JPH04505698A

JPH04505698A - ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法

Info

Publication number: JPH04505698A
Application number: JP2502804A
Authority: JP
Inventors: ボゲル，テイクバ; レバノン，アビグドー; ワーバー，モーシエ; ガイ，レイチエル; パネツト，アモス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-29
Publication date: 1992-10-08
Anticipated expiration: 2015-10-10
Also published as: DK128091A; EP0451211A4; KR910700339A; DK5693A; EP0451211A1; AU4959890A; WO1990007577A1; JP3095771B2; DK5693D0; DK128091D0; CA2006929C; AU636596B2; CA2006929A1; IL92925A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

２０、ｇｉｌｔ細胞である請求項１つに記載の細胞。２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞である請求項２０に記載の細胞。２２、　プラスミドがｐＦＮ１２６−３と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８２９で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［胞。２３、プラスミドがｐＦＮ１３２−５と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３０で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉ細胞。２４、　プラスミドがｐＦＮ１３７−２と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７９１０で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＭＩＬ。２５、　プラスミドがｐＦＮ９７５−２５と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３２で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。２６、　プラスミドがｐＦＮ９４９−２と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３１で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉ細胞。２７、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。２８、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。２９、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。３０．　ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項９に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。上ユ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。３１、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１０に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃＬ土ユ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの４０ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。３２、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１１に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの３３ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。３３、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１２に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。３４、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１３に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。３５、　天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。３６、　天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。３７、　天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。３８、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８つが欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない７５ｋＤの精製ポリペプチド。３つ、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない４０ｋＤの精製ポリペプチド。４０、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない３３ｋＤの精製ポリペプチド。４１、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤの精製ポリペプチド。４２、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤの精製ポリペプチド。４３、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。４４、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。４５、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。４６、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む７５ｋＤの細菌産生ポリペプチド。４７、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８つが欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む４０ｋＤの細菌産生ポリペプチド。４８、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む３３ｋＤの細菌産生ポリペプチド。４９、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤの細菌産生ポリペプチド。５０、　天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤの細菌産生ポリペプチド。５１、　ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。５２、　ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。５３、　ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。５４、　前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む７５ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。５５、　前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む４０ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。５６、　前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む３３ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。５７、　前記ポリペプチドが、アミンｒ１ｉ１〜２６２を含む３１ｋＤのポリペプチドである請求項５３に記載のポリペプチド。５８、　前記ポリペプチドが、アミノ酸１〜１５３と１３個の付加アミノ酸とを含む２０ｋＤのポリペプチドである請求項５３に記載のポリペプチド。５９、　少なくとも２つの請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な担体とを含有する組成物。６０、　前記ポリペプチドが相互に結合している請求項５９に記載の組成物。６１、　本質的に、少なくとも２つの請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドからなるハイブリッドポリペプチド。６２、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項５９または６０に記載の組成物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。６３、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項６１に記載のハイブリッドポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。６４、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。６５、　血小板からのトロンボキサンの放出を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。６６、　血小板を、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる血小板凝集を阻害する方法。６７、　血小板を、血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板からのトロンボキサン放出を阻害する方法。６８、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、脳血管疾患を有する対象を治療する方法。６９、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、心血管疾患を有する対象を治療する方法。７０、　前記心血管疾患が急性心筋梗塞である請求項６つに記載の対象を治療する方法。７１、　前記心血管疾患がアンギナである請求項６９の記載の対象を治療する方法。７２、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、血管形成法、血栓溶解療法または冠動脈バイパス手術を受けた対象において血小板凝集を阻害する方法。７３、　対象に、創傷の治癒を促進するのに有効な量の請求項３５から５８に記載のポリペプチドを投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。７４、　前記創傷が皮膚創傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。７５、　前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失火による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項７４に記載の対象を治療する方法。７６、　前記創傷が眼球創傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。７７、　前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜上皮創傷である請求項７６に記載の対象を治療する方法。７８、　前記創傷が鍵損傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。７９゜　対象に、細菌感染を予防または治療するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、細菌感染し易いまたは細菌感染した対象を治療する方法。８０、　前記対象が、その体内にカテーテルまたはインブラントが存在するが故に細菌感染し易いまたは細菌感染した請求項７９に記載の方法。８１゜　対象に、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。８２、　対象に、腫瘍を検出するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。８３、　対象に、血栓を検出するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。８４、　血栓溶解剤に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。８５　前記血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナ−ゼアクチベータ複合体（Ｅｍｉｎａｓｅ（登録商標））またはＴＰＡ類似体から成る群から選択される請求項８４に記載の血栓溶解剤に結合したポリペプチド。８６、　成長因子に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。８７、　前記成長因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、α−ＴＧＦ、β−ＴＧＦ、ＦＤＧＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−ＣＳＦまたはＣ３Ｆ−Ｉから成る群から選択される請求項８６に記載の成長因子に結合したポリペプチド。８８、　血清アルブミンに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。８９、　血液因子に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。９０、　前記血液因子が、因子ＶＩＩＩまたは因子Ｘ１ｌｌである請求項８つに記載の血液因子に結合したポリペプチド。９１、　ポリエチレングリコールに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。９２、　スーパーオキシドジスムターゼに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。９３、　医療器具と、前記医療器具の表面に被膜として塗られな請求項３７．４１．４２．４５．４９．５０．５３．５７または５８のいずれか一項に記載のポリペプチドとからなる被覆医療器具。９４、　前記医療器具がカテーテルである請求項９３に記載の被覆医療器具。９５、　（ａ）請求項３７．４１．４２．４５．４９．５０．５３．５７または５８のいずれか一項に記載のポリへプチドを被膜として器具表面に塗り、（ｂ）未被覆の器具ではなく、得られた被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。９６、　前記医療器具がカテーテルである請求項９５に記載の方法。９７、　未被覆の器具ではなく、請求項９３または９４に記載の被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。９８、　血小板を、血小板凝集を阻害するのに有効な量のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板凝集を阻害する方法であって、前記ポリペプチドが天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む該方法。９９、　血小板を、血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板からのトロンボキサン放出を阻害する方法であって、前記ポリペプチドが天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む該方法。１００、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、脳血管疾患を有する対象を治療する方法。１０１、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、心血管疾患を有する対象を治療する方法。１０２、　前記心血管疾患が急性心筋梗塞である請求項１０１に記載の対象を治療する方法。１０３、　前記心血管疾患がアンギナである請求項１０１に記載の対象を治療する方法。１０４、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、血管形成法、血栓溶解療法または冠動脈バイパス手術を受けた対象において血小板凝集を阻害する方法。１０５、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、創傷の治癒を促進するのに有効な量投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。１０６、　前記創傷が皮膚創傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。１０７、　前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失火による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項１０６に記載の対象を治療する方法。１０８、　前記創傷が眼球創傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。１０９、　前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜上皮創傷である請求項１０８に記載の対象を治療する方法。１１０、　前記創傷が鍵損傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。１１１、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、細菌感染を予防または治療するのに有効な量投与することからなる、細菌感染し易いまたは細菌感染した対象を治療する方法。１１２、　前記対象が、その体内にカテーテルまたはインブラントが存在するが故に細菌感染し易いまたは細菌感染した請求項１１１に記載の方法。１１３、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。１１４、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、腫瘍を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。１１５、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血栓を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。明細書ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法本出願は、１９８８年１２月２９日出願の米国特許出願第２９１．９５１号の部分継続出願である１９８９年４月２８日に出願した米国特許出願第３４５．９５２号の部分継続出願であり、前記両出願の内容は参照により本出願に含まれる。発明の背景本明細書中では、カッコ内にアラビア数字で示し種々の文献を参照している。これら参考文献の引用に関しては明細書の最後、請求の範囲のすぐ前に示しである。本発明が関係する当業界の状態をより充分に記すために、これら文献の開示内容は全て参照により本明細書に含むものとする。本発明は、ヒトフィブロネクチン類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法に関する。フィブロネクチンは各々の分子量が約２２０．０００である　２つの同一のサブユニットからなる糖タンパク質である。２つの主要な形のフィブロネクチンが培養及びｉｎ　ｖｉｖｏでヒト細胞内で産生され、分泌されている（１）。細胞会合したフィブロネクチンは比較的不溶性であり、細胞付着、傷の治癒、細胞分化及び食作用に関与している。主として肝臓で産生される血漿フィブロネクチンは可溶性の血清タンパク質であり、細胞フィブロネクチンと同様の生物学的特性を有している。フィブロネクチンを限定的にタンパク質分解して開裂させると個々の活性を有するポリペプチドが得られることから、フィブロネクチンは多機能性のモジュラ− タンパク質と考えられている。部分的タンパク質分解消化によりフィブロネクチン分子の種々の機能性ドメインが明らかにされてきており、ヘパリン−１ＤＮＡ −、フィブリン−、ゼラチン−及び細胞−結合ドメインが含れる（２〜６）。　１９８７年１月　７Ｂに発行された欧州特許第２０７，７５１号（Ｂａｒｘｌｌｅ、　Ｆ、Ｅ、）は、フィブロネクチンの完全なｃＤＮＡ配列を開示している。Ｂ！ｒｓｌｌｅは、大腸菌タンパク質β−ガラクトシダーゼに融合したフィブロネクチンのコラーゲン結合ドメインの一部を含有する融合タンパク質の発現も開示している。同様の融合タンパク質がＯｗｅ　Ｏｌ及びＢｔｒｓｌｌｅにより開示されている（７）。０ｂｘｔｌら（１９８７１は、大腸菌β−ガラクトシダーゼに融合したヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの一部の発現を開示している（８）。更に、Ｏｂａ＋ａら（１９８１１）は、変異誘発した、β−ガラクトシダーゼに融合した細胞結合ドメインの部分の発現を開示しており、すなわち、融合タンパク質として、細胞結合ドメインの部分の座位特異的欠損が得られた（９）。上記の参考文献は融合タンパク質の発現のみを開示しており、非融合タンパク質の発現は開示していない。１９８５年　５月２１日発行の米国特許第４．５１７．６８６号及び１９８７年４月２８日発行の米国特許第４．６１１．１１１号（Ｒ＋＋ｏｉｌｉｈｔｉ及びＰｉｅ＋５ｃｈｂｘｃｈｅｒ）は、フィブロネクチンの細胞接着活性を示すアミノ酸１０８個のポリペプチドを開示している。このポリペプチドは細胞培養又は医療器具で、基体への細胞接着を促進させるために使用しつる。ポリペプチドは、補綴デバイスの表面を被覆して、細胞接着を促進させるためにも使用できる。１９８６年３月２５日発行の米国特許第４．５７８．０７９号及び１９８６年９月３０日発行の米国特許第４．６１４．５１７号（Ｒｇｏ＋１ｉｈｔｉ及びＰｉ＋ｚｃｈｂｘｃｈｅｒ）は、式Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ−Ｙ（ＲＧＤ）を有し、フィブロネクチンの細胞接着活性を示すテトラペプチドを開示している。好ましいＲはＳｅｒであるが、Ｃｙｓ又はＴｈｒのような他のアミノ酸でもよい。テトラペプチドは、基体にペプチドを固定化することにより（補綴デバイスのような）基体への細胞接着を促進するために、溶解又は懸濁した形態のペプチドを使用することにより基体への接着を阻害するために、そして細胞の食作用を増強するために使用しうる。これらのテトラペプチドはＨｘｖｅｒ＋ｔｉｃｋら（１９）及びＧｉａｘｂｅｒｇら（２０）によっても開示されている。１９８６年　５月２０日発行の米国特許第　４．　Ｎ９．８８１号（Ｐｉｅ＋５ｅｈｂａｃｈｅｒ及びＲａｏｓｌｇｈｔｉｌは、フィブロネクチンの細胞接着活性を示すアミノ酸３０個のポリペプチドを開示しており、このポリペプチドにはアミノ酸１０８個のポリペプチドについて上記したような用途が提起されている。上記特許出願に開示されているペプチドはフィブロネクチンの細胞結合ドメイン −の活性を有してはいるものの、より大きなフィブロネクチンポリペプチドはどの細胞結合活性は有していない。より小さいペプチドは完全なフィブロネクチン分子を充分に模倣する正確な立体配置を得ることができないと考えられている。又、これらポリペプチドは、フィブロネクチン分子の細胞接着活性の増強に重要な細胞結合ドメインの池の部位又は部分を欠いているとも考えられている。