JP2002528058A - コントートロスタチン（ｃｎ）、並びに転移及び他の症状の抑制におけるその使用方法 - Google Patents
コントートロスタチン（ｃｎ）、並びに転移及び他の症状の抑制におけるその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】コントートロスタチン前駆体に対する完全長のｃＤＮＡと推定アミノ酸配列を得るためのクローニング戦略で、天然のコントートロスタチンのアミノ酸配列を使用した。該前駆体は、マルチドメインタンパク質のプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、及びディスインテグリン（コントートロスタチン）を含む。該配列は、発現時に、生物学的に活性な変種と断片を含むコントートロスタチンタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を作るために使用できる。薬学的に許容される組成物として処方されると、前記タンパク質は、インテグリン受容体へのインテグリンの結合と関連する疾病過程を阻害することによって、患者を治療するために使用できる。
Description
【０００１】
発明の分野 本発明は、一般的には、生物化学及び医学の分野に関し、具体的には、コント
ートロスタチン及びその前駆体のクローニング、配列決定、及び製造に関する。
ートロスタチン及びその前駆体のクローニング、配列決定、及び製造に関する。
【０００２】
発明の背景 乳癌は、非喫煙女性の主たる死因の一つであり、胸から離れた部位への本疾病
の広がりは、乳癌患者における主要な死因である。６０％を超える乳癌患者が、
診断時に、胸の原発部位から幾つかの離れた部位に広がった疾病を有しているで
あろう。転移と呼ばれるプロセスである離れた部位、例えば、骨、肺、肝臓、脳
への癌の広がりは、悪性腫瘍の特徴であり、多くの場合、手術不可能な疾病に至
る。転移は、乳癌による死をもたらす最も一般的な要因である。転移の制御は、
乳癌治療のための重要な道筋を与える。癌細胞は、血管又はリンパ管を通じて転
移する。転移の第１の工程は、細胞表面のインテグリンや他の接着受容体を介し
て、原発部位の周囲の組織、すなわち細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への癌細胞
の付着を含む。インテグリンは、細胞−細胞相互作用及び細胞−基層相互作用を
媒介し、ＥＣＭを細胞骨格タンパク質とリンクする双方向性のシグナリングに関
与している。インテグリンは、乳癌細胞とＥＣＭとの相互作用において重要な役
割を果たしている。第２の工程では、癌細胞は、周囲の組織を分解して、腫瘍細
胞がこれらの組織に浸潤し得るようにする消化酵素を分泌する。最後に、腫瘍細
胞は、血液又はリンパ系に入り、ここで、遠くの（転移）部位での接着及び浸潤
工程を繰り返す。この離れた部位で、腫瘍細胞は、増殖する腫瘍の中及び周囲に
新しい血管の形成を誘導する（新血管形成と称されるプロセス）。これらの新し
い血管は、転移した腫瘍に栄養分を供給して、腫瘍を増殖させる。これらの工程
の何れかをブロックする処置は、転移を阻害するように働くはずである。
の広がりは、乳癌患者における主要な死因である。６０％を超える乳癌患者が、
診断時に、胸の原発部位から幾つかの離れた部位に広がった疾病を有しているで
あろう。転移と呼ばれるプロセスである離れた部位、例えば、骨、肺、肝臓、脳
への癌の広がりは、悪性腫瘍の特徴であり、多くの場合、手術不可能な疾病に至
る。転移は、乳癌による死をもたらす最も一般的な要因である。転移の制御は、
乳癌治療のための重要な道筋を与える。癌細胞は、血管又はリンパ管を通じて転
移する。転移の第１の工程は、細胞表面のインテグリンや他の接着受容体を介し
て、原発部位の周囲の組織、すなわち細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への癌細胞
の付着を含む。インテグリンは、細胞−細胞相互作用及び細胞−基層相互作用を
媒介し、ＥＣＭを細胞骨格タンパク質とリンクする双方向性のシグナリングに関
与している。インテグリンは、乳癌細胞とＥＣＭとの相互作用において重要な役
割を果たしている。第２の工程では、癌細胞は、周囲の組織を分解して、腫瘍細
胞がこれらの組織に浸潤し得るようにする消化酵素を分泌する。最後に、腫瘍細
胞は、血液又はリンパ系に入り、ここで、遠くの（転移）部位での接着及び浸潤
工程を繰り返す。この離れた部位で、腫瘍細胞は、増殖する腫瘍の中及び周囲に
新しい血管の形成を誘導する（新血管形成と称されるプロセス）。これらの新し
い血管は、転移した腫瘍に栄養分を供給して、腫瘍を増殖させる。これらの工程
の何れかをブロックする処置は、転移を阻害するように働くはずである。
【０００３】 癌細胞上のインテグリンは、腫瘍の浸潤と広がりに重要な役割を果たしている
。それらは、細胞間の相互作用、及び細胞とそれらの周囲との相互作用を媒介す
る多くの細胞種の細胞表面上に見出されるタンパク質のファミリーである。ＣＮ
は、血液の血小板表面上にある特定のインテグリンに結合し、血小板が互いに接
着する能力（血小板凝集と称されるプロセス）をブロックする。血小板は、血流
中に見出される骨髄細胞の小さな断片である。それらは、有益な働きと有害な働
きの両者を併有している。それらの有用な作用は、血餅の形成を促進することに
よって、負傷後の出血を止めることである。しかし、ある条件下では、それらは
、心臓への栄養を供給する動脈をブロックするのに関与しており、この作用は、
心臓発作をもたらすことがある。インテグリンは、細胞−細胞及び細胞−基層相
互作用に関与するαサブユニットとβサブユニットから構成されるヘテロダイマ
ーである。インテグリンは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネク
チン、コラーゲン、及びラミニン（ｌａｍｉｎｅｎ）のような細胞外マトリック
スタンパク質に対する受容体として働く。これらの相互作用のうちの幾つかは、
マトリックスタンパク質中に存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を
介して媒介されることが示されている。αサブユニットとβサブユニットの両者
が、フィブリノーゲンの結合に必要とされる。例えば、インテグリン細胞表面受
容体のスーパーファミリーのメンバーの１つは、血小板の凝集で血漿フィブリノ
ーゲンと相互作用する血小板膜糖タンパク質（ＧＰ）IIｂ／IIIａである。イン
テグリン細胞表面受容体は、急性心筋梗塞の発症で、血小板が冠状動脈の血栓症
と再血栓症を媒介する役割について調べられてきた［Ｚｕｃｋｅｒ，Ｍ．Ｂ．，
Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：８６（１９９０）］。血小板の凝集に関し
ては、フィブリノーゲン中に存在するＲＧＤ配列が、（ＧＰ）IIｂ／IIIａとの
相互作用に不可欠である［Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．５９：１（１９８８）］。その血小板凝集の
阻害故に、ヘビ毒は、様々な研究の対象になってきた。
。それらは、細胞間の相互作用、及び細胞とそれらの周囲との相互作用を媒介す
る多くの細胞種の細胞表面上に見出されるタンパク質のファミリーである。ＣＮ
は、血液の血小板表面上にある特定のインテグリンに結合し、血小板が互いに接
着する能力（血小板凝集と称されるプロセス）をブロックする。血小板は、血流
中に見出される骨髄細胞の小さな断片である。それらは、有益な働きと有害な働
きの両者を併有している。それらの有用な作用は、血餅の形成を促進することに
よって、負傷後の出血を止めることである。しかし、ある条件下では、それらは
、心臓への栄養を供給する動脈をブロックするのに関与しており、この作用は、
心臓発作をもたらすことがある。インテグリンは、細胞−細胞及び細胞−基層相
互作用に関与するαサブユニットとβサブユニットから構成されるヘテロダイマ
ーである。インテグリンは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネク
チン、コラーゲン、及びラミニン（ｌａｍｉｎｅｎ）のような細胞外マトリック
スタンパク質に対する受容体として働く。これらの相互作用のうちの幾つかは、
マトリックスタンパク質中に存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を
介して媒介されることが示されている。αサブユニットとβサブユニットの両者
が、フィブリノーゲンの結合に必要とされる。例えば、インテグリン細胞表面受
容体のスーパーファミリーのメンバーの１つは、血小板の凝集で血漿フィブリノ
ーゲンと相互作用する血小板膜糖タンパク質（ＧＰ）IIｂ／IIIａである。イン
テグリン細胞表面受容体は、急性心筋梗塞の発症で、血小板が冠状動脈の血栓症
と再血栓症を媒介する役割について調べられてきた［Ｚｕｃｋｅｒ，Ｍ．Ｂ．，
Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：８６（１９９０）］。血小板の凝集に関し
ては、フィブリノーゲン中に存在するＲＧＤ配列が、（ＧＰ）IIｂ／IIIａとの
相互作用に不可欠である［Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．５９：１（１９８８）］。その血小板凝集の
阻害故に、ヘビ毒は、様々な研究の対象になってきた。
【０００４】 Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ及びＶｉｐｅｒｉｄａｅ科のヘビの毒から精製された多
くのタンパク質は、糖タンパク質（ＧＰ）IIｂ／IIIａを介した血小板の凝集を
阻害することが見出されている［例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２；１６１５７（１９８７）；Ｇａｎ，Ｚ．Ｒ
． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９８２７（１９８８）
；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１
６：７１４（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｓｉｓ ４（Ｓｕｐｐｌ．１）：１０５（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６（Ｓｕｐｐｌ．１）：４７９ａ（１９９０）；
Ｈｏｌａｈａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４２：３
４０（１９９１）；Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ ８２：１６９（１９９０）；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：１０３８（１９９１）参照］。ディスインテグリ
ンとして分類されるこれらのタンパク質は、典型的には、ジスルフィドが豊富で
ある。さらに、バルブリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）を除く［Ｓｃａｒｂｏｒｏｕ
ｇｈ，Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９（
１９９１）］これまでに単離された全てのディスインテグリンは、インテグリン
によって媒介される相互作用の阻害への関与が示されているＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ）配列を含有する。特に、ディスインテグリンのＲＧＤ配列は、血
小板の膜上にあるフィブリノーゲン結合部位を競合することにより、ＡＤＰ又は
他の媒介物によって誘導された血小板の凝集を阻害するかもしれない。
くのタンパク質は、糖タンパク質（ＧＰ）IIｂ／IIIａを介した血小板の凝集を
阻害することが見出されている［例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２；１６１５７（１９８７）；Ｇａｎ，Ｚ．Ｒ
． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９８２７（１９８８）
；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１
６：７１４（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｓｉｓ ４（Ｓｕｐｐｌ．１）：１０５（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６（Ｓｕｐｐｌ．１）：４７９ａ（１９９０）；
Ｈｏｌａｈａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４２：３
４０（１９９１）；Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ ８２：１６９（１９９０）；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：１０３８（１９９１）参照］。ディスインテグリ
ンとして分類されるこれらのタンパク質は、典型的には、ジスルフィドが豊富で
ある。さらに、バルブリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）を除く［Ｓｃａｒｂｏｒｏｕ
ｇｈ，Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９（
１９９１）］これまでに単離された全てのディスインテグリンは、インテグリン
によって媒介される相互作用の阻害への関与が示されているＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ）配列を含有する。特に、ディスインテグリンのＲＧＤ配列は、血
小板の膜上にあるフィブリノーゲン結合部位を競合することにより、ＡＤＰ又は
他の媒介物によって誘導された血小板の凝集を阻害するかもしれない。
【０００５】 それにもかかわらず、ディスインテグリンが、ＲＧＤ部位のみに基づく機序と
は異なる機序によって、インテグリンとの相互作用を促進するユニークな表面構
造を有するかもしれないというますます多くの証拠が存在するようである。例え
ば、（ＲＧＤ配列中のアルギニンがアラニンに置換された）エキスタチンの変異
し、化学的に合成された誘導体が、なお、幾らかの生物活性を保持するという発
見は、このタンパク質の他の領域が結合に関与しているかもしれず、ＲＧＤ結合
部位には幾らかの柔軟性が存在し得ることを示唆している［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，
Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２（Ｓｕｐｐｌ．III）
：６６０（１９９０）］。合成ＲＧＤペプチドは、一般的には、それらの小さな
サイズのためにディスインテグリンの分子構造的特徴を有していないので、ディ
スインテグリンの結合に関与しているであろう複数の機序を介して相互作用する
ことができない。
は異なる機序によって、インテグリンとの相互作用を促進するユニークな表面構
造を有するかもしれないというますます多くの証拠が存在するようである。例え
ば、（ＲＧＤ配列中のアルギニンがアラニンに置換された）エキスタチンの変異
し、化学的に合成された誘導体が、なお、幾らかの生物活性を保持するという発
見は、このタンパク質の他の領域が結合に関与しているかもしれず、ＲＧＤ結合
部位には幾らかの柔軟性が存在し得ることを示唆している［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，
Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２（Ｓｕｐｐｌ．III）
：６６０（１９９０）］。合成ＲＧＤペプチドは、一般的には、それらの小さな
サイズのためにディスインテグリンの分子構造的特徴を有していないので、ディ
スインテグリンの結合に関与しているであろう複数の機序を介して相互作用する
ことができない。
【０００６】 他の研究では、イヌのモデル系で組織型のプラスミノーゲン活性化因子を用い
た血栓溶解後の再閉塞の防止が、３μｇ／ｋｇ／分のビチスタチン（Ｂｉｔｉｓ
ａｒｉｅｔａｎｓの毒に由来する８３アミノ酸のディスインテグリン［Ｓｈｅ
ｂｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，上記］）、又は１５μｇ／ｋｇ／分、静脈内、エチ
スタチン（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓの毒に由来する４９アミノ酸のディ
スインテグリン）を加えた３０μｇ／ｋｇを用いて報告されてきた［Ｈｏｌａｈ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，上記］。報告された方法では、対照と比べて活性化部分ト
ロンボプラスチン時間を少なくとも１．５倍に増加させるために、ヘパリンの初
回大量瞬時投与（１００Ｕ／ｋｇ ｉ．ｖ．）とその後の１時間毎の５０Ｕ／ｋ
ｇの大量瞬時投与が使用された。以前には、組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔＰＡ）と組み合わせたヘパリンは、このモデル系で、急性再閉塞の発生に影
響を与えないことが観察されてきたが、エチスタチン又はビチスタチンを加える
と、急性血栓症の再閉塞の発生の劇的な減少がもたらされる。しかしながら、ヘ
パリンの投与は、急性血栓症の再閉塞を防止するのに、明らかに必要であった。
た血栓溶解後の再閉塞の防止が、３μｇ／ｋｇ／分のビチスタチン（Ｂｉｔｉｓ
ａｒｉｅｔａｎｓの毒に由来する８３アミノ酸のディスインテグリン［Ｓｈｅ
ｂｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，上記］）、又は１５μｇ／ｋｇ／分、静脈内、エチ
スタチン（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓの毒に由来する４９アミノ酸のディ
スインテグリン）を加えた３０μｇ／ｋｇを用いて報告されてきた［Ｈｏｌａｈ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，上記］。報告された方法では、対照と比べて活性化部分ト
ロンボプラスチン時間を少なくとも１．５倍に増加させるために、ヘパリンの初
回大量瞬時投与（１００Ｕ／ｋｇ ｉ．ｖ．）とその後の１時間毎の５０Ｕ／ｋ
ｇの大量瞬時投与が使用された。以前には、組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔＰＡ）と組み合わせたヘパリンは、このモデル系で、急性再閉塞の発生に影
響を与えないことが観察されてきたが、エチスタチン又はビチスタチンを加える
と、急性血栓症の再閉塞の発生の劇的な減少がもたらされる。しかしながら、ヘ
パリンの投与は、急性血栓症の再閉塞を防止するのに、明らかに必要であった。
【０００７】 同様に、重層した高度の狭窄を有する冠状動脈血栓のイヌのモデルで、キスト
リン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａの毒に由来する６８アミ
ノ酸のディスインテグリン）は、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子と組
み合わせて評価された［Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）、上記］。
４μｇ／ｋｇ／分の有効量が、再閉塞を防ぐのに十分であることが決定された。
同時全身治療用のヘパリン抗凝固が使用された。ヘパリンの用量は、実験観察期
間を通じて、２倍を超える活性化部分トロンボプラスチン時間を維持するように
選択した。
リン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａの毒に由来する６８アミ
ノ酸のディスインテグリン）は、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子と組
み合わせて評価された［Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）、上記］。
４μｇ／ｋｇ／分の有効量が、再閉塞を防ぐのに十分であることが決定された。
同時全身治療用のヘパリン抗凝固が使用された。ヘパリンの用量は、実験観察期
間を通じて、２倍を超える活性化部分トロンボプラスチン時間を維持するように
選択した。
【０００８】 Ｈｕａｎｇらの米国特許第５、０６６、５９２号は、ヒトの血小板へのフィブ
リノーゲンの結合を阻害することにより、フィブリノーゲンによって誘導される
ヒト血小板の凝集を阻害するために、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎ
ｅｕｓの毒から単離された７２アミノ酸のディスインテグリンであるトリグラミ
ン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎ）の使用を記載している。トリグラミンは、フォンビル
ブラント因子の血小板への結合を阻害することも報告されている。トリグラミン
は、濃度依存的に、２．８〜５．６×１０−８ＭのＩＣ５０で、１２５Ｉ−フィ
ブリノーゲンのＡＤＰ（１０μＭ）刺激された血小板への結合を阻害することが
報告されている。
リノーゲンの結合を阻害することにより、フィブリノーゲンによって誘導される
ヒト血小板の凝集を阻害するために、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎ
ｅｕｓの毒から単離された７２アミノ酸のディスインテグリンであるトリグラミ
ン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎ）の使用を記載している。トリグラミンは、フォンビル
ブラント因子の血小板への結合を阻害することも報告されている。トリグラミン
は、濃度依存的に、２．８〜５．６×１０−８ＭのＩＣ５０で、１２５Ｉ−フィ
ブリノーゲンのＡＤＰ（１０μＭ）刺激された血小板への結合を阻害することが
報告されている。
【０００９】 Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒
からの抗血小板因子アプラジン（ａｐｐｌａｇｉｎ）の単離も報告されている［
Ｃｈａｏ，Ｂ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８０５０（１９８９）；Ｓａｖａｇｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１７６６（１９９０）］。トリグラミンとは異
なり、アプラジンは、用量依存的に、血小板凝集の阻害と同時に密顆粒分泌を阻
害することが報告されている。最初は、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド架橋
を有するホモダイマーとして記載されたが［Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）上記］、その後の報告は、質量分析器による精製されたアプラジンの分析は
、７，６６６ダルトンの質量を有するアプラジンモノマーの存在を示し、二量体
化の証拠がないことを示した［Ｗｅｎｃｅｌ−Ｄｒａｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ
．，Ｂｌｏｏｄ ８１：６２（１９９３）］。
からの抗血小板因子アプラジン（ａｐｐｌａｇｉｎ）の単離も報告されている［
Ｃｈａｏ，Ｂ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８０５０（１９８９）；Ｓａｖａｇｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１７６６（１９９０）］。トリグラミンとは異
なり、アプラジンは、用量依存的に、血小板凝集の阻害と同時に密顆粒分泌を阻
害することが報告されている。最初は、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド架橋
を有するホモダイマーとして記載されたが［Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）上記］、その後の報告は、質量分析器による精製されたアプラジンの分析は
、７，６６６ダルトンの質量を有するアプラジンモノマーの存在を示し、二量体
化の証拠がないことを示した［Ｗｅｎｃｅｌ−Ｄｒａｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ
．，Ｂｌｏｏｄ ８１：６２（１９９３）］。
【００１０】 特に興味深いディスインテグリンの１つが、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎ
ｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から単離
されたＣＮである。最初に報告された精製操作は、セファデックスＧ−１００
ＳＦ上での分子ふるいクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５Ｆ上での脱
塩、及び逆相ＨＰＬＣを含んでいた。ヒト血小板が豊富な攪拌されたのＡＤＰで
増強された凝集とＣＮによるその阻害が、３７℃でモニターされた。血小板が豊
富な血漿（３×１０５／ｍｍ３）を、セファデックスＧ−１００ ＳＦ後の低分
子量のピーク５μＬとともに１分間プレインキュベートすると、１０μＭのＡＤ
Ｐによって誘導された血小板の凝集が７６％阻害されることが見出された［Ｔｒ
ｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、上記］。
ｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から単離
されたＣＮである。最初に報告された精製操作は、セファデックスＧ−１００
ＳＦ上での分子ふるいクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５Ｆ上での脱
塩、及び逆相ＨＰＬＣを含んでいた。ヒト血小板が豊富な攪拌されたのＡＤＰで
増強された凝集とＣＮによるその阻害が、３７℃でモニターされた。血小板が豊
富な血漿（３×１０５／ｍｍ３）を、セファデックスＧ−１００ ＳＦ後の低分
子量のピーク５μＬとともに１分間プレインキュベートすると、１０μＭのＡＤ
Ｐによって誘導された血小板の凝集が７６％阻害されることが見出された［Ｔｒ
ｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、上記］。
【００１１】 その後の報告で、未精製の毒では、血小板凝集活性が存在するために、阻害剤
は容易に検出することができないが、精製の第１工程（疎水性相互作用ＨＰＬＣ
）後には、凝集活性と前記毒の中に存在するα鎖分解性繊維素溶解酵素の両者か
ら阻害活性が分離されることが明らかとなった。ＨＰＬＣ後に、阻害活性がプー
