항기생충제, 항염증제, 항히스타민제, 항-박테리아제, 항섬유소용해제와 같은 항균제 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 키트.
36. 제 35 항에 있어서,

    칼슘, 인지질 및 인자 Va로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 보조 인자를 더 포함하는 키트.
37. 제 1 항의 SVP를 피험자에게 투여하여 치료하는 것을 포함하는 피험자 치료 방법.
38. 제 37 항에 있어서,

    피험자 신체 상 또는 내의 위치의 출혈을 억제하는 피험자 치료 방법.
39. 제 38 항에 있어서,

    상기 위치가 의료적 또는 외과적 처치 위치인 피험자 치료 방법.
40. 제 38 항에 있어서,

    상기 위치가 원치 않는 외상 위치인 피험자 치료 방법.
41. 제 38 항에 있어서,

    상기 피험자가 혈액 덩어리를 형성 또는 유지하는 능력에 결함이 있는 피험자 치료 방법.
42. 제 41 항에 있어서,

    상기 결함이 유전적 결함 또는 혈액 덩어리를 형성 또는 유지하는 피험자의 능력을 감소시키는 약물의 투여에 의한 결과에 의한 피험자 치료 방법.
43. 제 37 항에 있어서,

    상기 SVP가 피험자 이외의 사람에 의해 투여되는 피험자 치료 방법.
44. 제 37 항에 있어서,

    상기 SVP가 자가 투여되는 피험자 치료 방법.
45. 제 37 항에 있어서,

    상기 SVP가 사용할 필요가 있기 전에 피험자에게 제공되는 피험자 치료 방법.
46. 제 37 항에 있어서,

    상기 SVP가 이의 사용 지침에 따라 차액 용기(liquid resistant container)에 제공되는 피험자 치료 방법.
47. 액체 또는 가스 차단 용기에 넣어진 제 1 항의 SVP 제제.
48. 제 47 항에 있어서,

    상기 용기가 SVP를 액체, 스프레이, 에에로졸, 분말 또는 결정 형태로 조제하도록 형성되어진 제제.
49. 제 48 항에 있어서,

    상기 용기가 SVP를 계량된 복용량 또는 예정된 복용량으로 조제하도록 형성되어진 제제.
50. 피험자에 접촉될 때 출혈을 억제하는데 충분한 제 1 항의 SVP의 양이 넣어진 장치.
51. 제 50 항에 있어서,

    상기 장치가 붕대, 압박 붕대, 상처 드레싱, 봉합사 또는 의복의 임의의 것인 장치.
52. 제 1 항 또는 제 23 항의 SVP의 핵산 또는 단백질 서열이 저장된 기계-판독 가능 매체.
53. SVP 핵산 또는 아미노산 서열을 제공하는 단계 및 이 SVP 서열을 제 2 서열과 비교하거나 상기 서열을 한 컴퓨터에서 다른 컴퓨터로 전송하는 단계를 포함하여 SVP를 분석하는 방법.
54. 브라운, 인랜드 타이판, 코스탈 타이판, 레드 밸리, 타이거 또는 러프 스케일 스네이크의 임의의 것으로부터의 핵산 라이브러리.
55. 브라운, 인랜드 타이판, 코스탈 타이판, 레드 밸리, 타이거 또는 러프 스케일 스네이크의 임의의 것으로부터의 단백질 라이브러리.
56. 하기 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드:

    (여기서, X₁, X₁₀, X_12-13, X_15-16, X_19-23, X ₂₅, X_27-30, X_33-34, X₃₇, X₃₉, X_42-47, X₅₀, X_53-56, X_58-62, X₆₄, X₇₉, X_81-83, X_85-94 , X₉₆, X_99-105, X_108-109, X_113-115 및 X_117-119 는 임의의 아미노산 잔기로부터 각각 독립적으로 선택된다;

    X₂, X₆, X₁₁, X₁₄, X₂₆, X₃₁, X₄₈ , X₅₇ 및 X₆₃의 각각은 소형 아미노산 잔기이다;

    X₃, X₄, X₈, X₁₇, X_35-36, X₃₈, X_51-52 , X₇₈, X₈₀, X₈₄, X₉₅, X₉₈, X_106-107 , X_111-112 및 X₁₁₆의 각각은 소수성 아미노산 잔기이다;

    X₅, X₇ 및 X₁₁₀의 각각은 염기 아미노산 잔기이다;

    X₉, X_40-41 및 X₄₉는 대전된 아미노산 잔기이다;

    X₂₄는 산성 아미노산 잔기이다;

    X₃₂는 중성/극성 아미노산 잔기이다;

    X_65-67, X_70-72 및 X₇₅는 각각 독립적으로 없거나 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된다;

    X₆₈ 및 X₇₄는 각각 독립적으로 없거나 산성 아미노산 잔기로부터 선택된다;

    X₆₉, X₇₃ 및 X₇₉는 각각 독립적으로 없거나 소수성 아미노산 잔기로부터 선택된다;

    X₇₇은 없거나 소형 아미노산 잔기 이다; 및

    Z는 없거나 1-20 아미노산의 펩타이드이다).