本出願人の発明である、短かい合成ペプチド（ＲＧＤ）の代りに細胞結合ドメイン全体又は細胞結合ドメインの大きな断片をｉｎマｉｒｏ実験に使用することには多くの利点があり、それには次のものを含んでいる：い）血漿由来の細胞結合ドメイン（７５，０００ダルトン）は短かいＲＧＤペプチドと比ベフイブロネクチン受容体との親和性が約２００倍高い；　（ｉｉ）全細胞結合ドメインは短かい合成ペプチドに比ベプロテアーゼ、特にエキソペプチダーゼに対するｉｎマ１マＯの安定性が高い；そして　（ｉｉｉ）より大きなタンパク質では合成の短かいペプチドに比べ腎クリアランス速度が非常に遅いため細胞結合ドメイン（ＣＢ　Ｄ）のより大きな断片の半減期が長くなる。本出願人の発明によりポリペプチドを製造するために使用するプラスミドが提供される。ポリペプチドは血小板凝集反応の阻害にも使用しつる。凝集反応を阻害するためにこれまでに開発された薬剤では、完全に阻害することなく血小板の生理的機能を妨害していた。本出願人の発明のポリペプチドは、血小板間の相互作用及び血小板と基体との間の相互作用に関与する天然分子との競合を介して血小板凝集機構に障害を与えることによりこれらの難点を克服している。本出願人のポリペプチドは治療薬剤として使用することができ、プロスタサイクリンよりかなり長い半減期を有し得る。又、アスピリン又は他の常用されている抗血小板凝集剤よりはかなり半減期が短かい。従って、これらの薬剤による副作用はないであろう。負傷した内腔血管の修復の重大な段階に作用しても、本出願人のポリペプチドは傷の修復に必要な必須の凝固誘発を妨害することはないであろう。従って、制御不能な出血は起こり得ない。これは、本出願人のポリペプチドが、血小板凝集の生理学的機能を妨害する既存の治療薬剤とは異なり、付着機構を特異的に妨害し、凝集に関与する種々の部位を引き離すことにより作用しうろことによるものである。治療薬剤の薬動力学は設計により変更し、それによって、確実に過程を可逆的にし、凝固及び血小板凝集の過程を理想的に管理できるようにすることが可能である。Ｇ＋１ｎｎｅｌｌ及び共同研究者によるいくつかの論文は、慢性的な傷の治療へのフィブロネクチンの使用を示唆している（１０）。Ｇ＋１ｎｎｅｌｌは最近、臨床試験に関する科学会議で、外用使用した血漿由来のフィブロネクチンは傷の治癒を促進することを報告した。更に、Ｎｉ＋ｈｉｄａ及び共同研究者の動物モデルでの研究によると、角膜の潰′瘍形成（再度上層で覆うことの欠落）とフィブロネクチンの欠損との間の相互関係が示された。このグループはヒトの角膜潰瘍の治療に外因性血漿由来フィブロネクチンを使用していた（１１）。最近開発されている傷の治療法は、保存しであるドナーの血液又は自己の血液由来の完全なフィブロネクチン分子を使用する。本出願人の発明は傷の治癒のために個々の機能性ドメインを使用する。例えば、組換え細胞結合ドメインをフィブロネクチン分子全体の代りに使用し、傷の治癒を促進することができる。組換えポリペプチドはより安定であり、血液夾雑物質を全く含むことなく、実質的に無限な量製造することができる。フィブロネクチンのフィブリン結合ドメインは傷での敗血症を防ぐための抗感染薬として使用できる。Ｈｕｍｐｂｒｉｅ＋　ら（１２）は、ＲＧＤペプチドとマウスのメラノーマ細胞とを同時注射するとマウスでの肺転移コロニーの形成が劇的に阻害されることを示した。１９８９年　４月２８日出願の同時係属中の共通譲渡された米国特許出願Ｎ１１３４５．９５２は［９８８年１２月２９日出願の米国特許出願魔２９１．９５１の部分継続出願であり、この各々はヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法を開示している。本出願人のポリペプチドは、短かい合成ＲＧＤペプチドと比べ静脈注射後の半減期が長く、転移をより有効に阻害する。本出願人のフィブロネクチンポリペプチド類似体は、高齢者によく見られる臨床症状である足の静脈でのフィブリンクロッティングの検出にも有用でありうる。フィブリン血栓の位置測定は核医学部門で実施される非常に複雑な手法である。アッセイは、注入した放射性標識フィブリノーゲンの血栓に対する低い親和性に基くものである（２１）。しかしながら、標識フィブリノーゲンは大量（約１０ｇ）の血中の内因性フィブリノーゲンで希釈される。従って、この方法は感受性の高いものではない。本出願人の発明は、フィブリン血栓検出用トレーサーとしての、フィブリンに対する結合親和性の高い放射性標識フィブロネクチンアミノ末端ドメイン（３１ｋＤ）の使用を提供する。血中のフィブロネクチン量はフィブリノーゲン量よりはるかに低いため、本出願人の発明は血栓検出用のより感受性の高いトレーサーを提供する。更に、フィブロネクチンのこのドメインは第Ｘ■因子によりフィブリンクロットと共有的に架橋結合するために、クロット部位に放射性標識ドメインがかなり蓄積されるであろう。最後に、本発明は、ヒトフィブロネクチン分子のドメインと同様の配列を有する新規なフィブロネクチンポリペプチド類似体を提供する。本発明は、脳血管障害、心血管障害、創傷及び癌のような状態の対象の治療におけるフィブロネクチンの個々のドメインの使用も提供する。発明の概要本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク賀分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドを提供する。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物には対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドを提供する。また、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物には対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するような、ポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドを提供する。本発明の現在の好ましい実施態様では、ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約７５．ｋＤポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約４０ｋＤポリペプチド断片：ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約３３ｋＤポリペプチド断片：ヒトフイブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約３１ｋＤのポリペプチド断片：又はヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約２ＱｋＤポリペプチド断片である。さらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、アミノ酸１１０２〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋ［ｌポリペプチド断片；アミノ酸１３８０〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの４ＱｋＤポリペプチド断片；アミノ酸１３２９〜１７２２を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの３３ｋＤポリペプチド断片；アミノ酸１〜２６２を含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤポリペプチド断片；又はアミノ酸１〜１５３と１３個の付加アミノ酸とを含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤポリペプチドである。プラスミドは大腸菌の好適味で発現させるのが好ましい。好適な大腸菌株の例としては、大腸菌株Ａ４２５５（Ｆ　）　（ＡＴＣＣ受託番号黙６７８３０）　、大腸菌株Ａ１６４５［：ＡＴＣＣ受託番号融６７８２９３又は大腸菌株Ａ４２５５　（Ａ　Ｔ　ＣＣ受託番号ＮＩＬ　６７９１０）である。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法は、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞から回収することからなる。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメイン又はフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法は、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞から回収することからなる。本発明の現在の好ましい実施態様では、このように製造されるポリペプチドは、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋＤ、　４０ｋＤ、又は３３ｋＤポリペプチド断片又は天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤもしくは２０ｋＤのポリペプチド断片である。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの領域の１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチドを提供する。好ましいドメインは細胞結合ドメイン及びフィブリン結合ドメインである。好ましいポリペプチドは細胞結合ドメインの７５ｋＤ、　４０ｋＤ及ヒ３３ｋＤポリペプチド並びにフィブリン結合ドメインの３１ｋＤ及び２０ｋＤポリペプチドである。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、細菌産生ポリペプチドを提供する。好ましいドメインは細胞結合ドメイン及びフィブリン結合ドメインである。好ましいポリペプチドは細胞結合ドメインの７５ｋＤ、　４ＧｋＤ及び３３ｋＤポリペプチド並びにフィブリン結合ドメインの３１ｋＤ及び２０ｋＤポリペプチドである。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しないポリペプチドも提供する。又、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメイン又はフィブリン結合ドメインの１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しないポリペプチドも提供される。好ましいポリペプチドは細胞結合ドメインの７５ｋＤ、　４０ｋＤ及び３３ｋＤポリペプチド並びにフィブリン結合ドメインの３１ｋＤ及び２０ｋＤポリペプチドである。本発明は少なくとも２つの上記ポリペプチドと適当な担体とを含む組成物及び少なくとも２つのこのようなポリペプチドのみから本質的に成るハイブリッドポリペプチドを提供する。本発明は更に、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量の本発明ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物も提供する。又、血小板からのトロンボキサンの放出を阻害するのに有効な量の本発明ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物も提供する。本発明組成物は血小板凝集反応の阻害又は血小板からのトロンボキサン放出の阻害に使用できる。又、脳血管障害、心血管障害、創傷、細菌感染、癌を有する対象の治療又は腫瘍もしくは（血栓の・イメージングによる）血栓の検出にも使用できる。本発明ポリペプチドは血栓溶解剤、成長因子、血清アルブミン、血液因子、ポリエチレングリコール又はスーパーオキシドジスムターゼと結合させることができる。本発明のポリペプチドは、カテーテルのような医療器具の使用に伴う細胞感染の危険性を最小化するように、このような医療器具を被覆するためにも使用できる。又、血漿フィブロネクチンをプロテアーゼで消化することによりポリペプチドを得る、上記のような治療方法も提供する。図面の簡単な説明図中、示した制限酵素部位の隣のカッコ内の数字は、第４１図に示すようなヒトフィブロネクチンｃＤＮＡのヌクレオチド配列に添って同じく番号を付した位置に対応する（１９８７年１月　７日発行の欧州特許第２０７．７５１号明細書（Ｂｘｒｚｌｌｅ、Ｆ、Ｅ、　）　０）第３図も参照のこと）。本出願人がクローニングし発現させたｃＤＮＡ配列は、Ｂｘｒｚｌｌｅの地図のヌクレオチド４８１１〜５０８０　（両端を含む）の２７０ｂｐのエキストラドメイン（ＥＤ）セグメントを欠いている（４１図参照）。従って、Ｂｘｒｘｌｌｅマツプのヌクレオチド３３１７〜５５６Ｇに亘ると云われているｃＤＮＡ配列はＥＤ上セグメントなわちヌクレオチド４８１１〜５０８０　（両端を含む）を欠いているために１９８０個のヌクレオチドしか含有していない。この領域は当業界ではＥＤ−Ａ領域としても知られている。同様に、そのＤＮＡ断片で発現したタンパク質はＢａｒａｌｌｅマツプのアミノ酸ｌＩＯ２〜アミノ酸１８５１をコードするであろうが、ＥＤ領領域、コードされる９０個のアミノ酸すなわちアミノ酸１６００〜１６８９　（両端を含む）を欠いているだろう。そのため、これは６６０個のアミノ酸しか含有しないであろう。ＥＤ領領域及ぶ本明細書中に記載された全ての断片についてこれはあてはまる（当業界でＥＤ−Ｂ領域として知られている領域はＢｘｒｚｌｌｅの配列でも出願人のｃＤＮＡでも欠けている）。４０ｋＤ、３１ｋＤ、７５ｋＤ、３３ｋＤ及び２０ｋＤとして表現されるタンパク質の定義は分子量が既知であるマーカーと比較したＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での移動度を基とした操作上の定義である。３１１１図第１図の上部は単離された種々のフィブロネクチンｃＤＮＡクローン並びに相互の及びフィブロネクチンｃＤＮＡの全長配列に対するこれらｃＤＮＡクローンの配列を示している。茶１図の下部はヒトフィブロネクチンポリペプチド内に存在する種々のドメインを図式的に表わしている。第２図この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐＢＲ３２２とｐＦＮ９１９からのプラスミドｐＦＮ１０Ｇの構築を示している。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１００は、ヌクレオチド３３１７〜４０９０に対応する、フィブロネクチンの細胞結合ドメインに対応するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの５′末端をコードする。第３図この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐＢＲ３２２とｐＦＮ９１９からのプラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０１の構築を示している。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０１　はフィブロネクチンのヌクレオチド３６１１〜４Ｈｆｌに対応するｃＤＮＡを含有する。第４図この図は、合成リンカ−を使用したプラスミドｐＢＲ３２２とｐＦＮ９１６からのプラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０２の構築を示している。ヌクレオチド４１５１〜５５６６に対応するＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｆｆ断片を（図に示すような）合成リンカ−及びｐ　Ｂ　Ｒ３２２をＥｃｏＲＩ−３ａ　ｌ　Ｉ消化して得た大きなｐＢＲ３２２断片に連結させた。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０２は細胞結合ドメインに対応するｃＤＮＡの３′末端をコードする。第５図この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐＦＮＩＧＯ（第２図）とｐＦＮｌ［１２（第４図）からのプラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０３の構築を示している。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０３は、ヌクレオチド３３１７〜５５６６のフィブロネクチン細胞結合ドメインに対するｃ　ＤＮＡ領域をコードする。第６図この図は、プラスミドｐＦＮ１０３（第５図）とプラスミドｐＴＶ’３０１（第７図）からのプラスミドｐＦＮＩｆ１５の構築を示している。細胞結合ドメインに対応するｃＤＮＡをプラスミドをｐＦＮ１０３から取り出し、λＰＬプロモータ及びｃｒｌリポソーム結合部位の制御下のプラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　３０１の断片に挿入した。プラスミドｐＦＮ１０５は全細胞結合ドメイン（７５ｋＤ）を発現するであろうと予期された。しかし、４０３０位に　１つのチミジン欠失があるため、ｃＤＮＡのコード部位内の終結コドンが生じ、プラスミドｐＦＮ１０５は分子量３９ｋ［ｌのポリペプチドを発現した。第７図この図は、プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　１０４　（２）とｐ５７９からのプラスミＦｐＴＶ３０１の構築を示している。プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　３０１　はをコードするｃＤＮＡの下流にＴＩＴ２転写ターミネータも含この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０１とｐ　Ｆ　Ｎ　１Ｇ２からのプラスミドｐＦＮ１０４の構築を示している。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０４はヌクレオチド３６１１〜５５６６の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有している。第９図この図は、プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　３１０とｐＦＮ１０４からのプラスミＦｐＦＮ１０６の構築を示している。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０６はλＰＬプロモータとｃｌＩリポソーム結合部位との制御下に６５ｋＤポリペプチドを発現すると予想されていた。６５ｋＤポリペプチドはＲＧＤ配列を含むと予想された。しかし、４０３０位で１つのチミジンが欠失しているため、ｃ　’Ｄ　Ｎ　Ａ内の終結コドンが生じ、プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０６は３５ｋＤタンパク質を発現した。第１Ｇ図この図は、プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１０５とｐＦＮｌ１４−４からのプラスミドｐＦＮ１２６−３の構築を示している。プラスミドｐＦＮ１１４−４はｃＤＮＡライブラリーから独立して単離されたＦＮｃＤＮＡを有するその他のプラスミドである。ｐＦＮ１１４−４では４０３０位でのチミジンの欠失はない。プラスミドｐＦＮ１１４−４からのＳｓｔＴ−ＢｇｌＩ［断片を使用してプラスミドｐＦＮ１０５からのＳｓｔｌ−ＢｇｌｌＩ断片を置き換えた。得られたプラスミドｐＦＮ１１７−４は７５ｋＤの細胞結合ドメインタンパク質の全長を発現したが、プラスミドは翻訳終結コドンを含有せず、ｐＢＲ３２２配列内で終結する。この誤りを正すために次のリンカ−を構築した：ＧＡＴＣＴＡＣＴＡＡＧＧＣＣＴＡＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＡこのリンカ−はＢｇＩＩｆ及びＨｉｎｄｌｌ［［位を各々　５′及び３′末端に有し、翻訳終結コドンを含む７５ｋＤＣＢ　Ｄの　３′末端をコードする。これを、Ｂｇｌｎ及びＨｉｎｄｌＩ［で開裂させたプラスミドｐＦＮ１１７−４に連結させた。得られたプラスミドｐＦＮ　１２６−３は真正なＣ−末端を有する７５ｋＤの細胞結合ドメイン全体を発現した。第１１図この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐＴＶ３０１とｐＦＮ１０２からのプラスミドｐＦＮ１１８（又はｐＦＮｌ１８−２と表わす）の構築を示す。プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　ｔｉｌｌは４０ｋＤの細胞結合ドメインタンパク質を発現するよう設計されていた。しかし、リンカ−合成での誤りのため、タンパク質はリンカ−内で終結せず、むしろベクターｐＢＲ３２２由来の配列中でのみ終結した。従って、得られたタンパク質は融合タンパク質であった。第１２図この図は、合成リンカ−を使用した、プラスミドｐＦＮ１１８とプラスミドｐＴＶ３０１からのプラスミドｐＦＮ１３２−５の構築を示す。合成リンカ−を使用して、プラスミドｐＦＮｔ１ｇ中の欠陥合成リンカ−の部分を置き換えた。得られたプラスミドｐＦＮ１３２−５は４０ｋ［ｌの細胞結合ドメインタンパク質を発現した。第１３図この図は、本出願人らの創傷治癒モデルでのコラーゲン及びＤＮＡの合成を示している。スポンジ当り４０ｋ［ｌタンパク質５０μｇを使用し、実施例１０及び２２に記載したように実験を行なった。陰性対照としてスポンジ当り　１００μ ｇの牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）と食塩水を使用した。第１４図この図は４０ｋＤの組換えＣＢＤタンパク賀の薬物動力学を示しこの図は、細胞結合ドメインのサブクローニングに使用するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ合成断片のヌクレオチド配列を示してこの図はプラスミドｐ５７９の構築を示す。ｒＲＮＡオペロンＴＩＴ２転写終結断片を、ＨｉｎｄＩ［で消化しであるプラスミドｐｐｓ　ｌ（受託番号魔３９８１１７としてＡＴＣＣに寄託）から単離した。Ｔ１Ｔ２断片を、Ｈｉｎｄｌ［Ｉで消化しであるｐＲ０２１１（第１７図）の独自Ｈｉｎｄｍ部位に挿入した。得られた発現ベクターｐ５７９はλＰ　プロモータ及びＣＩＩリポソーム結合部り位、次にＴ１Ｔ２転写終結配列を含有する。第１７図この図はプラスミドｐ　Ｒ０２１１及びｐ　ＲＯ１２の構築を示す。プラスミドｐＪＨ２［１０（受託番号Ｎａ　３９７８３でＡＴＣＣに寄託）をＮｄｅＩで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ）で処理して末端を充填し、得られた末端を再び連結させて発現ベクターｐＲＯ２１１を形成した。発現ベクターｐ　ＲＯ２１１をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄｌｌＩで消化し、大断片を単離し、ｐＡＬ５００（受託番号！！ｌ　３９７ｇ２としてＡＴＣＣに寄託）から単離したＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄｌ［［ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）断片に連結してｐＲＯ１２を得た。（ＮｄｅＩ−１（ｉｎｄｎＩ断片は、ｐＡＬ５０ＧをＥｃｏＲＩで消化し、消化産物の末端に配列：ＴＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＡＧＴＴＡＡの合成リンカ−を連結することにより製造した。連結混合物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄｌ［で消化し、得られたＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩ［［ｂＧＨ断片を単離した。）第１８図この図は、細胞結合ドメインを含有する種々のフィブロネクチンプラスミド、及び相互の及び細胞結合ドメインの全配列に対するプラスミドの配列を示す（フィブロネクチンｃＤＮＡに対する細胞結合ドメインの配列は第１図に示す。）。各プラスミドにより発現したタンパク質の分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での移動度で測定し、右の欄にキロダルトン（ｋＤ）で示す。各タンパク質は分子量に従って表わし、例えば７５ｋＤタンパク質とする。カッコ内の番号は第４１図に示すヒトフィブロネクチンｃＤＮＡのヌクレオチド配列に添って同じく番号を付した位置と対応する（１９８７年１月　７日発行の欧州特許第２０７．７５１号明細書（Ｂｓｒｘｌｌｅ、Ｆ、Ｅ、）の第３図も参照）。エキストラドメイン（Ｅ　Ｄ）は欠けている。