ルされ、ヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣカラムにアプライされた。精製の最終
工程では、Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが使用された。均一なタンパク
質の収量は、毒１ｇ当たり３〜５ｍｇであった。ＣＮは、非還元条件下では、１
８〜２１ｋＤａの分子量を有し、還元条件下では、９ｋＤａの分子量を有するこ
とが報告された。このため、該分子は、ジスルフィド結合によって互いに固定さ
れた２つのサブユニットを有するホモダイマーであると考えられた。等電点電気
泳動は、該タンパク質が酸性のｐＩを有することを示した。ＣＮは、分子サイズ
と血小板凝集阻害の速度論に基づいて、繊維素溶解活性を示さず、５’−ヌクレ
オチダーゼ又はホスホリパーゼでないことが報告された。１分間プレインキュベ
ートすると、約１００ｎＭのＣＮが、ＡＤＰによって誘導された血小板の凝集を
完全に阻害することが報告された［Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、
上記］。
は容易に検出することができないが、精製の第１工程（疎水性相互作用ＨＰＬＣ
）後には、凝集活性と前記毒の中に存在するα鎖分解性繊維素溶解酵素の両者か
ら阻害活性が分離されることが明らかとなった。ＨＰＬＣ後に、阻害活性がプー
ルされ、ヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣカラムにアプライされた。精製の最終
工程では、Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが使用された。均一なタンパク
質の収量は、毒１ｇ当たり３〜５ｍｇであった。ＣＮは、非還元条件下では、１
８〜２１ｋＤａの分子量を有し、還元条件下では、９ｋＤａの分子量を有するこ
とが報告された。このため、該分子は、ジスルフィド結合によって互いに固定さ
れた２つのサブユニットを有するホモダイマーであると考えられた。等電点電気
泳動は、該タンパク質が酸性のｐＩを有することを示した。ＣＮは、分子サイズ
と血小板凝集阻害の速度論に基づいて、繊維素溶解活性を示さず、５’−ヌクレ
オチダーゼ又はホスホリパーゼでないことが報告された。１分間プレインキュベ
ートすると、約１００ｎＭのＣＮが、ＡＤＰによって誘導された血小板の凝集を
完全に阻害することが報告された［Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、
上記］。
【００１２】 さらに、ＣＮは、５〜６個のジスルフィド架橋を持つ７０アミノ酸を有し、Ｃ
Ｎの配列は、アプラジン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐ
ｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から得られる血小板凝集阻害剤）の１０アミノ酸下流か
ら始まるようであるということが報告されてきた。ＣＮは、９つのアミノ酸の挿
入及び／又はＣ末端の伸張を有するかもしれないと推測された。０．８μｇ／ｍ
ＬのＣＮで、及びイヌの血小板とともに２．２μｇ／ｍＬで、血小板が豊富な血
漿中のヒト血小板凝集の５０％阻害（ＩＣ５０）が観察されることがさらに報告
された［Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６Ｆ：１８０（１９９２）］。
Ｎの配列は、アプラジン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐ
ｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から得られる血小板凝集阻害剤）の１０アミノ酸下流か
ら始まるようであるということが報告されてきた。ＣＮは、９つのアミノ酸の挿
入及び／又はＣ末端の伸張を有するかもしれないと推測された。０．８μｇ／ｍ
ＬのＣＮで、及びイヌの血小板とともに２．２μｇ／ｍＬで、血小板が豊富な血
漿中のヒト血小板凝集の５０％阻害（ＩＣ５０）が観察されることがさらに報告
された［Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６Ｆ：１８０（１９９２）］。
【００１３】 ＣＮは、ヒトの繊維肉腫（ＨＴ−１０８０）及びｃ−Ｈａ−ｒａｓをトランス
フェクトしたラットの胚（４Ｒ）細胞のフィブロネクチンがコートされたプレー
トへの結合を阻害するが、マトリゲルがコートされたプレートへの結合は阻害し
ないことが報告された。１μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬのＣＮの存在下での、４Ｒ
細胞のフィブロネクチンへの結合の阻害は、それぞれ、４６％及び８８％であり
、ＨＴ１０８０細胞の阻害では、それぞれ、８９％と８５％であった［Ｔｒｉｋ
ｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：
３３：３４（１９９２）］。
フェクトしたラットの胚（４Ｒ）細胞のフィブロネクチンがコートされたプレー
トへの結合を阻害するが、マトリゲルがコートされたプレートへの結合は阻害し
ないことが報告された。１μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬのＣＮの存在下での、４Ｒ
細胞のフィブロネクチンへの結合の阻害は、それぞれ、４６％及び８８％であり
、ＨＴ１０８０細胞の阻害では、それぞれ、８９％と８５％であった［Ｔｒｉｋ
ｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：
３３：３４（１９９２）］。
【００１４】 ＣＮは、インテグリンとそれらの受容体間の相互作用を阻害することができ、
これらの相互作用が関連する疾病の処置に有用であり得るようなので、他のヘビ
毒の成分が実質的に存在しない、精製されたコントートロスタチンをより多量に
製造するための改良された方法に対する要求がある。
これらの相互作用が関連する疾病の処置に有用であり得るようなので、他のヘビ
毒の成分が実質的に存在しない、精製されたコントートロスタチンをより多量に
製造するための改良された方法に対する要求がある。
【００１５】
発明の概要 本発明は、血小板凝集、細胞の増殖、接着、転移、及び新血管形成のような生
物学的プロセスを阻害するために使用できる、より多量のコントートロスタチン
に対する要求を満足させる。天然のコントートロスタチンを精製し、エドマン分
解によってアミノ酸の一部を決定した。この情報により、ｃＤＮＡのクローニン
グ戦略が可能となり、完全長のｃＤＮＡ配列とコントートロスタチンの前駆体タ
ンパク質の推定アミノ酸配列が得られた。コントートロスタチンの前駆体は、プ
ロタンパク質領域、メタロプロテイナーゼ領域、及びディスインテグリン領域を
含む。メタロプロテイナーゼ領域は金属結合モチーフを含み、ディスインテグリ
ン領域は、インテグリンアンタゴニストとして作用することができるＲＧＤルー
プを含む。天然のコントートロスタチンの配列は、ディスインテグリン領域の中
に含まれている。
物学的プロセスを阻害するために使用できる、より多量のコントートロスタチン
に対する要求を満足させる。天然のコントートロスタチンを精製し、エドマン分
解によってアミノ酸の一部を決定した。この情報により、ｃＤＮＡのクローニン
グ戦略が可能となり、完全長のｃＤＮＡ配列とコントートロスタチンの前駆体タ
ンパク質の推定アミノ酸配列が得られた。コントートロスタチンの前駆体は、プ
ロタンパク質領域、メタロプロテイナーゼ領域、及びディスインテグリン領域を
含む。メタロプロテイナーゼ領域は金属結合モチーフを含み、ディスインテグリ
ン領域は、インテグリンアンタゴニストとして作用することができるＲＧＤルー
プを含む。天然のコントートロスタチンの配列は、ディスインテグリン領域の中
に含まれている。
【００１６】 本発明は、コントートロスタチン前駆体、生物学的に活性な変種、それらの断
片を含む精製されたコントートロスタチンタンパク質を含む。前記コントートロ
スタチンタンパク質は、好ましくは、天然のコントートロスタチンモノマー（配
列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３）、前記メタロプロテイナーゼ領域（配
列番号２のアミノ酸番号１９１〜４１０）、前記プロタンパク質領域（配列番号
２のアミノ酸番号１〜１９０）、又は前記コントートロスタチン前駆体全体（配
列番号２）と一致するアミノ酸配列を含む。最も好ましい精製されたタンパク質
は、ホモダイマーを形成する、それぞれ約５〜約７ｋＤａの分子量を有するコン
トートロスタチンモノマーから構成される。
片を含む精製されたコントートロスタチンタンパク質を含む。前記コントートロ
スタチンタンパク質は、好ましくは、天然のコントートロスタチンモノマー（配
列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３）、前記メタロプロテイナーゼ領域（配
列番号２のアミノ酸番号１９１〜４１０）、前記プロタンパク質領域（配列番号
２のアミノ酸番号１〜１９０）、又は前記コントートロスタチン前駆体全体（配
列番号２）と一致するアミノ酸配列を含む。最も好ましい精製されたタンパク質
は、ホモダイマーを形成する、それぞれ約５〜約７ｋＤａの分子量を有するコン
トートロスタチンモノマーから構成される。
【００１７】 インテグリンアンタゴニストとして作用し得る精製されたコントートロスタチ
ンは、一般的には、各モノマー中に、配列番号２のアミノ酸番号４５７〜４６９
を含むアミノ酸配列のように、２つのＣｙｓ残基が隣接した約１３アミノ酸残基
の柔軟なペプチドループの端に、拘束されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）
配列を含むであろう。
ンは、一般的には、各モノマー中に、配列番号２のアミノ酸番号４５７〜４６９
を含むアミノ酸配列のように、２つのＣｙｓ残基が隣接した約１３アミノ酸残基
の柔軟なペプチドループの端に、拘束されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）
配列を含むであろう。
【００１８】 生物学的に活性な変種は、アミノ酸の置換、欠失、及び挿入を含み得るが、一
般的には、前駆体タンパク質のプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、ディス
インテグリン、及び／又はコントートロスタチン領域と少なくとも９０％相同で
あるアミノ酸配列を有するであろう。変種は、コントートロスタチンに対する抗
体によって認識されるペプチドも含み得る。
般的には、前駆体タンパク質のプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、ディス
インテグリン、及び／又はコントートロスタチン領域と少なくとも９０％相同で
あるアミノ酸配列を有するであろう。変種は、コントートロスタチンに対する抗
体によって認識されるペプチドも含み得る。
【００１９】 本発明のタンパク質は、合成による方法を用いて作ることもできる。合成のプ
ロセスには、好ましくは、形質転換された宿主細胞内で、本明細書に開示されて
いるコントートロスタチンｃＤＮＡ分子を転写し、翻訳することを含み得る。あ
るいは、前記プロセスは、本明細書に開示したコントートロスタチンのアミノ酸
配列を有するポリペプチドを合成することを含む。
ロセスには、好ましくは、形質転換された宿主細胞内で、本明細書に開示されて
いるコントートロスタチンｃＤＮＡ分子を転写し、翻訳することを含み得る。あ
るいは、前記プロセスは、本明細書に開示したコントートロスタチンのアミノ酸
配列を有するポリペプチドを合成することを含む。
【００２０】 組換えＤＮＡ法によって調製されたタンパク質は、一般的に、配列番号１のよ
うな、発現時に、コントートロスタチンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤ
ＮＡ分子の使用を含むであろう。好ましくは、前記組換えＤＮＡ分子は、メタロ
プロテイナーゼ（例えば、配列番号１のヌクレオチド番号６５７〜１３１６）、
又はディスインテグリン（例えば、配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１
５３５）のような少なくとも１つの生物活性を有する配列をコードする。さらに
、組換えＤＮＡ分子は、プロタンパク質をコードする配列（例えば、配列番号１
のヌクレオチド番号８７〜６５６）、前駆体タンパク質全体（配列番号１のヌク
レオチド番号８７〜１５３５）、又は単に天然のコントートロスタチンモノマー
をコードする配列（配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１５３５）も含み
得る。
うな、発現時に、コントートロスタチンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤ
ＮＡ分子の使用を含むであろう。好ましくは、前記組換えＤＮＡ分子は、メタロ
プロテイナーゼ（例えば、配列番号１のヌクレオチド番号６５７〜１３１６）、
又はディスインテグリン（例えば、配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１
５３５）のような少なくとも１つの生物活性を有する配列をコードする。さらに
、組換えＤＮＡ分子は、プロタンパク質をコードする配列（例えば、配列番号１
のヌクレオチド番号８７〜６５６）、前駆体タンパク質全体（配列番号１のヌク
レオチド番号８７〜１５３５）、又は単に天然のコントートロスタチンモノマー
をコードする配列（配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１５３５）も含み
得る。
【００２１】 本発明は、さらに、原核又は真核宿主細胞を形質転換するために使用できる前
記組換えＤＮＡ分子を含むベクターを提供する。宿主細胞は、哺乳類細胞、植物
細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌又は細菌であり得る。組換えコントートロス
タチンを製造する方法は、一般的には、宿主細胞を培養することと宿主細胞によ
って発現されたコントートロスタチンを回収することの等の工程を含むであろう
。
記組換えＤＮＡ分子を含むベクターを提供する。宿主細胞は、哺乳類細胞、植物
細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌又は細菌であり得る。組換えコントートロス
タチンを製造する方法は、一般的には、宿主細胞を培養することと宿主細胞によ
って発現されたコントートロスタチンを回収することの等の工程を含むであろう
。
【００２２】 本発明のコントートロスタチンタンパク質は、薬学的に許容される担体と精製
されたタンパク質を含む薬学的に許容される組成物として処方できる。続いて、
該薬学的組成物は、インテグリン受容体に結合するリガンドが関連する疾病を有
する患者を治療する方法で使用できる。治療は、一般的に、インテグリン受容体
に結合するインテグリンが実質的に阻害され、患者が治療されるように、該患者
に前記組成物を投与することを含む。該治療方法は、血小板の凝集、腫瘍の転移
、血管新生、新血管形成、細胞の接着、浸潤性、又は増殖を阻害するために使用
できる。
されたタンパク質を含む薬学的に許容される組成物として処方できる。続いて、
該薬学的組成物は、インテグリン受容体に結合するリガンドが関連する疾病を有
する患者を治療する方法で使用できる。治療は、一般的に、インテグリン受容体
に結合するインテグリンが実質的に阻害され、患者が治療されるように、該患者
に前記組成物を投与することを含む。該治療方法は、血小板の凝集、腫瘍の転移
、血管新生、新血管形成、細胞の接着、浸潤性、又は増殖を阻害するために使用
できる。
【００２３】 発明の詳細な記述 ＣＮの性質決定、クローニング、及び発現 我々は、ディスインテグリン：Ａ．ｃ．ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ毒からのコント
ートロスタチン（ＣＮ）を精製し、性質決定した。天然タンパク質の場合、ＣＮ
は、１３，５０５の質量のホモダイマーであり、還元され、ピリジルエチル化さ
れたタンパク質の場合、６，９５６の質量である。血小板（ＧＰ）IIｂ／IIIａ
（フィブリノーゲン受容体）への結合親和性をテストするために、ヒト血小板が
豊富な血漿（ＰＲＰ）を用いて、（ＧＰ）IIｂ／IIIＡに対して誘導された抗体
である［１２５Ｉ］７Ｅ３とのＣＮの拮抗を分析した。ＣＮは、２５ｎＭのＩＣ
５０を示した。このように、ＣＮは、強力なβ３インテグリンアンタゴニストで
ある。
ートロスタチン（ＣＮ）を精製し、性質決定した。天然タンパク質の場合、ＣＮ
は、１３，５０５の質量のホモダイマーであり、還元され、ピリジルエチル化さ
れたタンパク質の場合、６，９５６の質量である。血小板（ＧＰ）IIｂ／IIIａ
（フィブリノーゲン受容体）への結合親和性をテストするために、ヒト血小板が
豊富な血漿（ＰＲＰ）を用いて、（ＧＰ）IIｂ／IIIＡに対して誘導された抗体
である［１２５Ｉ］７Ｅ３とのＣＮの拮抗を分析した。ＣＮは、２５ｎＭのＩＣ
５０を示した。このように、ＣＮは、強力なβ３インテグリンアンタゴニストで
ある。
【００２４】 λｇｔ１０に構築したＡ．ｃ．ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ毒腺細胞のライブラリー
から、ＣＮのｃＤＮＡを増幅した。ＣＮのアミノ酸組成と部分アミノ酸配列は、
エドマン分解によって決定した。図１を参照。この情報を用いて、コントートロ
スタチン前駆体タンパク質をコードする２，０２７ヌクレオチドの完全長ｃＤＮ
Ａ（配列番号１）をクローニングし、配列を決定した。
から、ＣＮのｃＤＮＡを増幅した。ＣＮのアミノ酸組成と部分アミノ酸配列は、
エドマン分解によって決定した。図１を参照。この情報を用いて、コントートロ
スタチン前駆体タンパク質をコードする２，０２７ヌクレオチドの完全長ｃＤＮ
Ａ（配列番号１）をクローニングし、配列を決定した。
【００２５】 ディスインテグリンスーパーファミリーのメンバーとして、ＣＮは、ヌクレオ
チド配列が公知であったトリグラミンを含む他のディスインテグリンと高度の類
似性を共有している。図１Ａは、エドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミ
ノ酸配列を示している。部分配列は、表記されている他のディスインテグリンと
も比較されている。ＲＧＤ配列は、ボールド体である。高度に保存され、それに
対してＰＣＲプライマーがデザインされたＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬ配列には下線が
付されている。図１Ａと１Ｂは、ＣＮのｃＤＮＡが、ディスインテグリンファミ
リーの間で高度に相同な配列とｃＤＮＡインサートに隣接する公知のλｇｔ１０
配列に基づいたプライマーを用いたＰＣＲによって、どのようにクローニングさ
れたかを示している。ＰＣＲプライマー対は、配列番号５（λｇｔ１０フォワー
ドプライマー）と下線が付されている保存された配列の一部をコードするトリグ
ラミンｃＤＮＡのアンチセンスである配列番号３（ＰＣＲ−１）５’−ＧＡＴＴ
ＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’（図１Ａと１Ｂ）、ＰＣＲ−１と相
補的な配列番号４（ＰＣＲ−２）と配列番号６（λｇｔ１０リバースプライマー
）である。配列番号５と３は、下線が付されている部分の上流のアミノ酸をコー
ドするＤＮＡを増幅する。配列番号４と６は、ＣＮの下流部分をコードするアミ
ノ酸を増幅する。完全長のｃＤＮＡは、２つのＰＣＲ産物の重複伸張によって得
られた（図１Ｃと２参照）。コントートロスタチン前駆体のｃＤＮＡ配列と推定
アミノ酸配列は、図３に示されている。完全長の配列は、２，０２９ヌクレオチ
ドから構成される（配列番号１）。５’末端の８６ヌクレオチド未翻訳領域、４
８３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）、及び
３’非コード領域から構成される。
チド配列が公知であったトリグラミンを含む他のディスインテグリンと高度の類
似性を共有している。図１Ａは、エドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミ
ノ酸配列を示している。部分配列は、表記されている他のディスインテグリンと
も比較されている。ＲＧＤ配列は、ボールド体である。高度に保存され、それに
対してＰＣＲプライマーがデザインされたＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬ配列には下線が
付されている。図１Ａと１Ｂは、ＣＮのｃＤＮＡが、ディスインテグリンファミ
リーの間で高度に相同な配列とｃＤＮＡインサートに隣接する公知のλｇｔ１０
配列に基づいたプライマーを用いたＰＣＲによって、どのようにクローニングさ
れたかを示している。ＰＣＲプライマー対は、配列番号５（λｇｔ１０フォワー
ドプライマー）と下線が付されている保存された配列の一部をコードするトリグ
ラミンｃＤＮＡのアンチセンスである配列番号３（ＰＣＲ−１）５’−ＧＡＴＴ
ＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’（図１Ａと１Ｂ）、ＰＣＲ−１と相
補的な配列番号４（ＰＣＲ−２）と配列番号６（λｇｔ１０リバースプライマー
）である。配列番号５と３は、下線が付されている部分の上流のアミノ酸をコー
ドするＤＮＡを増幅する。配列番号４と６は、ＣＮの下流部分をコードするアミ
ノ酸を増幅する。完全長のｃＤＮＡは、２つのＰＣＲ産物の重複伸張によって得
られた（図１Ｃと２参照）。コントートロスタチン前駆体のｃＤＮＡ配列と推定
アミノ酸配列は、図３に示されている。完全長の配列は、２，０２９ヌクレオチ
ドから構成される（配列番号１）。５’末端の８６ヌクレオチド未翻訳領域、４
８３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）、及び
３’非コード領域から構成される。
【００２６】 図４は、他の４つのヘビ毒出血性タンパク質：トリグラミン；Ｃａｔ（Ｃｒｏ
ｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ毒から得られたカトロコラスタチン（ｃａｔｒｏｃｏｌ
ｌａｓｔａｔｉｎ））；ハラルハジン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ毒
から得られる）；、及びＨｔ−ｅ（Ｃ．Ａｔｒｏｘ毒から得られる）の構造と比
較したコントートロスタチンのマルチドメイン構造を示している。ヘビ毒メタロ
プロテイナーゼの構造的な分類によれば、コントートロスタチンの前駆体は、プ
ロタンパク質（配列番号１又は２のアミノ酸残基１〜１９０）、メタロプロテイ
ナーゼ（配列暗号１又は２の残基１９１〜４１０）、及びディスインテグリン（
配列番号１又は２の残基４１９〜４８３）ドメインに分けることができる。天然
のディスインテグリンの成熟したモノマーは、Ｄ４１９、すなわち４１９位のア
スパラギン酸残基から始まる。図４の下線を付した部分は、コントートロスタチ
ンとトリグラミンの両者のＲＧＤ配列と、各分子のメタロプロテイナーゼドメイ
ン中の亜鉛結合モチーフの保存されたＨＥＭＧＨＮＬＧＩＨＨ配列を示している
。
ｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ毒から得られたカトロコラスタチン（ｃａｔｒｏｃｏｌ
ｌａｓｔａｔｉｎ））；ハラルハジン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ毒
から得られる）；、及びＨｔ−ｅ（Ｃ．Ａｔｒｏｘ毒から得られる）の構造と比
較したコントートロスタチンのマルチドメイン構造を示している。ヘビ毒メタロ
プロテイナーゼの構造的な分類によれば、コントートロスタチンの前駆体は、プ
ロタンパク質（配列番号１又は２のアミノ酸残基１〜１９０）、メタロプロテイ
ナーゼ（配列暗号１又は２の残基１９１〜４１０）、及びディスインテグリン（
配列番号１又は２の残基４１９〜４８３）ドメインに分けることができる。天然
のディスインテグリンの成熟したモノマーは、Ｄ４１９、すなわち４１９位のア
スパラギン酸残基から始まる。図４の下線を付した部分は、コントートロスタチ
ンとトリグラミンの両者のＲＧＤ配列と、各分子のメタロプロテイナーゼドメイ
ン中の亜鉛結合モチーフの保存されたＨＥＭＧＨＮＬＧＩＨＨ配列を示している
。
【００２７】 それ故、本発明によれば、実質的に精製されたコントートロスタチン、又はデ
ィスインテグリンの特性を保持した精製されたコントートロスタチンの変種、又
はプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、及びディスインテグリンドメインを
有するコントートロスタチンの前駆体からなるタンパク質も提供される。このタ
ンパク質は、ヘビ毒のような天然の採取源から精製することができ、又は、本明
細書の開示を参照することにより当業者が理解できるであろう組換え技術によっ
て作ることができる。 さらに、本出願は、天然と合成のアミノ酸及びヌクレオチド配列の両者について
権利を主張する。特に修正がなければ、本明細書で使用する「タンパク質」とい
う語は、天然と合成のポリペプチド及びペプチドの両者を包含する。合成タンパ
ク質には、組換えタンパク質と化学的に合成されたタンパク質を含む。特に示さ
れていなければ、「コントートロスタチン」という語は、天然と合成型のタンパ
ク質の両者を含む。「ヌクレオチド配列」という語は、ＤＮＡとＲＮＡ配列の両
者を含む。例えば、コントートロスタチンタンパク質のヌクレオチド配列は、（
「コントートロスタチンヌクレオチド配列」）は、天然及び前駆体タンパク質を
コードする遺伝子（「コントートロスタチン遺伝子」）、その相補的ＤＮＡ、及
び前記のものに対応するＲＮＡを含む。コントートロスタチンタンパク質をコー
ドするメッセンジャーＲＮＡ、その相補的ＲＮＡと、及び前記のものに対応する
ＤＮＡも含まれる。さらに、本出願で使用するヌクレオチド配列には、（１）コ
ントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列、（２）上記配列と相補
的なヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る）、（３）開示されたＤＮ
Ａ配列中のチミジン（「Ｔ」）がウラシル（「Ｕ」）に置換されたＤＮＡ配列に
対応するＲＮＡ配列、（４）前記配列中のヌクレオチドが、ヌクレオチド類縁体
のような本分野で公知の他のヌクレオチドに置き換わった、例えば、シトシンが
５−メチルシトシンに置き換わっているヌクレオチド配列、及び（５）例えば、
前記ヌクレオチド配列が２０％、好ましくは１０％以内変異したヌクレオチド配
列が含まれる。
ィスインテグリンの特性を保持した精製されたコントートロスタチンの変種、又
はプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、及びディスインテグリンドメインを
有するコントートロスタチンの前駆体からなるタンパク質も提供される。このタ
ンパク質は、ヘビ毒のような天然の採取源から精製することができ、又は、本明
細書の開示を参照することにより当業者が理解できるであろう組換え技術によっ
て作ることができる。 さらに、本出願は、天然と合成のアミノ酸及びヌクレオチド配列の両者について
権利を主張する。特に修正がなければ、本明細書で使用する「タンパク質」とい
う語は、天然と合成のポリペプチド及びペプチドの両者を包含する。合成タンパ
ク質には、組換えタンパク質と化学的に合成されたタンパク質を含む。特に示さ
れていなければ、「コントートロスタチン」という語は、天然と合成型のタンパ
ク質の両者を含む。「ヌクレオチド配列」という語は、ＤＮＡとＲＮＡ配列の両
者を含む。例えば、コントートロスタチンタンパク質のヌクレオチド配列は、（
「コントートロスタチンヌクレオチド配列」）は、天然及び前駆体タンパク質を
コードする遺伝子（「コントートロスタチン遺伝子」）、その相補的ＤＮＡ、及
び前記のものに対応するＲＮＡを含む。コントートロスタチンタンパク質をコー
ドするメッセンジャーＲＮＡ、その相補的ＲＮＡと、及び前記のものに対応する
ＤＮＡも含まれる。さらに、本出願で使用するヌクレオチド配列には、（１）コ
ントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列、（２）上記配列と相補
的なヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る）、（３）開示されたＤＮ
Ａ配列中のチミジン（「Ｔ」）がウラシル（「Ｕ」）に置換されたＤＮＡ配列に
対応するＲＮＡ配列、（４）前記配列中のヌクレオチドが、ヌクレオチド類縁体
のような本分野で公知の他のヌクレオチドに置き換わった、例えば、シトシンが
５−メチルシトシンに置き換わっているヌクレオチド配列、及び（５）例えば、
前記ヌクレオチド配列が２０％、好ましくは１０％以内変異したヌクレオチド配
列が含まれる。
【００２８】 ヌクレオチドコドンは縮重しているので、コントートロスタチンタンパク質、
それらのタンパク質変種、機能的な均等物、又は誘導体をコードするか、又はそ
れらに翻訳され得るヌクレオチド配列を含む均等なヌクレオチド配列も本発明の
範囲に属する。これらのヌクレオチド配列は、本発明の実施においても使用され
得る。
それらのタンパク質変種、機能的な均等物、又は誘導体をコードするか、又はそ
れらに翻訳され得るヌクレオチド配列を含む均等なヌクレオチド配列も本発明の
範囲に属する。これらのヌクレオチド配列は、本発明の実施においても使用され
得る。
【００２９】 上記に加えて、コントートロスタチンヌクレオチド配列には、（１）ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれのヌクレオチド配列のコ
ード配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、及び（２）それぞれのコン
トートロスタチンタンパク質と実質的に同一の生物学的特性／活性、例えば、イ
ンテグリンアンタゴニスト、亜鉛結合、プロテイナーゼ、抗血管新生因子、及び
別の実施態様と例で本明細書に開示されているような活性を有するタンパク質を
コードし、又はタンパク質に翻訳され得る本明細書に開示されているものの断片
又は変異したヌクレオチド配列も含まれる。
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれのヌクレオチド配列のコ
ード配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、及び（２）それぞれのコン
トートロスタチンタンパク質と実質的に同一の生物学的特性／活性、例えば、イ
ンテグリンアンタゴニスト、亜鉛結合、プロテイナーゼ、抗血管新生因子、及び
別の実施態様と例で本明細書に開示されているような活性を有するタンパク質を
コードし、又はタンパク質に翻訳され得る本明細書に開示されているものの断片
又は変異したヌクレオチド配列も含まれる。
【００３０】 タンパク質と関連して使用される「コントートロスタチンタンパク質」という
語には、以下の例の部で記載されている各タンパク質、本発明の方法によって得
ることができる前駆体タンパク質、最も好ましくは以下の例の部の単離法から得
ることができるディスインテグリンの特性を示すタンパク質、及び（１）これら
のタンパク質のタンパク質変種；例えば、これらのタンパク質変種は、例えば、
プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、及び／又は前記
タンパク質の天然のコントートロスタチン領域の配列と、それらの少なくとも９
０％、又は、より好ましくは少なくとも９５％が一致するアミノ酸を有するアミ
ノ酸配列を含有し得る；（２）それぞれ、これらのタンパク質の機能的な均等物
及びそれらの変種；並びに（３）それぞれ、コントートロスタチンタンパク質及
びそれらの変種の断片を含む誘導体が含まれる。
語には、以下の例の部で記載されている各タンパク質、本発明の方法によって得
ることができる前駆体タンパク質、最も好ましくは以下の例の部の単離法から得
ることができるディスインテグリンの特性を示すタンパク質、及び（１）これら
のタンパク質のタンパク質変種；例えば、これらのタンパク質変種は、例えば、
プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、及び／又は前記
タンパク質の天然のコントートロスタチン領域の配列と、それらの少なくとも９
０％、又は、より好ましくは少なくとも９５％が一致するアミノ酸を有するアミ
ノ酸配列を含有し得る；（２）それぞれ、これらのタンパク質の機能的な均等物
及びそれらの変種；並びに（３）それぞれ、コントートロスタチンタンパク質及
びそれらの変種の断片を含む誘導体が含まれる。
【００３１】 前記変種は、例えば、コントートロスタチンタンパク質のアミノ酸配列の置換
、挿入、又は欠失から得ることができる。タンパク質及びそれらの変種の誘導体
は、コントートロスタチンに対する抗体と特異的に結合するこれらのタンパク質
及び免疫反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｔｉｖｅ）ペプチドの断片を含む。
、挿入、又は欠失から得ることができる。タンパク質及びそれらの変種の誘導体
は、コントートロスタチンに対する抗体と特異的に結合するこれらのタンパク質
及び免疫反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｔｉｖｅ）ペプチドの断片を含む。
【００３２】 ２つのアミノ酸配列は、インテグリン受容体への結合能のような実質的に同一
の生物活性を有すれば、機能的に均等である。前記タンパク質は、他のタンパク
質に融合させてもよく、例えばシグナル配列融合は、組換えコントートロスタチ
ンタンパク質の分泌を、より迅速に誘導するために利用し得る。
の生物活性を有すれば、機能的に均等である。前記タンパク質は、他のタンパク
質に融合させてもよく、例えばシグナル配列融合は、組換えコントートロスタチ
ンタンパク質の分泌を、より迅速に誘導するために利用し得る。
【００３３】 本明細書に開示されたタンパク質の置換変種は、開示された配列中の少なくと
も１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ま
しくは、アミノ酸の変化は保存的である。このように、コントートロスタチンタ
ンパク質の一次アミノ酸配列の修飾は、保存的な変異も含む。本明細書で使用す
る「保存的な変異」という語は、別の、生物学的に類似する残基によるアミノ酸
残基の置換を示す。保存的な変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、
又はメチオニンのようなある疎水性残基を別の疎水性残基に置換すること、又は
、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、又はグルタミンを
アスパラギンに置換するなど、ある極性残基を別の極性残基に置換することが含
まれる。「保存的な変異」という語は、ポリペプチドがその生物活性を保持して
いるという条件で、置換されていない親アミノ酸に代えて、置換されたアミノ酸
を使用すること、例えば、置換されていないポリペプチドとも免疫反応する、置
換されたポリペプチドに対して作成された抗体も含む。
も１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ま
しくは、アミノ酸の変化は保存的である。このように、コントートロスタチンタ
ンパク質の一次アミノ酸配列の修飾は、保存的な変異も含む。本明細書で使用す
る「保存的な変異」という語は、別の、生物学的に類似する残基によるアミノ酸
残基の置換を示す。保存的な変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、
又はメチオニンのようなある疎水性残基を別の疎水性残基に置換すること、又は
、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、又はグルタミンを
アスパラギンに置換するなど、ある極性残基を別の極性残基に置換することが含
まれる。「保存的な変異」という語は、ポリペプチドがその生物活性を保持して
いるという条件で、置換されていない親アミノ酸に代えて、置換されたアミノ酸
を使用すること、例えば、置換されていないポリペプチドとも免疫反応する、置
換されたポリペプチドに対して作成された抗体も含む。
【００３４】 さらに、全てのタンパク質においてよくあることだが、正確な化学構造は、多
数の要素に依存する。分子中には、イオン化できるアミノ基とカルボキシル基が
存在するので、このタンパク質は、酸性若しくは塩基性塩、又は中性形態で得ら
れ得る。適切な環境状態に置いたときに、それらの活性を保持するこのような調
製物は全て、この定義の中に含まれる。さらに、一次アミノ酸配列は、糖部分を
用いた誘導体化（グリコシル化）によって、又は脂質、リン酸、アセチル基など
のような他の補充的な分子によって、より一般的には、糖を用いた結合によって
拡張し得る。一次アミノ酸構造は、凝集して、複合体、最も多くの場合には二量
体を形成し得る。この拡張のある種の側面は、産生宿主の翻訳後修飾系を介して
、達成される。他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。何れにして
も、このような修飾は、タンパク質の活性が破壊されない限り、定義に含まれる
。このような修飾は、様々なアッセイにおけるタンパク質の活性を増加し、又は
減弱することによって、定量的に、又は定性的に活性に影響を与え得ると予想さ
れる。
数の要素に依存する。分子中には、イオン化できるアミノ基とカルボキシル基が
存在するので、このタンパク質は、酸性若しくは塩基性塩、又は中性形態で得ら
れ得る。適切な環境状態に置いたときに、それらの活性を保持するこのような調
製物は全て、この定義の中に含まれる。さらに、一次アミノ酸配列は、糖部分を
用いた誘導体化（グリコシル化）によって、又は脂質、リン酸、アセチル基など
のような他の補充的な分子によって、より一般的には、糖を用いた結合によって
拡張し得る。一次アミノ酸構造は、凝集して、複合体、最も多くの場合には二量
体を形成し得る。この拡張のある種の側面は、産生宿主の翻訳後修飾系を介して
、達成される。他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。何れにして
も、このような修飾は、タンパク質の活性が破壊されない限り、定義に含まれる
。このような修飾は、様々なアッセイにおけるタンパク質の活性を増加し、又は
減弱することによって、定量的に、又は定性的に活性に影響を与え得ると予想さ
れる。
【００３５】 鎖中の各アミノ酸残基は、酸化、還元、又は他の誘導体化によっても修飾され
得、活性を保持している断片を得るためにタンパク質を切断してもよい。活性を
破壊しないこのような改変は、前記定義からこのタンパク質を除去しない。以下
では、例示のために、さらに詳細に幾つかの修飾について述べる。
得、活性を保持している断片を得るためにタンパク質を切断してもよい。活性を
破壊しないこのような改変は、前記定義からこのタンパク質を除去しない。以下
では、例示のために、さらに詳細に幾つかの修飾について述べる。
【００３６】 このように、グリコシル化変種は、コントートロスタチンタンパク質の範囲に
含まれる。それらは、グリコシル化を完全に欠く変種（非グリコシル化）と天然
の型と比べて、グリコシル化された部位が少なくとも１つ少ない変種（脱グリコ
シル化）、及びグリコシル化が変化した変種を含む。
含まれる。それらは、グリコシル化を完全に欠く変種（非グリコシル化）と天然
の型と比べて、グリコシル化された部位が少なくとも１つ少ない変種（脱グリコ
シル化）、及びグリコシル化が変化した変種を含む。
【００３７】 例に示されているように、天然のＣＮは、相対的に分かりやすい方法で、Ａｇ
ｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒から単
離され得る。あるいは、ＣＮは、組換えＤＮＡ技術等の現在使用されている様々
な生化学的な方法を利用することによって調製してもよい。さらに、本明細書に
報告された配列情報は、ＣＮ及びその前駆体と実質的な相同性を有する変種、断
片、保存されたドメイン、又はプロタンパク質を同定するためのプローブを作る
ために使用することができる。一旦同定されると、遺伝子は、単離し、さらに操
作し、発現ベクターの中にクローニングしてもよい。
ｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒から単
離され得る。あるいは、ＣＮは、組換えＤＮＡ技術等の現在使用されている様々
な生化学的な方法を利用することによって調製してもよい。さらに、本明細書に
報告された配列情報は、ＣＮ及びその前駆体と実質的な相同性を有する変種、断
片、保存されたドメイン、又はプロタンパク質を同定するためのプローブを作る
ために使用することができる。一旦同定されると、遺伝子は、単離し、さらに操
作し、発現ベクターの中にクローニングしてもよい。
【００３８】 本明細書の開示を参照することによって当業者により理解される技術に従って
作られたコントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有するベ
クターも提供される。本発明では、コントートロスタチンヌクレオチド配列は、
組換え発現ベクター中に挿入され得る。「組換え発現ベクター」という語は、コ
ントートロスタチンの遺伝配列の挿入又は取り込みによって操作された本分野で
公知のプラスミド、ウイルス、又は他の媒体を指す。このような発現ベクターは
、宿主中での挿入された遺伝配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を
含有する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、及び形質転
換された細胞の表現型による選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。これら
のベクターは、コンピテント宿主を形質転換して、ヘビ毒タンパク質を産生でき
る形質転換体を製造するために使用され得る。
作られたコントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有するベ
クターも提供される。本発明では、コントートロスタチンヌクレオチド配列は、
組換え発現ベクター中に挿入され得る。「組換え発現ベクター」という語は、コ
ントートロスタチンの遺伝配列の挿入又は取り込みによって操作された本分野で
公知のプラスミド、ウイルス、又は他の媒体を指す。このような発現ベクターは
、宿主中での挿入された遺伝配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を
含有する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、及び形質転
換された細胞の表現型による選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。これら
のベクターは、コンピテント宿主を形質転換して、ヘビ毒タンパク質を産生でき
る形質転換体を製造するために使用され得る。
【００３９】 さらに、前記ベクターによって安定に形質転換又はトランスフェクトされた原
核又は真核宿主細胞、コントートロスタチンタンパク質又はその生物学的変種を
作る方法を提供する。該方法は、まず、コントートロスタチンタンパク質をコー
ドするＤＮＡで形質転換した原核又は真核宿主細胞を培養することと、続いて、
前記コントートロスタチンタンパク質を回収することという工程を含む。前記宿
主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌又は細菌であり
得る。
核又は真核宿主細胞、コントートロスタチンタンパク質又はその生物学的変種を
作る方法を提供する。該方法は、まず、コントートロスタチンタンパク質をコー
ドするＤＮＡで形質転換した原核又は真核宿主細胞を培養することと、続いて、
前記コントートロスタチンタンパク質を回収することという工程を含む。前記宿
主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌又は細菌であり
得る。
【００４０】 前記タンパク質をコードするＤＮＡ配列の採取源には、適切な細胞又は細胞株
から得た単離されたＤＮＡ、ヘビ毒ゲノムライブラリーからクローニングされた
ＤＮＡ、又は相補的ＤＮＡライブラリーからクローニングされたＤＮＡが含まれ
、ここで全相補的ＤＮＡは、ＤＮＡに逆転写され、クローニングされる。目的の
タンパク質をコードするＤＮＡ配列が一旦同定されると、塩基の配列は、公知の
手段［例えば、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０（１９７７）］によって決定され得る。
さらに、発現を得るために、ハイブリッドＤＮＡ技術が利用され得る。前記ＤＮ
Ａ配列の制限地図を作成して、切断のための適切な部位を決定してもよい。この
ように、前記配列を切り出して、適切な制御シグナルを有するベクター中に導入
してもよい。ディスインテグリン遺伝子の同定及び発現のための適切な技術につ
いてのさらに詳細な考察は、例えば、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらの米国特許第５，
１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号に記載されており、その開示全
体は、参照文献として本明細書に組み込まれる。
から得た単離されたＤＮＡ、ヘビ毒ゲノムライブラリーからクローニングされた
ＤＮＡ、又は相補的ＤＮＡライブラリーからクローニングされたＤＮＡが含まれ
、ここで全相補的ＤＮＡは、ＤＮＡに逆転写され、クローニングされる。目的の
タンパク質をコードするＤＮＡ配列が一旦同定されると、塩基の配列は、公知の
手段［例えば、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０（１９７７）］によって決定され得る。
さらに、発現を得るために、ハイブリッドＤＮＡ技術が利用され得る。前記ＤＮ
Ａ配列の制限地図を作成して、切断のための適切な部位を決定してもよい。この
ように、前記配列を切り出して、適切な制御シグナルを有するベクター中に導入
してもよい。ディスインテグリン遺伝子の同定及び発現のための適切な技術につ
いてのさらに詳細な考察は、例えば、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらの米国特許第５，
１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号に記載されており、その開示全
体は、参照文献として本明細書に組み込まれる。
【００４１】 さらに、天然のタンパク質をコードする配列は、続いて、１以上のアミノ酸の
変化が導入された修飾タンパク質を得るために、本分野で周知の方法で（例えば
、単一又は複数の変異又は欠失により）取り扱ってもよい。次に、本明細書に記
載されている操作に従って、あるポリペプチドがＣＮに特異的な活性プロフィー
ルを示すかどうかを決定することが、定型的な実験作業であろう。従って、本発
明は、本明細書に明記されている特徴的な活性プロフィールを示す天然のＣＮと
その変異体の両者を想定している。さらに、ＣＮは、適切な血栓溶解剤との融合
タンパク質の形態で利用してもよい。この種の融合タンパク質は、Ｍａｒａｇａ
ｎｏｒｅらの上記米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３
号に、血小板凝集阻害剤／抗トロンビンポリペプチド融合タンパク質の形成につ
いて記載されている方法と類似の方法で調製し得る。
変化が導入された修飾タンパク質を得るために、本分野で周知の方法で（例えば
、単一又は複数の変異又は欠失により）取り扱ってもよい。次に、本明細書に記
載されている操作に従って、あるポリペプチドがＣＮに特異的な活性プロフィー
ルを示すかどうかを決定することが、定型的な実験作業であろう。従って、本発
明は、本明細書に明記されている特徴的な活性プロフィールを示す天然のＣＮと
その変異体の両者を想定している。さらに、ＣＮは、適切な血栓溶解剤との融合
タンパク質の形態で利用してもよい。この種の融合タンパク質は、Ｍａｒａｇａ
ｎｏｒｅらの上記米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３
号に、血小板凝集阻害剤／抗トロンビンポリペプチド融合タンパク質の形成につ
いて記載されている方法と類似の方法で調製し得る。
【００４２】 他のディスインテグリン（図１Ａに示されている）［Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋ
ｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ，Ｍ．， ａｎｄ
Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ． Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ
Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ Ｐ
ｌａｔｅｌｅｔ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ． ３１：２８９−３００（１９９４）］と
の高度の配列相同性にかかわらず、コントートロスタチンは、約８アミノ酸の末
端切断を有するユニークなアミノ末端配列を示す。他のディスインテグリンと比
べて、コントートロスタチンのアミノ末端には、２つのシステイン残基が喪失し
ている。モノマーのディスインテグリンが偶数のシステインを有することは十分
に確立されており、それらの全ては、ジスルフィド結合の形成に関与している。
コントートロスタチン前駆体中の喪失した２つのシステインは、ジスルフィド結
合対の崩壊を生じせしめ得る。その結果、これによって、２つの同じ鎖の間に、
２つの分子間ジスルフィド結合が形成されて、ホモダイマー構造のコントートロ
スタチンの形成を導き得る。図５は、そのジスルフィド結合の位置が公知である
ディスインテグリン、キストリン［Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｌ
ａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ． Ｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ IIｂ／IIIａ ａ
ｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｋｉｓｔｒｉｎ ｕｓｉｎｇ ＮＭＲ， ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏ
ｎｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２８２−９（１９９３）］と比較し
た、ダイマーのディスインテグリンの構造の仮定的なモデルを示している。図５
Ａには、２つのインテグリンの配列が比較されている。キストリンは、１２の半
シスチンが６つのジスルフィド結合を形成していることが容易に分かるであろう
。比較すると、２つの対を成していないシステイン残基を有するコントートロス
タチンは、図５Ｂに示されているホモダイマーの構造を形成することができる。
我々は、現段階では、何れの配列が好ましいか確信を得ていないが、天然及び還
元されたコントートロスタチンの質量分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、我々
は、示されている２つのうち１つと同一である可能性が最も高いホモダイマー構
造が形成されていると信じている。
ｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ，Ｍ．， ａｎｄ
Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ． Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ
Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ Ｐ
ｌａｔｅｌｅｔ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ． ３１：２８９−３００（１９９４）］と
の高度の配列相同性にかかわらず、コントートロスタチンは、約８アミノ酸の末
端切断を有するユニークなアミノ末端配列を示す。他のディスインテグリンと比
べて、コントートロスタチンのアミノ末端には、２つのシステイン残基が喪失し
ている。モノマーのディスインテグリンが偶数のシステインを有することは十分
に確立されており、それらの全ては、ジスルフィド結合の形成に関与している。
コントートロスタチン前駆体中の喪失した２つのシステインは、ジスルフィド結
合対の崩壊を生じせしめ得る。その結果、これによって、２つの同じ鎖の間に、
２つの分子間ジスルフィド結合が形成されて、ホモダイマー構造のコントートロ
スタチンの形成を導き得る。図５は、そのジスルフィド結合の位置が公知である
ディスインテグリン、キストリン［Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｌ
ａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ． Ｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ IIｂ／IIIａ ａ
ｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｋｉｓｔｒｉｎ ｕｓｉｎｇ ＮＭＲ， ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏ
ｎｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２８２−９（１９９３）］と比較し