これはアミノ酸１６００〜１６８９　（両端を含む）の９０個のアミノ酸をコードするヌクレオチド４１１１１〜５０８０（両端を含む）の２７０個のヌクレオチドに対応する。（このＥＤ領領域当業界ではＥＤ−Ａ領域としても知られている。Ｂ！＋１ｌｌｅの配列及び本出願人のｃＤＮＡの両者ともＥＤ−Ｂを欠いている。）ＣＢＤＩ＝細胞結合ドメインＩ　（ＲＧＤ配列を含む）ＣＢＤＩ［＝細胞結合ドメイ：／　ＩＩ　（Ｏｂａ＋ｉら、Ｃｅ１ｌ　５３：　６４９〜６５７　（１９８８）に開示されている）東１９図この図は、細胞結合ドメインの種々の断片をコードするプラスミド及びそれらにより発現されるタンパク質についての情報を概説している。第２０図この図は、プラスミドｐＦＮ　１１７−Ｎ第１０図）をＥｃｏＲＶ及びＢｇｌｌＩで消化して産生じた大断片に合成リンカ−Ａ（第２６図）を連結することによるプラスミドｐＦＮ１２８−４の構築を示す。プラスミドｐＦＮ１２８−４はヌクレオチド３３１７〜５１７９の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有している。３′末端はリンカ−Ａにより形成される。プラスミドはλＰ。プロモータ及びｃＩＩリポソーム結合部位の制御下で６５ｋＤ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。このプラスミドは、細胞結合ドメインをコードするｃ　ＤＮＡの３′末端のみがプラスミドｐＦＮ１１７−４　と異なるプラスミドｐＦＮ　１２６−３（ＡＴＣＣ受託番号ｋ　６７８２９）から同様に構築し得るであろうことを特記する。第２１図この図は、プラスミドｐＦＮ　１１７−４をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｍで消化して得た大断片に合成リンカ−Ｂ（第２６図）を連結することによるプラスミドＩ）ＦＮ　＋３０−＋１の構築を示す。プラスミドｐＦＮ　１３０−１１はヌクレオチド３３１７〜４０９０の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有する。３′末端はリンカ−Ｂで形成した。このプラスミドはλＰＬプロモータ及びｃｌＩリポソーム結合部位の制御下で２８ｋＤ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。このプラスミドは、細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡの３′末端のみがプラスミドｐＦＮ１１？−４と異なるプラスミドｐＦＮ　１２６−３（ＡＴＣＣ受託番号魚６７ｇ２９）から同様に構築し得るであろうことを特記する。第２２図この図は、合成リンカ−Ｃ（第２６図）、合成リンカ−Ｄ（第２６図）及びプラスミドＩ）ＦＮｌ１７−４をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化して得た大断片を三分節連結することによるプラスミドｐＦＮ１３５−１２の構築を示す。プラスミドｐＦＮ１３５−１２はヌクレオチド３９９８〜約５５６６の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有し、５′末端はリンカ−Ｃ及びＤで形成した。このプラスミドはλＰＬプロモータ及びｃｌＩリポソーム結合部位の制御下で４５ｋＤ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。親プラスミドｐＦＮ１１７−４で発現させた７５ｋ［ｌタンパク質（第１０図の説明参照のこと）におけると同様の誤りがこのタンパク質のＣ−末端にあり、すなわち、フィブロネクチンｃＤＮＡの末端には翻訳終結コドンがな（、従って、ｐＢＲ３２２コード配列で翻訳が終結することを特記しておく。第２３図この図は、プラスミドｐ　Ｆ　Ｎ　１３５−１２　（第２２図）のＥｃｏＲＶ及びＢｇｌｌＩ消化により産生じた大断片に合成リンカ−Ａ（第２６図）を連結することによるプラスミドｐＦＮ１３７−２の構築を示す。プラスミドｐＦＮ１３７−２はヌクレオチド３９９８〜５１７９の細胞結合ドメインをコードするｃ　ＤＮＡを含有し、３′末滴はリンカ−Ａで形成した。このプラスミドはλＰ、プロモータ及びｃＵリポソーム結合部位の制御下で３３ｋＤ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。プラスミドｐＦＮ１３７−２は受託番号６７９１０としてＡＴＣＣに寄託しである。第２４図この図は、合成リンカ−Ｅ（第２６図）、プラスミドｐＦＮ１３７−２のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化により得た大断片並びにプラスミドｐＦＮ１２６−３の５ｓｔＩ及びＢａｍＨＩ消化により得た小断片の三分節連結によるプラスミドｐＦＮ１４３−１の構築を示す。プラスミドｐＦＮ１４３−１はヌクレオチド３６０２〜５１７９の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有し、５′末端はリンカ−Ｅで形成した。このプラスミドはλＰ、プロモータ及びｃｌＩリポソーム結合部位の制御下で５５ｋ［ｌ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。第２５図この図は、合成リンカ−Ａ（第２６図）、プラスミドｐ５７８（下記参照）のＮｄｅＩ及び８ｇ１ｍ消化による大断片、並びにプラスミドｐＦＮ１１８（第１１図）のＮｄｅｌ及びＥｃｏＲＶ消化による小断片の三重連結によるプラスミドｐＦＮ　１３４−９の構築を示す。プラスミドｐＦＮ１３４−９はヌクレオチド４１５１〜５１７９の細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡを含有しており、Ｃ ′末端はリンカ−Ａで形成した。３′末端の下流はＴ　ＩＴ　２転写終結配列である。プラスミドはλＰＬプロモータ及びｃＵリポソーム結合部位の制御下に２１１ｋＤ細胞結合ドメインタンパク質を発現する。プラスミドｐ５７Ｂはｐ５７９を作製したのと同じ連結（第１６図参照）からのもう　１つの単離物である。プラスミドｐ５７８とｐ５７９は同様であると理解される。プラスミドｐＦＮ１３４−９は、細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡの３′ 末端のみがプラスミドｐＦＮ１１ｇと異なるプラスミドｐ　Ｆ　Ｎ１３２−５（ＡＴ　ＣＣ受託番号Ｎｉ１６７８３０）から同様の方法で構築し得るであろうことを特記しておく。第２６図本発明プラスミドの構築には合成リンカ−を使用した。この図はこれまでの図で記載したプラスミドの構築でリンカ−として使用した合成オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥの塩基配列を示す。第２７図この図は、放射性標識した３３ｋＤタンパク質をラットに静脈注射したときの薬動力学を示す。第２８図この図は、３３ｋＤ及び４０ｋ［ｌタンパク質、血漿性７５ｋＤタンパク質（Ｐ　−７５ｋＤ）並びに合成ペンタペプチドＧ　ＲＧ　Ｄ　Ｓ　（Ｓｉｇｌｎｇ）の、実施例７に記載の１０マｉｔ＋ｏでのヒト血小板凝集アッセイ系に対する用量一応答作用を示す（血漿性７５ｋＤタンパク質は、Ｈｘ７ｇ＋ｈｉ、　Ｍ、及びＹａ！Ｂａｄａ、　Ｋ、　Ｍ、（２８）に記載の方法を使用してフィブロネクチンのトリプシン消化物から精製した）。ＰＢＳ溶液中、示した量のタンパク質（及びＧＲＧＤＳ）を、（ドナーＴからの）血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）　１２５μｌを含有する別々の反応管に加えた。平衡化後ＰＢＳを加えて最終の反応容量を２５０μｌとした。最終濃度がｌＯμＭ　ＡＤＰとなるようにＡＤＰ溶液を加えて血液凝固反応を誘発した。各反応管の透過率を（３分間の反応時間の間に）測定し、最大透過率の割合（％）として計算した血小板凝集反応阻害をタンパク質濃度に対してプロットした（凝集実験では新鮮な血液を使用した。又、血小板の挙動のその起源に依存する変動のため、ドナー（Ｔ又はＲ）を示した。）。を下記のような変更を行って使用した、全血の血小板凝集に対する３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質の用量一応答作用を示す：反応管の混合物は（Ｒからの）全血５００μ！とＰＢＳ又はＰＢＳ中のタンパク質溶液５００μｌとを含んでいた。３３ｋＤタンパク質Ｏ（対照）、０．６５μＭ及び２６μＭの存在下、並びに４０ｋ［ｌタンノ々り賀Ｇ（対照）、１．５μＭ及び７，５μＭの存在下で実験を実施した。溶液を３７℃で３分間平衡化し、次に、最終濃度ｌＯμＭＡＤＰとなるようＡＤＰ溶液を加えて血小板凝集反応を誘発した。全血溶液については、透過率の代りにインピーダンスをモニターした。インピーダンス法では、血液サンプル中に浸漬した２枚の電極の間に非常に小さな電流を流し、電極間の電気的インピーダンスを測定することにより凝集を検出する（２２）。上記実験でのインピーダンスの結果を（対照の反応管での最大インピーダンスの割合（％）として計算した）阻害率に変換し、３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質の濃度（μＭ）に対しプロットした。実施例２０に記載のように尿素処理して４０ｋＤタンノ々り質サンプルを再活性化させた。茶３０図この図は、実施例７に記載のｉｎ　ｆｉ＋＋０血小板凝集系での３３ｋＤ及び４ＱｋＤタンパク質の作用を示す。血小板の豊富な血漿（Ｒ由来）を使用し、示した濃度で３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質を反応管混合物に加えた。４０ｋＤタンパク質の　２つの異なる調製物をテストした。ｒＴＳＫ−１−尿素−ＰＢＳＪと表わす４０ｋ［ｌのサンプルは、（実施例１５に記載のように）　Ｆ＋ｘｃｔｏｇｅｌ濾過した後、実施例２０に記載のように尿素処理して再活性化した。もう一方の４０１Ｄ調製物は再活性化しなかった。０．５分間反応させた後の凝集を比較して凝集阻害を計算した。第３１図実施例１９に記載の方法を使用して、３３ｋｆｌ及び４０ｋＤタンパク質並びにヒト血漿性フィブロネクチンの血小板との結合に対するタンパク質濃度の作用を調べた。反応混合物は５Ｘ　１０８の洗浄した血小板とトロンビンを含有していた。各鋼中の標識タンパク質量は図中に示す通りであった。第３２図実施例１９に記載の方法を使用し、刺激剤としてトロンビンを用いて、ヒト血漿フィブロネクチン（ｈ−ＦＮ）並びに４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の洗浄血小板への結合に対する合成ペンタペブチドＧ　ＲＧ　Ｄ　Ｓ　（ＳｉｇＩｌｌｇ）の作用を調べた。０．１μＭの　■−標識４０ｋＤ、　３３ｋ［ｌ並びに血漿性ＦＮを使用し、単独並びに１０倍過剰の非放射性（非標識）同種タンパク質（各々４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質）の存在下及び５０ｋＭ　ＧＲＧＤＳペンタペプチドの存在下で実験を行った。図は各標識タンパク質のみによる結合を　１００％として標準化した。第３３図実施例１９に記載の方法を使用して、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の洗浄血小板への結合に対するトロンビン存否の作用を調べた。血小板濃度は５ＸＩＩ］８血小板／　ｍｌであった。Ａ９図示したように、トロンビン存在又は不在下及び追加の１μＭ非標識４０ｋ［ｌの存在又は不在下で、各反応混合物は１１００ｎの　ｌ−４０ｋＤを含有していた。Ｂ１図示したように、トロンビンの存在又は不在下及び追加の１μＭ非標識３３ｋＤの存在又は不在下で、各反応混合物は１０００Ｍの　１−３３ｋ［ｌを含有していた。示した結合率は結合した添加放射活性標識の割合（％）である。第３４図フィブリノーゲンの洗浄血小板への結合に対する４ＱｋＤ及び３３ｋＤタンパク賀、血漿性７５ｋＤ　（ｐ　７５ｋＤ）並びにＧＲＧＤＳの作用を研究した。方法は、次の点を除き、実施例１９に記載した通りであった。反応混合物は５Ｘ　１０８の血小板を含有しており、トロンビンの存在下及び不在下の両方で実験を行った。２５℃で１０分間ブレインキュベートした後、１ｍｌ当り　４単位のヒルジン（Ｂｉｏ−Ｍａｋｏｒ、イスラエル）を加え、更に５分間２５℃でブレインキュベートした。反応混合物に　１００μＭの　１２５Ｉ−フィブリノーゲンを加えた。対照サンプルはこれ以外の添加物を含まず、テストサンプルは１２５ ■−フィブリノーゲンと同時に加えた５μＭの４０ｋＤ、５μＭの３３ｋＬ　５ μＭの血漿性７５ｋ［ｌ又は５０ｋＭＧＲＧＤ　Ｓペンタペプチドを含有していた。これらは全て図中に示す通りであった。更に２０分間インキュベーションを続け、反応を終結し、放射活性を測定した。示した結合率は結合した添加放射活性標識の割合（％）である。第３５図実施例１９に記載の方法を使用して、トロンビンの存在下及び不在下での４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の洗浄血小板への結合の用量応答を測定した。反応混合物は５ＸＩ０８の血小板を含有していた。Ａ、示した量の　１２５１−４ＱｋＤを反応混合物に加えた。Ｂ、示した量の　１２５１−３３ｋＤを反応混合物に加えた。第３６図実施例１９に記載の方法を使用して、３３ｋＤ組換えタンパク質の洗浄血小板への結合の時間的推移を得た。反応混合物は１１００ｎの　１２５１−３３ｋＤを含有しており、インキュベーション時間は５゜１５、２５及び３５分であった。示したようにトロンビンの存在下及び不在下の両方で実験を行った。第３７図実施例１９に記載の方法を使用して、ＦＮ、　４０ｋＤタンパク質及び３３ｋＤタンパク賀の洗浄血小板に対する結合を研究した。反応混合物は５×ＩＯの血小板と各ＩＱＯｎＭの　Ｉ−ＦＮ又は１２５１−４０ｋＤ又は　１２５１−３３ｋＤのいずれかを含んでいた。示したように、トロンビンの存在下又は不在下でインキュベーションを行った。Ａ、インキュベーション時間＝３０分間Ｂ、インキュベーション時間＝１０分間第３８図４０ｋＤタンパク賀の細胞結合活性を血漿性フィブロネクチン（ＦＮ）と比較する。Ａ、尿素再活性化前後の４０ｋＤタンパク質、４０ｋＤ及び４０ｋＤ（Ｕ）並びに血漿性フィブロネクチンＦＮの細胞結合活性を、ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３繊維芽細胞系（ＡＴＣＣ受託番号磁ＣＣＬ　１６３＋を用いて、細胞接着アッセイ系（２３）　（実施例１６参照）により測定した。実施例２０に記載の通りに尿素再活性化を行った。Ｂ、上記の　３７３線維芽細胞系又はＮＲＫ−５２Ｅ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号＆　ＣＲＬ　１５７１）のいずれかを使用して、細胞接着アッセイ系により、４０ｋＤタンパク質及び血漿性フィブロネクチン（ＦＮ）の細胞結合活性を測定した。アッセイ手法は上記Ａに記載の通りであった。第３９図第３８図に記載したように、細胞接着アッセイ系により、４０ｋＤ及び３３ｋＤ組換えタンパク質並びに血漿性フィブロネクチン（ＦＮ）の細胞結合活性を測定した。使用したＢＨＫ細胞はＹｒｍｇｄｘが記している。最大の半分の接着は、フィブロネクチンについては０．８μｇ／Ｑ１１で、４０ｋＤタンパク質では２．４μｇ／ｍｌで得られる。第４０図この図は、ラットのスポンジ（５ｐｏｋｅ）創傷治癒モデルにおける４０ｋＤタンパク質のコラーゲン及びＤＮＡ合成に対する作用を示す。実施例２２に記載のように実験を実施した。陽性対照として、血漿フィブロネクチン（ＦＮ）及び表皮成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　、　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ＋　Ｉｎｃ、　）を各々スポンジ当り　ｉｏｏμｇ及び８μｇ使用した。！旦ヌこの図はヒトフィブロネクチンｃＤＮＡのヌクレオチド配列７対の化学合成オリゴマーを製造した。合成オリゴマーはヒトＦＮの最初の　１５３Ｎ＝末端アミノ酸をコードする。この図はこれら　７対の合成オリゴマーの配列を示す。第４３図次のように、ｊＩ４２図に示す７対の化学合成すリボマーから、ヒトＦＮのＮ末端ドメインのアミノ酸１〜１５３をコードするＤＮＡｌＩｌｒ片を組立てた。別々の試験管内でオリゴマー３／４　、　５／６　、　７／８及び９／１０をアニール（ａｎｎｅａｌｌ　ｌ、、次にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して５′末端をリン酸化した。第２ステツプでは、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて対３／４及び５／６を互いに連結させた。同様に、反応対７／８及び９／１０を互いに連結させた。連結の各ステップ後に連結混合物のアリコートをゲルで分析し、新しく形成された断片の大きさと連結の有効性を測定した。第３ステツプでは、２つの上記の連結混合物を混合し、別の試験管で予めアニールし、リン酸化した対６、オリゴマー１１／１２を混合物に加えた。上記連結混合物から得た３２６塩基対のＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、精製した。精製した合成３２６断片を合成リンカ−の２つの他の対すなわち対１（オリゴマー１７２）及び対７（オリゴマー１３／　１４）に加えた。対しではオリゴマー２のみを５′末端でリン酸化し、対７ではオリゴマー１３のみを５′末端でリン酸化した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結した後、混合物は更に精製することなく、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで消化したｐ　Ｂ　Ｒ３２２ベクターＤＮＡに加えた。得られたｐ　Ｆ　Ｎ’　９３２−１８と表わすプラスミドは、ｐＢＲ３２２ベクター内に、ヒトＦＮのＮ−末端１５３アミノ酸をコードする合成Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　（５’末端）　−Ｂ　ａｍＨＩ　（３’末端）制限断片全体を含有していた。＊４４！Ｕ　ＦＮのＮ−末端ｔ５３アミノ酸配列配発現プラスミドｐＦＮ　９３２−１８をＮｄｅＩ及びＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　エンドヌクレアーゼで消化した。ＦＮ（最初の　１５３アミノ酸＋追加のＮ−末端メチオニン）をコードするＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を単離し、プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　３ＱｌをＮｄｅＩ及び８ｇｌｆｆエンドヌクレアーゼで消化して得た大断片に連結した。（プラスミドｐＴＶ３０１（第７図）はラムダＰ、プロモータ及びｃＩＩＲＢｓの制御下でヒト成長ホルモンｈＧＨを発現する）。得られたプラスミドをｐＦＮ９４９−２と表わした。ＥＣ０ＲＩ及びＰｖｕＩ［で消化したｃＤＮＡクローンプラスミドＥ）　９３１〜５（第１ＦｉｌＩ参照）から単離したＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩＦＮ断片の３′ 末端（ＰｖｕＩＩ部位）に、次の配列：を有するＢｇｌＩＩ部位とＴＡＡ終結コドンとを含有する合成オリゴヌクレオチドを連結させた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したＤＮＡベクタープラスミドｐＢＲ３２２（大断片）の存在下で連結を行った。得られたプラスミドをｐＦＮ　９３５−１２と表プラスミドｐＦＮ　９３５−１２をＥｃｏＲＩ及びＨｆｎｃＩＩで消化した。ＦＮをコードするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片を単離し、ＤＮＡすなわちプラスミドｐＴｖ　１９４−８０をＥｃｏＲｌとＳｍａ　Ｉで消化して得た大断片に連結させた。（プラスミドｐＴＶ　ｔ９４−ＨｊｔＡ　ＰＬプロ！−９及Ｕ／３−−ｙり９７−ゼプロモータ及びＲＢＳの制御下でヒトＡｐｏＥを発現する）。得られたプラスミドをｐＦＮ　９４Ｂ−１２と表わした。このプラスミドはＰＢＬＡ配列を欠いており、そのためＦＢＤのカルボキシドメインは発現しない。第ＴＯ及び７１図に、プラスミドｐ５７９（第１６図）かう７７）ｐＴＶ１９４ −８０の構築を示す。次のＤＮＡ配列：＃Ｉ６３’−ＣＴＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴ−５’＃Ｉ８３−　ＣＴＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＴＡＡＣＡ−５’を有する　３対の化学合成オリゴマーを使用してこの構築を行った。各々別の試験管内で、オリゴマー１５／　１６及び１７／　１ｇをアニールし、５′末端をリン酸化し、次に混合して、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用し連結させた。３時間連結させた後、（予めアニールし、５′末端でリン酸基転移した）オリゴマー１９／　２０を加え、更に室温で３時間連結させた。得られた合成りＮＡ断片を使用して、プラスミドｐＦＮ９３２−１８をＥｃｏＲＩ及びＤｄｅＩで消化して得たＥｃｏＲＩ−ＤｄｅＩＦＮコード配列と更に連結させた。ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９（大断片）の存在下で連結を実施した。得られたプラスミドをｐＦＮ　９４８−４　と表わした。第４８図　全ＦＢＤ領域の構築プラスミドｐＦＮ　９４ｇ−４をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。ＦＢＤのＮ末端領域をコードするＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片を単離し、プラスミドｐＦＮ　９４６−１２をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化して（大断片を使用し）ＦＢＤのカルボキシ末端領域に連結させた。得られたプラスミドをｐＦＮ９５７と表わした。プラスミドｐＦＮ９５７をＮｄｅｌ及びＨｉｎｄｌｌ［で消化した。ＦＢＤをコードするＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄｌｌ［断片を単離し、単離精製したＨｉｎｄｌ［Ｉ−ＨｉｎｄｍＴ、Ｔ２：７−ドＤＮＡ断片の存在下で、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄｎ［で消化したプラスミドｐＴＶ３０１の単離したベクター断片に連結させた。得られたプラスミドをｐＦＮ　９６２−　３と表わした。プラスミドｐＢＬＡｌｌ（ＡＴＣＣＮｌｌ　３９７８８）をＥｃｏＲＩ及びＡｌｕｌで消化した。β−ラクタマーゼブロモータ及びβ−ラクタマーゼＲＢＳをコードするＥｃｏＲＩ−ＡｌｕＩ断片を単離し、Ｎｄｅｌで消化し、次に４つの全てのｄＮＴＲの存在下でクレノー酵素で処理してＮｄｅＩ部位を充填し、ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＦＮ　９６２−　３（第４９図）（大断片を使用）に連結させた。得られたプラスミドはｐＦＮ９７５−２５と表わした。（β−メルカプトエタノール（ＭＥ）を用いる）還元条件下でのゲル（１２％アクリルアミド）は精製過程をモニターし、（ＭＥを用いない）非還元条件は再生（「ｅｌｏｌｄｉｎｇ）　／再酸化を示し、より早く移動し、拡散のより少ないバンドを導く。（ＭＥの不在下では）「フェニル−８後」のバンドは「再生」のバンドより鋭く、このことは精製の間でさえも再酸化が続いていることを示していることを特記しよう。再生（ＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ）：　ｐＨ８，０，ＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ　３ｍＭ／　０．３ｍＭの存在下で粗ペレットから抽出した後に、再生／再酸化したｒ　３１ｋＤ　；フェニル−８，フェニル−セファロース：Ｑ−８；Ｑ−セファロース；ｐ３１ｋＤ；（トリプシン消化により得た）血漿由来の３１ｋＤ　、分子量マーカー：分子量９４ｋＤ、　６７ｋＤ、　４３ｋＤ。３０ｋＤ、　２０．ｌｋＤ及び＋４．４ｋＤのマーカーを含む低分子量タンパク質較正キット（Ｐｈａ＋ｍａｃｉ！Ｆｉｎｅ　Ｃｂｓｍｉｅａｌ＋）。ペレット１０グラムから抽出した再生／再酸化し「スクランブルしたＪ　３１ｋＤと不溶性夾雑物質の懸濁液を１３．０００＋ｐｍで遠心した（実施例２４の３、ｌ参照）。上滑（１，２８０ｍ１）を硫酸アンモニウム（ＡＳ）で０．２Ｍとし、０．２Ｍ　Ａｓを含むｐＨ８，５の緩衝液Ａで予め平衡化したフェニル−セファロースの４５ｍ１カラムにロードした。