た、ダイマーのディスインテグリンの構造の仮定的なモデルを示している。図５
Ａには、２つのインテグリンの配列が比較されている。キストリンは、１２の半
シスチンが６つのジスルフィド結合を形成していることが容易に分かるであろう
。比較すると、２つの対を成していないシステイン残基を有するコントートロス
タチンは、図５Ｂに示されているホモダイマーの構造を形成することができる。
我々は、現段階では、何れの配列が好ましいか確信を得ていないが、天然及び還
元されたコントートロスタチンの質量分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、我々
は、示されている２つのうち１つと同一である可能性が最も高いホモダイマー構
造が形成されていると信じている。
【００４３】 ＣＮは、明らかにアプラジンとは全く異なっている。何故なら、後者は、間違
いなくモノマーであると実証されている［Ｗｅｎｃｅｌ−Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９３）、上記］からである。さらに、ＣＮは、上記Ｍａｒａｇａｎ
ｏｒｅらの米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号でア
プラジンに関して実証されているように、血小板放出反応を阻害しない。最後に
、配列の類似性にもかかわらず、開始部位とその後に続く配列の両者に関して、
配列の間には有意な差も存在する。
いなくモノマーであると実証されている［Ｗｅｎｃｅｌ−Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９９３）、上記］からである。さらに、ＣＮは、上記Ｍａｒａｇａｎ
ｏｒｅらの米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号でア
プラジンに関して実証されているように、血小板放出反応を阻害しない。最後に
、配列の類似性にもかかわらず、開始部位とその後に続く配列の両者に関して、
配列の間には有意な差も存在する。
【００４４】 使用方法 ＣＮは、ヒト、ウサギ、及びイヌのインビトロでの血小板凝集の強力な阻害剤
であることが明らかとなっている。しかしながら、アプラジンとは異なり、ＣＮ
は、血小板放出反応を阻害しない。血小板は、α顆粒、及び密顆粒を含む、血小
板が凝集したときに内容物が放出される様々な複数の顆粒を含む。ＣＮは、（密
顆粒からのＡＴＰを含む）顆粒内容物の血小板放出を阻害しないという発見は、
凝集の阻害にもかかわらず、血小板は、それらの内容物をまだ放出し得ること（
それ故、正常な生理活性の幾つかの外見を維持すること）を意味している。対照
的に、アプラジンが血小板の凝集を阻害すると、例えば、密顆粒からのセロトニ
ンの放出の阻害によって測定した）血小板の放出も阻害する。このため、アプラ
ジンの投与により、正常な血小板の生理的プロセスはさらに必然的に擾乱される
。
であることが明らかとなっている。しかしながら、アプラジンとは異なり、ＣＮ
は、血小板放出反応を阻害しない。血小板は、α顆粒、及び密顆粒を含む、血小
板が凝集したときに内容物が放出される様々な複数の顆粒を含む。ＣＮは、（密
顆粒からのＡＴＰを含む）顆粒内容物の血小板放出を阻害しないという発見は、
凝集の阻害にもかかわらず、血小板は、それらの内容物をまだ放出し得ること（
それ故、正常な生理活性の幾つかの外見を維持すること）を意味している。対照
的に、アプラジンが血小板の凝集を阻害すると、例えば、密顆粒からのセロトニ
ンの放出の阻害によって測定した）血小板の放出も阻害する。このため、アプラ
ジンの投与により、正常な血小板の生理的プロセスはさらに必然的に擾乱される
。
【００４５】 幾つかの証拠は、（ＧＰ）IIｂ／IIIａインテグリン受容体に特異的に結合す
ることによって、ＣＮが血小板の凝集を阻害することを示している。例えば、固
定化されたフィブリノーゲンに結合した精製（ＧＰ）IIｂ／IIIａの程度を定量
できるフィブリノーゲン−（ＧＰ）IIｂ／IIIａ ＥＬＩＳＡ［Ｄｅｎｎｉｓ，
Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
） ８７：２４７１（１９９０）］では、ＣＮは、（ＧＰ）IIｂ／IIIａ結合を
効果的にブロックする。さらに、ＣＮの部分アミノ酸配列は、（ＧＰ）IIｂ／II
Iａに結合することが知られている他のディスインテグリンとのかなりの類似性
を示している。最後に、ＣＮは、７Ｅ３の（ＧＰ）IIｂ／IIIａへの結合をブロ
ックする。７Ｅ３は、（ＧＰ）IIｂ／IIIａに特異的に結合することにより、ヒ
ト及びイヌの血小板凝集を阻害するマウスのモノクローナル抗体である［Ｃｏｌ
ｌｅｒ，Ｂ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：３２
５（１９８３）］。低濃度のＣＮの存在下では、７Ｅ３の血小板への結合は著し
く阻害される。
ることによって、ＣＮが血小板の凝集を阻害することを示している。例えば、固
定化されたフィブリノーゲンに結合した精製（ＧＰ）IIｂ／IIIａの程度を定量
できるフィブリノーゲン−（ＧＰ）IIｂ／IIIａ ＥＬＩＳＡ［Ｄｅｎｎｉｓ，
Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
） ８７：２４７１（１９９０）］では、ＣＮは、（ＧＰ）IIｂ／IIIａ結合を
効果的にブロックする。さらに、ＣＮの部分アミノ酸配列は、（ＧＰ）IIｂ／II
Iａに結合することが知られている他のディスインテグリンとのかなりの類似性
を示している。最後に、ＣＮは、７Ｅ３の（ＧＰ）IIｂ／IIIａへの結合をブロ
ックする。７Ｅ３は、（ＧＰ）IIｂ／IIIａに特異的に結合することにより、ヒ
ト及びイヌの血小板凝集を阻害するマウスのモノクローナル抗体である［Ｃｏｌ
ｌｅｒ，Ｂ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：３２
５（１９８３）］。低濃度のＣＮの存在下では、７Ｅ３の血小板への結合は著し
く阻害される。
【００４６】 ３つのヘビ毒ディスインテグリン、キストリン［Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．
（１９９０）、上記］、エチスタチン［Ｈｏｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９
１）、上記］、及びビチスタチン［Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．
，（１９９０）、上記］は、組換え組織プラスミノーゲン活性因子と組み合わせ
て動脈の血栓溶解を増大し、維持することによる血栓溶解療法で使用するための
抗血栓剤としての潜在的な役割が実証されている。ＣＮの低いＩＣ５０値に基づ
いて、抗血栓剤としてのそのインビボでの効力が調べられた。イヌの再閉塞頚動
脈血栓症モデルを用いて、ＣＮは、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキ
ナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ；ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）と組み合わせると、頚動脈の開通路を効果的に維持することが見出された。
ＡＰＳＡＣのみでは、頚動脈の迅速な再閉塞を防止するには不十分であることが
見出された。ＡＰＳＡＣと共にＣＮを投与すると、ヘパリンは、開通を維持する
ためには必要でなかった。これは、冠状動脈の血栓症のモデルで評価された他の
ディスインテグリン（例えば、エチスタチン、ビチスタチン、及びキストリン）
と比べて、有意な差である。
（１９９０）、上記］、エチスタチン［Ｈｏｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９
１）、上記］、及びビチスタチン［Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．
，（１９９０）、上記］は、組換え組織プラスミノーゲン活性因子と組み合わせ
て動脈の血栓溶解を増大し、維持することによる血栓溶解療法で使用するための
抗血栓剤としての潜在的な役割が実証されている。ＣＮの低いＩＣ５０値に基づ
いて、抗血栓剤としてのそのインビボでの効力が調べられた。イヌの再閉塞頚動
脈血栓症モデルを用いて、ＣＮは、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキ
ナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ；ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）と組み合わせると、頚動脈の開通路を効果的に維持することが見出された。
ＡＰＳＡＣのみでは、頚動脈の迅速な再閉塞を防止するには不十分であることが
見出された。ＡＰＳＡＣと共にＣＮを投与すると、ヘパリンは、開通を維持する
ためには必要でなかった。これは、冠状動脈の血栓症のモデルで評価された他の
ディスインテグリン（例えば、エチスタチン、ビチスタチン、及びキストリン）
と比べて、有意な差である。
【００４７】 本発明の組成物は、単独で、又は１以上の血栓溶解剤と組み合わせて、哺乳類
の血栓症を治療するのにとりわけ有用である。特に、本発明の組成物は、動脈、
静脈、及び毛細血管の血栓症及び血栓塞栓症を治療し、又は防止するのに有用で
ある。このように、前記組成物は、発作、一過性の虚血性発作、動脈硬化症、ア
テローム性動脈硬化症、肺塞栓症、動脈瘤、及び狭心症を治療するのに有用であ
る。とりわけ、前記組成物は、心筋梗塞を防止し、又は治療するのに有用である
。
の血栓症を治療するのにとりわけ有用である。特に、本発明の組成物は、動脈、
静脈、及び毛細血管の血栓症及び血栓塞栓症を治療し、又は防止するのに有用で
ある。このように、前記組成物は、発作、一過性の虚血性発作、動脈硬化症、ア
テローム性動脈硬化症、肺塞栓症、動脈瘤、及び狭心症を治療するのに有用であ
る。とりわけ、前記組成物は、心筋梗塞を防止し、又は治療するのに有用である
。
【００４８】 本発明の組成物は、メラノーマ、がん腫、及び肉腫患者の転移を阻害するのに
も有用である。ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細胞上の少なくとも２つの
部位：１．１（±０．７ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）と細胞当たり９６，０００（
±３９，０００）部位を有する高親和性部位と、４１（±１３）ｎＭのＫｄと細
胞当たり４８０，０００（±９０，０００）部位を有する、より低親和性の部位
に結合することが観察された。さらに、ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細
胞が、フィブロネクチン及びビトロネクチンに接着するのを阻害し、これらに比
べて程度は低いが、コラーゲン及びラミニンに接着するのを阻害することが見出
された。このように、メラノーマ、がん腫、及び肉腫患者の転移を防止する方法
及び組成物も、本発明の範囲に含まれることが想定される。
も有用である。ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細胞上の少なくとも２つの
部位：１．１（±０．７ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）と細胞当たり９６，０００（
±３９，０００）部位を有する高親和性部位と、４１（±１３）ｎＭのＫｄと細
胞当たり４８０，０００（±９０，０００）部位を有する、より低親和性の部位
に結合することが観察された。さらに、ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細
胞が、フィブロネクチン及びビトロネクチンに接着するのを阻害し、これらに比
べて程度は低いが、コラーゲン及びラミニンに接着するのを阻害することが見出
された。このように、メラノーマ、がん腫、及び肉腫患者の転移を防止する方法
及び組成物も、本発明の範囲に含まれることが想定される。
【００４９】 本発明によれば、ディスインテグリンのユニークな特性は、がん腫、肉腫、及
びメラノーマ患者の転移を防止するための方法及び組成物で利用される。ある態
様では、乳癌患者の転移を防止するための肢位と方法が提供される。
びメラノーマ患者の転移を防止するための方法及び組成物で利用される。ある態
様では、乳癌患者の転移を防止するための肢位と方法が提供される。
【００５０】 さらなる態様では、我々は、強力な抗腫瘍活性を有するミナミアメリカマムシ
毒からのタンパク質コントートロスタチンを提供する。ミナミアメリカマムシの
毒に見出されるタンパク質の複雑な混合物からの該タンパク質を精製するための
洗練された技術を開発した。上述のように、ＣＮは、まず、血小板凝集の阻害剤
として性質決定された。我々は、ヘビ毒から幾つかのディスインテグリンを精製
した。コントートロスタチン（ＣＮ）は、ミナミアメリカマムシから精製した。
ディスインテグリンは、柔軟なペプチドループの端に、Ｃｙｓ残基が隣接した約
１３アミノ酸残基の、主要なタンパク質のコアから突出した拘束されたＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有する。例えば、配列番号１又は２のアミノ
酸残基４５７〜４６９を参照。この露出したＲＧＤ配列は、ディスインテグリン
が、高い親和性でインテグリンに結合するのを可能にする。
毒からのタンパク質コントートロスタチンを提供する。ミナミアメリカマムシの
毒に見出されるタンパク質の複雑な混合物からの該タンパク質を精製するための
洗練された技術を開発した。上述のように、ＣＮは、まず、血小板凝集の阻害剤
として性質決定された。我々は、ヘビ毒から幾つかのディスインテグリンを精製
した。コントートロスタチン（ＣＮ）は、ミナミアメリカマムシから精製した。
ディスインテグリンは、柔軟なペプチドループの端に、Ｃｙｓ残基が隣接した約
１３アミノ酸残基の、主要なタンパク質のコアから突出した拘束されたＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含有する。例えば、配列番号１又は２のアミノ
酸残基４５７〜４６９を参照。この露出したＲＧＤ配列は、ディスインテグリン
が、高い親和性でインテグリンに結合するのを可能にする。
【００５１】 我々は、マウス乳腺の脂肪パッド中にヒト乳癌細胞を移植することにより、転
移性の乳癌モデルを開発した。我々が使用するマウスは、それらの免疫系が欠損
し、移植したヒトの癌細胞を拒絶できないように遺伝学的に操作された。我々は
、癌細胞の移植から２週間後に、乳腺の脂肪パッド中に触診可能な腫瘍の塊が発
育し、１２週以内に、未処置の動物の肺に腫瘍細胞が広がることを観察した。異
なる数グループのマウスの腫瘍に、ＣＮ又はプラセボを毎日投与した。処置後に
、我々は、ＣＮ処置したマウスで腫瘍の塊のサイズが、プラセボ処置したマウス
のものと比べて、有意に小さくなっていることを見出した。意味深いことに、Ｃ
Ｎ処置群は、プラセボ群と比べて、身体の他の部位への腫瘍の広がり（転移）に
関して９０％を超える阻害を示した。我々の研究は、ＣＮが血管壁の必須成分で
あるタンパク質への乳癌細胞の接着をブロックすることを示している。ＣＮは、
絨毛尿膜と呼ばれるニワトリ胚の膜状呼吸器官上でのインキュベーション後に、
乳癌細胞によって誘導される新しい血管の形成（新血管形成）も阻害したが、プ
ラセボ処置は、阻害しなかった。新血管形成は、増殖する腫瘍が増殖し続けるの
に極めて重要なので、新しい血管の増殖を阻害する能力は、ＣＮの重要な抗癌作
用である。
移性の乳癌モデルを開発した。我々が使用するマウスは、それらの免疫系が欠損
し、移植したヒトの癌細胞を拒絶できないように遺伝学的に操作された。我々は
、癌細胞の移植から２週間後に、乳腺の脂肪パッド中に触診可能な腫瘍の塊が発
育し、１２週以内に、未処置の動物の肺に腫瘍細胞が広がることを観察した。異
なる数グループのマウスの腫瘍に、ＣＮ又はプラセボを毎日投与した。処置後に
、我々は、ＣＮ処置したマウスで腫瘍の塊のサイズが、プラセボ処置したマウス
のものと比べて、有意に小さくなっていることを見出した。意味深いことに、Ｃ
Ｎ処置群は、プラセボ群と比べて、身体の他の部位への腫瘍の広がり（転移）に
関して９０％を超える阻害を示した。我々の研究は、ＣＮが血管壁の必須成分で
あるタンパク質への乳癌細胞の接着をブロックすることを示している。ＣＮは、
絨毛尿膜と呼ばれるニワトリ胚の膜状呼吸器官上でのインキュベーション後に、
乳癌細胞によって誘導される新しい血管の形成（新血管形成）も阻害したが、プ
ラセボ処置は、阻害しなかった。新血管形成は、増殖する腫瘍が増殖し続けるの
に極めて重要なので、新しい血管の増殖を阻害する能力は、ＣＮの重要な抗癌作
用である。
【００５２】 これらの研究に基づくと、ヘビ毒タンパク質コントートロスタチンのようなデ
ィスインテグリンは抗転移活性を有しているものと思われる。我々の発見は、Ｃ
Ｎが転移における幾つかの重要なステップをブロックし、それ故、単一のステッ
プを阻害するだけの他の物質より強力であることを示唆する。本発明のディスイ
ンテグリン含有組成物は、骨粗鬆症の治療にも有用である。破骨細胞は、脊椎動
物の石化した組織を再吸収する直径４００μｍまでの多核細胞である。骨の再吸
収は、骨への接着、酸及びプロテアーゼの偏向した分泌、並びに骨基質に沿った
破骨細胞の活発な移動を含むプロセスの組合せによって進行するようであり、破
骨細胞は、骨の再吸収における必須のステップとして、ＲＧＤ配列を介して骨に
結合し、このＲＧＤ結合性インテグリンは、接着構造のところにある［Ｓａｔｏ
，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：１７１３（１９９０
）］。破骨細胞が骨に接着する分子的な機序はよく理解されていないが、他の細
胞から類推することにより、二価の陽イオン依存性の接着分子のインテグリンス
ーパーファミリーのメンバーが、この相互作用を媒介していると考えられている
。エチスタチン［Ｓａｔｏ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，上記］と、おそらくはＣＮの
ように、ディスインテグリンは、分離した破骨細胞による骨の再吸収を阻害する
。作用機序は、おそらく、接着構造を崩壊することによる。従って、破骨細胞に
よる骨の再吸収を阻害するのに有効な量のＣＮを用いた骨粗鬆症の治療用組成物
及び方法も、本発明の範囲に属すると想定される。
ィスインテグリンは抗転移活性を有しているものと思われる。我々の発見は、Ｃ
Ｎが転移における幾つかの重要なステップをブロックし、それ故、単一のステッ
プを阻害するだけの他の物質より強力であることを示唆する。本発明のディスイ
ンテグリン含有組成物は、骨粗鬆症の治療にも有用である。破骨細胞は、脊椎動
物の石化した組織を再吸収する直径４００μｍまでの多核細胞である。骨の再吸
収は、骨への接着、酸及びプロテアーゼの偏向した分泌、並びに骨基質に沿った
破骨細胞の活発な移動を含むプロセスの組合せによって進行するようであり、破
骨細胞は、骨の再吸収における必須のステップとして、ＲＧＤ配列を介して骨に
結合し、このＲＧＤ結合性インテグリンは、接着構造のところにある［Ｓａｔｏ
，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：１７１３（１９９０
）］。破骨細胞が骨に接着する分子的な機序はよく理解されていないが、他の細
胞から類推することにより、二価の陽イオン依存性の接着分子のインテグリンス
ーパーファミリーのメンバーが、この相互作用を媒介していると考えられている
。エチスタチン［Ｓａｔｏ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，上記］と、おそらくはＣＮの
ように、ディスインテグリンは、分離した破骨細胞による骨の再吸収を阻害する
。作用機序は、おそらく、接着構造を崩壊することによる。従って、破骨細胞に
よる骨の再吸収を阻害するのに有効な量のＣＮを用いた骨粗鬆症の治療用組成物
及び方法も、本発明の範囲に属すると想定される。
【００５３】 最後に、ＣＮは、創傷治癒の促進において有用である。創傷治癒に関与する事
象には、インテグリンの発現又は機能的な活性の変化が含まれることが知られて
おり、インテグリン受容体のモジュレーションが、創傷の回復と炎症において中
心的な役割を果たしていることが示唆されている。フィブロネクチンも、創傷治
癒プロセスにおいて多くの役割を果たすことが知られている。フィブロネクチン
機能は、効果的な創傷治癒にとって重要であると考えられているが、少なくとも
１つのその活性（細菌の結合）は逆効果であり得るという報告があり［Ｇｒｉｎ
ｎｅｌｌ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１０７（１９８４）；
Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２４：２０１（１
９８８）］、このため、創床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）におけるフィブロネクチン
の存在は、細菌の接着と感染を促進するかもしれない。フィブロネクチンは、ケ
ロイドの形成に密接に関係しているようにも思われる。ケロイドは、かなりの割
合の非白人患者を冒す創傷治癒の病的な結果である。ケロイドは、元の創傷の境
界を超えて増殖し、フィブロネクチンとＩ型コラーゲンが豊富な結合組織の良性
腫瘍である［Ｓｉｂｌｅ，Ｊ．Ｃ．＆ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｆ：１７０（１９９２）］。それらの細胞−細
胞及び（フィブロネクチンとの相互作用を含む）細胞−細胞外マトリックス相互
作用の阻害によって、ＣＮのようなディスインテグリンは、ケロイドの形成を含
む創傷の回復に関わるプロセスに対して強い効果を有すると予想されるであろう
。
象には、インテグリンの発現又は機能的な活性の変化が含まれることが知られて
おり、インテグリン受容体のモジュレーションが、創傷の回復と炎症において中
心的な役割を果たしていることが示唆されている。フィブロネクチンも、創傷治
癒プロセスにおいて多くの役割を果たすことが知られている。フィブロネクチン
機能は、効果的な創傷治癒にとって重要であると考えられているが、少なくとも
１つのその活性（細菌の結合）は逆効果であり得るという報告があり［Ｇｒｉｎ
ｎｅｌｌ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１０７（１９８４）；
Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２４：２０１（１
９８８）］、このため、創床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）におけるフィブロネクチン
の存在は、細菌の接着と感染を促進するかもしれない。フィブロネクチンは、ケ
ロイドの形成に密接に関係しているようにも思われる。ケロイドは、かなりの割
合の非白人患者を冒す創傷治癒の病的な結果である。ケロイドは、元の創傷の境
界を超えて増殖し、フィブロネクチンとＩ型コラーゲンが豊富な結合組織の良性
腫瘍である［Ｓｉｂｌｅ，Ｊ．Ｃ．＆ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｆ：１７０（１９９２）］。それらの細胞−細
胞及び（フィブロネクチンとの相互作用を含む）細胞−細胞外マトリックス相互
作用の阻害によって、ＣＮのようなディスインテグリンは、ケロイドの形成を含
む創傷の回復に関わるプロセスに対して強い効果を有すると予想されるであろう
。
【００５４】 分娩及び婦人科手術後の主な問題は、癒着の形成である。腹腔の創傷の回復で
観察される、この広く見られる現象は、痛み（ｐａｉｎ）、腸閉塞、及び不妊の
主要な原因である。癒着の形成には、繊維素溶解性炎症反応と繊維素増殖性の炎
症反応の不均衡が関わっているようであり、細胞−細胞又は細胞−細胞外マトリ
ックス相互作用の調節も関わっているかもしれない。癒着の形成の最初の段階に
おけるフィブリンの重要な役割には強固な証拠が存在する［ｄｉＺｅｒｅｇａ，
Ｇ．Ｓ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３８１：１（１９９３）］
。血小板を含む細胞要素の存在は、さらに、フィブリンの役割を悪化させる。癒
着の形成における血小板とフィブリンの役割に照らせば、ＣＮのようなディスイ
ンテグリンの潜在的な治療剤としての使用は、最も魅力的である。
観察される、この広く見られる現象は、痛み（ｐａｉｎ）、腸閉塞、及び不妊の
主要な原因である。癒着の形成には、繊維素溶解性炎症反応と繊維素増殖性の炎
症反応の不均衡が関わっているようであり、細胞−細胞又は細胞−細胞外マトリ
ックス相互作用の調節も関わっているかもしれない。癒着の形成の最初の段階に
おけるフィブリンの重要な役割には強固な証拠が存在する［ｄｉＺｅｒｅｇａ，
Ｇ．Ｓ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３８１：１（１９９３）］
。血小板を含む細胞要素の存在は、さらに、フィブリンの役割を悪化させる。癒
着の形成における血小板とフィブリンの役割に照らせば、ＣＮのようなディスイ
ンテグリンの潜在的な治療剤としての使用は、最も魅力的である。
【００５５】 非処置動物に創傷治癒の間に癒着の形成を誘導するために、癒着形成のウサギ
のモデルでの予備的研究では、ウサギの子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ ｈｏｒｎ）の
掻爬及び血管除去（ｄｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が使用された［Ｒｏ
ｄｇｅｒｓ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｅｒｔｉｌ．３５：４０（１
９９０）］。１０μＬ／時間（３６μｇ／ｍＬ）の速度で、ＣＮを継続的に送り
込むためにアルゼット（ａｌｚｅｔ）ポンプを使用した。このモデル系では、対
照に比べて、被処置動物で減少した癒着の形成が観察された。それ故、癒着の形
成を防止するのに有効な量のＣＮを、このような治療を必要としている患者に投
与することによって、癒着の形成を防止するための組成物及び方法も、本発明の
範囲に属するものと想定される。
のモデルでの予備的研究では、ウサギの子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ ｈｏｒｎ）の
掻爬及び血管除去（ｄｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が使用された［Ｒｏ
ｄｇｅｒｓ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｅｒｔｉｌ．３５：４０（１
９９０）］。１０μＬ／時間（３６μｇ／ｍＬ）の速度で、ＣＮを継続的に送り
込むためにアルゼット（ａｌｚｅｔ）ポンプを使用した。このモデル系では、対
照に比べて、被処置動物で減少した癒着の形成が観察された。それ故、癒着の形
成を防止するのに有効な量のＣＮを、このような治療を必要としている患者に投
与することによって、癒着の形成を防止するための組成物及び方法も、本発明の
範囲に属するものと想定される。
【００５６】 本発明の組成物は、最小限、所望の効果（すなわち、血栓形成を防止する、癌
患者での転移を防止する、癒着の形成を防止するなど）を達成するのに有効な量
のＣＮと、適切な担体又は賦形剤を含む。一般的に、これらの組成物では、約０
．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ
／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０
．５ｍｇ／ｋｇ／日、を与えるのに十分な量で存在する。このような組成物は、
血栓形成の防止に特に有用である。
患者での転移を防止する、癒着の形成を防止するなど）を達成するのに有効な量
のＣＮと、適切な担体又は賦形剤を含む。一般的に、これらの組成物では、約０
．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ
／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０
．５ｍｇ／ｋｇ／日、を与えるのに十分な量で存在する。このような組成物は、
血栓形成の防止に特に有用である。
【００５７】 あるいは、ＣＮは、血栓溶解を達成するのに有効な量で存在する少なくとも１
つの血栓溶解剤と組み合わせて投与される。適切な血栓溶解剤には、以下のもの
：アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳ
ＡＣ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｊｒらの米国特許第４，
６１０，８７９号に記載されているヘビ毒血栓溶解剤フィブロラーゼが含まれる
が、これらに限定されない。
つの血栓溶解剤と組み合わせて投与される。適切な血栓溶解剤には、以下のもの
：アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳ
ＡＣ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｊｒらの米国特許第４，
６１０，８７９号に記載されているヘビ毒血栓溶解剤フィブロラーゼが含まれる
が、これらに限定されない。
【００５８】 ＣＮは、血流中への相当量でのその送達に適した、様々なこれまでに知られて
いる手段によって投与され得る。ここでは、適切な液体媒体又は賦形剤中のＣＮ
の静脈内投与が、好適な投与経路として想定されている。ＣＮは、水に可溶性で
あり、それ故、適切な水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水）中で効果的
に投与され得る。あるいは、ＣＮは、（適切な結合剤若しくは賦形剤成分と調合
した錠剤若しくはカプセルの形態で、又は水性若しくは油性の懸濁物、溶液、エ
マルジョン、シロップ、若しくはエリキシル剤の形態で）経口で、又は、非経口
懸濁物として投与し得る。本分野で周知であるように、これらの調合物には何れ
も、局所麻酔、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、湿潤剤、着色剤、香料、賦形剤、及び
希釈剤のようなアジュバントを適切に含有させてもよい。
いる手段によって投与され得る。ここでは、適切な液体媒体又は賦形剤中のＣＮ
の静脈内投与が、好適な投与経路として想定されている。ＣＮは、水に可溶性で
あり、それ故、適切な水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水）中で効果的
に投与され得る。あるいは、ＣＮは、（適切な結合剤若しくは賦形剤成分と調合
した錠剤若しくはカプセルの形態で、又は水性若しくは油性の懸濁物、溶液、エ
マルジョン、シロップ、若しくはエリキシル剤の形態で）経口で、又は、非経口
懸濁物として投与し得る。本分野で周知であるように、これらの調合物には何れ
も、局所麻酔、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、湿潤剤、着色剤、香料、賦形剤、及び
希釈剤のようなアジュバントを適切に含有させてもよい。
【００５９】 例 これらの更なる実施態様は、添付の例を参照することによって、よりよく理解
され得るであろうが、この例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる意
味においても、本明細書に付された特許請求の範囲に明記された本発明の範囲を
限定するように解釈してはならない。
され得るであろうが、この例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる意
味においても、本明細書に付された特許請求の範囲に明記された本発明の範囲を
限定するように解釈してはならない。
【００６０】 以下の例を実施する際には、Ｂｉｏｔｏｘｉｎｓ社、Ｓｔ．Ｃｌｏｕｄ，ＦＬ
から、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ
から凍結乾燥した毒を取得した。全ての化学薬品は、入手可能な最高級のもので
あった。タンパク質濃度を決定するためには、ビシンコニン酸を用いたピアース
のタンパク質アッセイキットを使用した［Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６（１９８５）］。
から、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ
から凍結乾燥した毒を取得した。全ての化学薬品は、入手可能な最高級のもので
あった。タンパク質濃度を決定するためには、ビシンコニン酸を用いたピアース
のタンパク質アッセイキットを使用した［Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６（１９８５）］。
【００６１】 疎水性相互作用（ＨＩＣ）ＨＰＬＣのためには、ＬＣ−９５ＵＶ／ＶＩＳ検出
器とともに、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ４１０ＬＣポンプを使用した。逆相Ｈ
ＰＬＣのためには、ＳＰ８４５０ＵＶ／ＶＩＳ検出器とともに、Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｐｈｙｓｉｃｓ ＬＣ８８１０ポンプを用いた。ＨＩＣ−ＨＰＬＣの吸光度は
２８０ｎｍでモニターし、ＲＰ−ＨＰＬＣの吸光度は２１５ｎｍでモニターした
。疎水性相互作用ＨＰＬＣには、ポリプロピルアスパルタミド（２５０×２１ｍ
ｍ）カラム（Ｐｏｌｙ ＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用した。逆相（Ｒ
Ｐ）ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）には、Ｃ１８（２１８Ｔ
Ｐ５４と２１８ＴＰ５１０）カラムを使用した。陽イオン交換クロマトグラフィ
ーには、ＣＭ（カルボキシメチル）３００カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．
，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用した。
器とともに、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ４１０ＬＣポンプを使用した。逆相Ｈ
ＰＬＣのためには、ＳＰ８４５０ＵＶ／ＶＩＳ検出器とともに、Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｐｈｙｓｉｃｓ ＬＣ８８１０ポンプを用いた。ＨＩＣ−ＨＰＬＣの吸光度は
２８０ｎｍでモニターし、ＲＰ−ＨＰＬＣの吸光度は２１５ｎｍでモニターした
。疎水性相互作用ＨＰＬＣには、ポリプロピルアスパルタミド（２５０×２１ｍ
ｍ）カラム（Ｐｏｌｙ ＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用した。逆相（Ｒ
Ｐ）ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）には、Ｃ１８（２１８Ｔ
Ｐ５４と２１８ＴＰ５１０）カラムを使用した。陽イオン交換クロマトグラフィ
ーには、ＣＭ（カルボキシメチル）３００カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．
，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用した。
【００６２】 例１ ＣＮの精製と性質決定 ＣＮは、４工程のＨＰＬＣ操作を用いて、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔ
ｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から精製し
た。精製の第１段階では、１Ｍの硫酸アンモニウムｐＨ６．８（緩衝液Ａ）を含
有する０．１Ｍのリン酸緩衝液の中に、未精製の毒（１ｇ）を溶かして、ポリプ
ロピルアスパルタミドＨＩＣ−ＨＰＬＣカラムにアプライした。溶出は、以下の
ように行った：１００％の緩衝液Ａで５０分間イソクラティック、０．１Ｍリン
酸ｐＨ６．８（緩衝液Ｂ）まで９０分間の直線グラジエント、１００％緩衝液Ｂ
で４０分。５ｍＬ／分の流速を用いて、４℃で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｒａｃ
１００フラクションコレクターに１０ｍＬの画分を採集した。血小板凝集阻害
活性を含有する画分をプールし、ＹＭ３膜を備えたＡｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒ ｃ
ｅｌｌを用いた限外濾過によって濃縮した。タンパク質は、２８０ｎｍで検出し
た。血小板凝集阻害活性は、フロースルー中に観察された。
ｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から精製し
た。精製の第１段階では、１Ｍの硫酸アンモニウムｐＨ６．８（緩衝液Ａ）を含
有する０．１Ｍのリン酸緩衝液の中に、未精製の毒（１ｇ）を溶かして、ポリプ
ロピルアスパルタミドＨＩＣ−ＨＰＬＣカラムにアプライした。溶出は、以下の
ように行った：１００％の緩衝液Ａで５０分間イソクラティック、０．１Ｍリン
酸ｐＨ６．８（緩衝液Ｂ）まで９０分間の直線グラジエント、１００％緩衝液Ｂ
で４０分。５ｍＬ／分の流速を用いて、４℃で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｒａｃ
１００フラクションコレクターに１０ｍＬの画分を採集した。血小板凝集阻害
活性を含有する画分をプールし、ＹＭ３膜を備えたＡｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒ ｃ
ｅｌｌを用いた限外濾過によって濃縮した。タンパク質は、２８０ｎｍで検出し
た。血小板凝集阻害活性は、フロースルー中に観察された。
【００６３】 さらなる精製は、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣによって達成された。この第２の工程
のために、血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、濃縮した。水中の０
．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）９５％と水中０．１％アセトニトリル中の８０％アセト
ニトリル５％でＣ１８カラム（２１８ＴＰ５１０）を平衡化した。溶出は、以下
のように行った：９５％の溶媒Ａと５％の溶媒Ｂで１０分間イソクラティック、
６５分で４０％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、２０分で１００％の溶媒Ｂまで
直線グラジエント、１００％の溶媒Ｂで２５分間イソクラティック。画分は、７
ｍＬ／分の流速で、１分ごとに手で採集した。ＣＮは、２８％のアセトニトリル
（６６分）で溶出した。
のために、血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、濃縮した。水中の０
．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）９５％と水中０．１％アセトニトリル中の８０％アセト
ニトリル５％でＣ１８カラム（２１８ＴＰ５１０）を平衡化した。溶出は、以下
のように行った：９５％の溶媒Ａと５％の溶媒Ｂで１０分間イソクラティック、
６５分で４０％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、２０分で１００％の溶媒Ｂまで
直線グラジエント、１００％の溶媒Ｂで２５分間イソクラティック。画分は、７
ｍＬ／分の流速で、１分ごとに手で採集した。ＣＮは、２８％のアセトニトリル
（６６分）で溶出した。
【００６４】 血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、より緩いグラジエントを用い
て、同じＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＡに再度流した。溶出は、以下のように達成した：
８０％の溶媒Ａと２０％の溶媒Ｂで２０分間イソクラティック、９０分以上で３
０％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、２５分で１００％の溶媒Ｂまで直線グラジ
エント。ＣＮは、２２％のアセトニトリル（８２分）で溶出した。ＣＮの直前に
溶出する小さなピークも血小板凝集阻害活性を含み、ＣＮの分子量と同様の分子
量を有していたが、低収率のために、このピークは、さらに性質決定しなかった
。
て、同じＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＡに再度流した。溶出は、以下のように達成した：
８０％の溶媒Ａと２０％の溶媒Ｂで２０分間イソクラティック、９０分以上で３
０％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、２５分で１００％の溶媒Ｂまで直線グラジ
エント。ＣＮは、２２％のアセトニトリル（８２分）で溶出した。ＣＮの直前に
溶出する小さなピークも血小板凝集阻害活性を含み、ＣＮの分子量と同様の分子
量を有していたが、低収率のために、このピークは、さらに性質決定しなかった
。
【００６５】 最後の精製工程は、前の工程からのプールした画分を用いて行った。陽イオン
交換ＣＭ３００ＨＰＬＣカラムに、これらのプールされた画分をアプライし、徐
々に増加する塩化ナトリウムのグラジエントによって溶出を達成した。ＣＮは、
５２．５分（１６０ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出する。この工程によって、ＣＮのそ
のイソフォームからの分離が達成された。１ｇの未精製毒当たり、１〜２ｍｇの
収量の４工程精製されたＣＮが得られた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために、還元及び非還元条件下で、発表されたプロ
トコール［Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ． ＆ Ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８（１９８７）］に従って、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉ
ｃｉｎｅの１６．５％ゲルを用いた。ＢｉｏＲａｄミニゲルシステムを用いて、
このゲルを展開し、銀［Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１１７：３０７（１９８１）］又はクマシーブルーＲ２５０で染色した。
交換ＣＭ３００ＨＰＬＣカラムに、これらのプールされた画分をアプライし、徐
々に増加する塩化ナトリウムのグラジエントによって溶出を達成した。ＣＮは、
５２．５分（１６０ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出する。この工程によって、ＣＮのそ
のイソフォームからの分離が達成された。１ｇの未精製毒当たり、１〜２ｍｇの
収量の４工程精製されたＣＮが得られた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために、還元及び非還元条件下で、発表されたプロ
トコール［Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ． ＆ Ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８（１９８７）］に従って、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉ
ｃｉｎｅの１６．５％ゲルを用いた。ＢｉｏＲａｄミニゲルシステムを用いて、
このゲルを展開し、銀［Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１１７：３０７（１９８１）］又はクマシーブルーＲ２５０で染色した。
【００６６】 ＣＮのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＣＮは、非還元条件下で、約１５，０
００ダルトンの分子量を有し、還元条件下で５，０００〜７，０００ダルトンの
分子量を有することが明らかとなった。このことは、ＣＮが２つのサブユニット
から構成されることを強く示唆している。あり得にくいことであるが、別の可能
性は、大きな移動度の差は、非還元条件と還元条件下で、ＳＤＳの取り込みが異
なることに由来するかもしれないということである。
００ダルトンの分子量を有し、還元条件下で５，０００〜７，０００ダルトンの
分子量を有することが明らかとなった。このことは、ＣＮが２つのサブユニット
から構成されることを強く示唆している。あり得にくいことであるが、別の可能
性は、大きな移動度の差は、非還元条件と還元条件下で、ＳＤＳの取り込みが異
なることに由来するかもしれないということである。
【００６７】 ＣＮの分子量は、エレクトロスプレーイオン源を有する３重４極子装置を用い
た質量分析によって確認した。天然のＣＮについては、１３，５０７ダルトンの
質量が決定された・この分析も高度の精製を示した。還元され、ピリジルエチル
化されたタンパク質の質量分析は、７，９９６ダルトンの質量を与えた。６つの
還元されたジスルフィド結合中に取りこまれた１２のピリジルエチル基の１，２
４８質量単位を考慮に入れると（公知のディスインテグリンとの相同性に基づけ
ば、６つのジスルフィド結合が存在するはずである）、これは、この分子量のホ
モダイマーの各鎖について予想された値である。これらの発見は、二量体として
存在する点で、これまでに報告された全てのディスインテグリンの中で、ＣＮを
ユニークな位置に置くものである。活性化されていないヒト血小板へのＣＮ結合
のスキャッチャード分析によって、３７ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する単一の
結合部位と１００，０００に等しい結合部位の数（Ｂｍ）が明らかとなった。ジ
スルフィド結合の還元は、ＩＣ５０の１０倍の濃度においてさえ、血小板凝集阻
害活性を完全に喪失せしめ、活性を維持するためには構造的なパラメーターが重
要であることを示唆した。
た質量分析によって確認した。天然のＣＮについては、１３，５０７ダルトンの
質量が決定された・この分析も高度の精製を示した。還元され、ピリジルエチル
化されたタンパク質の質量分析は、７，９９６ダルトンの質量を与えた。６つの
還元されたジスルフィド結合中に取りこまれた１２のピリジルエチル基の１，２
４８質量単位を考慮に入れると（公知のディスインテグリンとの相同性に基づけ
ば、６つのジスルフィド結合が存在するはずである）、これは、この分子量のホ
モダイマーの各鎖について予想された値である。これらの発見は、二量体として
存在する点で、これまでに報告された全てのディスインテグリンの中で、ＣＮを
ユニークな位置に置くものである。活性化されていないヒト血小板へのＣＮ結合
のスキャッチャード分析によって、３７ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する単一の
結合部位と１００，０００に等しい結合部位の数（Ｂｍ）が明らかとなった。ジ
スルフィド結合の還元は、ＩＣ５０の１０倍の濃度においてさえ、血小板凝集阻
害活性を完全に喪失せしめ、活性を維持するためには構造的なパラメーターが重
要であることを示唆した。
【００６８】 例２ ポリメラーゼ連鎖反応を用いたコントートロスタチンのｃＤＮＡクローニング エドマン分解法を用いたコントートロスタチンの部分アミノ酸配列分析によっ
て、コントートロスタチンのサブユニットとＲＧＤ配列が、システイン残基を並
列した他のディスインテグリンと相同である（図１Ａ）ことが示唆された［Ｎｉ
ｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ
．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ． Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａ
ｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ａｎｔａｇｏｎ
ｉｓｔｓ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３１：２８９−３００
（１９９４）］。ＰＣＲを用いたコントートロスタチンｃＤＮＡのクローニング
戦略は、ディスインテグリンファミリー間の構造的な相同性に基づいている。Ｐ
ＣＲプライマーのデザインは、図１に図式的に示されている。図１Ａ中の下線を
付した配列は、ディスインテグリンファミリーの間で高度に保存されている。Ｐ
ＣＲプライマーは、この領域に基づいて合成した。プライマーＰＣＲ−１とＰＣ
Ｒ−２を合成するために、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓから
のトリグラミンのｃＤＮＡ中のこの領域をコードするヌクレオチド配列を使用し
た（図１Ｂ）。ＰＣＲ−１とＰＣＲ−２は、ディスインテグリン間のコンセンサ
ス配列ＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬのコーディング配列に相当する相補的なプライマー
である。それらのヌクレオチド配列は、 ＰＣＲ−１：５’−ＧＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’ （配列番号３） ＰＣＲ−２：５’−ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＣ−３’ （配列番号４） である。
て、コントートロスタチンのサブユニットとＲＧＤ配列が、システイン残基を並
列した他のディスインテグリンと相同である（図１Ａ）ことが示唆された［Ｎｉ
ｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ
．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ． Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａ
ｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ａｎｔａｇｏｎ
ｉｓｔｓ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３１：２８９−３００
（１９９４）］。ＰＣＲを用いたコントートロスタチンｃＤＮＡのクローニング
戦略は、ディスインテグリンファミリー間の構造的な相同性に基づいている。Ｐ
ＣＲプライマーのデザインは、図１に図式的に示されている。図１Ａ中の下線を
付した配列は、ディスインテグリンファミリーの間で高度に保存されている。Ｐ
ＣＲプライマーは、この領域に基づいて合成した。プライマーＰＣＲ−１とＰＣ
Ｒ−２を合成するために、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓから
のトリグラミンのｃＤＮＡ中のこの領域をコードするヌクレオチド配列を使用し
た（図１Ｂ）。ＰＣＲ−１とＰＣＲ−２は、ディスインテグリン間のコンセンサ
ス配列ＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬのコーディング配列に相当する相補的なプライマー
である。それらのヌクレオチド配列は、 ＰＣＲ−１：５’−ＧＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’ （配列番号３） ＰＣＲ−２：５’−ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＣ−３’ （配列番号４） である。
【００６９】 ＰＣＲのために、ベクターのＥｃｏＲＩ部位に隣接するλｇｔ１０フォワード
及びリバースプライマーを使用した。該プライマーのヌクレオチドを以下に記す
。
及びリバースプライマーを使用した。該プライマーのヌクレオチドを以下に記す
。
【００７０】 λｇｔ１０フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧ
ＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５） λｇｔ１０リバースプライマー：５’−ＣＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣ
ＣＡＧＧＧＴＡ−３’（配列番号６） オリゴヌクレオチドプライマーは、ミナミカリフォルニア大学総合癌センター
の微量化学中心施設によって合成した。プライマーは、脱保護された凍結乾燥形
態で調製され、使用前に、水で再懸濁し、適当な濃度まで希釈した。
ＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５） λｇｔ１０リバースプライマー：５’−ＣＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣ
ＣＡＧＧＧＴＡ−３’（配列番号６） オリゴヌクレオチドプライマーは、ミナミカリフォルニア大学総合癌センター
の微量化学中心施設によって合成した。プライマーは、脱保護された凍結乾燥形
態で調製され、使用前に、水で再懸濁し、適当な濃度まで希釈した。
【００７１】 例３ コントートロスタチンｃＤＮＡのＰＣＲ増幅 我々は、λｇｔ１０ベクターのＥｃｏＲＩ部位に構築したＡｇｋｉｓｔｒｏｄ
ｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ毒のｃＤＮＡライブラリー
を使用した。該ライブラリーの概算の力価は、１０１０プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）であり、複雑性は５０，０００であった。このｃＤＮＡライブラリーファー