カラムを　１５０ｍ１の同じ溶液で洗った後、緩衝液Ａ　ｌ５０ｍ１．水５０ｍ１及び６Ｍ　Ｇ　ｕ　Ｃ１５０ｍ１で洗った。精製されたｒ　３１ｋＤは緩衝液Ａの両分に表われ、この段階で８５％以上の純度を有していた。２８０ｎｍで吸光度を測定した。フェニル−セファロ−スステップからの緩衝液Ａのピーク（第５２図参照）の約１／２を、Ｉｈ＋１のヘパリンーセファ口−スカラムで濃縮及び精製し、緩衝液Ａ中の［１，５Ｍ　ＮａＣ１溶液で溶出した。この段階のｒ　３１ｋＤの純度は９０％以上である。　２８０ａｍで吸光度を測定した。緩衝液Ａ　（ｐＨ８，５）に対して透析した濃縮ｒ　３１ｋＤ　（第５３図）を、同じ緩衝液で予め平衡化した４　０　ｍｌのＱ−セファロースカラムにロードした。流出及び洗浄画分に溶出した精製されたｒ３１ｋＤを凍結乾燥で濃縮した。カラムを　１ＭＮａｃｌで洗い、混在するタンパク質を完全に除去した。この段階での精製ｒ　３１ｋＤの純度は９５％以上である。２８ＧＩ１ｍで吸光度を測定した。ランニングバッファ（２０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　ＨＣＪ　−１５０ｍＭＮａＣ１ｐＨ７，８）中の血漿由来及び組換え３１ｋ［ｌの混合物（０，８ｗ／ｍｌで１００μｌ）を、ランニングバッファで予め平衡化したセファロース１２カラム（ＨＲＩＧ／３０）にかけ、同じバッファで溶出した。流速０４ｍ１Ｚ分；チャート速度０．２５μｍ／分；吸収単位フルスケール０．［、検出波長２８０ｎｍ　；操作時間６０分間。別々に操作したときの、血漿由来及び組換え３１ｋＤの両者の保持時間は混合物について得られたものと同じであった。第５６図　ラットにおけるｐ３１ｋＤの薬動力学図は、時間の関数としての、ラット血清中での血漿由来３１ｋＤの薬動力学を示している。ラットに体重１ｋｇ当り　０．５■のｐ３１ｋＤを静脈注射した。２０μｌのクエン酸塩添加した全血、０．１５μＭ＋２５■　−ｒ−ＦＢＤ　（ｒ３１ｋＤ）　（５，６ｘｌｆ１５ｃｐｓ　／μｇ）を使用して、実施例２６に記載のように反応Ｉを実施した。使用して、非標識フィブリンクロットの形成により反応■を開始した。最初のインキュベートの後、既存の反応管（「血清」）又はフィブリンペレットに０．１５μＭの　Ｉ−ｒ−ＦＢＤを加えた後、遠心し、ＰＢＳに再懸濁させた（ｒＰＢｓＪ）。Ｃａ　Ｃｉ　２及びヒルジンを加えるときの各々の濃度は５１ｎＭ及び３Ｕ／ｍｌであった。その後、実施例２６に記載のように反応■を続げた。第５８図　プラスミンによるフィブリンクロットからの１００μｌのクエン酸塩添加全血及び０．３μＭ１２５■−Ｐ−Ｆ　Ｂ　Ｄ　（５，Ｑｘ　ｔｏ’　ｃｐｃ　／μｇ）を含有するいくつかの試験管を使用して反応Ｉを実施した。インキュベーションの最後に、ペレットを遠心により集め、次に、１μ／ｍｌのプラスミン（豚血液由来、５１ｇｎ５）を含有するＰＢＳ溶液に再懸濁させ、さらに指示した時間の間隔で３３℃でインキュベートした。冷却し、直ちに遠心して反応を終了させた。上清及びペレット中の放射活性をガンマカウンターで計測した。ペレットと上溝をゲル電気泳動サンプルバッファ（最終濃度：グリセロール３％、ＢＭＥ　２％、ＳＤ８　１％、ブロモフェノールブルー０．２％）に再懸濁させ、Ｌ５分間沸騰させ、１０％ＰＡＧＥ−３ＤＳ中で電気泳動した。次に、ゲルをＸ線フィルム上でオートラジオグラフィーにかけた。ペレットからは放射活性は検出されなかった。上溝の放射活性は、プラスミンと共にインキュベートした対照　Ｉ−ＦＢＤに対応する位置で検出された（結果は示していない）。第５９図反応■の条件（実施例２６参照）を使用して、０．１５μＭｌ−ｒ−Ｆ　ＢＤ　（１２５１−ｒ３１ｋＤ；　５．６Ｘ１０５ｃｐｍ　／ｉｔ　ｇ）を２０μ！クエン酸塩添加全血に結合させた。競合剤（Ｃ）なしで、或いは種々の濃度の非標識「折りたたみ（ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質」、「還元Ｊ　ＦＢＤ及び関連分子の存在下で反応を実施した。ｒＩ＝ｒ完全に還元したＪ　ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤｒｌＩ＝ｒ還元し、カルボキシアミド化した」ｒ　３１ｋＤ　Ｆ　Ｂ　Ｄｐ　＝血漿由来フィブロネクチンをトリプシンで切断した３１ｋＤ　Ｆ　Ｂ　Ｄ２０μｌのクエン酸塩添加全血を用い、実施例２Ｇで反応■について記載した条件を使用して非標識フィブリンクロットを形成した。最初のインキュベージジン期間の終り、ｒ−ｒ−ＦＢＤ（０，１５μＭ　；　２．９ｘｌＯ’　ｃｐｍ　／μｇ）添加前に、指示した濃度のスペルミジン、プトレシン及びＦＢＤ−ｒＲＪ　（ｒ還元−カルボキシアミド化」血漿由来ＦＢＤ）を特定の反応物に加えた。２０μｌのクエン酸塩添加全血を用い、実施例２６で反応Ｈについて記載した条件を使用して非標識フィブリンクロットを形成させた。最初のインキュベーション期間の終りに、サンプルの半分を遠心し、フィブリンペレットを、５ｍＭ　ＣａＣｌ２含有ＰＢＳ溶液（反応「Ｃ」）又は５ｍＭ　Ｃａ　Ｃｉ　２及び　３００μｇ／ｍ１ＦＮ含有ＰＢＳ　（反応「Ｄ」）に再懸濁させた。ｒＡＪと表わすサンプルには添加も変更も行わなかった。ｒＢＪと表わすサンプルには３００μｇ　／　ｍｌのＦＮを加えた。次に、反応混合物を３７ ℃で（図中に示すように）１時間、　４時間又は２４時間インキュベートした。次に、　１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤ　（最終濃度０．１５μＭ、５．４　ｘ１０５ｃｐｍ　／ｌｔ　ｇ）を加え、更に３０分間インキュベートした。実施例２６に記載したように反応を終了させた。（反応工及び■）・結合に対する血栓熟成時間の作用２０μｌのクエン酸塩非添加の新鮮なヒト全血アリコートを０、１５μＭ　１２５ｒ　−ｒ　３１ｋＤと共に又は単独で（各々、反応工及びＩＩ）、３７℃で、非シリコン化試験管内でインキュベートした。指示した時間の間隔で、反応を終了させ（反応Ｉ）又は０．１５．ｃ＋Ｍ　１２５Ｔ　−ｒ３１ｋ［ｌ（２，９ｘｌＯ’　ｃｐｌａ／ａ　ｇ）を加え、更に２時間の後にインキュベートを終了した（反応ＩＩ）。クエン酸塩添加していないヒト全血の２０μ！アリコートを、０．１５μＭ１２５Ｉ　−ｒ３１ｋＤ（２，９Ｘ１０’ｅｐｍ　／　ａ　ｇ）のみと（対照）、又はそれに加えて豚の肝臓のトランスグルタミナーゼ（「対照＋Ｔ、Ｇ、Ｊ、０．２単位７ｍｌ；　５１ｇ１ｓ）と共にインキュベートした。試験管のいくつかは図中に示すように「還元」　（カルボキシアミド化した）ｐ３１ｋＤを含有していた。結合反応に外因性トランスグルタミナーゼを加えると結合値が２倍以上増加した。反応物に「還元−カルボキシアミド化」ｒ　３１ｋＤを加えると、外因性１［Ｉａ因子と同様の程度の阻害作用（０，３μＭと　３．０μＭでは各々５３％と７１％の阻害率）が観察され、このことは、両方の型のトランスグルタミナーゼに対し還元ＦＢＤは同じ阻害作用を持つことを示していた。東６４図　ＥＣＭへのＦＢＤの結合培養内皮細胞の細胞外マトリックスｒＥｃＭＪを使用し、実施例１８に示すような血管損傷モデルでＦＢＤの生物学的活性を研究した。ＰＢＳで　３回洗った３３ｍのＥＣＭプレートを、Ｃｏ２インキュベータ中、３７℃で、２．５ｍＭＣａＣｆ　、トａンビ：／１μ／ａ＋１及び指示シタ濃度（７）　Ｉ−Ｐ−ＦＢＤ　（約４．４Ｘ　１１０５ｃｐ　／μｇ）を含有するＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８０，５ｍｌと共にインキュベートした。図に示すように、トロンビンの不在下で、対応のプレートをインキュベートした。４５分間インキュベートした後、プレートを　１ｎｌＰＢｓで３回洗い、０．１％５ＤＳ−ＰＢＳ溶液０．５ｍｌで抽出し、ガンマカウンターで放射活性を測定した。図中に示す値は２枚のプレートの平均を表わしている。３５５５６）及び図中に示す濃度の　Ｉ　−Ｆ　Ｎ　（４Ｘ　１０’　ＣＰｌａ　／ｌｔ　ｇ）又は　ｌ−Ｆ　ＢＤ　（１，３ｘｌＱ’　ｅｐｍ　／ｌｔ　ｇ　；　ｒ３１ｋＤ　Ｆ　ＢＤ、「再酸化−再生」）を用いて溶液中で、方法に記載したように結合反応を実施した。記載した標識分子の濃度はＦＮ及びｒ３１ｋＤについて各々　２２０．０００及び３１．ＯＱＯダルトンの分子量を使用して計算する。示した濃度の次の非標識タンパク質：　ｐ−ＦＢＤ　（ｐ３１ｋＤ）　。ｒ−ＦＢＤ　（ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤ　ｒ再酸化−再生Ｊ）、ｒ−ＦＢＤ−Ｒ（ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤ　ｒ還元、カルボキシアミド化」）、及びｒ−ＣＢＤ　（ＦＮのｒ−３３ｋＤ細胞結合ドメイン）の存在下で、１．２５μｇの　Ｉ　−ｐ　３１ｋＤ（２，３Ｘ　１１０５ｅｐ　／μｇ）を溶液中での部分に示すように結合反応を実施した。第６７図　Ｓ、ｘａｒｅａｓの固定化ＦＮへの結合方法に記載したように、ヒト血漿ＦＮ、　ｒ−ＦＢＤ　（ｒ３１ｋＤＦＢＤ　ｒ再酸化−再生Ｊ　）　、　Ｐ −ＦＢＤ　（ｐ３１ｋＤ）又はＢＳＡ（牛血清アルブミン、　Ｓｉｇｍｚｌの存在下で、プラスチックバイアルに固定化したＦＮに７．５ＸＩＯ８Ｐ　ＦＵ／ｍｌの　３Ｈ−ロイシン−３，ａｕ＋＋ｕ＋　（５，８ｃｐｍ　／１０５Ｐ　Ｆ　Ｕ）を結合させた。競合剤（加えた細菌の　９．３％）の不在下での「対照」反応の結合がＩＨ％となるように標準化した。第６８図　Ｓ、ａｕｔｅｕ＋のカテーテルへの結合方法に記載したように、ＦＮで被覆した「［ＩｎｏＪ気管支プラスチックカテーテル（各反応に３ＣｆＩＩずつ、デューブリケ−３Ｐ　Ｆ　Ｕ）を結合させた。競合反応を実施したときには、方法に記載のように、細菌と添加タンパク質とを室温で３０分間インキュベートし、カテーテルに加え、更にインキュベートした。競合反応に使用したタンパク質は次の通りであった：Ｐ−３１（ｐ３１ｋＤ）　、ｒ−２０（組換え体由来の２０ｋＤ　ＦＢＤ）及びｒ−３１（再酸化し、再生したｒ　３１ｋＤ）。反応のいくつか（図参照）は５μｍのヘパリン（豚の小腸粘膜からのもの、分子量１０．０００　。Ｓｉｇｍａ）の存在下で測定した。競合剤（加えた細菌の８．８％）の不在下での「対照」反応の結合を１００％と標準化した。第６９図　ウサギ大動脈病変モデルでのり　３１ｋＤの付着図は、バルーンカテーテル挿入したウサギからの連続的に分割した大動脈切片での放射活性分布を示す。　■−標識フィブロネクチン（Ｆ　Ｎ）又は血漿由来の３１ｋｌｌ　ＦＢＤ　（３１ｋＤ）を注射した７２時間後に測定した。１７０１１！Ｕ　ｐＴＶ−１７０の構築Ｎｄｅ　Ｉ−Ｎｄｅ　ＩＡｐｏＥ断片をプラスミドｐＡｐｏＥ−ＥＸ２（ＡＴＣＣ受託番号Ｎａ３９７８７）から単離し、Ｎ　ｄ、　ｅ　Ｉで消化した発現ベクターｐ５７９（第１６図）の独自ＮｄｅＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　−１７０はＮ−末端にメチオニン残基を加えた天然のヒトＡｐｏＥタンパク質の類似体を発現する。第７１図　ｐＴＶ　−１９４−８０ｃ７）構築ＥｃｏＲＩ及びＡｌｕＩで消化した後にプラスミドｐＢＬＡ１１（ＡＴＣＣ受託番号磁３９７８ｇ）からβ−ラクタマーゼプロモータ及びリポソーム結合部位断片を単離した。ＮｄｅＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）で充填し、モしてＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＴＶ−１７０（第７０図）プラスミドの大断片にこの断片を連結させた。発明の詳細な説明プラスミドｐＦＮ　１２６−３　、ｐＦＮ　１３２−５　、ｐＦＮ　９７５−２５、ｐ　Ｆ　Ｎ　９４９−２及びｐＦＮ１３７２は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の要件に従い、又、これを満たして、Ａｍｅｒｉｗｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、　１２３０１　Ｐｘ＋ｋｌｘｔｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｉ＋ｌｌｅ、　１ＪａｒＹｌａｎｄ　２０８５２に各々ＡＴＣＣ受託番号磁６７８２９．　６７８３Ｇ、、　６７８３２．　６７８３１及び６７９１Ｇとして寄託されている。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドを提供する。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　ＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメレントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドも提供する。さらに、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリ結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含むプラスミドを提供する。本出願人はフィブリン結合ドメインポリペプチド類似体の３つの例を提供している。これらにはｐ　３１ｋＤ、ｒ　３１ｋＤ及びｒ　２０ｋＤポリペプチドがある。これらのポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンの部分の結合及び付着特性を示す。本出願の請求の範囲はこれら３つのＦＢＤアナログに限定されることを意図しているのではなく、これら　３つのＦＢＤアナログは単に好ましい実施態様の例である。また、本出願人はｒ　３１ｋＤフィブリン結合ドメインポリベブチドという用語を、次のような実施例２４で定義しているタンパク質の　３つの形を包含するように使用している゛（り　洗浄ペレットから、６Ｍ　ＧｕＣＩｌに溶解した後に得られる、すなわち「スクランブル」形のタンパク質：［ｂ）　６Ｍ　ＧｕＣｌの存在下でＧＳＨのような還元剤で処理した後に存在する完全に還元されたタンパク質：（ｅ）　実施例２４に記載のようにＧＳＨ／Ｇ５５Ｇで処理して得た再酸化−再生タンパク質。「スクランブルＪｒ３１ｋＤポリペプチドは、　１つ以上の誤ったジスルフィド結合が形成されたために明らかに不適正に折りたたまれているｒ　３１ｋＤタンパク質である。本発明の現在の所好ましい実施態様では、ポリペプチドは、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約７５ｋＤポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約４０ｋＤポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約３３ｋＤポリペプチド断片：ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約３１ｋＤのポリペプチド断片；又はヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約２ＱｋＤポリペプチド断片である。さらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、アミノ酸１１０２〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋＤポリペプチド断片二アミノ酸１３８０〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの４０ｋ［ｌポリペプチド断片；アミノ酸１３２９〜１７２２を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの３３ｋＤポリペプチド断片；アミノ酸１〜２６２を含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤポリペプチド断片；又はアミノ酸１〜１５３個とＬ３個の付加アミノ酸とを含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤポリペプチドである。天然ヒトフィブロネクチンは人体（血漿中）で生じるようなものである。本明細書では、実賞的部分とは少なくとも　１／４である。天然のヒトフィブロネクチンの生物学的活性を有するポリペプチドは、このような活性をアッセイ又は測定すると、天然のヒトフィブロネクチンと同様の結合又は付着特性を示す。細胞結合ドメインのような天然のヒトフィブロネクチンの領域の　１つの生物学的活性を有するポリペプチドは、このような活性をアッセイ又は測定すると、天然のヒトフィブロネクチンの領域と同様の結合又は付着特性を示す。本発明では、種々の機能性ドメインのヌクレオチド配列は制限酵素による開裂で決定しており、フィブロネクチンのタンパク質分解消化で規定したようなヌクレオチド配列には対応しない。本発明のプラスミドは更に、プロモータ及びオペレータ例えばλＰＯ，リポソーム結合部位例えばＣ■及びレプレッサＬのような、適当な宿主細胞内でポリペプチドを発現させるための、ポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントを含んでいる。他の適当な調節エレメントに一夕がある（１９８９年２月２２日発行の欧州特許出願Ｎａ　Ｑ３０３９７２）。適当な調節エレメントは、適当な細菌宿主細胞内でポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置される。本発明の好ましい実施態様では、調節エレメントはポリペプチドをコードするＤＮＡの近く且つ上流に配置する。本発明は、第１０図に示す制限地図を有し、ＡＴＣＣ受託番号淘６７８２９として大腸菌株Ａ　１６４５中で寄託しである、ｐＦＮ１２６−３と表わされるプラスミドを提供する。プラスミドｐＦＮ１２６−３はアミノ酸１１０２〜１８５１を含み、アミノ酸１６００〜１６８９を欠くヒトフィブロネクチン細胞結合ドメインの７５ｋＤポリペプチド断片をコードする。又、第１２図に示す制限地図を有し、ＡＴＣＣ受託番号魚６７８３Ｇとして大腸菌Ａ４２５５（Ｆ＋）中で寄託されているｐＦＮ１３２−５と表わされるプラスミドも提供する。プラスミドｐＦＮ１３２−５は、アミノ酸１３８０〜１８５１を含み、アミノ酸１６００〜１６８９を欠くヒトフィブロネクチン細胞結合ドメインの４０ｋＤポリペプチド断片をコードする。本発明は、第２３図に示す制限地図を有し、ＡＴＣＣ受託番号ｌｈ　６７９１０として大腸菌株Ａ　４２５５中で寄託されているｐＦＮ１３７−２と表わされるプラスミドを提供する。プラスミドｐＦＮ　１３７−２は、アミノ酸１３２９〜１７２２を含み、アミノ酸１６００〜１６８９を欠くヒトフィブロネクチン細胞結合ドメインの３３ｋＤポリペプチド断片をコードする。本発明はｐ　Ｆ　Ｎ　９７５−２５と表わされ、ＡＴＣＣ受託番号丸６７８３２として寄託されているプラスミドも提供する。プラスミドｐＦＮ　９７５−２５はアミノ酸１〜２６２からなるヒトフィブロネクチンフィブリン結合ドメインの３１ｋＤポリペプチド断片をコードする。更に、ｐＦＮ９４２−２と表わされ、ＡＴＣＣ受託番号魔６７８３１　として大腸菌株Ａ　１６４５中で寄託されているプラスミドも提供される。プラスミドｐＦＮ９４９−２はアミノ酸ｌ〜１５３及び１３個の追加アミノ酸を含むヒトフィブロネクチンフィブリン結合ドメインの２０ｋＤポリペプチド断片をコードする。本発明のプラスミドは適当な細胞宿主細胞、好ましくは大腸菌に導入することができる。適当な大腸菌細胞の例には、株Ａ４２５５（Ｆ＋）（ＡＴＣＣ受託番号魔６７１１３０１　、株Ａ　１６４５（ＡＴＣＣ受託番号Ｎａ　６７１１２９）及び株Ａ４２５５　（ＡＴ　ＣＣ受託番号ＮｃＬ６７９１０〕があるが、他の大腸菌株及び他の細菌もプラスミドの宿主細胞として使用できる。このような細菌にはＰ＋ｅｕｄｏｍｏｎａ＋　ｘｅｒｕｇｉｎｏ＋ａ及びＢａｅｉｌｌｕ＋　＋ｕｂｔｉｌｉ＋がある。宿主として使用する細菌は、（Ａ　１６４５のような）栄養要求株、（Ａ　４２５５のような）原栄養株及び溶菌味；Ｆ　及びＦ−株；（Ａ［６４５及びＡ　４２５５のような）プロファージのｃｌ　レプレ伝子が欠損している株（＋９８９年２月２２日発行の欧州特許出願魔０３０３９７２参照）を含むいずれの株でもよい。大腸菌株Ａ　４２５５（Ｆ　）は各々ＡＴＣＣ受託番号漱６７８３０及び６７９１１１としてプラスミドｐＦＮ１３２−５及び１）ＦＮ　１３７−２を含有して寄託されている。大腸菌株Ａ　ｌ６４５はＡＴＣＣ受託番号＆　６７ｇ２９としてプラスミドｐＦＮ１２６３を含んで寄託されている。現在の所好ましい実施態様では、本発明はｐＦＮ　１２６−３と表わされるプラスミドを含有する大腸菌細胞を提供し、この細胞はＡＴＣＣ受託番号Ｎｃｔ　６７８２９として寄託されている。又、ｐＦＮ　１３２−５と表わされるプラスミドを含有する大腸菌細胞も提供され、この細胞はＡＴＣＣ受託番号Ｎ１１６７１１３０として寄託されている。さらに好ましい実施態様で、本発明はｐＦＮ１３７−２と表わされるプラスミドを含有している大腸菌細胞を提供し、この細胞はＡＴＣＣ受託番号Ｎａ　６７９１０として寄託されている。又、ｐ　Ｆ　Ｎ　９７５−２５と表わされるプラスミドを含有する大腸菌細胞も提供され、この細胞はＡＴＣＣ受託番号＆　６７ｇ３２として寄託されている。本発明はｐＦＮ９４９−２と表わされるプラスミドを含有する大腸菌細胞を提供し、この細胞はＡＴＣＣ受託番号Ｎα６７８３１として寄託されている。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法は、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡからなるプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞から回収することからなる。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法は、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡからなるプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞から回収することからなる。更に、本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法は、ＤＮＡがポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードするＤＮＡからなるプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞から回収することからなる。好ましくは、このように製造されたポリペプチドは細胞結合ドメインの７５ｋ［）、４０ｋＤもしくは３３ｋ［ｌポリペプチド、又はフィブリン結合ドメインの３１ｋＤもしくは２０ｋＤポリペプチドである。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチドを提供する。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない純粋なポリペプチドも提供する。さらに、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク賀分解消化産物に対応しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチドを提供する。好ましくは、精製ポリペプチドは、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１１０２〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８ｇを欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンバり質分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない７５ｋＤポリペプチドである。もう　１つの好ましい精製ポリペプチドは、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１３８０〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない４ＧｋＤポリペプチドである。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１３２９〜１７２２を含み、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない３３ｋＤの精製ポリペプチドも提供する。又、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの精製ＨｋＤポリペプチド、及び、天然のヒトフィブロネクチンのタンノくり質分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの精製２０ｋＤポリペプチドが提供される。本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない細菌産生ポリペプチドも提供する。好ましいドメインは天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びフィブリン結合ドメインである。好ましいポリペプチドには次のものがある：天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１１０２〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物対応しない細菌産生７５ｋＤポリペプチド；天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１３８０〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない細菌産生４０ｋＤポリペプチド；天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１３２９〜１７２２を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない細菌産生３３ｋＤのポリペプチド；天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの細菌産生３１ｋ［ｌポリペプチド：天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの細菌産生２０ｋＤポリペプチド。本発明は、ヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの　１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドを提供する。ドメインは好ましくは細胞結合ドメイン又はフィブリン結合ドメインである。好ましくは、ポリペプチドは、アミノ酸１１０２〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠＜　７５ｋＤポリペプチド：アミノ酸１３８０〜１８５１を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠＜　４０ｋＤポリペプチド；アミノ酸１３２９〜１７２２を含むが、アミノ酸１６００〜１６８９を欠＜　３３ｋＤポリペプチド：アミノ酸１〜２６２を含む３１ｋＤポリペプチド；又はアミノ酸１〜１５３と１３個の付加のアミノ酸を含む２０ｋＤポリペプチドである。本発明は、上記開示のポリペプチドの少なくとも　２つと適当な担体を含む組成物を提供する。このような組成物中のポリペプチドは互いに結合していてもよい。本出願中では、「結合」とは共有的、非共有的に結合した、又は連結したポリペプチドを含んでいる。ポリペプチドは、本発明の属する業界で標準的に使用され、よく知られているアミノ酸又はポリペプチドリンカ−を含む他の化学部分を介して連結されていてよい。又、少なくとも　２つの上記開示ポリペプチドから本質的になるハイブリッドポリペプチドも提供する。本発明は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量の少なくとも　２つのポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物及び血小板凝集反応を阻害するのに有効な量の）＼イブリッドポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物も提供する。更に、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物及び血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物が提供される。本発明は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを適当な条件下で血小板と接触させることからなる血小板凝集反応阻害法：及び血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを適当な条件下で血小板と接触させることからなる血小板からのトロンボキサン放出阻害法も提供する。し、この方法は血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを対象に投与することからなる。治療できる心血管疾患の例には、急性心筋梗塞又はアンギナが含まれる。血管形成法（ｒＢｉｏｐｌｘ＋＋７）又は冠動脈バイパス手術を受けた対象又は血栓溶解療法を受けた対象も、血小板凝集反応を阻止するために本発明ポリペプチドで治療することができる。本発明は創傷を有する対象の治療法も提供し、この方法は創傷の治癒を促進するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを対象に投与することからなる。創傷は切開、皮膚の失火、皮膚移植又は火傷のような皮膚の創傷でありうる。創傷は又、角膜上皮の創傷もしくは角膜固有質の創傷のような眼球の創傷又は鍵の創傷でもありうる。本発明は又、細菌感染に感染しやすい又は感染した対象の治療法も提供し、その方法は、細菌感染を予防又は治療するのに有効な量のいずれかの開示ポリペプチドを対象に投与することからなる。このような細菌感染は対象の体内にカテーテル又はインブラントが存在するために起るものでありうる。本発明は又、腫瘍の転移を遅延させるのに有効な量のいずれかの開示ポリペプチドを対象に投与することからなる癌を有する対象の治療法、及び腫瘍検出に有効な量のいずれかの開示ポリペプチドを対象に投与することからなる対象での腫瘍の検出法を提供する。本発明ポリペプチドは血栓を検出するのに有効な量のポリペプチドを対象に投与することからなる対象での血栓を検出する方法も提供しつる。これらの腫瘍及び血栓の各検出法では、ポリペプチドを腫瘍又は血栓を検出する診断薬として使用する。このような検出の分野では多くの方法が公知であり、例えば放射性標識（アイソトープの核医学的使用）、放射線不透過標識（例えばＣＡＴスキャン）、及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）がある。これらの標識法のいずれも腫瘍又は血栓の検出用の本発明方法に使用できる。本発明は血栓溶解剤に結合したいずれかの開示ポリペプチドも提供する。血栓溶解剤は組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニフィル化（Ａｎｉｓｏ７１ａｔｅｄ）プラスミノーゲンーストレプトキナーゼアクチベータ複合体［Ｅｌｉｎａ＋ｅＴＭ）又はＴＰＡ類似体からなる群から選択される。本発明は、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、　α−ＴＧＦ、　β−ＴＧＦ。ＦＤＧＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）、ＧＭ−Ｃ３Ｆ。Ｇ−Ｃ３Ｆ又はＣ３Ｆ−Ｉのような成長因子と結合したいずれかの開示ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは血清アルブミン、第■因子もしくは第Ｘ■因子のような血液因子、ポリエチレングリコール、又はスーパーオキシドジスムターゼにも結合しつる。本発明は医療器具と医療器具表面に被覆として塗られた天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのポリペプチドからなる被覆医療器具を提供する。被覆しつる医療器具の例には、カテーテル、医療用インブラント（例えば腰部代替物（ｈｉｐ　＋ｅｐｌｔｃｅｍｅｎｔ）及び補綴物）、チューブ及びシリンジがある。本発明は医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法を提供し、その方法は、（ａ）　器具表面の被覆としてフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのポリペプチドを塗り；そして（ｂ）　非被覆器具よりむしろ得られた被覆器具を使用することからなる。本出願人の発明はフィブリン結合ドメインのトリプシン分解断片の使用も提供する。このようなトリプシン分解断片は血漿由来のフィブロネクチンをタンパク質分解消化することにより得られる。このようなトリプシン分解断片は血小板凝集反応阻害法に使用でき、この方法は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のポリペプチドを適当な条件下で血小板と接触させることからなり、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。又、血小板からのトロンボキサンの放出を阻害するのに有効な量のポリペプチドを適当な条件下で血小板に接触させることからなる血小板からのトロンボキサン放出の阻害法を提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。又、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のポリペプチドを対象に投与することからなる脳血管疾患を有する対象の治療法も提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの実質的部分を含む。フィブリン結合ドメインのポリペプチドは心血管疾患を有する対象の治療にも使用でき、治療法は血小板凝集反応阻害に有効な量を対象に投与することからなり、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。心血管疾患には心筋梗塞又はアンギナが挙げられる。血管形成法又は冠動脈バイパス手術を受けた対象又は血栓溶解治療を受けた対象も血漿由来のフィブリン結合ドメインポリペプチドで治療することができる。本発明は、創傷の治癒を促進するのに有効な量のフィブリン結合ドメインポリペプチドを対象に投与することからなる創傷を有する対象の治療法も提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。創傷は切開、皮膚の失火、皮膚移植又は火傷のような皮膚の創傷であってよい。創傷は又、角膜上皮の創傷もしくは角膜固有質の創傷のような眼球の創傷又は朧の創傷であってもよい。本発明は細菌感染を予防又は治療するのに有効な量のポリペプチドを対象に投与することからなる細菌感染しやすい又はした対象の治療法も提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。細菌感染は対象の体内にカテーテル又はインブラントが存在することによるものでありうる。更に、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量のフィブリン結合ドメインポリペプチドを対象に投与することからなる癌を有する対象の治療法を提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。本発明は腫瘍を検出するのに有効な量のＦＢＤポリペプチドを対象に投与することからなる対象での腫瘍の検出法を提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。血栓を検出するのに有効な量のこのようなポリペプチドを対象に投与することからなる対象での血栓検出法も提供され、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸の実質的部分を含む。Ｋ１」マツプ位置に対する全ての参照は、第４１図に示したヒトフィブロネクチンｅＤＮ＾のヌクレオチド配列に沿って等しく番号付けされた位置に対応する（１９８７年１月７日公開のＢａｒａ　ＩＩｅ、Ｆ、Ｅ、の欧州特許公開第２０７，７５１号の第３図も参照されたい）。本出願人らがクローニングし発現させたｃＤＮ＾ＤＮＡ、Ｂａｒａｌｌｅマツプにおいてヌクレオチド４８１１から５０８０までにわたる２７０ｂｐのエキストラドメイン（ｅｘｔｒａ　ｄｏｍａｉｎ）（ＥＤ）が欠失している。従ってＢａｒａｌｌｅマツプにおいてヌクレオチド３３１７から５５６６までにわたるとされているｅＤＮ＾ＤＮＡ、上記２７０個のヌクレオチドのＥＤ断片、即ちヌクレオチド４８１１から５０８０までが欠失しているので、１９８０個のヌクレオチドしか含んでいない、この領域は当業者にはＥＤ−＾領域としても公知である。同様に、上記ＤＮＡ断片によって発現されるタンパク質は、Ｂａｒａｌｌｅマツプにおけるアミノ酸１１０２からアミノ酸１８５１までをコードするだろうが、ＥＤ領領域よってコードされる９０個のアミノ酸、即ちアミノ酸１６００〜１６８９は欠失しているだろうから、このタンパク質は６６０個のアミノ酸のみを含むだろう。このことは、ＥＤ領領域またがる本明細書に記載の全ての断片に対して当てはまる（当業者にはＥＤ−Ｂ領域として公知の領域はＢａｒａｌｌｅの配列及び本出願人らのｃＤＮＤＮＡにおいて欠失している）。本出願人らは、ＥｃｏＲｌリンカ−を使用してクローニング過程の間に、位置３３１７に示したＥｃｏＲｌ切断部位を構築した。位置３３１３から３３１８にあるこの配列Ｇ＾＾ＴＴＣは、対応するＢａｒａ１１ｅ配列にＡＴＴＣとヌクレオチドが１つ異なっている。即ち、ヌクレオチド３３１５において単一のヌクレオチドＣがＡに変更されている。このことから対応するアミノ酸はＴｈｒから＾ｓｎへと変更される。Ｋ凰■ユフィプロネ　ンｅＤＮ＾−イブ−１−の公開方法（１３，１４＞に従ってヒト肝臓から単離したポリ＾＋ｍＲＮ＾からｊｔｌｌにおいてｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを作製した。ＥｃｏＲｌリンカ−を使用してｅＤＮ＾ＤＮＡ断片−ニングし、ｅＤＮ＾ＤＮＡラリーをフィブロネクチン（ＦＭ）陽性プラスミドに対して以下の合成りＮＡプローブを使用してスクリーニングした。ムドメイン（ＣＢＤ）に　する１０−ブブローブ　ヌクレオチド（３′）ＣＡＣＴＣＴＡＴ＾＾ＴＧＴＣＣＴＡＧＴＧ＾＾ＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣ（４３５５−（３′）八Ｇ＾＾ＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＧ＾＾ＣＴ＾＾Ｇ　（３９６７−（３′）ＣＣＧＧＴＴＧＴＴＡＧＴＴにＴＣ＾Δ＾ＧＡＣＴＡＣ＾＾ＧＧＣＴＣＣＣＴｆ；ｆｌ：ＡＣＣ（４２ＱＯ −Ｎ　ドメインに　るプローブ（３’）ＧＧＩ；ＧＧＴＣＧＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧｆｌ：ＴＧＡＣＡＣＡにＴｌ；ＴＣＴＴ＾＾　（８１７−８５０）（３′）　ＣＧ　ＡＣＧＧＧＴｆ；ＣＴＣＣＴＴＴＡ（：ＡＣＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡ　ＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣフィブリン、コラーゲン、ヘパリン及び細胞結合ドメインの全領域をカバーする一連のＦＮ　ｃＤＮ＾ＤＮＡンを同定及び単離した（第１図）。ｃＤＮ＾ＤＮＡ断片Ｒ３２２のＥｅｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＦＮのｍＲＨ＾は択一的にスプライシングされており、従って種々の長さのｃＤＮ＾が文献において報告されている。本出願人らのｃＤＮ＾は、ＦＮ物理マツプ（完全な非スプライシングｃＤＮ＾）において塩基４８１１から塩基５０８０までの２７０塩基対が欠失している。ｍλ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおける［１’Ｂ［ｌのＦＮの７５ｋＤ及び４０ｋＤ細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）タンパク質の発現を得るために、穐々の部分ｃＤＮ＾ＤＮＡンを、実施例１に記載した種々のＦＮ　ｃＤＮ＾ＤＮＡンから誘導したＤＮＡ断片から構築した。＾、ＣＯＤの５′　の　ブクローニング配列５′　丁＾ＴにＧＡＴＣ＾＾ＴＴＣ３’八ＣＣＴＡＣＴＴ八八（、ＴＴ八へへ有する合成オリゴマーをｃＤＮ＾クローンｐＦＮ９１９由来のＥｃｏＲＩ　− Ｂａｓａｌ断片（塩基３３１７〜４１５１）に連結してＮｄｅ　１部位を生成した。この連結断片をＮｄｅＩ−Ｂａｍ旧消化したｐＢＲ３２２中に挿入した（第２図）。得られたプラスミドをｐＦＮｌｏｏと命名した。プラスミドクローニングは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１中で実施した。配列丁＾ＴににＡＴＣＡＧＡＧＣＴ八ＣＣＴＡＧＴＣをへする合成オリゴマーをｃＤＮＡクローンｐＦＮ９１９由来のＳｓｔＩ−Ｂａｍ［断片（塩基３６１１〜４０９０）に連結してＮｄｅ　［部位を生成した。この連結断片をＮｄｅｒ−ＢａｎＨｒ消化したｐＢＲ３２２に挿入した（第３図）。得られたプラスミドをｐＦＮｌｏｌと命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。終結コドンと旧ｎｄｍ及び５ａｉｌ制限部位を含む合成オリゴマーをｃＤＮ＾クローンｐＦＮ９１６由来のＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片（塩基４１５１〜５５６６）の３′末端に連結した。この連結断片をＥｃｏＲｌ　−５ａｌ　Ｔ消化したｐＢＲ３２２プラスミド中に挿入した（第４図）。得られたプラスミドをｐＦＮ１０２と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＮＣ１０６１中に維持した。この合成オリゴマーは配列：５’　ＧＡＴＣＴＴ＾八ＣＣＴＴＧへ　３’＾＾ＴＴＣＧ＾＾ＣＡＧＣＴ５′末端に（開始コドン＾ＴＧを含む）Ｎｄｅ　Ｉ部位を有し且つ３′末端に（終結コドンを含む）旧ｎｄｌｌＩを有するＣＢＤ全部のサブクローンを得るために、プラスミドｐＦＮ１０２をＥｃｏＲＩ及びＨｌｎｄ（［１酵素で消化し、ＣＢＤの３′末端ＥｃｏＲＩ　−ＨｉｎｄｎＩを単離し、Ｂａｗｌ　Ｉ及び旧ｎｄ［で消化したプラスミド、ＦＮＩＯＱに連結したく第５図）。この連結は、第１５図に示した配列を有するＢａｗｌ（Ｉ−ＥｃｏＲＩ合成断片の存在下に実施した。得られたプラスミドをｐＦＮ１０３と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。Ｕ株ＭＣ１０６１中に維持した。Ｄ−劇とＩ（α見１Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏ旨におけるＣａｎ全体の発現を得るために、Ｎｄｅ　Ｉ　４ｉｎｄＩ［［断片をプラスミドｐＦ８１０３から単離し、Ｎｄｅ　ｒ及び旧ｎｄｌ［で消化したプラスミドｐＴＶ３０１中に連結した（第６図）。得られたプラスミドをｐＦＮ１０５と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。ｕ株＾１６４５中に維持した。ヒト成長ホルモン（ｈａｌｌ）発現体プラスミドｐＴＶ１０４（２）のＮｄｅｌ切断によって第７図に示したプラスミドｐＴＶ３吋を構築しり、　７　ラスミＦ　ｐＴＶ１０４（２）ＧｉＡＴＣＣニ受託番号３９３８４ｔ’　Ｗ　託されている。Ｎ４ｅ　Ｉ　−Ｎｄｅ　Ｉ　ｈにＨ断片を発現ベクタープラスミドｐ５７９のＮｄｅ　１部位に挿入した。プラスミドｐ５７９はプラスミドｐＲＯ２１１及びｐＰｓｌから構築したく第１６図）。プラスミドｐＰｓ１は＾ＴＣＣに受託番号３９８０７で寄託されている。プラスミスミドｐＪｌ（２００は＾ＴＣＣに受託番号３９７８３で寄託されている。え族■ユムドメインＣＢＤの　の　ブ　ローニング　び現ＲＧＤ配列を含む約６５ｋＤのＣＢＤタンパク質の発現を得るために、プラスミドｐＦＮ１０２をＥｃｏＲｒ−Ｈｉｎｄｌ［［で消化し、ＣＢＤを含む断片を単離し、プラスミドｐＦＮ１０１に、第１５図に示した配列を有するＢａｍＨＩ　 −ＥｃｏＲＩ合成断片の存在下（実施例２参照）に連結した（第８図）、得られたプラスミドをｐＦＮ１０４と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１中に維持した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉにおいてＣＢＤの発現を得るために、ＦＮのＮｄｅ　１−ＨｉｎｄＩ［［断片をプラスミドｐＦＮ１０４から単離し、Ｎｄｅ ■及びＨｉｎｄＩ［［で消化したプラスミドｐＴＶ３０１に連結したく第９図）、得られたプラスミドをｐＦＮ１０６と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾１６４５中に維持した。夫施１タンパ　の　ンバプラスミドｐＦＮ１０５及び、ＦＮ１０６を使用してＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃ。貝株＾１６４５を形質転換じた。得られたクローンを、アンピシリン（１００同／ｌ１１）を含むＬＢ培地において３０℃で０．Ｄ、が０．７になるまで増殖させた。４２℃で１〜３時間誘導すると発現が得られた。誘導後の細菌細胞を回収し、１０．ＯＯＯＲＰＭで５分間遠心分離した。ベレットを１０容積の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＺ　ｐＨ＝８．０１０．５ＪＥｆｌＴ＾、ＩｆｉＭＰＭＳＦ中に懸濁させたく即ち、ペレットがＩＦＩであるならば１０容積の溶液を加えた）、　（ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールを含有する）試料緩衝液を加えた。試料を１０分間沸騰させ、次いで小型遠心分離器内で最高速度で２分間回転した。得られた上澄み１５ｕｌを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にロードした。ＣＢＤ全部及び部分の予想サイズはそれぞれ７５ｋＤ及び６５ｋＤであったが、誘導に際して得られたタンパク質は切端（ｔｒｕｎｃａｔｅ＋（）されており、サイズはそれぞれ４５ｋＤ及び３５ｋＤであった。叉ｔｍンバ　ブース々ドのなぜ切端タンパク質が得られたかを明らかにするために、クローンｐＦＮ１０５及びｐＦＮ１０８のＤＮＡを再度配列決定すると、１つのヌクレオチド、即ち位置４０３０にあるＴの欠失が認められた。この障害を克服するために、原ｃＤＮ＾ライブラリーを、ＦＮの細胞結合ドメインプローブにハイブリッド化する更なるｃＤＮ＾ＤＮＡンに対して再度スクリーニングした。陽性のｃＤＮ＾ＤＮＡンを単離し、そのＤＮＡを配列決定した。　ｐＦＮ１１４−４と命名したｃＤＮ＾ＤＮＡン（ｂｐ３５７：（−６７２０）は正しいＤＮＡ配列を有することが判った。の７５ｋＤタンパク　の非切端のＣＢＤタンパク質を得るために、クローンρＦＮ１０５のＳｓｔ　ｒ　 −Ｂｇｌ　Ｉ［断片をクローンｐＦＮ１１４−４のＳｓｔ　ｌ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片と置き換えた（第１０図）、プラスミドｐＦＮ１１４−４は、ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーから独立に単離したＦＮ　ｃＤＮ＾を有する他のプラスミドであり、ｐＦＮ１１４−４には位置４０３０のチミジンの欠失はない、プラスミドｐＦＮ１１４−４由来のＳｓｔ　Ｔ　−Ｂｇｌ　１１断片を使用してプラスミドｐＦＮ１０５由来のＳｓｔ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉ［断片を置き換えた。得られたプラスミドｐＨ７−４は全長７５ｋ［ｌの細胞結合ドメインタンパク質の発現を誘導したが、翻訳終結コドンを含まず、ｐＢＲ３２２配列内で終わっていた。この欠陥を修正するために、リンカー：１１：ＡＴＣＴＡＣＴ＾＾ＧにＣＣＴ＾＾ＴＧＡＴＴＣＣＧｆｌ：ＡＴＴＣＧ＾を構築した。このリンカ−は５′末端及び３′末端にそれぞれＢｇｌＩ［部位及び旧ｎｄ［［［部位を含み、翻訳終結コドンを含む７５ｋＤのＣＯＤの３′末端をコードする。これを、Ｂｇｌｌｌ及び旧ｎｄ■で切断したプラスミドｐＦＮ１１７−４に連結した（第１０図）、得られたプラスミドｐＦＮ１２６−３は、真正なＣ末端を含む全長７５ｋＤの細胞結合ドメインタンパク質の発現を誘導した。プラスミドｐＦＮ１２６−３は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ＾１６４５中で＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受託番号６７８２９で寄託されている。発現されたタンパク質は、フィブロネクチン分子のアミンＩ！　１１０２から始まりアミノ酸１８５１（但しアミノ酸１６００〜１６８９は除く）にわたるタンパク質のアミン末端に付加したアミノ酸Ｍｅｔ−＾５ｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−＾ｓｎ−Ｓｅｒ（ＭＤＱＦＮＳ）を有する。