ジ溶液５００μＬを、エッペンドルフチューブ中の５００μＬの２０％ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）／１Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合した。エッペンドルフチ
ューブを２回逆さまにし、室温で３０分間インキュベートした。続いて、この溶
液を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、１００μＬの滅菌
水の中に沈降物を再懸濁した。５０℃で１時間、１０μＬのプロテイナーゼＫ（
１０ｍｇ／ｍＬ）とともに、この懸濁物をインキュベートした。フェノール／ク
ロロホルムを用いて、ファージ粒子懸濁物を２回抽出し、１／１０容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムと２倍量の無水エタノールでＤＮＡを沈殿した後、８０％エタノー
ルで洗浄した。ＰＣＲの準備のため、１０μＬの滅菌水の中にＤＮＡを再懸濁し
た。
ｏｎ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ毒のｃＤＮＡライブラリー
を使用した。該ライブラリーの概算の力価は、１０１０プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）であり、複雑性は５０，０００であった。このｃＤＮＡライブラリーファー
ジ溶液５００μＬを、エッペンドルフチューブ中の５００μＬの２０％ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）／１Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合した。エッペンドルフチ
ューブを２回逆さまにし、室温で３０分間インキュベートした。続いて、この溶
液を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、１００μＬの滅菌
水の中に沈降物を再懸濁した。５０℃で１時間、１０μＬのプロテイナーゼＫ（
１０ｍｇ／ｍＬ）とともに、この懸濁物をインキュベートした。フェノール／ク
ロロホルムを用いて、ファージ粒子懸濁物を２回抽出し、１／１０容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムと２倍量の無水エタノールでＤＮＡを沈殿した後、８０％エタノー
ルで洗浄した。ＰＣＲの準備のため、１０μＬの滅菌水の中にＤＮＡを再懸濁し
た。
【００７２】 ＰＣＲ反応は、以下のようにセットアップした。５μＬのＤＮＡ溶液を、１μ
Ｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、各１μＬ（１００ｎｇ／μＬ
）のフォワード及びリバースＰＣＲプライマー、並びに５μＬの１０×ＰＣＲ緩
衝液と混合した。反応液の最終容量は、水で５０μＬにした。混合した後、液体
の上にミネラルオイルを一滴加えた。エッペンドルフチューブを９８℃まで５分
間、予め加熱した後、室温まで冷える前に、７０℃と６０℃で、それぞれ１分間
インキュベートした。２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を各混合物に加えた。サーマルサイクラーは、以下のようにプログ
ラムした：９６℃１５秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間。ＰＣＲ増幅は、３
０サイクル行った。最後のサイクルに続いて、７分間の最後の７２℃での延長工
程を与えた。アガロースゲル電気泳動によって分析する前に、クロロホルムでＰ
ＣＲ産物を抽出した。直接ＤＮＡ配列決定用の製造者のマニュアルに従って、Ｇ
ｅｎｅｃｌｅｎａキット（Ｂｉｏ １０１社）を用いて、アガロースゲルから、
電気泳動によって分離したバンドを回収した。
Ｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、各１μＬ（１００ｎｇ／μＬ
）のフォワード及びリバースＰＣＲプライマー、並びに５μＬの１０×ＰＣＲ緩
衝液と混合した。反応液の最終容量は、水で５０μＬにした。混合した後、液体
の上にミネラルオイルを一滴加えた。エッペンドルフチューブを９８℃まで５分
間、予め加熱した後、室温まで冷える前に、７０℃と６０℃で、それぞれ１分間
インキュベートした。２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を各混合物に加えた。サーマルサイクラーは、以下のようにプログ
ラムした：９６℃１５秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間。ＰＣＲ増幅は、３
０サイクル行った。最後のサイクルに続いて、７分間の最後の７２℃での延長工
程を与えた。アガロースゲル電気泳動によって分析する前に、クロロホルムでＰ
ＣＲ産物を抽出した。直接ＤＮＡ配列決定用の製造者のマニュアルに従って、Ｇ
ｅｎｅｃｌｅｎａキット（Ｂｉｏ １０１社）を用いて、アガロースゲルから、
電気泳動によって分離したバンドを回収した。
【００７３】 接着部位の上流領域を増幅するために、λｇｔ１０フォワードプライマーとＰ
ＣＲ−１プライマーを使用した（図１Ｂ）。同様に、ｃＤＮＡの下流部分を増幅
するために、ＰＣＲ−２プライマーとλｇｔ１０フォワードプライマーを対にし
た（図１Ｂ）。第１のプライマーのペアにより、約１３００ｂｐの主要なバンド
（ＣＮ−Ｎと表記した）が得られ（図２、レーン１）、後者のプライマー対を用
いたＰＣＲからは、約７００ｂｐの主要なバンド（ＣＮ−Ｃと表記した）が得ら
れた（図２、レーン２）。重複伸張の前に、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃは、ヌクレオチ
ド配列決定分析にかけた。予想どおり、ＣＮ−Ｎは、そのＮ末端のシグナルペプ
チドをコードするトリグラミンのｃＤＮＡと高度な類似性を示した。ＣＮ−Ｃヌ
クレオチドの推定アミノ酸配列は、ＲＧＤ部位をコードするディスインテグリン
のＣ末端の配列と極めて似ていた。
ＣＲ−１プライマーを使用した（図１Ｂ）。同様に、ｃＤＮＡの下流部分を増幅
するために、ＰＣＲ−２プライマーとλｇｔ１０フォワードプライマーを対にし
た（図１Ｂ）。第１のプライマーのペアにより、約１３００ｂｐの主要なバンド
（ＣＮ−Ｎと表記した）が得られ（図２、レーン１）、後者のプライマー対を用
いたＰＣＲからは、約７００ｂｐの主要なバンド（ＣＮ−Ｃと表記した）が得ら
れた（図２、レーン２）。重複伸張の前に、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃは、ヌクレオチ
ド配列決定分析にかけた。予想どおり、ＣＮ−Ｎは、そのＮ末端のシグナルペプ
チドをコードするトリグラミンのｃＤＮＡと高度な類似性を示した。ＣＮ−Ｃヌ
クレオチドの推定アミノ酸配列は、ＲＧＤ部位をコードするディスインテグリン
のＣ末端の配列と極めて似ていた。
【００７４】 ＰＣＲ−１とＰＣＲ−２は相補的なので、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃは、この部位で
重複し、それ故、完全長のｃＤＮＡに集合することができる。この目標を達成す
るために、我々は、図１Ｃに示した重複伸長法を使用した。簡潔に述べれば、等
モル量の二本鎖のＰＣＲ産物ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃを、λｇｔ１０フォワード及び
リバースプライマーと混合した。両二本鎖の変性後、続く再アニ−リングによっ
て、２種類の分子が得られる。１つは、接着部位に逆行性の（ｒｅｃｅｓｓｉｖ
ｅ）末端が３’末端であるアニ−リングしたＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃである。この分
子は、ＰＣＲを用いて、自動的に、完全長の二本鎖に伸長させることができる。
他方の分子は、同様にアニ−リングしているが、逆行性の末端が５’末端である
。これらの分子は、自己伸長しないが、各末端でのλｇｔ１０プライマーによる
プライミングを用いて埋めることができる。図２のレーン３は、アガロースゲル
電気泳動によって分離された重複伸長の産物を示している。主要なバンドのサイ
ズは、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃの合計に等しい２，０００ｂｐであると見積もられ、
このため、「完全長」と表記される。完全長のバンドをゲルから回収し、Ｅｃｏ
ＲＩで処理した。続いて、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）の中に、
このＤＮＡ片をサブクローニングした。
重複し、それ故、完全長のｃＤＮＡに集合することができる。この目標を達成す
るために、我々は、図１Ｃに示した重複伸長法を使用した。簡潔に述べれば、等
モル量の二本鎖のＰＣＲ産物ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃを、λｇｔ１０フォワード及び
リバースプライマーと混合した。両二本鎖の変性後、続く再アニ−リングによっ
て、２種類の分子が得られる。１つは、接着部位に逆行性の（ｒｅｃｅｓｓｉｖ
ｅ）末端が３’末端であるアニ−リングしたＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃである。この分
子は、ＰＣＲを用いて、自動的に、完全長の二本鎖に伸長させることができる。
他方の分子は、同様にアニ−リングしているが、逆行性の末端が５’末端である
。これらの分子は、自己伸長しないが、各末端でのλｇｔ１０プライマーによる
プライミングを用いて埋めることができる。図２のレーン３は、アガロースゲル
電気泳動によって分離された重複伸長の産物を示している。主要なバンドのサイ
ズは、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃの合計に等しい２，０００ｂｐであると見積もられ、
このため、「完全長」と表記される。完全長のバンドをゲルから回収し、Ｅｃｏ
ＲＩで処理した。続いて、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）の中に、
このＤＮＡ片をサブクローニングした。
【００７５】 例４ プラスミドベクター中へのＰＣＲ産物のサブクローニング ＥｃｏＲＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）を消
化した後、Ｔ４ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
用いて脱リン酸化した。ＰＣＲ重複伸長産物も、ＥｃｏＲＩで消化した。１６℃
で１晩のＴ４リガーゼを用いた連結反応によって、直鎖化したベクター中にＰＣ
Ｒ産物を挿入した。全ての反応は、標準的なプロトコールに従ってセットアップ
し、実施した。成功した連結は、アンピシリンを含有するプレート上に形質転換
したＥ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）を播種することによって選択した。インサートを
含有するプラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で増幅した。精製したプラスミドＤＮＡ
は、Ｑｉａｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐカラムを用いて得た。
化した後、Ｔ４ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
用いて脱リン酸化した。ＰＣＲ重複伸長産物も、ＥｃｏＲＩで消化した。１６℃
で１晩のＴ４リガーゼを用いた連結反応によって、直鎖化したベクター中にＰＣ
Ｒ産物を挿入した。全ての反応は、標準的なプロトコールに従ってセットアップ
し、実施した。成功した連結は、アンピシリンを含有するプレート上に形質転換
したＥ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）を播種することによって選択した。インサートを
含有するプラスミドは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で増幅した。精製したプラスミドＤＮＡ
は、Ｑｉａｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐカラムを用いて得た。
【００７６】 例５ ｃＤＮＡの配列決定 自動ＤＮＡ配列決定は、微量化学中心施設によって行った。ＰＣＲプライマー
は、ＰＣＲ産物の直接配列決定用の配列決定プライマーとして使用した。プラス
ミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のインサートの配列分析のために、アッセイを始
めるために、複クローニング部位（ＭＣＳ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｓｉｔｅ）に隣接するＴ７プロモータープライマーとＢＧＨリバースプライマ
ーを使用した。典型的な反応は、４００〜６００ｂｐの読み取り可能な配列を与
えた。プラスミドＤＮＡの場合には、配列決定反応は、二本鎖ＤＮＡに対して行
った。新しい配列決定プライマーを合成して、別の配列を取得し、これらは、Ｄ
ＮＡｓｉｓコンピュータープログラムを用いて、重複する連続配列に集められた
。
は、ＰＣＲ産物の直接配列決定用の配列決定プライマーとして使用した。プラス
ミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のインサートの配列分析のために、アッセイを始
めるために、複クローニング部位（ＭＣＳ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｓｉｔｅ）に隣接するＴ７プロモータープライマーとＢＧＨリバースプライマ
ーを使用した。典型的な反応は、４００〜６００ｂｐの読み取り可能な配列を与
えた。プラスミドＤＮＡの場合には、配列決定反応は、二本鎖ＤＮＡに対して行
った。新しい配列決定プライマーを合成して、別の配列を取得し、これらは、Ｄ
ＮＡｓｉｓコンピュータープログラムを用いて、重複する連続配列に集められた
。
【００７７】 図３は、ＥｃｏＲＩ部位の間に挿入された完全長のヌクレオチド配列を示して
いる。それは、２，０２９ヌクレオチドから構成され、重複伸長の完全長のバン
ドのサイズである（図２、レーン３）。８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域
（５’−ＮＴＲ）に続いて、ヌクレオチド番号８７と１５３５の間には、オープ
ンリーディングフレームが見出される。ヌクレオチド１５３６〜１５３８は終止
コドンである。３’―ＮＲＴは、３’末端の非コード領域にＡＡＴＡＡＡ部位を
有し、ポリ（Ａ）テールで終結しており、重複伸長で我々が得たｃＤＮＡが確か
に完全なｃＤＮＡであったことを示唆している（図３）。前記オープンリーディ
ングフレームは、４８３アミノ酸をコードする。ｃＤＮＡから推定されるアミノ
酸配列の構造は、３つのドメインに分けることができる。メチオニンから始まる
最初の１９０アミノ酸は、多くのクローニングされたヘビ毒タンパク質と非常に
類似している（図４に比較が示されている）。アミノ酸１９１〜４１８は、亜鉛
結合モチーフＨＥＭＧＨＮＬＧＩＳＨ（アミノ酸３３４〜３４４）を含むメタロ
プロテイナーゼドメインである。残りの６５アミノ酸は、エドマン法によって決
定されたコントートロスタチンの公知の部分アミノ酸配列と同一であるコントー
トロスタチンモノマーに属する。この配列は、その配列が決定されている多くの
ディスインテグリンと極めて似ている（図４及び１Ａ）。計算された前記ディス
インテグリンの分子量は６．７７ｋＤａであり、ＣＮモノマーの分子量と等しい
。ＲＧＤ（アミノ酸４６１〜４６３）配列は、ボールド体で記載されている。３
ドメイン構造は、Ｋｉｎｉら［Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ
Ｖｅｎｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ｍｅｔａｌｌｏ
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｌａｔｅｌｅ
ｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ
ｓ） ｆｒｏｍ Ｓｎａｋｅ Ｖｅｎｏｍｓ ａｒｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ
Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，
Ｔｏｘｉｃｏｎ ３０：２６５−２９６，（１９９２）］によって提案されたヘ
ビ毒メタロプロテイナーゼの前駆体モデルと一致している。ディスインテグリン
は、翻訳後タンパク質分解を行う複ドメイン前駆体として、ヘビ毒腺細胞で合成
され、折り畳まれて成熟したディスインテグリンになるという証拠がある。
いる。それは、２，０２９ヌクレオチドから構成され、重複伸長の完全長のバン
ドのサイズである（図２、レーン３）。８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域
（５’−ＮＴＲ）に続いて、ヌクレオチド番号８７と１５３５の間には、オープ
ンリーディングフレームが見出される。ヌクレオチド１５３６〜１５３８は終止
コドンである。３’―ＮＲＴは、３’末端の非コード領域にＡＡＴＡＡＡ部位を
有し、ポリ（Ａ）テールで終結しており、重複伸長で我々が得たｃＤＮＡが確か
に完全なｃＤＮＡであったことを示唆している（図３）。前記オープンリーディ
ングフレームは、４８３アミノ酸をコードする。ｃＤＮＡから推定されるアミノ
酸配列の構造は、３つのドメインに分けることができる。メチオニンから始まる
最初の１９０アミノ酸は、多くのクローニングされたヘビ毒タンパク質と非常に
類似している（図４に比較が示されている）。アミノ酸１９１〜４１８は、亜鉛
結合モチーフＨＥＭＧＨＮＬＧＩＳＨ（アミノ酸３３４〜３４４）を含むメタロ
プロテイナーゼドメインである。残りの６５アミノ酸は、エドマン法によって決
定されたコントートロスタチンの公知の部分アミノ酸配列と同一であるコントー
トロスタチンモノマーに属する。この配列は、その配列が決定されている多くの
ディスインテグリンと極めて似ている（図４及び１Ａ）。計算された前記ディス
インテグリンの分子量は６．７７ｋＤａであり、ＣＮモノマーの分子量と等しい
。ＲＧＤ（アミノ酸４６１〜４６３）配列は、ボールド体で記載されている。３
ドメイン構造は、Ｋｉｎｉら［Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ
Ｖｅｎｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ｍｅｔａｌｌｏ
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｌａｔｅｌｅ
ｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ
ｓ） ｆｒｏｍ Ｓｎａｋｅ Ｖｅｎｏｍｓ ａｒｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ
Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，
Ｔｏｘｉｃｏｎ ３０：２６５−２９６，（１９９２）］によって提案されたヘ
ビ毒メタロプロテイナーゼの前駆体モデルと一致している。ディスインテグリン
は、翻訳後タンパク質分解を行う複ドメイン前駆体として、ヘビ毒腺細胞で合成
され、折り畳まれて成熟したディスインテグリンになるという証拠がある。
【００７８】 例６ 血小板凝集阻害活性のアッセイ 少なくとも２週間薬物治療を全く受けていないヒトのボランティアから得た血
液から調製した新鮮なヒトの血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を用いて、精製中に
得られたカラム画分の活性をアッセイした。４ｍＬの０．１Ｍクエン酸の中に血
液（３６ｍＬ）を取り出し、１５０×ｇで２０分間遠心した。上清、ＰＲＰを除
去し、血小板が少ない血漿（ＰＰＰ；ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍ
ａ）を得るために、１０，０００ＲＭＰで残った血液を遠心した。血小板の数は
、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて、２５０，０００血小板／μＬに調節した
。血小板の凝集をモニターするために、Ｈｅｌｅｎａ４チャンネルの血小板凝集
計を用いた。ＡＤＰで誘導された血小板凝集の阻害は、ＡＤＰを添加する１分前
に、毒画分を加えることによって（１０〜２０μＭの最終濃度）、３７℃でモニ
ターした。血小板凝集阻害活性を示す画分をプールし、さらに精製した。同じ手
順によって、ウサギとイヌのＰＲＰを調製し、以下に記載した研究で使用した。
液から調製した新鮮なヒトの血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を用いて、精製中に
得られたカラム画分の活性をアッセイした。４ｍＬの０．１Ｍクエン酸の中に血
液（３６ｍＬ）を取り出し、１５０×ｇで２０分間遠心した。上清、ＰＲＰを除
去し、血小板が少ない血漿（ＰＰＰ；ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍ
ａ）を得るために、１０，０００ＲＭＰで残った血液を遠心した。血小板の数は
、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて、２５０，０００血小板／μＬに調節した
。血小板の凝集をモニターするために、Ｈｅｌｅｎａ４チャンネルの血小板凝集
計を用いた。ＡＤＰで誘導された血小板凝集の阻害は、ＡＤＰを添加する１分前
に、毒画分を加えることによって（１０〜２０μＭの最終濃度）、３７℃でモニ
ターした。血小板凝集阻害活性を示す画分をプールし、さらに精製した。同じ手
順によって、ウサギとイヌのＰＲＰを調製し、以下に記載した研究で使用した。
【００７９】 ＣＮは、ヒト、イヌ、及びウサギＰＲＰにおけるＡＤＰで誘導される血小板凝
集を阻害した（図６）。白抜きの円はヒトの血小板が豊富な血漿を表し、黒の円
はイヌの血小板が豊富な血漿を表し、白抜きの三角はウサギのＰＲＰを表してい
る。ＡＤＰを加える前に、様々な濃度のＣＮを１分間プレインキュベートした。
ＣＮ（０．７３μｇ／ｍＬ）は、１０μＭのＡＤＰで誘導されるヒトの血小板の
凝集を５０％阻害した（ＩＣ５０）。２０μＭのＡＤＰで誘導されるイヌの血小
板の凝集に対するＩＣ５０は、ＣＮについては１．８μｇ／ｍＬであった。興味
深いことに、ＣＮを媒介したウサギの血小板の凝集の阻害のＩＣ５０は、かなり
高く、２０μＭのＡＤＰで誘導されるウサギの血小板の凝集に対するＩＣ５０は
、ＣＮについては１７．３μｇ／ｍＬであった。
集を阻害した（図６）。白抜きの円はヒトの血小板が豊富な血漿を表し、黒の円
はイヌの血小板が豊富な血漿を表し、白抜きの三角はウサギのＰＲＰを表してい
る。ＡＤＰを加える前に、様々な濃度のＣＮを１分間プレインキュベートした。
ＣＮ（０．７３μｇ／ｍＬ）は、１０μＭのＡＤＰで誘導されるヒトの血小板の
凝集を５０％阻害した（ＩＣ５０）。２０μＭのＡＤＰで誘導されるイヌの血小
板の凝集に対するＩＣ５０は、ＣＮについては１．８μｇ／ｍＬであった。興味
深いことに、ＣＮを媒介したウサギの血小板の凝集の阻害のＩＣ５０は、かなり
高く、２０μＭのＡＤＰで誘導されるウサギの血小板の凝集に対するＩＣ５０は
、ＣＮについては１７．３μｇ／ｍＬであった。
【００８０】 例７ （ＧＰ）IIｂ／IIIＡ特異的な結合の測定 血小板（ＧＰ）IIｂ／IIIａ受容体へのＣＮの結合の測定は、ヒトのボランテ
ィア又はオスの雑種犬から得た血液から調製したＰＲＰを用いて実施した。上述
のように、ＰＲＰを調製し、Ｈ−１０細胞カウンター（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔ
Ｘ）を用いて血小板数を決定した。２０μＬの様々な濃度のＣＮとともに、ＰＲ
Ｐ（１８０μＬ）を室温でインキュベートした。続いて、（ＧＰ）IIｂ／IIIａ
に特異的な、放射線標識した抗体（１２５Ｉ−７Ｅ３ ＩｇＧ、２０μＬ、１８
ｍｇ／ｍＬ、８０，０００ｒｐｍ）を加えて、混合物を３０分間インキュベート
した。平衡結合を確立するために、一定分量の５０μＬの結合アッセイ混合物を
、０．４ｍＬの遠心チューブ中の３０％ショ糖２００μＬの上に重層し、血小板
が結合した抗体を遊離の抗体と分離するために、スイングバケットローターの中
で、４分間１０，０００ＲＰＭで回転させた。沈降物と上清を分離し、Ｐａｃｋ
ａｒｄ Ｍｉｎａｘｉ５０００シリーズガンマカウンターで計数した。以下の式
： （（４）×０．９μｇ７Ｅ３×３．７６×１０１２分子７Ｅ３／μｇ）／（５
）（ここで、（１）＝沈降物の計測数、（２）＝上清の計測数、（３）全ＣＰＭ
（１）＋（２）、（４）＝結合した画分（１）／（３）、（５）＝μＬ当たりの
血小板計測数×４５μＬ）を用いて、ＣＮの存在下及び不存在下での、血小板当
たりの結合した１２５Ｉ−７Ｅ３を計算した。
ィア又はオスの雑種犬から得た血液から調製したＰＲＰを用いて実施した。上述
のように、ＰＲＰを調製し、Ｈ−１０細胞カウンター（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔ
Ｘ）を用いて血小板数を決定した。２０μＬの様々な濃度のＣＮとともに、ＰＲ
Ｐ（１８０μＬ）を室温でインキュベートした。続いて、（ＧＰ）IIｂ／IIIａ
に特異的な、放射線標識した抗体（１２５Ｉ−７Ｅ３ ＩｇＧ、２０μＬ、１８
ｍｇ／ｍＬ、８０，０００ｒｐｍ）を加えて、混合物を３０分間インキュベート
した。平衡結合を確立するために、一定分量の５０μＬの結合アッセイ混合物を
、０．４ｍＬの遠心チューブ中の３０％ショ糖２００μＬの上に重層し、血小板
が結合した抗体を遊離の抗体と分離するために、スイングバケットローターの中
で、４分間１０，０００ＲＰＭで回転させた。沈降物と上清を分離し、Ｐａｃｋ
ａｒｄ Ｍｉｎａｘｉ５０００シリーズガンマカウンターで計数した。以下の式
： （（４）×０．９μｇ７Ｅ３×３．７６×１０１２分子７Ｅ３／μｇ）／（５
）（ここで、（１）＝沈降物の計測数、（２）＝上清の計測数、（３）全ＣＰＭ
（１）＋（２）、（４）＝結合した画分（１）／（３）、（５）＝μＬ当たりの
血小板計測数×４５μＬ）を用いて、ＣＮの存在下及び不存在下での、血小板当
たりの結合した１２５Ｉ−７Ｅ３を計算した。
【００８１】 ７Ｅ３を用いた拮抗結合研究は、ヒト（図７Ａ）とイヌ（図７Ｂ）の両者の血
小板とＣＮの特異的な血小板（ＧＰ）IIｂ／IIIａ受容体結合を実証した。ヒト
（ＧＰ）IIｂ／IIIａへの７Ｅ３の結合を５０％阻害するためのＣＮの濃度（Ｉ
Ｃ５０）は、０．４μｇ／ｍＬである。イヌの（ＧＰ）IIｂ／IIIａに対するＣ
ＮのＩＣ５０は、０．２４μｇ／ｍＬである。これらの研究は、ＣＮが（ＧＰ）
IIｂ／IIIａへの結合による血小板の凝集を阻害することを確認する。