この分子は、フィブロネクチンの部分トリプシン消化によって得られる７５ｋＤのタンパク質とは異なる。トリプシンポリペプチド断片は８７３番目のアミノ酸から１５５５番目のアミノ酸にわたる。の４０ｋＤＣＢＤ　ンパク　のプラスミドｐＦＮ１０２をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌＩで消化し、ＦＮのＥｃｏＲ■−Ｈ１ｎｄｌ［［断片を単離し、Ｎｄｅ　（及びＨｉｎｄｌ［［で消化しておいなプラスミドｐｒｖ３ｏｔに、配列：ＴＡＴＧ（：ＡＴＣ＾＾ＴＴＣ＾ＣＣＴＡＩＩ：ＴＴ＾＾ＧＴＴ＾＾を有する合成りＮＡ断片の存在下に連結した。得られたプラスミドを、ＦＮ１１８と命名し、Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃ。ｕ株＾１６４５中に維持し、４０ｋＤ　、ＣＢＤタンパク質を発現させた。Ｂｇｌ　Ｉ［−Ｈ１ｎｄｎｌ終結リンカ−の合成の誤りのために、このタンパク質はＢｇｌ［［部位で終結せず、ｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列において終結した（第１１図）。翻訳を正しく終結させるために、プラスミドｐＦＮ１１８を８ｇ１■及びＮｄｅ　ｒで消化し、ＦＮのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｎｄｅ　Ｉ断片を単離し、プラスミドｐＴＶ３０１から単離したＮｄｅ　Ｉ　−Ｈｌｎｄｌ［［大断片及び合成リンカ− の両方に連結したく第１２図）。合成リンカ−は配列：ＧＡＴＣＴＡＣＴ＾八ＧにＣＣＴ＾へＴ［；ＡＴＴＣＣＣＧＡＴＴＣＧ＾を有していた。得られたプラスミドｐＦＮ１３２−５は、正しい位置で終結した４０ｋＤ　ＣＢＤタンパク質を発現したことが判った。プラスミドｐＦＮ１３２−５の最初の形質転換はＥｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾１６４５中で実施した。プラスミド解析（制限酵素、ＤＮＡ配列決定及び４０ｋＤタンパク質発現の決定）の後、このプラスミドを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株４２５５　（Ｆ”）を形質転換した。プラスミドｐＦＮ１３２−５はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ中で、＾彌ｅｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受託番号６７８３０で寄託されている０発現したタンパク質は、フィブロネクチンアミノ酸１３８０から開始しフィブロネクチン分子のアミノ酸１８５１（但しアミノ酸１６００〜１６８９は除く）に達するポリペプチドのアミン末端に付加したアミノ酸Ｍｅｔ−＾５ｐ −ｆ；Ｉｎ−Ｐｈｅ（ＭＤＱＦ）を有する。この分子は、フィブロネクチンの部分トリプシン消化によって得られる７５ｋＤタンパク質とは異なる。トリプシンポリペプチド断片は８７３番目のアミノ酸から１５５５番目のアミノ酸にわたっている。艮叉ゑ１４０ｋＤ　ＦＮ　ＣＢＤを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株４２５５（Ｆ”）中のクローンｐＦＮ１３２−５を、アンピシリンを含有するＬＢ培地において３０℃で、０．Ｄ、が０．７になるまで増殖させた。４２℃で１〜３時間誘導すると発現が得られた。４０ｋＤ　ＣＢＤ　ンパ　の４２℃で２時間誘導した後に細胞を回収し、遠心分離し、ベレット化した材料５ｇを緩衝液（５０＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐ）Ｉ＝　８．０，５ＩＩＭＥＤＴ＾、ＩｍＭＰＭＳＦ、２５１１ＭＮａＣｔ’）５０＋ｍｌ中に懸濁させ、４℃ で５回（１回１分）超音波処理した。遠心分離後、４０ｋＤ　ＣＯＤタンパク質がベレット画分中に存在するのが認められた。この４０ｋＤのＣＯＤタンパク質を更に、ベレットを（上記緩衝液中の）６Ｎ尿素中に溶解し、　ＤＥＡＥセルロースイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離することにより精製した。４０ｋＤのタンパク質をプールし、ＰＢＳに対して透析した。４０ｋＤのタンパク質相の優れた精製方法は実施例１５に示す。Ｋ！■玉４０ｋＤ（７）ＣＢＤボＩベプ　ドの　４゛精製した４０ｋＤ　ＣＢＤの生物学的活性をアッセイした。真正な血漿ＦＮを陽性コントロールとして使用した。血漿ＦＮ及び組換え４０ｋＤ　ＣＢＤをプラスチック表面上に固定し、トリチウム標識マウス３Ｔ３細胞の上記層への結合を、Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ。台、ら（１５，１８）が記載したように固定タンパク質濃度の関数として決定した。この結果から、４０ｋＤタンパク質による結合の程度は真正な血漿ＦＮのものに匹敵し得ることが判った。その他の結果は実施例１６で説明する。え１■ユバ　゛　アッセイ種々のフィブロネクチン組換え断片の血小板凝集を阻害する能力を評価するために、血漿タンパク質の存在下の」ｖｉｔｒｏアッセイにおいて実験を実施した。血小板を豊富に含む血漿（ＰＲＰ）及び血小板の乏しい血漿（ＰＰＰ）の調製（１６，１７）は以下のように行なった。１、室温のヒト血液２０ｎ１に４．８％クエン酸ナトリウムＺａｌを加え、２、　Ｂｅｃｋ＋＊ａｎ遠心分離器において１，２００ＲＰＭ、２０℃で１００分間遠心離した後、上澄み（ＰＲＰ）を回収し、３、上記上澄み１ｍｌを更に１０．ＯＯＯＲＰＭ、室温で２分間遠心分離し、上澄み（ｐｐｐ）を分離した。二二皇４ＰＲＰ及びＰＰＰを使用し、それぞれ０．１及び０，９透過単車位において凝集検出計を較正した。

【麦工里皇１ａ、　ＰＲＰ　１２５ｐ１、ｂ、　ＰＢＳ溶液中のタンパク質試料Ｏｐ１〜１２５ｕ１、ｃ、　３７℃で２〜３分間溶液を平衡させ、ｄ、　ＰＢＳを加えて最終容積２５０．１とする。＾ＯＰ溶液を最終濃度１０μＨになるまで加える（０．５ｍＭ八〇へ溶液５．１）ことにより血小板凝集を誘導した。この結果は表■にまとめて示すが、これらの結果は、４０ｋＤ　ＣＢＤ及び３１ｋＤ　ＦＢＤタンパク質の両方がへ〇Ｐ誘導の血小板凝集を一部阻害するが、未消化の全血漿フィブロネクチンは効果がないことを示している。表」完全系　１１豆ロ　１１じ口（５，Ｍ＾ＤＰ）　１００　０１２５ｕｌＰＲＰ４　ｕＭ　Ｏ１００船１１ヒエＬ喝じ４上０．５　ｕＭ　１１０　０ｔｌＬＬ１頭」ムコ（陰性対照）４　ｕＭ　１００　０艮■ の　゛タンパ　の　ハ　゛　にお（るタンパク質濃度（ｕＭ）　凝集阻害（％）血漿精製フィブロネクチン　０．５０分解血漿フィブロネクチン　０．５　５０精製血漿３１ｋＤ　ＦＢＤ　０．８　４０にＲＧＤＳ（ペンタペプチド＞　５０　６０４０ｋＤ　ｒｃＢＤ　Ｏ，５４０組換えアポリポタンパク質Ｅ４　０組換えウシ成長ホルモン（ｂにＨ）　２２　０八〇Ｐ誘導の血小板凝集を防止する上でのｒｃＢＤドメインの活性は、このポリペプチドが有効な阻害剤であることを明らかに示している（精製ポリペプチド０．５．Ｍを用いて４０％阻害が得られた（表■））、無傷（ｉｎｔａｃｔ）の血漿精製フィブロネクチンはこのアッセイ条件下では全く効果を示さなかった。それに反して、制限的なタンパク質加水分解を行って別個のフィブロネクチンドメインを生成した同じ調製物は、強力な阻害活性を得た。ＲＧ［ｌ含有合成ペンタペプチドは、文献に報告されているように、比較的高いモル濃度で阻害効果を示した。２種のタンパク質、即ち組換えｂＧＨ及び組換えアポリポタンパク質Ｅを陰性の対照として試験したが、予想通り、血小板凝集を防止しなかった。精製血漿ＦＢＤは血小板凝集をｉｎ　ｖｉｔｒ９で阻害した。この知見は、組換えＦＢＤを使用して更に確証される。血小板凝集における４０ｋＤタンパク質の作用を示す他の結果は実施例１７で説明する。え五■１３１ｋＤフイブ１ン　ムドメインの　ハ　に　るの　集　の・　明血漿ＦＮ由来の３１ｋＤトリプシン分解断片を単離し、ＤＥＡＥ−セルロース、Ｃトセファロース及びヘパリン−セファロース上のクロマトグラフィーによって精製した。精製した断片は、血小板凝集を防止する上で有効であることが判った（０゜５〜１．１ｕＭの濃度で４０％阻害）。の・　び（ゼラチン−セファロースカラム上で溶出させて精製し、１Ｍグアニジニウムヒドロクロリド中に保存した）血漿ＦＮを切断することにより３１ｋＤ断片を得た。次いで、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに対して透析した後、ＦＮ　２０６Ｂを０．０１％のＴＰＣＫ−）リブシンを用いて３７℃で５分間消化した。トリプシン消化物をＤＥ５２カラム（６＋ｓｉ’）にロードし、１１５の流出画分（５０ｖ１２）をＣトセファロースカラム（３糟りに供し、ＮａＣ１勾配（Ｏ〜０．５Ｍ）で溶出させた。塩勾配において約８０％のタンパク質が回収された（ピークは約２２０−であった）、透析して塩を除去した後、約１７２のタンパク質をヘパリン−セファロースカラム（１，５＠１）にロードし、０．５Ｍ　Ｎ１ｃｌで溶出させた。この画分においては約７５％、即ち約１ｍｇのタンパク質が回収されたく理論的収率の約４０％）。この両分は９０％以上純粋な３１ｋＤ断片であり、血小板凝集をｉｎ　ｖｉｔｒｏで防止することが判った。血ハ　凝集のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　止ヒトＰＲＰ及び＾ＤＰ（１０ｕＭ）誘導の凝集を使用し、２種の別個の実験を実施すると、その結果は以下のようになった。３１ｋＤ＋１’）　’　Ｈ％ＪＬＪｌ　尺翌ＩＪ４．０　１００　１０．５　３８１１】Ｉ還元及び非還元条件下の５Ｏ３−ＰＡＧＥ、　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２（分子量２６ｋＤ）上のゲル濾過クロマトグラフィー及びＮ末端配列決定（Ｎ末端は、ピログルタメート残基に対して予想されたように、ブロックされていることが判った）によって、精製断片の特性を調査した。更に、この材料は、抗ＦＮ及び抗ｒｅｃ２０ｋＤ抗体とイムノプロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）中で反応した（ｒｅｃ　２０ｋＤはアミノ酸１〜１９０を含む組換えＦＮ分子を表わす）。そのヘパリン−セファロースへの結合特性もその性質を証明するものである。この３１ｋＤ断片は更に、細菌結合アツセイにおいて江旺ｈｂ９μＩＬ覗坦■に反応した。及胤■ユライブ１ン　ムドメインＦＢＤ　の　び＾、２０ｋＤＦＢＤタンパク　の実施例１に記載したように得られ、第１図に図示したＦＮｅＤＮ＾クロＤＮＡ、ＦＮ分子のアミノ酸１〜１９０をコードするＤＮＡを含んでいなかった。これらのアミノ酸はＦＢＤの部分である。ヌクレオチド１４〜４７２に対応し、アミノ酸１〜１５３をコードするＤＮＡ（第４１図）を、７対の化学合成ヌクレオチドを連結することにより構築したく第４２図及び第４３図）、この合成りＮＡ断片には、５′末端に＾ＴＧ開始コドンが含まれ、また種々の発現ベクターに挿入するのに都合の良い制限部位も含まれていた。　ＦＢＤをコードするＤＮＡ配列を更に操作できるように、ヌクレオチド番号１９のチミジン（Ｔ）をアデニン（＾）に変え、それによってアミノ酸配列を変更することな（Ｏｄｅ■制限部位を除去した（このヌクレオチド交換部位は第４２八図に示したリンカ−＃１においてはアスタリスクで表されている）。上記合成りＮＡ断片を、ＥｅｏＲｌ及び８ａｍＨＴで消化したｐＢＲ３２２プラスミドベクター中にクローニングする種々のスチップを第４３図に記載した。得られたプラスミドをｐＦＮ９３２−１８と命名した。プラスミドｐＦＮ９３２−１８由来のフィブロネクチンの最初の１５３個のＮ末端アミノ酸をコードするＤＮＡ断片をｐＴＶ３０１、即ちλＰＬ発現ベクターのＮｄｅ　ｒ及びＬｒｌ　Ｉ［部位間に挿入し、プラスミドｐＴＶ３０１におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＷ）をコードするＤＮＡ配列を置換したく第４４図）。得られたプラスミドｐＦＮ９４９−２は、＾＋ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受託番号６７８３１で寄託した。プラスミドｐＦＮ９４９−２を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ原栄養株＾４２５５を形質転換した。これらの形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞は、全細胞タンパク質の約５％を占める量において部分ＦＢＤタンパク質を発現することが判った。このタンパク質は、サイズマーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）の移動度から決定される還元ＳＯＳポリアクリルアミドゲル上で約２０ｋＤの移動度を有した。このタンパク質は、メチオニンに続くフィブロネクチンの最初の１５３個のアミノ酸と、それに続く合成リンカ−によってコードされた４個のアミノ酸と、さらに、ＢＲ３２２ベクター中まで読取られることにより生成された９個のアミノ酸、即ち合成１６７個のアミノ酸からなる。この明細書においてはこのタンパク質をｒ２０ｋＤタンパク質またはｒ２０ｋＤ　ＦＢＤと表記する。Ｂ、「６全ＦＢＤタンパク　のアミノ酸１〜２６２を含む全細胞タンパク質の発現を得るために、以下のプラスミドを構築した。１．３′　にお（る　コドンＴ＾＾の第４５図に示したように、Ｔ＾＾終結コドン及びＢｇｌＵ部位を含む配列：５’　ＣＴＧＴＴＴ＾＾ＧＣΔ ３′にＡＣ＾＾＾ＴＴＣにＴＣＴＡにを有する合成オリゴヌクレオチドを、ＦＮ　ｃＤＮ＾クローンｐ９３１−５から単離したＥｃｏＲＩ　−Ｐｖｕ　Ｕ断片の３′末端と、ＥｃｏＲＴ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢＲ３２２ベクターとに連結した。得られたプラスミドをｐＦＮ９３５−１２と命名した。第４６図に示したように、ＦＢＤのカルボキシ末端領域をコードするＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｃ　ＩＩ　ＤＮＡ断片をプラスミドｐＦＮ９３５−１２がら単離し、ＥｃｏＲｌ及びＳ＋＊ａ　ｌで消化したプラスミドｐＴＶ１９４−８０に連結した。得られたプラスミドをｐＦＮ９４６−１２と命名した。３、ＦＮのヌクレ　ド４６８〜５９９に・　るＤＮＡのム　びクローニング第４７図に詳細に示したように、３対の化学合成ヌクレオチドを、プラスミドｐＦＮ９３２−１８（第４３図）から単離したＥｅｏＲｌ　−Ｄｄｅ　Ｉ　ＦＮ断片に、ＥｅｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉで消化したｐＵｃ１９ベクターＤＮＡ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ　Ｃｏから購入）の存在下に連結した。得られたプラスミドをｐＦＮ９４８−４と命名した。４、ＬｔＪｕ　コード　るブースミドの全ＦＢＤ、即ちアミノ酸１〜アミノ！１２６２までをコードするプラスミドを構築するために、第４８図に示したように、ＦＮをコードするＥｅｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＤＮＡ断片をｐＦ８９４８−４から単離し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉで消化したプラスミドｐＦＮ９４６−１２中に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＮ−９５７と命名した。このプラスミドはＦＢＤを完全にコードする配列を含むが、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）が欠如しているのでＦＢＤタンパク質を発現しない。５、λＰ、プロモーーｃＲＢｓ　のＦＢＤの第４９図に示したように、ＦＢＤをコードする領域及びＴ、Ｔ。転写終結因子を含むＮｄｅ　ｒ−ｆｌｉｎｄｌｌｌ断片をプラスミド９ＦＮ−９５７から単離し、Ｎｄｅ　［及びＨｉｎｄｌ［［で消化したプラスミドｐＴＶ３０１（第７図）中に挿入した。得られたプラスミド（ｐＦＮ９６２−３と命名した）は、λＰ、プロモーター及びｅＩ［リボゾーム結合部位の制御下にＦＢＤ類似タンパク質の発現を誘導した。このプラスミドを用いて形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾１６４５及び＾４２５５は少量のＦＢＤタンパク質のみ発現した。　ＦＢＤタンパク質の発現は、ヒト血漿由来のＦＮに対するポリクローナル抗体を使用するウェスタンプロット分析によってのみ検出可能であった。６、λＰＬプロモーター　び　−−クタマーゼプロモータ　びリボゾーム　Δ　のＦＢＤ　タンパク　のプラスミドｐＦＮ９６２−３を用いて得られるＦＢＤ類似タンパク質の発現レベルは低いので、β−ラクタマーゼプロモーター及びβ− ラクタマーゼＲＢＳ（ＰＢＬ＾）をコードするＤＮＡ断片を加えた。第５０図に示したように、ＰＢＬ＾をコードするＤＮＡ断片を１ラスミドｐＢＬ＾１１（＾ＴＣＣ受託番号３９７８８）から単離し、Ｎｄｅｌで消化したプラスミドｐＦ８９６２−３中に挿入し、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素で充填し、ＥｅｏＲＩで消化した。得られたプラスミドはｐＦＮ９フ５−２５と命名し、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣｏｔＩｅｃｔｉｏｎに受託番号６７８３２で寄託した。このプラスミドを使用してＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ原栄養株＾４２５５　（Ｆ”）を形質転換した。これらのＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｅｏｌｉ細胞は、全細胞タンパク質の約５〜８％のレベルで「完全ＪＦＢＤ類似タンパク質を発現することが判った。見掛けの分子量３１ｋＤを有するタンパク質が５ＯＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動し、従ってこれを、３１ｋＤタンパク質またはｒ３１ｋＤ　ＦＢＤと表記する。Ｃ，ｍ込崖ｊ逢１ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤタンパク質を発現するクローンを、アンピシリンを含む富培地（酵母抽出物及びカゼイン加水分解産物）中で発酵させた。増殖は３０℃で行った。４２℃で２時間誘導すると発現が得られた。Ｄ・　゛ライブ１ン　４ドメインｒ３１ｋＤ　ンノ（のこのプロセスは３つの段階：１、細菌ケーキの粗処理、２、再生／再酸化、３、精製。からなる。１、粗処理まず、細菌ケーキを５容積の５０＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４１５０ｍＭ　Ｎａ− ＥＤＴ＾、　ｐｆ１８　（［衝液１）中で破壊し、次いで、１１当たりリゾチーム１００Ｂを含む緩衝液１の１．２容積で処理（３７℃で２時間撹拌）した、得られた懸濁液にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００を（１％になるまで）加え、室温で３０分後、懸濁液を遠心分離し、ペレットを再憇濁させ、水で２回洗浄した。これらのステップ全てはペレットの破壊及び遠心分離によって行われ、５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルから立証されたように、３１ｋＤはペレット中に存在した。洗浄したペレットを１４容積のＩＯＩＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ１１５ｍＭ　ＥＤＴ＾／２ＤＭＡＰＭＳＦ／２ｍＭ　Ｂ−アミノカプロエート、ｐＨ７，５（１１衝液Ａ）中に懸濁させ、次いで、１％硫酸デシル、１％硫酸デシル１５％グリセロール及び５％グリセロールを含むＭ＊’ｉ＆Ａで順次処理し、最後に、添加剤を含まない緩衝液Ａで処理した。２、再生／再酸化原則：ペレットは６Ｍグアニジン−ＨＣｆ（ＧｕＣｌ）中に、グルタチオン（ＧＳＩＩ）のようなチオール系還元剤の存在下に溶解し、また再生／再酸化は、酸化グルタチオン（ＧＳＳに）を加えることによってより低いＧｕＣ１濃度で行なう。上記ステップ１で洗浄したペレットを緩衝液Ａ中の６８　Ｇｕｃ１／３ｍＭ　ＣＳＨ１５（１〜７００容Ｍ　ニ溶Ｎしり、ＧｕＣｌｆ）濃度を次第に低める、即ち、まず２Ｎ、次いでＩＭ及び０．５Ｍとするが、他の全ての成分の濃度は一定に維持した。但し容積は、この段階ではペレットの容積より５００〜ｔｏｏｏ倍大きくなった。Ｇｕｃｌの中間濃度の１つ、即ち０．５Ｍと２Ｎとの間において、０．３ｍＨＧ５５Ｇを加えることにより再生を開始させ、室温で２４〜４８時間インキュベートした。次いで再生した３１ｋＤを、添加剤を含まない緩衝液Ａに対して透析した。３、精製濃度工大容積の再生３１ｋＤを遠心分離して、３１ｋＤを含まない不溶性のペレットを除去し、次いでＴｒｉｓ−ＨＣＺ、ｐＨ７，８に対して透析し、濃縮し、まずヘパリン−セファロースカラム上で精製した。え４匠旦紅■血１ラットの創傷治癒モデルにおいてｒ４０ｋＤ　ＣＢＤ断片ドメインを試験した。このモデルにおいて、ポリビニルスポンジを皮下に移植し、試験物質をｉｎ　５ｉｔｕ注射した。走化性及び細胞外基質形成についての試験物質の効果は、スポンジ中のＤＭＡの増大及びコラーゲンの蓄積によって表される（第１３図参照）。え旌更旦１１藍査１１ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤの江吐１回窪」土↓二と細菌浮遊物への結合について実験を実施した。無傷の放射性ヨウ素化血漿フィブロネクチン、ヒト血漿フィブロネクチン由来のタンパク質加水分解３１ｋＤアミノ末端断片（ｐ３１ｋＤ）及びｒ３１ｋＤ　ＦＢＤに対して同一の結合曲線が得られた。［＋　”Ｔ］ｐ３１ｋＤによる細菌結合の阻害は、組換え３１ｋＤ　ＦＢＤが真正なタンパク質加水分解断片と拮抗することを示唆した。Ｋ１匠Ｈ紋ｍ限１ｒ３１ｋＤ　ＦＢＤの、細菌の創傷中の細胞外基質への付着に干渉する能力を評価するために、競合アッセイを実施した。このアッセイにおいては、江ｈμ：ｕｓ　ａｕｒｅ■ノフィブロネクチンで被覆したプラスチック表面への付着及びＦＢＤの付着への干渉を測定した。真正なＦＢＤ及びｒ３１ｋＤ　ＦＢＤは両方ともフィブロネクチン被覆表面への細菌付着を阻害する上で活性であった。１１匠旦フイブロネク　ンの　；４ｏｋｏ　Ａドメインの・九ヱラットにおいて４０ｋＤ組換えタンパク質の薬物動力学的挙動を調査した。精製した４０ｋＤ　ＣＢＤを放射性ヨウ素で標識し、体重１ｋｇ当たり１１の投与量で静脈注射した。血中放射能レベルは、まず最初の１時間は半減期約１時間で減少し、１〜８時間はより長い半減期（ｔｌ／２＝　３．２時間）のよりゆっくりしたクリアランス期が続いた。従って、組換えタンパク質の体内滞留時間は比較的長い（第１４図参照）。これに比較し、ＲＧＤペプチドの半減期は８分である。Ｋ１匠Ｂ Δドメインの　々の　に　る　゛　ンバクこ　る　ベク　−の　びこれ　の　゛　ン氏久ｉ五叉Ｉ以下に記載するＣＢＤの種々の領域の発現に対するベクターの全ては、実施例２〜５に記載した７５ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質をコードするプラスミドから構築した。第１８図は、各プラスミドにおけるｃＤＮ＾の長さ及び位１を模式的に示しており、細胞結合ドメイン■及び［（ＣＢＤ　Ｉ及びＣＢＤＩ［＞をコードするｃＤＮ＾の存在及び不在を示している。第１９図は、得られたプラスミドによって発現されるタンパク質についての情報をまとめたものである。以下に記載するタンパク質の発現はく特に記載のない限りは）全ての場合において以下のように達成された。最初にプラスミドを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾１６４５を形質転換し、プラスミド解析（制限酵素データ及び発現の決定）後、このプラスミドを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾４２５５（Ｆ゛）を形質転換した。７５ｋＤタンパク質に類似であるが切端のＣ末端を有するタンパク質を発現するプラスミドを構築するために、第２０１Ｊに示すように、発現プラスミドｐＦＮ１２８−４を構築した。このプラスミドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると、分子量６５ｋＤを有するタンパク質を発現した。従ってこのタンパク質をｒ６５ｋＤタンパク質」と表記する。６５ｋＤタンパク質は、第１９図に示したようにアミノＰｉ１２５３１個の長さであると考えられる。プラスミドｐＦＮ１２８−４よりも大きい（ＣＢＤ　Ｉ領域の欠失を含む）Ｃ末端セクションの欠失を含むタンパク質を発現するプラスミドを第２１図に示すように構築した。得られたプラスミドｐＦＮ１３０−１１は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると分子量２８ｋＤを有するタンパク質を発現した。ｒ２８ｋＤタンパク質」と表記されるこの組換えタンパク質は、第１９図に示したように２５８個のアミノ酸を含むと考えられる。６５ｋＤタンパク質に類似であるがＮ末端が切端である組換えタンパク質を生産するために、第２２図〜第２４図に示すように発現プラスミドｐＦＮ１４３−１を構築した。このプラスミドは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると分子量５５ｋＤを有するタンパク質を発現した。ｒ５５ｋＤタンパク質」と表記されるこのタンパク質は、第１９図に示したように４３６個のアミノ酸を含むと考えられる。７５ｋＤタンパク質に類似であるが、ＣＢＤ　ＩＦ領領域含むＮ末端領域が欠失している組換えタンパク質を生産するために、第２２図に示すように発現プラスミドｐＦＮ１３５−１２を構築した。親プラスミド（ｐＦＮ１１７−４）及びその子プラスミド（ｐＦＮｔ３５−１２）は両方とも、翻訳終結コドンを欠いた同じ３′末端を含む。従って、翻訳はｐＢＲ３２２ｍＲＮ＾内で終結し、得られたタンパク質は更にそのＣ末端に非フィブロネクチン由来アミノ酸を含んでいた。発現されたタンパク質の分子量は、５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると４５ｋＤであり、従ってこのタンパク質をｒ４５ｋＤタンパク質」と表記する。このタンパク質は、非フィブロネクチン誘導Ｃ末端を含み、第１９図に示したように約４３３個のアミノ酸を含むと考えられる。４５ｋＤタンパク質に類似であるが切端のＣ末端を有するタンパク質を生産するために、第２３図に示したようにプラスミドｐＦＮ１３７−２を構築した。プラスミドｐＦＮ１３７−２は、瞳舶猛１ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ宿主＾４２５５中で＾ＴＣＣに受託番号８７９１０で寄託した。このプラスミドは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると分子量３３ｋＤを有するタンパク質を発現した。従ってこのタンパク質をｒ３３ｋＤタンパク質」と表記する。このタンパク質は、第１９図に示したように３０４個のアミノ酸を含むと考えられる。３３ｋＤタンパク質に類似であるがＮ末端において切端である組換えタンパク質を生産するために、第２５図に示すように発現プラスミドｐＦＮ１３４−９を構築した。このプラスミドは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると分子量２８ｋＤを有するタンパク質を発現した。このタンパク質を「２８（零）ｋＤタンパク質」と表記する。　２８（京）ｋｎタンパク質は、第１９図に示したように２５３個のアミノ酸を含むと考えられる。及１匠耳４０ｋＤ　び３３ｋＤ　ンパク　の（ａ）４０ｋＤタンパク　の実施例５で生産した４０ｋＤタンパク質は、実施例５の最後部分に４０ｋＤタンパク質に対して記載したように精製することができるが、以下に記載する変法で精製した。湿潤な細菌ケーキ１０ｇを、１００＋ｓ１の緩衝液Ａ：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　ｐＨ８，０５Ｊ　ＥＤＴ＾２５ｍＭ　ＮａＣ４１ｍ１ＭＰＭＳＦ１０１１Ｎエチレンジアミン中に再懸濁させ、得られた懸濁液を水中で８分間超音波処理した。この超音波処理は２回繰り返した。得られた超音波処理後の液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた細菌ベレットを、６Ｎ尿素を含む緩衝液Ａ１００ｍｍ！中に再懸濁させ、４分間音波処理し、音波処理後の液を１５゜０００ｒｐ−で３０分間遠心分離し、得られた上澄み液５００００単位を、緩衝液Ａで平衡させたＤＥ５２セルロースカラム（２５０ｍｊりにロードした。カラムをＭ＠液Ａで洗浄し、両分を回収した。精製された４０ｋＤタンパク質（Ｐｏｏｌ　Ｉ　”　ＩＩ　）が流出容積の１７６内で溶出した。この組換えタンパク質の調製物を緩衝液Ａに対して透析し、精製された４０ｋＤタンパク質画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。次に、大量の４０ｋＤタンパク質調製物を実質的に前記したのと同様に精製した。但し、ＤＥ５２セルロースカラムに代えてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏ−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した６次いで、部分精製４０ｋＤタンパク質を高分子凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）及び低分子量夾雑物から、仕様書に従って発熱物質除去処理をしておいたＦｒａｃｔｏｇｅ！・ＴＳＫ　ＨＬ５５（Ｆ）カラム（Ｅ。Ｍｅｒｅｋ）上でサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。典型的には、硫酸アンモニウム沈澱によって約４ａｇ／ｍｌに濃縮し、Ｍｆｒ液Ａ中の６Ｎ尿素中に再溶解した部分精製４０ｋＤタンパク質１００＋ｓ＆をＦｒａｃｔｏｇｅｌ”ＴＳＫ　５５カラムにロードし、尿素不在の緩衝液Ａ中で溶出させた。凍結保存した精製４０ｋＤタンパク質のプールは濃度Ｌ６Ｂ／ｌＩＮを有し、９２％以上純粋であった。（ｂ）３３にロ　ンパク　の３３ｋＤタンパク質を発現するプラスミドｐＦＮ１３７−２を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株＾４２５５（Ｆ′″）を、アンピシリンを含むＬ［＋培地中で３０℃で増殖させた。４２℃で１〜３時間誘導すると発現が得られた。湿潤な細菌ケーキを上記（ａ）に記載のごとく超音波処理した。洗浄した細菌ベレット（７０ｙ）を、（前記のごとく）新たに脱イオン化した６Ｍ尿素を緩衝液Ａに溶解した溶液１６００＋ａｌ中に溶解した。次いで遠心分離し、無視し得る量の３３ｋＤタンパク質を含む不溶性物質を除去し、予め同じ緩衝液で平衡させておいた１０　Ｘ　６３ｃｍＤＥ＾Ｅ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ）カラム上でクロマトグラフィー操作を２回実施した。溶出は尿素不在の緩衝液Ａを用いて行なった。このような条件下で、３３ｋＤ断片はカラム上で遅延し、はとんどの夾雑細菌タンパク質は結合し、０．５８　ＮａｆＪをＭｆｒ液に加えるとカラムから溶出した。カラムの５ＯＳ−ＰＡＧＥプロフィールに従って画分をプールし、２回の操作から得られた精製画分のプールを組み合わせた（ＤＥＡＥ−Ｓ　３．４）、これらのプールのタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの変法（２４）によって決定し、純度を、５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールのクーマシーブリリアンプルー染色がら評価した。結果を表■にまとめて示す６表１タンパク質濃度　合計タンパク質　純度＆ｉミニブーＵ■Ｌ−一　−−■Ｌ−一　咀旺」歿■６Ｎ尿素溶解　５．５　８７４０　（３５Ｋ）ＤＥＡＥ−Ｓ　３．４７−７１，１　０．９３　１６７４　（９２＄）７−ル２　０．５５　９９０　（８５１）犬ｍにお番　３３ｋＤ　び４０ｋＤ　ンパク　の細胞接着（ｃｅｌｌ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）における３３ｋ［ｌ及び４０ｋＤタンパク質の作用を、僅かに改変した細胞接着アッセイ（２３）を使用して調査した（更に１５．１８を参照）、予備結果は実施例６に記載した。簡単に述べると、ＰＢＳ溶液中の試験タンパク質リガンドのプラスチック表面への固定を４℃で１６時閉実施し、未結合のタンパク質をＰＢＳで洗い落とし、非特異的な部位をＰＢＳ中のＢＳ八でブロックした後、３Ｈ−チミジン標識したトリプシン処理増殖真核細胞を前記表面上に置き、３７℃で４５分間インキュベートした。洗浄後、皿上に残っている放射能レベルを測定した。これを、種々の濃度の試験タンパク質リガンドにおいて実施し、第３８図及び第３９図に示した用量一応答曲線を作成した。驚くべきことに、４０ｋＤタンパク質は、血漿フィブロネクチンと同様に３Ｔ３繊維芽細胞及びＢＨＫ細胞に（ＮＨＫ細胞には結合しなかったが）結合した。しかしながら、３３ｋＤタンパク質はＢＩＩＫ細胞に極めて少ししか結合しなかっな、　４０ｋＤタンパク質は、血漿フィブロネクチンと同様に、追加実験からその結合がペンタペプチドＧＲにＤＳによって完全に阻害されることが判ったので、解析した真核細胞の細胞表面上に存在するインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）受容体に結合することが判った６４０ｋＤタンパク質は、ＣＢＤ　Ｉ　（ＲＧＤ）部位と相乗的に作用すると考えられているＣＢＤ　ＩＦ部位を含まないので、無傷のフィブロネクチンと同様の程度に細胞接着に関与することは予想外であった（２５参照）、　４０ｋＤタンパク質中に存在するヘパリン結合部位（第１図参照）の３分の２は予想外にも細胞接着機能を果たすことができ、ＣＢＤＩＩ部位欠失を補償し得る。この仮説は、ヘパリンは４０ｋＤタンパク質の結合と拮抗するがフィブロネクチンの結合とは拮抗しないことを示す細胞接着の追加実験によって立証された。３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質は両方ともＣＢＤ　Ｉ領域は含むがＣＢＤＩ［領域は含まないことに留意されたいく第１８図参照）。４０ｋＤタンパク質はＣ末端において（３８７塩基対＝１２９個のアミノ酸だけ）拡張されており、この領域は、３３ｋＤタンパク質中には存在しないヘパリン結合ドメインの３分の２を含んでいる。衷Ｗハ　゛　アッセイにお番る４０ｋＤ　び３３ｋＤタンパク実施例７に記載したｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを使用し、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の血小板凝集を阻害する能力を評価した。４０ｋＤタンパク質の＾ＤＰ誘導血小板凝集を一部阻害する能力は実施例７に示した（表Ｉ及び■）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ血小板凝集アッセイ系における３３ｋＤタンパク質、４０ｋＤタンパク質、血漿７５ｋＤ及びペンタペプチドＧＲにＤＳの用量一応答作用を第２８図に示す。ＰＲＰを使用したこれらの結果は、試験した全てのタンパク質が血小板凝集を阻害するが、３３ｋＤタンパク質が最も強力な作用を有することを示している。同様の実験をまとめて表■に示す、血漿７５ｋＤは第２８図の説明において記載したように調製した。表１ＰＲＰ　のｉｎ　ｖｉｔｒｏ血ハ　゛　アッセイにお番るらの　′タンパク　の：　タンパク　へプ　ド　５０％　が　られるｐＨｍｙ／１３３ｋＤタンパク質　１〜３　３３〜１００４０ｋＤタンパク質　４〜６１６８〜２４８血漿７５に０　５〜８３７５〜６００合成ペンタペプチド　５０〜１００　３３〜６６ＧＲＧＤＳ（Ｓｉｇｍａ＞凝集を５０％阻害するために３３ｋＤタンパク質は１１当たりたった３３〜１００ｓｙ　Ｌか必要としないことに留意されたい。（第２０図に示したように尿素処理の前後の＞４０ｋＤの作用と比較して３３ｋＤタンパク質の作用を調査するために、ＰＲＰを使用する類似のｉｌｌ　ｖｉｔｒｏ凝集研究を行った。この結果、４０ｋＤタンパク質の尿素処理は血小板凝集における阻害作用を増大させること、及び３３ｋＤタンパク質ははるかに高い阻害作用を有することが判った。全血中における４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質による血小板凝集の阻害を、前記と同様であるが但し第２９図の説明に記載のごとく改変したｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ系において調査した。タンパク質濃度の関数としてのパーセント阻害のグラフを第２９図に示す。これらの結果は、３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質がヒト全血中において血小板凝集を阻害すること、及び３３ｋＤタンパク質の阻害作用が驚くほど強力であることを示す、　３３ｋＤタンパク質１．５μＮまたは４０ｋＤタンパク質２．５．Ｍを使用して８０％阻害が得られ、これは、３３ｋＯタンパク質では５０Ｂ／ｊ！及び４０ｋＤタンパク質では１００Ｂ／ｊ！に相当する。更に３３ｋＤタンパク質に、コラーゲン誘導血小板凝集を防止し得るか決定する試験を行なった。前記と同様であるが但し八〇Ｐの代わりにｈｙ／ｗ４のコラーゲン（タイプ■、Ｓｉｇｍａ）を用いて誘導する血小板凝集アッセイ系を使用し、実験を実施した。　３３ｋＤタンパク質はコラーゲンによる血小板凝集を阻害した。凝集を防止するのに必要な３３ｋＤタンパク質の有効量は、八〇Ｐに刺激された細胞に対するよりも約５〜１０倍高かった。ラット由来のＰＲＰを使用しても同様の結果が得られた。種々の種における血小板凝集に及ぼす４０ｋＤ及び３３ｋＤポリペプチド並びににＲにＤＳポリペプチドの作用を調査した。Ｐｌ’ＪＰは、ラット、ウサギ、モルモット（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ）、イヌ及びヒト由来の血液から調製し、前記凝集アッセイを使用して凝集阻害を測定した。この結果を表■に示す。表Ｎり　びに［；ＲにＤＳポリペプチドの試験化合物（１Ｍ）　凝集阻害（％）ラット　ＧＲＧＤＳ（２００）　１０３３ｋＤ（６）　１００４０ｋＤ（１２）　１００ウサギ　ＧＲＧＤＳ（２００）　５０３３ｋＤ（２）　７５４０ｋＤ（６）　６０モルモット　ＧＲにＤＳ（４００）　７５３３ｋＤ（７）　７０４０ｋＤ（１２）　７０イヌ　にＲＣＤＳ（５０）　７０３３ｋＤ（３）　９０４０に口（６）　８０ヒト　ＧＲにＤＳ（７５）　５０３３ｋＤ（１，５＞　５０４０ｋＤ（５）　５０表Ｖは、ヒトフィブロネクチンと相同である３３ｋＤ及び４０ｋＤタンパク質が種々の哺乳動物種由来の血小板の凝集を阻害することを示す、血小板凝集の５０〜１００％阻害に必要な平均濃度は、ＧＲＧＤＳのそれと比較してはるかに低く、血小板機能を遮蔽する上でのこれらの組換えフィブロネクチン断片の効能を示している。１１匠卦モールにお（４０ｋＤ　び３３ｋＤ　ンバ　の４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の生物学的活性を血管損傷モデルにおいて調査した（２Ｂ）、簡単に述べると、培養した内皮細胞は、除内皮化（ｄｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌ　ｉａｌ　１ｚｅｄ）血管切片と同様に血小板を活性化する細胞外基質（ＥＣＭ）を産生ずる６ヒト血小板をこれらＥＣＭ上でインキュベートすると血小板の付着、血小板を豊富に含む血漿（ＰＲＰ）をＥＣＭ被覆プレート上でインキュベートすると、大きな血小板凝集が形成される。このモデル系における血小板の相互作用を、Ｅｌｄｏｒらが記載したように（２６）、位相差顕微鏡検査法及びラジオイムノアッセイによるトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ、）の測定によってモニターする。まず不安定なトロンボキサン＾２（ＴＸ＾２）が放出され、迅速にトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）に変換されることに留意されたい。このモデル系は、血小板付着、凝集及び放出に干渉する種々の物質を試験するのに使用することができる。このモデル系におけるＧＲＧＤＳペンタペプチドと、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の作用を調査した。　ＰＲＰ　３００ｕ／及びＰＢＳ　７００ｕ１を含むＰＲＰ混合物１翔ｌを試験化合物の存在下または不在下に、ＥＣＭで被覆した培養皿に与えた。４５分間インキュベートした後、血小板凝集物のサイズ及びＴＸＢ、放出を決定した。小さな凝集物（＋）は面積１〜２Ｘ　１０’μ２の大きさであり、大きな凝集物（＋＋＋＋）は面積１〜２．５ｘｌＯ’μ２の大きさであった。このアッセイ系の他の詳細はＥ　Ｉ　ｄｏｒらが記載している（２６）。この結果を表■に示す。表Ｍモールにお番る　ハ　２　び　に　ぼの　゛タンパク　の血小板凝集　トロンボキサンＢ２　トロンボキサン（謬微鏡検査）　（ｎｇ／＋ｉｉり　放出阻害（％〉対照　÷千十＋４９．６　０７５、ＭＧＲにＯＳペプチド　＋　３７．１　２５１４μＨ４０ｋＤタンパク質　＋　４．０　９２４１Ｍ３３ｋＤタンパク質　＋　２．７　９６上記結果は、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質が血小板凝集を強力に、はぼ完全に阻害することを示している。更に、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質は、トロンボキサン放出をほとんど完全に（それぞれ９２％及び９６％）阻害するが、これとは全く対照的に、ＧＲＧＤＳペンタペプチドはＴＸＢ２放出をかろうじて（２５％）阻害するにすぎない、更に、３３ｋＤタンパク質の存在下のＥＣＭプレートの顕微鏡検査解析がら、はとんどの血小板が浮遊しており、ＥｃＭに付着していないことが明らかになり、このことは、３３ｋＤタンパク質がＥＣＭへの血小板付着に特異的に作用することを示唆している。この作用は４０ｋＤタンパク質を用いるほうがより謬著でなかった。以上をまとめると、３３ｋＤタンパク質は静止（ｒｅｓｔ　ｉｎｇ）及び活性化血小板に、時間及び用量に依存して特異的に結合し、更に溶液中及びＥＣＭ表面上での血小板凝集を阻害し、ＥＣＭへの血小板付着及びトロンボキサンＢ２放出を阻害する。この驚くべき特性の組合せは、３３ｋＤタンパク質の独自性及びその抗血栓薬剤としての有用性を示すものである。４０ｋＤ及び３３ｋＤ組換えタンパク質の血小板へのｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合を研究した。」：組換えタンパク質の血小板への結合を、Ｇｉｎｓｂｅｒｇらが記載の方法り２７）を以下のように改変した方法でアッセイした。５ｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂカラムは使用せず、代わりに、ｌ５ｒａｅｌ　ＢｌｏｏｄＢａｎｋから得た２４時間濃縮血小板（約２Ｘ１０’血小板／ｍ１）５ｕＮを５ｏｒｖａｌｌ遠心分離器において１．５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたベレットをへ〇Ｄ：生理食塩水緩衝液の１ニア溶液（下記参照）中に再懸濁させ、もう一度５ｏｒｖａ　Ｉ　ｌ遠心分離器において１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離しな。得られたベレットをタイロード緩衝液（下記参照）２．５ｍｌ中に再懸濁させ、血小板の数を数えたく約４ｘｌＯ’血小板／＋１）。この血小板調製物を、「洗浄血小板（ｗａｓｈｅｃｌ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）」と称し、記載した全ての血小板結合実験に使用した。反応混合物は、ａＨ３３，３ｕＮの洗浄血小板（５ｘｌＯ’血小板）、ｂ）１０〜６００１Ｈの＋２５ＩＩＩＩｍタンパク質、Ｃ）記載のごとき非標識タンパク質ｄ）（特に記載のない限り清澄としての）１単位のトロンビンｅ）最終反応容積（２００１Ｊ１）までのＰＢＳを含有した。上記反応混合物１０ｕ１を合計放射能測定のために取り出し、残りを（特に記載がなければ）３７℃で３０分間インキュベートした。トリブリケートで、反応混合物５０．１を、１ｕＮの２０％スクロース０，６５％ＯＳ＾／タイロードＭ衝液を含むシリコーン処理遠心分離管内に入れた。小型遠心分離器において最高速度で３分間遠心分離した後、溶液を吸い出し、血小板を含むベレットの放射能をガンマカウンターで測定した。これは、血小板に結合した放射性タンパク質の量を示す。醪」Ｌｌ蓬：　クエン酸８ｇ／ｌクエン酸ナトリウム２２ｇ／Ｉｌグルコース２ｇ／ｌ久４旦ユ上ＪＬＩ！　＋　５ＩＩＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ＝　７．５０．１３７８　ＮａＣｌ２．７ｕＮ　ＨｇＣｂ・６Ｈ２０２−Ｎ　ＣａＣｊ！２３．８ＩＩＭＮａＨｚＰＯ＜グルコース１ｇ／ＩＢＳ＾３．５ｇ／ｌｌ：上記アッセイを使用した結合実験の結果を第３１図から第３８図に示し、図の説明において記載する。第３１図及び第３５図は、血小板１つ当たり４０，０００〜１２５，０００個の３３ｋＤまたは４０ｋＤタンパク質分子が結合したことを示している。組換え４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の血小板への結合は、非放射性相同タンパク質または合成ペンタペプチドＧＲＣＤＳ（Ｓｉｇｍａ　）のいずれかを加えることにより破壊され（第３２図）、これらの結果は、血漿ＦＮを使用して得られるものと同様である。これらの結果は、４０ｋＤ及び３３ｋＤ組換えタンパク質は、ＧＲＧＤＳが認識する血小板受容体部位に特異的に結合することを示唆している。上記受容体はインテグリンとして公知である。組換え４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質のトロンビンの刺激を受けた及び刺激を受けていない血小板への結合を研究したく第３３［］）、これらの結果は、３３ｋＤタンパク質は刺激を受けていない血小板に結合することができ、一方４０ｋＤタンパク質は刺激を受けていない血小板により低いレベルで結合することを示した。更に、これらの結果は、非標識相同タンパク質が標識された４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質と拮抗することも示しており＝　３３ｋＤタンパク質が刺激を受けていない血小板に結合している場合もこの特異的な拮抗が生じた。フィブリノーゲンのトロンポン刺激を受けた及び刺激を受けていない血小板への結合における組換え４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の作用を調査した（第３４図）、かかる実験は、トロンビンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を回避するために、ヒルジンの存在下に２５℃で実施した。この結果は、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質が血小板結合においてフィブリノーゲンと拮抗することを示した。［１；Ｒに［）Ｓペンタペプチドは同様に血小板結合においてフィブリノーゲンと拮抗し、このこともまた、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質は血小板に結合し、主血小板リガンド（フィブリノーゲン）と、恐らくはＧＲにＤＳ認識部位で拮抗することを示唆する。４０ｋＤ及び３３ｋ（１組換えタンパク質の血小板への結合の用量一応答作用を研究したく第３５図）。４０ｋＤタンパク質は、血小板がトロンビン刺激されているときのみうまく結合しく第３５八図）、一方３３ｋＤタンパク質は刺激を受けていない血小板に、刺激を受けていない血小板で得られる最大結合の最高５０％までのレベルで結合する。３３ｋＤタンパク質の刺激を受けた及び刺激を受けていない血小板への結合の経時変化は同様の結果を与えた（第３６図及び第３７図）、　３３ｋＤタンパク質の刺激を受けていない血小板への結合は、その刺激を受けた血小板への結合レベルの約８０％であり、即ち３３ｋＤタンパク質は、それらの活性状態とはほとんど無関係に血小板に結合する。更にこれらの実験は、この結合のほとんどが反応物質混合の１０分以内に起こることを示した。更に、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質の血小板への結合の研究を、ＧＰｌ［ｂ／ｌ［ａ受容体に対するマウスモノクローナル抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔ　ａ／ｓ、デンマーク）の存在下に実施した。タンパク質の血小板への結合は前記のごとく測定した。この結果から、４０ｋＤ及び３３ｋＤタンパク質は刺激を受けた血小板にＧＰＩＩｂ／Ｉ［［ａ部位で結合でき、また３３ｋＤタンパク質は、インテグリンスーパーファミリーの他の幾つかのＲＧＤ従属部位で刺激を受けていない血小板に結合できることが判った。丸１匠並による４０ｋＤ゛タンパク　の　゛′ ４０ｋＤタンパク質は、保管時の凝集のために抗血小板凝集アッセイにおいては不活性となった。再活性化は以下の手順により達成することができる。ｉ　）　４０ｋＤタンパク質を含む溶液を５０％硫酸アンモニウムを使用し、４ ℃で撹拌しながらＯＤ２．。