小板とＣＮの特異的な血小板（ＧＰ）IIｂ／IIIａ受容体結合を実証した。ヒト
（ＧＰ）IIｂ／IIIａへの７Ｅ３の結合を５０％阻害するためのＣＮの濃度（Ｉ
Ｃ５０）は、０．４μｇ／ｍＬである。イヌの（ＧＰ）IIｂ／IIIａに対するＣ
ＮのＩＣ５０は、０．２４μｇ／ｍＬである。これらの研究は、ＣＮが（ＧＰ）
IIｂ／IIIａへの結合による血小板の凝集を阻害することを確認する。
【００８２】 例８ ＣＮのインビボでの血栓溶解能 動脈血栓症のイヌの再閉塞モデルで、ＣＮを研究した。その相対的な効果を決
定するために、まず、異なる用量での全身注入によって、このタンパク質を研究
した。このデータによって、効果的な抗血栓（抗血小板）活性に必要な全身用量
の評価が可能となった。生理的なパラメーターと循環する凝固因子に対する影響
もモニターした。
定するために、まず、異なる用量での全身注入によって、このタンパク質を研究
した。このデータによって、効果的な抗血栓（抗血小板）活性に必要な全身用量
の評価が可能となった。生理的なパラメーターと循環する凝固因子に対する影響
もモニターした。
【００８３】 記載の麻酔したイヌでの頚動脈血栓のモデルは、実験的に誘導された冠状動脈
血栓の研究のために開発されたものを改造したものである［Ｒｏｍｓｏｎ，Ｊ．
Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１７：８４１（１９８０）］。こ
の実験操作は、遠位の動脈狭窄症に近い、電気分解で誘導された内皮の障害部位
に、血小板が豊富な血管内血栓の形成をもたらす。この実験モデルに頚動脈を選
択することにより、一方の血管を対照として使用し、他方の血管を血栓溶解及び
抗血栓療法の実行後に使用することが可能となる。このモデルでは、ＡＰＳＡＣ
（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）が有効
な血栓溶解剤として使用されてきた。電気分解の障害に対する頚動脈の応答は、
イヌの冠状動脈で観察されたものと似ているが、各イヌが両側性の閉塞性血栓を
形成する能力を示すという利点を有する。次に、閉塞した血管の１つだけに溶解
−抗血栓を組み合わせた薬剤を投与してもよい。これは、内部標準となり、血管
壁の障害、その後の閉塞性の血栓の形成、すなわち、少ない循環血小板数、増大
した自発的血栓溶解、ハートワーム（ｈｅａｒｔ ｗｏｒｍ）の存在とは無関係
の原因によって血栓を形成しないかもしれない動物を除去する。記録されるパラ
メーターには、独立した動物の群へのＡＰＳＡＣ又はＡＰＳＡＣ＋ＣＮの投与前
と投与後における、超音波フロープローブを用いた相及び平均頚動脈血流速度、
血栓性の閉塞までの時間、再カニューレ挿入までの時間、エクスビボでの血小板
の凝集、プロトロンビン時間、トロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン
時間、赤血球と白血球の数、ヘマトクリット、ＥＫＧプロフィール、及び体温の
測定が含まれる。全てのインビボ研究には、条件に慣らしたオスの雑種犬（８〜
１０ｋｇ）を使用した。ペントバルビタールナトリウムでイヌを麻酔し、挿管し
、陽圧下で部屋の空気を呼吸させた。動脈の血液ガスとｐＨの決定は、４５分毎
に行い、血液ガスと動脈のｐＨを正常な限界以内に維持するために適切な調整を
行った。総頚動脈と右内頚静脈を露出させる。血液の採取と試験薬物の投与のた
めに、頚静脈にカテーテルを挿入する。血圧変換器を使用して、挿管した大腿動
脈から動脈の血圧をモニターする。動脈内電極の挿入点と機械的圧縮装置の近位
の各総頚動脈上にドップラーフロープローブを置く。圧縮装置は、平均血流量を
変化させずに、脈流パターンが５０％減少するまで調整する。頚動脈の血流速度
は、連続的にモニターする。図８は、頚動脈への器具の取り付けを図示したもの
である。
血栓の研究のために開発されたものを改造したものである［Ｒｏｍｓｏｎ，Ｊ．
Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１７：８４１（１９８０）］。こ
の実験操作は、遠位の動脈狭窄症に近い、電気分解で誘導された内皮の障害部位
に、血小板が豊富な血管内血栓の形成をもたらす。この実験モデルに頚動脈を選
択することにより、一方の血管を対照として使用し、他方の血管を血栓溶解及び
抗血栓療法の実行後に使用することが可能となる。このモデルでは、ＡＰＳＡＣ
（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）が有効
な血栓溶解剤として使用されてきた。電気分解の障害に対する頚動脈の応答は、
イヌの冠状動脈で観察されたものと似ているが、各イヌが両側性の閉塞性血栓を
形成する能力を示すという利点を有する。次に、閉塞した血管の１つだけに溶解
−抗血栓を組み合わせた薬剤を投与してもよい。これは、内部標準となり、血管
壁の障害、その後の閉塞性の血栓の形成、すなわち、少ない循環血小板数、増大
した自発的血栓溶解、ハートワーム（ｈｅａｒｔ ｗｏｒｍ）の存在とは無関係
の原因によって血栓を形成しないかもしれない動物を除去する。記録されるパラ
メーターには、独立した動物の群へのＡＰＳＡＣ又はＡＰＳＡＣ＋ＣＮの投与前
と投与後における、超音波フロープローブを用いた相及び平均頚動脈血流速度、
血栓性の閉塞までの時間、再カニューレ挿入までの時間、エクスビボでの血小板
の凝集、プロトロンビン時間、トロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン
時間、赤血球と白血球の数、ヘマトクリット、ＥＫＧプロフィール、及び体温の
測定が含まれる。全てのインビボ研究には、条件に慣らしたオスの雑種犬（８〜
１０ｋｇ）を使用した。ペントバルビタールナトリウムでイヌを麻酔し、挿管し
、陽圧下で部屋の空気を呼吸させた。動脈の血液ガスとｐＨの決定は、４５分毎
に行い、血液ガスと動脈のｐＨを正常な限界以内に維持するために適切な調整を
行った。総頚動脈と右内頚静脈を露出させる。血液の採取と試験薬物の投与のた
めに、頚静脈にカテーテルを挿入する。血圧変換器を使用して、挿管した大腿動
脈から動脈の血圧をモニターする。動脈内電極の挿入点と機械的圧縮装置の近位
の各総頚動脈上にドップラーフロープローブを置く。圧縮装置は、平均血流量を
変化させずに、脈流パターンが５０％減少するまで調整する。頚動脈の血流速度
は、連続的にモニターする。図８は、頚動脈への器具の取り付けを図示したもの
である。
【００８４】 各頚部血管の脈管内膜表面への電気分解による障害は、血管内電極の使用によ
って達成される。各動脈内電極は、二重チャンネル刺激装置の陽極（アノード）
に接続する。陰極は、離れた皮下部に接続する。各血管に運ばれた電流を継続的
にモニターし、３００μＡに維持する。陽極の電極は、絶縁されていない部分が
血管の内皮表面と近接するように置かれる。各頚動脈へ電極が適切に置かれるこ
とは、各実験の最後に眼で調べることによって確認する。陽極の電流は、最長３
時間与えられ、又は、安定な閉塞性の血栓の形成が達成されたことを確かめるた
めに、関与する血管中の流速が流速ゼロで安定になってから３０分後に終了する
。右頚動脈は対照用の欠陥として機能するのに対して、左頚動脈は試験用の血管
として機能する。血管壁の障害は、各頚動脈に同時に誘導される。
って達成される。各動脈内電極は、二重チャンネル刺激装置の陽極（アノード）
に接続する。陰極は、離れた皮下部に接続する。各血管に運ばれた電流を継続的
にモニターし、３００μＡに維持する。陽極の電極は、絶縁されていない部分が
血管の内皮表面と近接するように置かれる。各頚動脈へ電極が適切に置かれるこ
とは、各実験の最後に眼で調べることによって確認する。陽極の電流は、最長３
時間与えられ、又は、安定な閉塞性の血栓の形成が達成されたことを確かめるた
めに、関与する血管中の流速が流速ゼロで安定になってから３０分後に終了する
。右頚動脈は対照用の欠陥として機能するのに対して、左頚動脈は試験用の血管
として機能する。血管壁の障害は、各頚動脈に同時に誘導される。
【００８５】 ＡＰＳＡＣ（０．０５Ｕ／ｋｇ）は、大量瞬時投与として、左頚動脈のみに血
栓の近位に注入する。ＡＰＳＡＣの用量は、全身的な溶解効果を生じずに、局所
的に注入した頚部の血栓を一定して溶解するであろう用量として決定した。この
ため、投与していない右の頚部には溶解は起こらないはずである。ＣＮは、ＡＰ
ＳＡＣ直後に１０％の大量瞬時投与を静脈内に与え、１時間にわたって残りの９
０％を注入する。ＣＮの投与量は、０．１５５〜０．４０ｍｇ／ｋｇの範囲であ
った。この物質は、２０ｍＬの用量の注射用の滅菌生理的食塩水中に、適切な用
量で溶かした。再潅流は、ベースライン値の２０％への頚動脈血流の復活として
定義される。開通は、測定可能な頚動脈の流速として定義される。血圧、心拍数
、及び頚動脈の流速は、６時間、又は再血栓症が起こるまでモニターする。
栓の近位に注入する。ＡＰＳＡＣの用量は、全身的な溶解効果を生じずに、局所
的に注入した頚部の血栓を一定して溶解するであろう用量として決定した。この
ため、投与していない右の頚部には溶解は起こらないはずである。ＣＮは、ＡＰ
ＳＡＣ直後に１０％の大量瞬時投与を静脈内に与え、１時間にわたって残りの９
０％を注入する。ＣＮの投与量は、０．１５５〜０．４０ｍｇ／ｋｇの範囲であ
った。この物質は、２０ｍＬの用量の注射用の滅菌生理的食塩水中に、適切な用
量で溶かした。再潅流は、ベースライン値の２０％への頚動脈血流の復活として
定義される。開通は、測定可能な頚動脈の流速として定義される。血圧、心拍数
、及び頚動脈の流速は、６時間、又は再血栓症が起こるまでモニターする。
【００８６】 血小板の研究のために、抗凝固剤として３．２％のクエン酸ナトリウムを含有
するプラスチックシリンジの中に、頚部カニューラから血液（２０ｍＬ）を引き
出した（１／１０クエン酸／血液、ｖｏｌ／ｖｏｌ）。ベースライン、ＣＮの投
与から６０、１２０、１８０、２４０、及び３００分後の血小板の凝集及び全血
液細胞数のために血液を採取した。血小板の数は、細胞カウンターで決定した。
２００，０００／ｍｍ３の血小板数を達成するために、血小板が少ない血漿で、
血小板が豊富な血漿、すなわち抗凝固化された全血の１４０×ｇ、５分間の遠心
後に存在する上清を希釈した。血小板が少ない血漿は、血小板が豊富な血漿を除
去した後に、残った血液を１２，０００×ｇで１０分間遠心し、底の細胞相を捨
てることによって調製した。エクスビボでの血小板の凝集は、４チャンネルの血
小板凝集計を用いて、３７℃に維持された血小板が豊富な血漿の攪拌された懸濁
液を通した光の透過の増加を記録することによる、確立された分光光度法によっ
て測定した。凝集は、アラキドン酸（０．６５ｍＭと０．３２５ｍＭ）とＡＤＰ
（２０μＭと５μＭ）で誘導した。刺激前に血小板を準備させるために、凝集を
起こさない用量のアドレナリン（５５０ｎＭ）を使用した。値は、それぞれ、０
％と１００％の光透過を生じる血小板が豊富な血漿の試料と血小板が少ない血漿
の試料に標準化された光透過のパーセントに相当する凝集のパーセントとして表
した。
するプラスチックシリンジの中に、頚部カニューラから血液（２０ｍＬ）を引き
出した（１／１０クエン酸／血液、ｖｏｌ／ｖｏｌ）。ベースライン、ＣＮの投
与から６０、１２０、１８０、２４０、及び３００分後の血小板の凝集及び全血
液細胞数のために血液を採取した。血小板の数は、細胞カウンターで決定した。
２００，０００／ｍｍ３の血小板数を達成するために、血小板が少ない血漿で、
血小板が豊富な血漿、すなわち抗凝固化された全血の１４０×ｇ、５分間の遠心
後に存在する上清を希釈した。血小板が少ない血漿は、血小板が豊富な血漿を除
去した後に、残った血液を１２，０００×ｇで１０分間遠心し、底の細胞相を捨
てることによって調製した。エクスビボでの血小板の凝集は、４チャンネルの血
小板凝集計を用いて、３７℃に維持された血小板が豊富な血漿の攪拌された懸濁
液を通した光の透過の増加を記録することによる、確立された分光光度法によっ
て測定した。凝集は、アラキドン酸（０．６５ｍＭと０．３２５ｍＭ）とＡＤＰ
（２０μＭと５μＭ）で誘導した。刺激前に血小板を準備させるために、凝集を
起こさない用量のアドレナリン（５５０ｎＭ）を使用した。値は、それぞれ、０
％と１００％の光透過を生じる血小板が豊富な血漿の試料と血小板が少ない血漿
の試料に標準化された光透過のパーセントに相当する凝集のパーセントとして表
した。
【００８７】 研究プロトコールの最後に、障害点の近位及び遠位で、各血管セグメントを結
紮し、血管内の血栓を乱さないように除去した。血管セグメントを開いて、無傷
の血栓を持ち上げて取り、秤量する。
紮し、血管内の血栓を乱さないように除去した。血管セグメントを開いて、無傷
の血栓を持ち上げて取り、秤量する。
【００８８】 ここまでに、ＣＮ＋ＡＰＳＡＣで５匹の動物、ＡＰＳＡＣのみで６匹、ＡＰＳ
ＡＣ＋７Ｅ３抗（ＧＰ）IIｂ／IIIａモノクローナル抗体で６匹のイヌのポジテ
ィブコントロール群を調べた。ＣＮの注入後には、平均動脈血圧又は平均心拍数
に実質的に変化が存在しなかった。さらに、ＡＰＳＡＣ注入のみと比べて、ＡＰ
ＳＡＣ＋ＣＮの注入後には、頚動脈流速は高いレベルに留まった。ＡＰＳＡＣの
みを注入した動物群では、溶解剤の注入後に２〜３分間頚動脈を開いたが、その
後再び閉じて、研究の間、閉じたままにした。ポジティブコントロール群では、
動物は、動脈内にＡＰＳＡＣ（０．１Ｕ／ｋｇ）を注入し、この後に、７Ｅ３抗
−（ＧＰ）IIｂ／IIIａＦ（ａｂ’）２の大量瞬時投与（０．８ｍｇ／ｋｇ）を
行った。これらの３匹の動物では、ＡＰＳＡＣと７Ｅ３の組合せの注入後に頚動
脈を開放し続け、実験のプロトコールが終了するまで、開放しつづけた。ＡＰＳ
ＡＣ＋ＣＮを注入した５匹の動物群では、７Ｅ３とＡＰＳＡＣの組合せを注入し
たものと実質的に同じであった。しかしながら、表１は、残余血栓重量の点で、
ＡＰＳＡＣ＋ＣＮの組合せに有意な利点が存在したことが明らかである。表１で
は、ＣＴＴＸ＝ＣＮ、ＲＣＡ＝右頚動脈である。この薬剤の組合せで処置した５
匹の動物群では、イヌのｋｇ体重当たり残余血栓重量は１．５であったのに対し
て、ＡＰＳＡＣ＋７Ｅ３群の６匹の動物では２．４であり、ＡＰＳＡＣのみの群
（６匹の動物）では４．１であった。最後に、ＡＰＳＡＣ＋ＣＮ（０．１５５ｍ
ｇ／ｋｇ）で処置したイヌのうちの１匹では、血小板の凝集と血小板数を追った
（図９）。ＣＮの注入はゼロ時間に開始し、その後６０分間継続した。
ＡＣ＋７Ｅ３抗（ＧＰ）IIｂ／IIIａモノクローナル抗体で６匹のイヌのポジテ
ィブコントロール群を調べた。ＣＮの注入後には、平均動脈血圧又は平均心拍数
に実質的に変化が存在しなかった。さらに、ＡＰＳＡＣ注入のみと比べて、ＡＰ
ＳＡＣ＋ＣＮの注入後には、頚動脈流速は高いレベルに留まった。ＡＰＳＡＣの
みを注入した動物群では、溶解剤の注入後に２〜３分間頚動脈を開いたが、その
後再び閉じて、研究の間、閉じたままにした。ポジティブコントロール群では、
動物は、動脈内にＡＰＳＡＣ（０．１Ｕ／ｋｇ）を注入し、この後に、７Ｅ３抗
−（ＧＰ）IIｂ／IIIａＦ（ａｂ’）２の大量瞬時投与（０．８ｍｇ／ｋｇ）を
行った。これらの３匹の動物では、ＡＰＳＡＣと７Ｅ３の組合せの注入後に頚動
脈を開放し続け、実験のプロトコールが終了するまで、開放しつづけた。ＡＰＳ
ＡＣ＋ＣＮを注入した５匹の動物群では、７Ｅ３とＡＰＳＡＣの組合せを注入し
たものと実質的に同じであった。しかしながら、表１は、残余血栓重量の点で、
ＡＰＳＡＣ＋ＣＮの組合せに有意な利点が存在したことが明らかである。表１で
は、ＣＴＴＸ＝ＣＮ、ＲＣＡ＝右頚動脈である。この薬剤の組合せで処置した５
匹の動物群では、イヌのｋｇ体重当たり残余血栓重量は１．５であったのに対し
て、ＡＰＳＡＣ＋７Ｅ３群の６匹の動物では２．４であり、ＡＰＳＡＣのみの群
（６匹の動物）では４．１であった。最後に、ＡＰＳＡＣ＋ＣＮ（０．１５５ｍ
ｇ／ｋｇ）で処置したイヌのうちの１匹では、血小板の凝集と血小板数を追った
（図９）。ＣＮの注入はゼロ時間に開始し、その後６０分間継続した。
【００８９】
【表１】
【００９０】 これらの結果は、この群のイヌの典型的な結果である。血小板の凝集が、毒タ
ンパク質での処理によって弱められたが、実験の終わりには、凝集が復活してい
るようであることが分かるであろう。同様に、実験の間には、血小板の数も減少
した。血小板は、脾臓のような避難場所に隠れ、続いて、短い滞在時間後に放出
されると考えられる。循環中に戻っている血小板は機能的なようである。少ない
血小板数のために凝集能が幾分変動しながら、ベースライン値の１０〜２０％ま
で血小板数が減少している。しかしながら、残りの血小板における血小板凝集能
は、実験操作の最後には正常に戻るようにみえることが分かる。
ンパク質での処理によって弱められたが、実験の終わりには、凝集が復活してい
るようであることが分かるであろう。同様に、実験の間には、血小板の数も減少
した。血小板は、脾臓のような避難場所に隠れ、続いて、短い滞在時間後に放出
されると考えられる。循環中に戻っている血小板は機能的なようである。少ない
血小板数のために凝集能が幾分変動しながら、ベースライン値の１０〜２０％ま
で血小板数が減少している。しかしながら、残りの血小板における血小板凝集能
は、実験操作の最後には正常に戻るようにみえることが分かる。
【００９１】 例９ 乳癌の接着と浸潤に対するＣＮの影響 高度の転移性ヒト乳癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株のＥＣＭタンパク質
への結合に対するＣＮの影響を調べた。９６ウェルのマイクロタイタープレート
のウェルの中にヒトのフィブロネクチンとビトロネクチンを固定化した。図３と
４を参照すると、ＣＮは、用量依存的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の両ＥＣＭタン
パク質への接着を阻害した。フィブロネクチンへの接着に対するＩＣ５０は１８
ｎＭであり（図１０）、ビトロネクチンに対しては、ＩＣ５０は１．５ｎＭであ
る（図１１）。ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞によるヒトのI型コラーゲン
に対する、又ＭＤＡ細胞が相対的に強い親和性を有するラットのI型コラーゲン
への弱い接着に対しては、最少の影響しか有さなかった。上記実験の変形では、
ＣＮを固定化した。ＣＮは、用量依存的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の結合を
支持できることが見出された。固定化したＣＮへのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の
結合は、ＲＧＤペプチド、ＧＲＧＤＳＰ（ＩＣ５０＝０．４ｍＭ）、及びＥＤＴ
Ａ（ＩＣ５０＝０．８ｍＭ）によってブロックされる。インテグリン受容体は、
それらのサブユニットの非共有的な会合に金属イオンを必要とするので、我々の
発見は、ＣＮが、ＲＧＤを媒介した機序を介して、ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞の
表面上にあるインテグリン受容体に結合することを示している。固定化したＣＮ
がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の接着を支持できるという発見は、この結合には、
腫瘍細胞上の細胞表面受容体が関与していることを示唆する。図１２と１３を参
照すると、 ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合を阻害するために、様々な濃度のＧＲ
ＧＤＳＰ（図１２）又はＥＤＴＡ（図１３）を使用した。ＣＮは、０．１μｇ／
ウェルであった。各データ点の縦線は、ｙ軸の誤差線を示している。全ての実験
は、各データ点について３回を３セット行った。
への結合に対するＣＮの影響を調べた。９６ウェルのマイクロタイタープレート
のウェルの中にヒトのフィブロネクチンとビトロネクチンを固定化した。図３と
４を参照すると、ＣＮは、用量依存的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の両ＥＣＭタン
パク質への接着を阻害した。フィブロネクチンへの接着に対するＩＣ５０は１８
ｎＭであり（図１０）、ビトロネクチンに対しては、ＩＣ５０は１．５ｎＭであ
る（図１１）。ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞によるヒトのI型コラーゲン
に対する、又ＭＤＡ細胞が相対的に強い親和性を有するラットのI型コラーゲン
への弱い接着に対しては、最少の影響しか有さなかった。上記実験の変形では、
ＣＮを固定化した。ＣＮは、用量依存的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の結合を
支持できることが見出された。固定化したＣＮへのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の
結合は、ＲＧＤペプチド、ＧＲＧＤＳＰ（ＩＣ５０＝０．４ｍＭ）、及びＥＤＴ
Ａ（ＩＣ５０＝０．８ｍＭ）によってブロックされる。インテグリン受容体は、
それらのサブユニットの非共有的な会合に金属イオンを必要とするので、我々の
発見は、ＣＮが、ＲＧＤを媒介した機序を介して、ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞の
表面上にあるインテグリン受容体に結合することを示している。固定化したＣＮ
がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の接着を支持できるという発見は、この結合には、
腫瘍細胞上の細胞表面受容体が関与していることを示唆する。図１２と１３を参
照すると、 ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合を阻害するために、様々な濃度のＧＲ
ＧＤＳＰ（図１２）又はＥＤＴＡ（図１３）を使用した。ＣＮは、０．１μｇ／
ウェルであった。各データ点の縦線は、ｙ軸の誤差線を示している。全ての実験
は、各データ点について３回を３セット行った。
【００９２】 ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞の固定化されたＣＮへの接着は、ＧＲＧＤＳＰによ
り、及びＥＤＴＡにより完全にブロックされるので（図１２と１３）、ＣＮは、
ＲＧＤ依存性の機序を介して、専らＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞のインテグリン受
容体に結合する。
り、及びＥＤＴＡにより完全にブロックされるので（図１２と１３）、ＣＮは、
ＲＧＤ依存性の機序を介して、専らＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞のインテグリン受
容体に結合する。
【００９３】 図１４を参照すれば、我々は、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコートした浸潤チャンバー
を用いて、ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞による合成基底膜の浸潤に対するＣＮの影
響も実証した。Ｍａｔｒｉｇｅｌの層を横切るように、様々な濃度のＣＮで処理
した２．５×１０３のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を４８時間移動させた。各ＣＮ
濃度でのアッセイは、３回行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌフィルターを介して浸潤し
た細胞を固定し、染色した。３つのランダムに選択した視野中の細胞数の平均に
よって、顕微鏡で、浸潤した細胞を定量した。
を用いて、ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞による合成基底膜の浸潤に対するＣＮの影
響も実証した。Ｍａｔｒｉｇｅｌの層を横切るように、様々な濃度のＣＮで処理
した２．５×１０３のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を４８時間移動させた。各ＣＮ
濃度でのアッセイは、３回行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌフィルターを介して浸潤し
た細胞を固定し、染色した。３つのランダムに選択した視野中の細胞数の平均に
よって、顕微鏡で、浸潤した細胞を定量した。
【００９４】 例１０ ＣＮは、ヌードマウス実験モデルで、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌の増殖と転移
を阻害する ヌードマウスの自発的な（同所）転移モデルは、乳腺の脂肪パッド（ｍｆｐ；
ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（０．１ｍＬ中
５×１０５）を移植することによって確立した。移植から１０日後に、触診可能
な腫瘍が現れた。移植から１４日後に開始して、各群の腫瘍塊中に毎日ＣＮの投
与を実行する。移植から８週間後までに、腫瘍を除去した。動物は、ＣＮを投与
せずに、２週間生存させた。その後、動物を屠殺し、肺の転移を注意深く調べた
。図１５を参照すれば、我々の発見は、ＣＮの局所投与が、腫瘍の増殖速度をか
なり阻害したことを示している。対照（黒い棒）の腫瘍塊の体積（平均±Ｓ．Ｄ
．）、低用量（０．５μｇ／日、灰色の棒）のＣＮ処置群、及び高用量（５μｇ
／日、灰色の棒）のＣＮ処置群が示されている。左から右への７つの群の棒は、
投与前（ＰＩ、移植から１４日後）と投与の第１〜第６週のデータを表している
。スチューデントのｔ検定を利用した。＊と＊＊は、それぞれ、Ｐ＜０．０５と
ｐ＜０．０１を示している。高用量（５μｇ／日）のＣＮで処理した腫瘍の平均
重量は、 対照群（Ｐ＜０．０５）と比べて有意に低い。表１は、肉眼による検査と表面の
小結節の計数に基づく肺転移の発生を示している。対照群での転移の広がりは、
９０％を超える転移の阻害を示した高用量のＣＮ群に比べて、ずっと広範である
。これらのデータは、ヒト乳癌の治療におけるＣＮの潜在的な治療的役割を実証
している。
を阻害する ヌードマウスの自発的な（同所）転移モデルは、乳腺の脂肪パッド（ｍｆｐ；
ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（０．１ｍＬ中
５×１０５）を移植することによって確立した。移植から１０日後に、触診可能
な腫瘍が現れた。移植から１４日後に開始して、各群の腫瘍塊中に毎日ＣＮの投
与を実行する。移植から８週間後までに、腫瘍を除去した。動物は、ＣＮを投与
せずに、２週間生存させた。その後、動物を屠殺し、肺の転移を注意深く調べた
。図１５を参照すれば、我々の発見は、ＣＮの局所投与が、腫瘍の増殖速度をか
なり阻害したことを示している。対照（黒い棒）の腫瘍塊の体積（平均±Ｓ．Ｄ
．）、低用量（０．５μｇ／日、灰色の棒）のＣＮ処置群、及び高用量（５μｇ
／日、灰色の棒）のＣＮ処置群が示されている。左から右への７つの群の棒は、
投与前（ＰＩ、移植から１４日後）と投与の第１〜第６週のデータを表している
。スチューデントのｔ検定を利用した。＊と＊＊は、それぞれ、Ｐ＜０．０５と
ｐ＜０．０１を示している。高用量（５μｇ／日）のＣＮで処理した腫瘍の平均
重量は、 対照群（Ｐ＜０．０５）と比べて有意に低い。表１は、肉眼による検査と表面の
小結節の計数に基づく肺転移の発生を示している。対照群での転移の広がりは、
９０％を超える転移の阻害を示した高用量のＣＮ群に比べて、ずっと広範である
。これらのデータは、ヒト乳癌の治療におけるＣＮの潜在的な治療的役割を実証
している。
【００９５】
【表２】
【００９６】 例１１ ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍によって誘導されたＣＡＭ中の血管新生を
阻害する 腫瘍の増殖に対する阻害的な効果が、おそらくは、少なくとも部分的には、Ｃ
Ｎによる血管新生の阻害から生じるという仮説は、ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ
）上の腫瘍によって誘導された血管新生に対するＣＮの効果を観察することによ
って予備的に確認された。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍塊を、１０日のニワトリ胚
のＣＡＭに接種した。様々な用量のＣＮを、接種から２日後に、ＣＡＭの中に静
脈内投与した。腫瘍によって誘導された血管新生と血管新生に対するＣＮの阻害
的な効果は、インキュベーションから３日後に、容易にＣＡＭに観察することが
できる。図１６に示されているように、血管は、対照胚中の腫瘍塊を中心として
、集中的に分布している。ニワトリの胚は免疫不全であり、このため、移植した
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の増殖を可能とする。胚は、３７℃、６０％の湿度で
インキュベートされる。接種から２日後に、様々な用量のＣＮをＣＡＭの中に静
脈内投与した。第３日目の腫瘍によって誘導された血管新生が写真に示されてい
る。上（図１６Ａ）が対照胚である。血管は、腫瘍塊を中心として、集中的に分
布している。真中（図１６Ｂ）は、２０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。下
（図１６Ｃ）は、１５０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。２０μｇのＣＮを
処置した胚の血管は、対照と比べて、より薄く、密度が低い。対照のＣＡＭと比
べて、腫瘍塊はより小さい。１５０μｇのＣＮによって処置したＣＭＡでは、血
管は、ずっと薄く、集中的な分布パターンは完全に消失している。おそらくは、
血液供給の欠如のために、対照及び低用量のＣＮと比べて有意に小さな体積の壊
死した腫瘍塊が存在する（図１６）。
阻害する 腫瘍の増殖に対する阻害的な効果が、おそらくは、少なくとも部分的には、Ｃ
Ｎによる血管新生の阻害から生じるという仮説は、ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ
）上の腫瘍によって誘導された血管新生に対するＣＮの効果を観察することによ
って予備的に確認された。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍塊を、１０日のニワトリ胚
のＣＡＭに接種した。様々な用量のＣＮを、接種から２日後に、ＣＡＭの中に静
脈内投与した。腫瘍によって誘導された血管新生と血管新生に対するＣＮの阻害
的な効果は、インキュベーションから３日後に、容易にＣＡＭに観察することが
できる。図１６に示されているように、血管は、対照胚中の腫瘍塊を中心として
、集中的に分布している。ニワトリの胚は免疫不全であり、このため、移植した
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の増殖を可能とする。胚は、３７℃、６０％の湿度で
インキュベートされる。接種から２日後に、様々な用量のＣＮをＣＡＭの中に静
脈内投与した。第３日目の腫瘍によって誘導された血管新生が写真に示されてい
る。上（図１６Ａ）が対照胚である。血管は、腫瘍塊を中心として、集中的に分
布している。真中（図１６Ｂ）は、２０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。下
（図１６Ｃ）は、１５０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。２０μｇのＣＮを
処置した胚の血管は、対照と比べて、より薄く、密度が低い。対照のＣＡＭと比
べて、腫瘍塊はより小さい。１５０μｇのＣＮによって処置したＣＭＡでは、血
管は、ずっと薄く、集中的な分布パターンは完全に消失している。おそらくは、
血液供給の欠如のために、対照及び低用量のＣＮと比べて有意に小さな体積の壊
死した腫瘍塊が存在する（図１６）。
【００９７】 例１２ ＣＮは、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖には全く効果がない １／１００希釈のＭａｔｒｉｇｅｌでコートした６ウェルの細胞培養プレート
に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（０．３×１０６／ｍＬ）を加えた。続いて、様
々な濃度のＣＮで細胞を処理した。ＣＮなし（円）、１００ｎＭのＣＮあり（三
角）、及び５００ｎＭのＣＮあり（菱形）での、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のイ
ンビトロでの増殖曲線が示されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１／１００希釈）で
コートされた６ウェルの細胞培養プレートに、３ｍＬのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細
胞の懸濁物（０．３×１０６／ｍＬ）を播種した。細胞の密度は、２４時間毎に
決定した。図１７を参照すれば、ＣＮの存在下で、対照細胞と同じように増殖し
ている。この結果は、ＣＮが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のインビトロ培養中に
、直接的な細胞毒性を有しないことを示している。
に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（０．３×１０６／ｍＬ）を加えた。続いて、様
々な濃度のＣＮで細胞を処理した。ＣＮなし（円）、１００ｎＭのＣＮあり（三
角）、及び５００ｎＭのＣＮあり（菱形）での、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のイ
ンビトロでの増殖曲線が示されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１／１００希釈）で
コートされた６ウェルの細胞培養プレートに、３ｍＬのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細
胞の懸濁物（０．３×１０６／ｍＬ）を播種した。細胞の密度は、２４時間毎に
決定した。図１７を参照すれば、ＣＮの存在下で、対照細胞と同じように増殖し
ている。この結果は、ＣＮが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のインビトロ培養中に
、直接的な細胞毒性を有しないことを示している。
【００９８】 例１３ ＣＮは、インビボで有効であり、よく許容される 上記のヌードマウスを用いた慢性実験から、ＣＮは毒性がないと結論付けるこ
とができる。その血小板凝集阻害活性にもかかわらず、実験中には、自発的な出
血は全く観察されない。しかしながら、ＣＮ処置した動物の投与部位には幾らか
の出血が見られた。
とができる。その血小板凝集阻害活性にもかかわらず、実験中には、自発的な出
血は全く観察されない。しかしながら、ＣＮ処置した動物の投与部位には幾らか
の出血が見られた。
【００９９】 ＣＮは、新しい抗転移剤である。我々は、ＣＮが癌の転移と進行における幾つ
かの重要な工程（例えば、接着、浸潤、血管新生）をブロックすると仮定してい
る。それ故、単一の工程をブロックする他の物質よりも、強力である。
かの重要な工程（例えば、接着、浸潤、血管新生）をブロックすると仮定してい
る。それ故、単一の工程をブロックする他の物質よりも、強力である。
【０１００】 上記の記述から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に探知するこ
とができ、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、本発明を様々な用途と条件に採
用することができる。情況が適宜であることを示唆し、又は適宜であり得るので
あれば、形式の片か及び均等物の置換が想定されている。本明細書では具体的な
用語が用いられているが、それらは、説明的な意味を意図したものであり、限定
を意図したものではない。
とができ、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、本発明を様々な用途と条件に採
用することができる。情況が適宜であることを示唆し、又は適宜であり得るので
あれば、形式の片か及び均等物の置換が想定されている。本明細書では具体的な
用語が用いられているが、それらは、説明的な意味を意図したものであり、限定
を意図したものではない。
【配列表】
図面の簡単の記述
【図１】 本発明は、添付の図面を参照することにより、よりよく理解され得る。図１は
、コントートロスタチンｃＤＮＡをクローニングする戦略を示している。図１Ａ
は、共通のＲＧＤ配列と高度に保存された配列を示している、他のディスインテ
グリンと比較したエドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミノ酸配列（ＣＮ
）を示しており、図１ＢはＰＣＲプライマーを示し、図１Ｃは、コントートロス
タチンの完全長ｃＤＮＡを作製するために使用された重複伸張反応の原理を示し
ている。
、コントートロスタチンｃＤＮＡをクローニングする戦略を示している。図１Ａ
は、共通のＲＧＤ配列と高度に保存された配列を示している、他のディスインテ
グリンと比較したエドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミノ酸配列（ＣＮ
）を示しており、図１ＢはＰＣＲプライマーを示し、図１Ｃは、コントートロス
タチンの完全長ｃＤＮＡを作製するために使用された重複伸張反応の原理を示し
ている。
【図２】 図２は、ＰＣＲ産物の電気泳動を示しており、約１３００ｂｐの主要なバンド
は、λｇｔ１０フォワードとＰＣＲ−２によって開始されたＰＣＲで増幅され（
レーン１）、約７００ｂｐのバンドはＰＣＲ−２とλｇｔ１０リバースによって
開始されたＰＣＲから生じ（レーン２）、約２０００ｂｐの分子サイズを有する
２つの断片の重複する産物はレーン３に示されている。
は、λｇｔ１０フォワードとＰＣＲ−２によって開始されたＰＣＲで増幅され（
レーン１）、約７００ｂｐのバンドはＰＣＲ−２とλｇｔ１０リバースによって
開始されたＰＣＲから生じ（レーン２）、約２０００ｂｐの分子サイズを有する
２つの断片の重複する産物はレーン３に示されている。
【図３Ａ】 図３は、８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域（ＮＴＲ）、ヌクレオチド８
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
【図３Ｂ】 図３は、８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域（ＮＴＲ）、ヌクレオチド８
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
【図３Ｃ】 図３は、８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域（ＮＴＲ）、ヌクレオチド８
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
【図３Ｄ】 図３は、８６ヌクレオチドの５’末端未翻訳領域（ＮＴＲ）、ヌクレオチド８
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１
５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３
’ＮＴＲを含むＣＮ ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示し
ている。
【図４】 図４は、トリグラミン前駆体と他のヘビ毒の出血性タンパク質と比較したコン
トートロスタチン前駆体のマルチドメイン構造を示している。
トートロスタチン前駆体のマルチドメイン構造を示している。
【図５Ａ】 図５は、コントートロスタチンのホモダイマーの形成を示している。図５Ａは
、Ｎ末端に６アミノ酸の末端切断を有し、２つの不対システイン残基を与える２
つの半シスチン残基を含むコントートロスタチンと比較したディスインテグリン
、キストリンのアミノ酸配列とジスルフィド結合パターンを示している。
、Ｎ末端に６アミノ酸の末端切断を有し、２つの不対システイン残基を与える２
つの半シスチン残基を含むコントートロスタチンと比較したディスインテグリン
、キストリンのアミノ酸配列とジスルフィド結合パターンを示している。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、不対システインが、２つの分子間ジスルフィド結合の形成に関与し
て、ユニークなホモダイマー構造を形成し得ることを示している。２つのモノマ
ーは、パラレル又はアンチパラレルパターンで連結され得る。
て、ユニークなホモダイマー構造を形成し得ることを示している。２つのモノマ
ーは、パラレル又はアンチパラレルパターンで連結され得る。
【図６】 図６は、ヒト、イヌ、及びウサギ血小板凝集のＣＮ阻害の測定結果を示してい
る。
る。
【図７Ａ】 図７Ａは、固定した飽和濃度のマウスモノクローナル抗体７Ｅ３の存在下での
ヒト（図７Ａ）及びイヌ（図７Ｂ）（ＧＰ）IIｂ／IIIａへのＣＮの結合研究の
結果を示している。
ヒト（図７Ａ）及びイヌ（図７Ｂ）（ＧＰ）IIｂ／IIIａへのＣＮの結合研究の
結果を示している。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、固定した飽和濃度のマウスモノクローナル抗体７Ｅ３の存在下での
ヒト（図７Ａ）及びイヌ（図７Ｂ）（ＧＰ）IIｂ／IIIａへのＣＮの結合研究の
結果を示している。
ヒト（図７Ａ）及びイヌ（図７Ｂ）（ＧＰ）IIｂ／IIIａへのＣＮの結合研究の
結果を示している。
【図８】 図８は、超音波フロープローブ、機械的圧縮装置（狭窄症）、及び血栓形成を
開始するために血管壁に脈管内膜の傷害を誘導するための頚内陰電極の設置を示
す、器具を取り付けたイヌの頚動脈を図示したものである。
開始するために血管壁に脈管内膜の傷害を誘導するための頚内陰電極の設置を示
す、器具を取り付けたイヌの頚動脈を図示したものである。
【図９】 図９は、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体
（ＡＰＳＡＣ）とＣＮで処理したイヌのゼロ時の値のパーセントとして表した血
小板数と血小板の凝集性を示している。
（ＡＰＳＡＣ）とＣＮで処理したイヌのゼロ時の値のパーセントとして表した血
小板数と血小板の凝集性を示している。
【図１０】 図１０は、ＣＮがＭＤＡ−ＭＢ−４３５のフィブロネクチンへの接着を阻害し
たことを示している。
たことを示している。
【図１１】 図１１は、ＣＮがＭＤＡ−ＭＢ−４３５のビトロネクチンへの接着を阻害した
ことを示している。
ことを示している。
【図１２】 図１２は、ＧＲＧ−ＤＳＰによる、ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合
の阻害を示している。
の阻害を示している。
【図１３】 図１３は、ＥＤＴＡによる、ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合の阻害
を示している。
を示している。
【図１４】 図１４は、マトリゲルをコートした浸潤チャンバーを介したＭＤＡ−ＭＢ−４
３５の浸潤の阻害を示している。
３５の浸潤の阻害を示している。
【図１５】 図１５は、実験用ヌードマウスでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の増殖に対する
ＣＮの影響を示している。
ＣＮの影響を示している。
【図１６Ａ】 図１６は、対照ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ；ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉ
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
【図１６Ｂ】 図１６は、対照ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ；ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉ
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
【図１６Ｃ】 図１６は、対照ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ；ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉ
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
ｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１６Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１
６Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１６Ｂ）での腫瘍によって
誘導された血管新生を示す写真である。
【図１７】 図１７は、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖に対するＣＮの影
響を示す。
響を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１０月２６日（２０００．１０．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 35/04 35/00 43/00 １０５ 35/04 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/46 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/46 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゾウ、キン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 アル ハンブラ、ノース・プリムローズ・アベニ ュー 224、アパートメント・エー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA01 4B064 AG30 CA19 CC24 4B065 AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 BA01 BA08 BA22 BA23 CA43 DC50 NA14 ZA362 ZA402 ZA452 ZA542 ZA592 ZB212 ZB262 ZC022 4H045 AA10 BA10 CA53 DA83 EA20 FA74
Claims (24)
- 【請求項１】 実質的に精製されたコントートロスタチン、コントートロス
タチン前駆体、又は生物学的に活性なそれらの変種からなるタンパク質。 - 【請求項２】 請求項１に記載の組換えタンパク質。
- 【請求項３】 ａ）配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３； ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１９１〜４１０； ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１〜１９０； ｄ）配列番号２ からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
- 【請求項４】 前記コントートロスタチンが、約５〜約７ｋＤａの分子量を
有するモノマーを含む請求項１に記載の精製されたタンパク質。 - 【請求項５】 前記コントートロスタチンモノマーが、別のコントートロス
タチンモノマーとホモダイマーを形成している請求項４に記載の精製されたタン
パク質。 - 【請求項６】 ２つのＣｙｓ残基が隣接した約１３アミノ酸残基の柔軟なペ
プチドループの端に、拘束されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含む
請求項１に記載の精製されたコントートロスタチンタンパク質であって、前記ペ
プチドループが、配列番号２のアミノ酸番号４５７〜４６９を含むアミノ酸配列
を有するインテグリンアンタゴニストである精製されたコントートロスタチンタ
ンパク質。 - 【請求項７】 前記生物学的に活性な変種が、 ａ）配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３； ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１９１〜４１０； ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１〜１９０； ｄ）配列番号２ と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク
質。 - 【請求項８】 コントートロスタチンに対する抗体によって認識されるペプ
チド。 - 【請求項９】 配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされるコント
ートロスタチンタンパク質の調製物。 - 【請求項１０】 前記調製物には、他のヘビ毒の成分が実質的に存在せず、
前記コントートロスタチンが、配列番号１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ
分子を転写し、翻訳するプロセスによって作られる請求項９に記載のコントート
ロスタチンタンパク質の調製物。 - 【請求項１１】 前記転写及び翻訳が組換えＤＮＡを含有する宿主細胞で行
われる請求項１０の調製物。 - 【請求項１２】 前記コントートロスタチンが、配列番号２に記載のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを合成するプロセスによって作られる、他のヘビ毒
の成分が実質的に存在しないコントートロスタチンの調製物。 - 【請求項１３】 発現時にコントートロスタチンをコードするＤＮＡ配列を
含む組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１４】 発現時に、金属結合、プロテイナーゼ、又はディスインテ
グリンからなる群から選択される少なくとも１つの生物活性を有するコントート
ロスタチンタンパク質をコードする請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１５】 実質的にコントートロスタチンをコードするヌクレオチド
からなる精製され、且つ単離されたＤＮＡ分子であって、前記ヌクレオチド配列
が、 ａ）配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１５３５； ｂ）配列番号１のヌクレオチド番号６５７〜１３１６； ｃ）配列番号１のヌクレオチド番号８７〜６５６； ｄ）配列番号１のヌクレオチド番号８７〜１５３５；及び ｅ）配列番号１ からなる群から選択される精製され、且つ単離されたＤＮＡ分子。 - 【請求項１６】 請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子を含むベクター。
- 【請求項１７】 請求項１６のベクターで形質転換された宿主細胞であって
、前記宿主細胞が、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌、並びに
細菌からなる群から選択される宿主細胞。 - 【請求項１８】 請求項１７の宿主細胞を培養する工程を備えたコントート
ロスタチンを製造する方法。 - 【請求項１９】 宿主細胞によって発現されたコントートロスタチンを回収
することをさらに備えた請求項１８の方法。 - 【請求項２０】 ａ）宿主細胞を培養することと（前記宿主細胞は、哺乳類
細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌、並びに細菌からなる群から選択
され、前記宿主細胞はベクターで形質転換されており、前記ベクターは、発現時
にコントートロスタチンをコードするＤＮＡ配列を含んでいる） ｂ）宿主細胞によって発現されたコントートロスタチンを回収すること という工程を備えた方法によって製造された組換えタンパク質。 - 【請求項２１】 薬学的に許容される担体と請求項１に記載の精製されたタ
ンパク質とを含む薬学的に許容される組成物。 - 【請求項２２】 インテグリン受容体へのインテグリンの結合が関連する疾
病を有する患者を治療する方法であって、インテグリン受容体へのインテグリン
の結合が実質的に阻害され、前記患者が治療されるように、前記患者に請求項２
１の組成物を投与する工程を備えた方法。 - 【請求項２３】 前記方法が、血小板の凝集、腫瘍の転移、血管新生、新血
管形成、細胞の接着、浸潤性、又は増殖を阻害する請求項２２の方法。 - 【請求項２４】 前記ＤＮＡ配列が、 ａ）配列番号１のヌクレオチド番号１３４１〜１５３５； ｂ）配列番号１のヌクレオチド番号６５７〜１３１６； ｃ）配列番号１のヌクレオチド番号８７〜６５６； ｄ）配列番号１のヌクレオチド番号８７〜１５３５；及び ｅ）配列番号１ からなる群から選択される請求項２０の組換えタンパク質。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16304798A | 1998-09-29 | 1998-09-29 | |
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| PCT/US1999/022608 WO2000018421A1 (en) | 1998-09-29 | 1999-09-29 | Contortrostatin (cn) and methods for its use in preventing metastasis and other conditions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002528058A true JP2002528058A (ja) | 2002-09-03 |
Family
ID=22588249
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