が２．０〜３．０になるまで濃縮した。ｉｉ）得られた溶液を１０．ＯＯＯｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。ｉｉ）得られたベレットを、新たにＡＣ−５０１−ｘ８分析用混合床樹脂（Ｂｉｏｒａｄ）で処理した、６Ｍ尿素を含むｙ１！ｒ液Ａ中に再度懸濁させた。１１豆Ａ３０１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−■ＣＩ、ｐＨ＝８．０５傳Ｍ　ＥＤＴ＾２５＋Ｍ　ＮａＣ１１ｍＭ　ＰＭＳＦ１０ａ＋Ｍエチレンジアミンこれは、４℃で３〜１６時間放置することができる。ｉｖ　）得られた溶液を、１００倍容積の以下の溶液に対して順次透析した：ａ）３Ｍ尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３時間）ｂ）１．５Ｍ尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３時間）ｃ）０．５Ｍ尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３時間）ｄ＞１１衝液Ａ（３回交換）（合計３〜１６時間）ｅ）ＰＢＳ（２回交換）ｆ）ｒ逆浸透（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｏｓｍｏｓｉｓ）」（ＲＯ）水中のＰＢＳ（２回交換）合計透析時間は約４８時間であった。実施例２１３３ｋＤタンパク質を実施例１５に記載されたと同様に精製し、次のように特徴づけた。３３ｋＤタンパク質は、Ｂｒｘｄｆｏｒｄ法の変法（実施例１５参照）によって確定されるタンパク賀濃度を基礎として、２８０ｎａ＋でＥｔ％＝１６２という吸収係数と、Ｒ＝　２．３　というスペクトル最大（２７８ｎｍ）と最小（２５２ｎｉ）との間の吸光度の比率（Ｒ）を示す。サイズ排除プロフィールの主要画分（約８０％、２８Ｑｎｍ吸収による）は、Ｓｕｐｅｒｏｇｅ１２カラム（Ｐｈｉｒｍａｅｉｚ）を装備したＦＰＬＣにかけると、４７ｋ［ｌの明白な分子量を示した。残りの吸収は、次のように配分される８１０％までは高分子（約１０３ｋ［ｌ）の凝集体から成り、約１０％は低分子（ＩＧｋＤ未満）成分から成る。３３ｋＤ断片は、ｐＨ３，５〜６．５で最小溶解度を有するＵ字形溶解度曲線を３３ｋＤタンパク質のＮ末端配列は、Ｍｅ　ｔ −３ｅ　ｒ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｙであることが判明した；大腸菌Ｅ＋ｃｈｅｒｉｅｈｉｘｅｏｌｉメチオニンアミノペプチダーゼは、ＡＴＧコーデング配列に由来する付加的メチオニン残基を除去しない。ｂ）　４０ｋＤタンパク質の予備的特徴付け４０ｋＤタンパク質を実施例１５に記載されたと同様に９２％以上の純度に精製し、つぎに以下のように特徴づけた。４０ｋＤタンパク質の吸収スペクトルを測定した；それは、上記Ｆ１）　と同様に測定されたタンパク質濃度を基礎とした、２８０１でＥ１％＝１５９の吸収係数と、Ｒ＝　２．３というスペクトルの最大（２７８ｎｍ）及び最小（２５０ｎａ）の間の吸光度の比率（Ｒ）を示す。５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ｐｈ＊＋ｉ＊ｅｉｘ）上でのＦＰＬＣ実施により測定した場合、４０ｋＤタンパク質調製物の約６０％は３００ｋ［ｌより小さい分子量のオリゴマー型から成り、調製物の４０％以上は約１０００ｋＤの分子量の可溶性凝集体型から成る。しかしながら、これらの条件下では、４０ｋＤタンパク質はモノマーとして５ａｐｅｒｏｓｅ１２カラム（４Ｍ尿素中）から溶出するため、この凝集は４Ｍ尿素中で可逆的であることが判明した。アミノ酸配列４０ｋＤタンパク質のＮ−末端配列は、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−３６ｒ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒであることが判明した。Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ配列は、次のＡｓｎで開始するフィブロネクチンドメインのＮ末端に付加される（第１９図参照）。ポンジインプラントを用いて研究した。予備的な結柔は実施例１Ｇに記載している。方　法実施例５及び１５に記載されたと同様に調製された精製４０ｋＤタンパク質を、最終濃度０．２〜０．５■／ｍｌで、等張（２１１５ミリオスモル）の、滅菌した、発熱物質無含有塩水と結合した。滅菌ポリビニルアルコールスポンジ円板、即ちイヴアロンＩｖｉｌｏｎＴＭ（Ｕｏｉｐｏｉｎｔ　Ｉｎｄｏｓｔｒｉｅｓ、　二二一カロライナ）を、雌Ｓｐｔａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｒラット（体重１５０〜２００ｇ）　（生後６〜８週）の背部皮膚の下に、外科的に皮下植込みした。２〜３ａａの長さの単一の縦方向切開を、麻酔動物の正中線に沿って行ない、毛をそり、消毒した十分な厚さの皮膚を貫いた。この切開によって、切開部から　１〜２ａｌの距離で、互いに２〜３ａｓ離して、４個のスポンジ（ＬＯｍ）を挿入し、筋肉層（ｐ＊ｎｎ１ｃｕｌｎ＋　ｃ’ｔ＋ｎｏｔｏ＋ｊ下に置いた。各動物に４個の滅菌スポンジを植込み、個々のラットからの等しく処理されたスポンジに関して、各実験条件の分析を行なった。植込み後５日目に、動物を軽く麻酔し、スポンジに０．１ｍｌの下記の試験物質の１つを注射した＝０．９％塩水のみ；塩水中に溶解した４０ｋＤタンパク質（０５■／ｍｌ）；ヒト血漿から精製され、塩酸グアニジン中に保存され、使用前にＰＢＳ（３回交換）に対して透析された天然のフィブロネクチン（塩水中に１■／ｍｌ）；及びウシ血清アルブミン（塩水中に１■／ｍｌ）。注射後４８時間目に動物を屠殺した。植込んだスポンジを切り出して粗く付着した脂肪や筋肉を除去し、計量した（湿重量）。スポンジは、ＤＮＡ、タンパク質及びコラーゲン含量に関して分析した。各動物からのスポンジ１個を緩衝ホルマリン液で固定し、組織学的切片を調製して、マラソン三色染色法で染色して、細胞及び基質成分を明示した。ＤＮＡ含量及びタンパク質含量を測定するために、スポンジをＩＮ　ＮＨ４ＯＨ中でホモジエナイズして、４℃で一晩抽出した。ＤＮＡ含量は、Ｂａｒｔｏｎの方法（２９）に従って測定した。タンパク質含量は、Ｌｏｖｒ７の方法に従って測定した。コラーゲン含量の測定値としてのヒドロキシプロリン含量は、真空中でスポンジを酸加水分解（１１０ ℃で６時間、６Ｎ　ＨＣｌ）後、Ｗｏｅｓｓｎｅｒの方法（３０）によって測定した。結　果菓１３図に示される結果は、４０ｋＤタンパク賀で処理したスポンジのＤＮＡ及びコラーゲン含量が塩水処理又はＢＳＡ処理スポンジに比して増大することを立証している。ＤＮＡ及びコラーゲンレベルは、４０ｋＤタンパク質処理スポンジでは有意に上昇したが（１）＜０．０１）　、ＬかＵＢＳＡ処理スポンジにおいては上昇しなかった。第４０図に示された結果は、４０ｋＤタンパク質で処理したスポンジが、正の対照である血漿フィブロネクチン（ＦＮ）で処理したスポンジと同様に、ＤＮＡ及びコラーゲンレベルの上昇を生じた、ということを示す。別の正の対照である表皮成長因子は、同様の効果を示した。薬物動力学放射能標識した４０ｋＤタンパク質の薬物動力学をラットで試験し、静脈注射の結果を第１４図に示す。静脈注射後の４０ｋＤタンパク質の半減期は３．２時間、腹腔内注射後は４．２時間である。した。試験物質を鰯歯順に静脈注射し、血液試料（注射後種々の時間に採取した）から調製したＰＲＰをｉｎマＮｒｏでの血小板凝集に関して試験した。用いた方法は、実施例７に記載されたものと同じである。ラットにおいては、各動物は単一試料のみを供給し得るし、対照動物は比較のための基準として用いる。対照動物においては、タンパク質の代わりに等量の燐酸塩緩衝塩水を注射する。ウサギでは、各動物は多重試料として用い得るし、試験物質の作用時間経過を確定し得る。ラットの実験では、３〜１５■／ｋｇの３３ｋＤタンパク質を注射するが、いくつかの実験においては、３３ｋＤタンパク質は、注射後１０〜１５分の範囲の時間で、ＡＤＰによる血小板凝集を完全に阻害する。しかしながら、阻害の程度が大きく変動するので、さらなる研究が必要である。ウサギを用いた限定数の試験では、３３ｋＤタンパク質の阻害効力は注射後１／　２時間まで観察された。これらの結果は、抗血栓薬としての３３ｋＤタンパク質の効力をさらに支持するものである。薬物動力学ラットに静脈注射した後の放射性標識３３ｋＤタンパク質の薬物動力学を試験した。その結果を第２７図に示す。静脈注射後の血中３３ｋＤタンパク質の半減期は４０分であることが判明した。下記の事項は、実施例９に記載されたのと同様に製造される組み換え３１ｋＤフィブリン−結合ドメイン（ｒ　３１ｋＤ）の精製の改良手法である。その工程は次の　３段階より成る：１、細菌ケーキの粗製プロセッシング。２、再生／再酸化。３、精製。細菌細胞ケーキを、先ず５容積の５０ｍ１ｌ　トリス−ＨＣ１／　５０ｉｉ１Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８（緩衝液１）中で粉砕する。つぎにそのペレットを、１００■／１リゾチームを含有する緩衝液１で（３７℃で２時間）、　１％トリトンｘ　−１００を含有する緩衝液１で（室温で３０分）、そして水で２回、順次処理する。これらの工程は全て、ペレットの粉砕と遠心分離によって実行する；ｒ３１ｋＤは、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより立証されるように、ペレット中に留まる。１．２　ペレットの抽出：洗浄したペレットを１４容積の１０１１Ｍトリス−ＨＣｊ１５ｍＭＥＤＴＡ／２ｍＭ　ＰＭＳ　Ｆ／２ｍ１ｌ　ｘブシロンーアミノカブロン酸塩（緩衝液Ａ）　ｐＨ７，５中に懸濁し、つぎに　（１）１％硫酸デシル：（ｂ）　１％硫酸デシル１５％グリセロール、及び　（Ｃ）５％グリセロールを含有する緩衝液Ａで順次処理する。最終処理は、添加物を含まない緩衝液Ａを用いる。２、再生／再酸化組み換え３１ｋＤ断片（ｒ　３１ｋＤ）に関する再生／再酸化手法が開発され、改良された。２、１　原　理　：グルタチオン（Ｇ　Ｓ　Ｈ）のようなチオール還元剤の存在下で６Ｍグアニジン −ＨＣｌ　（ＧｕＣｌ）中にペレットを溶解すること、及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の付加によって、より低いＧｕＣｊ濃度で再生／再酸化すること。２、２　手　法：抽出ペレットを、緩衝液Ａ、ＰＨ８，０に溶解した６ＭＧｕＣ１／　３ｍＭ　ＧＳＨの１００〜７００容積に溶解する。透析緩衝液中のＧｕＣｌの濃度を、例えば先ず３Ｍ、つぎに１５Ｍ１そして最後に０．５Ｍといったように漸次低する一方、他の全ての成分の濃度は一定に保つ。ＧｕＣｌの中間濃度、即ち　２Ｍ〜ＩＭのある濃度で、再生を、Ｑ、　３ｉＭのＧ５５Ｇの付加と、ｐＨ８で室温で４８〜７２時間のインキュベージコンによって、開始する。つぎに再生ｒ　３１ｋＤを、添加物を用いずに、ｐＨ８，５で緩衝液Ａに対して透析する。具体例：約１０グラムの抽出ペレット（１，２参照）をホモジェナイズし、１リツトルの緩衝液Ａ／　６Ｍ　ＧｕＣ１／　３ｍＭ　ＧＳＨ／ｐＨ８に溶解し、その懸濁液をそれが透明溶液になるまで１４時間撹拌した。この溶液を、付加的に３＋ａＭＧＳＨ及び３Ｍ　ＧｕＣｌ。を含有する緩衝液Ａ、ｐＨ８の４リツトルに対して２４時間透析した。つぎに、その結果生じた溶液を、３ｍＭＧＳＨを含む緩衝液Ａ、　ｐＨ８の８リツトルに対して２４時間透析した。その結果生じた溶液を、Ｑ、　３１ＩＩＭ　Ｇ　Ｓ　Ｈ及び０．３ｍＭ　Ｇ５５Ｇを含むｌＯリットルの緩衝液Ａ、ｐＨ８に対して２回透析した。透析工程は約８０時間継続したが、この間には再酸化も起きた。最後に、１０リツトルの緩衝ＩＡ、　ｐ）Ｉ　８．３〜８．５に対する透析によって再生されたタンパク質からグルタチオンを除去した。この工程を２回実行した。つぎに、その溶液をフェニルーセファロースカラムグルタチオニンの代わりにシスティン（３ｄ）を用いた場合、及び酸化グルタチオンの代わりにシスチン（３ｉＭ）を用いた場合には、同様の結果が得られている。２．４　チオレドキシンの使用二チオレドキシンを用いてｒ　３１ｋＤの再酸化率を増大させることも試みた。メルカプトエタノール（ＭＥ）の非存在下で処理した５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールに基づいて、“スクランブル（＋ｅｒｘｗｈｌｅｄ）”物質のチオレドキシン還元及び再酸化はｒ　３１ｋＤのより均質な調製物を生じると思われるが、しかし使用しなければならなかったチオレドキシンの濃度は約１００ｍＭであった。 “スクランブル物質”は、ｒ３ＬｋＤであって、これは、　１つ又はそれ以上の間違ったジスルフィド結合の形成により、明らかに不適当に折りたたまれる。先ず、大量の再生ｒ　３１ｋＤを遠心分離して“スクランブル”ｒ　３１ｋＤか又は夾雑物を含む不溶性ペレットを除去する。上清を緩衝液Ａに溶解した０、２Ｍ硫酸アンモニウムとし、同一濃度の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡させたフェニル−セファロースカラムにロードする。つぎに、塩濃度を低下させることにより、即ち緩衝液Ａ中で溶出させることによって、ｒ３１ｋＤタンパク質を精製する。具体例：１０グラムのペレットから抽出した粗製タンパク質混合物を再酸化後、再生及び “スクランブル”ｒ　３１ｋＤ、並びに不溶性夾雑物の懸濁液を、Ｊ−１４０− ターを装備した高速Ｂｓｃｋｂｍｘｎ遠心分離機中で、１３．０００＋ｐｍ（１７，０００ｘ　ｇ　）で遠心分離する。上清（１，２８０ｍ１　）を硫酸アンモニウム（ＡＳｉ）で２Ｍにして、予め０、２Ｍ　Ａ　Ｓを含む緩衝液Ａで平衡させたフェニル−セファロースの４５　ｍｌカラムにロードした。そのカラムを１５０ｍ１の同溶液で洗浄した後、１５０ｍ１の緩衝液Ａ１５０ｍ１の水、及び５０ｍ１の６ＭＧｕＣ１で洗浄した（第５１図及び第５２図）。ｒ　３１ｋＤ断片の精製の最終工程は、それが流出（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏＢｈ）画分中に溶出するＱ−セファロース上でのクロマトグラフィ、もしくはそれが塩勾配の使用によって溶出されるへ７＜リン−セファロース上でのクロマトグラフィである。それはＳ−セファロースとも結合するが、しかし溶出物質は依然として大半の不純物を含んでいる。具体例：緩衝液Ａピークの約１／２を、それが緩衝液Ａに溶解した１５Ｍ　ＮａＣ７の溶液によって溶出される１０ｍ１へノくリン−セファロースカラム上で濃縮し、精製した（第５３図）。濃縮３１ｋＤを、緩衝液Ａ、ｐｌＴ８．５に対して透析し、その後、予め同一緩衝液で平衡させたＱ−セファロースの４０ｍ１カラムにロードした。流出及び洗浄画分中に溶出した精製ｒ　２３１ｋＤ断片を凍結乾燥によって濃縮し、その後特徴付けを行った。そのカラムを　ＩＭＮａＣｊ！のステップによって洗浄して夾雑タンパク質を除去した（第５４図）。精製物質は純度９５％以上である（第５１図）。３．３　ペレットの再抽出：再生操作後、ペレットはおそら（４スクランブル”形態で５０％以上のｒ　３１ｋＤ断片を依然として含有するため、それを再抽出し、上記と同様に処理した。３カラム後の本工程の総収率（再抽出工程を含む）は、約１０％であった（表■ ）。３．４　特徴付けｒ　３１ｋＤタンパク質は特徴付けされ、その純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元ゲル上での純度プロフィール）　、５ＤＳ−ＰＡＧＥの非還元ゲルにおける移動位置（第５１図）、スベロースｚＬ上での見かけの分子量（約３７ｋＤ）　（第５５図）、イムノプロット及びヘパリン−セファロース上での挙動（ヘパリン−セファ０−スからの両物質の溶出に対するＮａＣ１濃度は約０．３２Ｍであることが判明した）に関して、その血漿由来対応物と比較されている。これらの全アッセイにおいて、ｒ３１ｋＤタンパク質は血漿由来フィブリン結合ドメインと同様である。４、その再酸化／再生に関する種々の形態のｒ　３１ｋＤ間の比較３つの異なる形態のｒ　３１ｋＤタンパク質が定義されている＝ａ型：　６Ｍ　ＧｕＣｊ！に溶解後に洗浄済ペレットから得られる、即ち°スクランブル”形態の、タンパク質。ｂｆｉ：　６Ｍ　ＧｕＣ１存在下でＧＳＨのような還元剤で処理した後に存在する、十分に還元されたタンパク質。Ｃ型：上記と同様にＧＳＨ／Ｇ５５Ｇで処理して得られる再酸化−再生タンパク質。これら　３ｍは、以下によって相互に区別できる。（１）　還元試薬の非存在下で（即ちＭＥを含まずに）、そしてチオール−捕捉剤のヨードアセトアミドの存在下での、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのその移動（第５１図）；及び（ｉｉ）　ＭＥ非非存上下処理されたゲルのイムノプロットにおける抗血漿３１ｋＤとのそれらの反応。正しく再酸化−再生された形態のものだけが抗体と反応した。ＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ存在下（又はシスティン／シスチン存在下）での再酸化に関する上記研究は、ｒ　３１ｋＤタンパク質が経時的に、血漿由来フィブリン結合ドメインのものと区別できない　（Ｃｌ型に再生することを示している。１スクランブル″″　ｒ　３１ｋＤタンパク質の特徴付け：本タンパク質は、抽出後にペレット中に大量に残留することから明らかなように、この形態ではほとんど溶けないと考えられる。さらに、スクランブル型タンパク質は、フェニル−セファロース及びＱ−セファロースの両方とのその結合特性において、再生タンパク質とは異なる。十分に還元されたｒ　３１ｋＤタンパク質の特徴付け：このタンパク賀形態は、 “スクランブル”型のものよりも可溶性であり、且つより均質である。ＧＳＨ（又はＤＴＴ、又はシスティン）の存在下で６Ｍ　ＧｕＣＪ中に溶解後に変性剤の濃度をほとんどゼロに下げると、“還元型”タンパク質は、ＧＳＨ存在下でフェニル−セファロース上で精製可能である。最後に、Ｇ５５Ｇを用いて、ＧＳＨの濃度の１／　１０．即ち０．３ａ＋Ｍで、そのタンパク質を“再酸化”する。これは再生型３１ｋＤを生じなかったが、しかし、おそらく還元型タンパク質は、それがＧ５５Ｇに露出される前であっても、スクランブル形態に徐々に自動酸化するために、前項に記載のものとは異なる“スクランブル”タンパク質の形態を生じた。５、還元−カルボキシアミド化３１ｋＤタンパク質の調製精製血漿由来又は組み換え３１ｋＤタンパク質（約０．６■／ｍｌ）を室温で２４時間、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ１１，５に溶解した４、３Ｍ塩酸グアニジニウムヒドロクロリド（Ｇ　ｕ　Ｃ１）　、４０ｍＭ　β−メルカプトエタノール（ＭＥ）中で２４時間室温において還元した。カルボキシアミド化は、ＭＥの濃度の４倍以上の濃度でタンパク質にヨードアセトアミドを添加することによって行なわれ、その溶液を室温で１時間、インキュベートした。つぎに、ＧｕＣｊ濃度を漸進的透析によって低減しく３Ｍ、２Ｍ、ｔＭ。及び０．５Ｍ　ＧｕＣＪに）、その後、緩衝液Ａに対して透析した。生成した沈澱物を遠心分離し、その結果生じる上溝中の３ＬｋＤタンパク質の濃度は、血漿由来３１ｋＤ及び組み換え３１ｋｌ）のそれぞれに関して、０．３４及び０．１９■／ｍｌであった。血漿由来３１ｋＤを用いた予備試験において、阻害作用は、血小板凝集アッセイを用いた場合に観察された（実施Ｎ８）。したがって、ＡＰＡにおける血漿由来３１ｋＤの抗凝集特性を立証する実験を再現するための試みは不成功に終っている。実施例２５ラットにおけるヒト血漿性フィブロネクチン（３１ｋＤ）のアミノ末端３１ｋＤ断片の薬物動力学ＦＮのアミノ末端断片の代謝挙動を解明するために、ヒト血漿由来ＦＮ（実施例８に記載されたのと同様に調製）のトリプシン分解の３１ｋＤ断片の精製調製物をＩＣＩ法（Ｙｏｇｅｌ　ｅｔ　１１．。 −ド化し、９匹のラットに静脈注射した（４．５ＸｌＯ’　ｃｐｓ　；　０．５ ■／ｋｇ）。注射して１０分後に、次いで注射後１．４．７及び２４時間目に血液試料を回収した。各々　３匹のラットの群を１．７及び２４時間目に層殺し、種々の器官を切り出して、放射能に関して分析した。２４時間群ラットは個別代謝ケージで飼育し、累積尿及び糞を７時間目と２４時間目に収集した。検出された放射能が無傷タンパク質又は小分解断片を示すか否かを調べるために、試料をＴＣＡ沈澱させた。血清中の総放射能及びＴＣＡ沈澱放射能の薬物動力学を第５６図に示す。図示したように、注射した３１ｋＤタンパク質（ＴＣＡ沈澱性）の血中レベルは、最初の１時間で初期値の約３０％に急速に低下した。その時点での分解の程度は約４Ｇ％であった。、血中レベルは、その後３時間の間に初期値の約１０％にさらに減少した。ＴＣＡ沈澱性の値の最初の３　Ｉｏｌｉｐｏｉａｊｓ　（１０分、　１時間及び４時間）に適合する一次ラインは、１．５時間の半減期と一致した。その後の血清中のＴＣＡ沈澱性Ｃ９ｍの減少は著しく低速であった（ｔ　＝１１時間）が、一方分解程度は増大しなかつた（血清中に約５ａ〜７０％ＴＣＡ可溶性放射能）。尿中では、注射された放射能の３０％は最初の７時間の間に排出されたが、残り（〉９０％）は２４時間後に排出された。尿の放射能は全て、ＴＣＡ可溶性であった。種々の器官（腎臓、胃、肝臓、肺、子宮、卵巣、副腎、結腸、回腸、皮膚、脳、眼、筋肉、膀胱、心臓、膵臓、気管、大動脈及び大静脈）の分析は、いかなる特異的蓄積も示さず、放射能の消失の動力学は血液の場合と同様のパターンにしたがった。はとんどの器官において、比放射能（組織ｔｇ当たりのｃｐｓ）は血清の場合より低かった；例外は７時間目の回腸と胃であって、これらは４倍高い値を示した。７時間目の胃及び回腸組織のホモジエネートのＴＣＡ分析から、はとんどの標識がタンパク質の小分解生成物に関連していることが明示された。結果は、ＦＮの外因性血漿由来３１ｋＤアミノ末端断片は体内で中等度に分解されて、排出されるということを示す。その薬物動力学的挙動は一次動態と一致せず、これは、タンノくり質が血液以外の組織及び身体区分中に中等度に配分されることを示し得る。これは、分解の程度が４〜２４時間の期間中は増大せず、したがって身体区分からのタンパク質の漸進的放出を反映する、という所見からも明らかである。尿中の代謝物質の排他的且つ相対的に早期の出現は、タンパク質が腎臓を通じて容易に排出されることを示す。肝臓にその物質の蓄積が認められな１嘱ことは、この器官が分解の主な場所ではなく、解毒に関与しないことを示すものと思われる。３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄの相対的に短い半減期は、血栓の診断イメージングにそれを使用できるかもしれないために、重要である。血漿由来３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ又は組み換え３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ　（ｒ　３１ｋＤ）を放射能で、又は他の方法によって標識して、つぎに血栓をイメージングするために血中に導入することができる。半減期が短い分子はまた、クロット形成を防止するためにそれを利用する場合にも重要である。これに対比して、一般的に選択される治療薬であるヘパリンは、非常に長い半減期をもつ。実施例２６組み換えフィブリン結合ドメイン（ｒ　３１ｋＤ）の生物学的活性精製組み換え３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄタンパク質の生物学的活性を、ヒト血漿由来ＦＮ、又はヒト血漿由来ＦＭの部分的トリプシン消化物（実施例８）から得られた３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄタンパク質の生物学的活性と比較した。アッセイした生物学的活性は、１ｎマｉマ０及び合であった。 ■、フィブリン結合２組の実験を実施した。１組目の実験では、１２５　■＋　ｒ３１ｋ［ｌのフィブリンとの結合をクロット形成中モニターした（反応工）が、一方、２組目の実験では、１２５Ｉ−ｒ３１ｋＤのフィブリンとの結合を、クロット形成機種々の時点でモニターした（反応ＩＩ）。クエン酸塩前血液中でクロット形成を可能にするために、トロンビン又はＣａ　を混合物に付加した。血漿由来３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄを、ヒトのフィブロネクチンの部分的トリプシン消化により得た（実施例８参照）。実施例２４にしたがって、大腸菌Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉにおいてｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄを産生し、その後、細胞溶解産物のペレットから精製した。フィブロネクチンは、ヒト血漿から得た。ＦＢＤ及びＦＮの１２５■−標識を、ＩＣｆ法（３１）によって実施した。２０〜２００ｃｐｍ／ｎｇの比活性を有する標識タンパク質をＱ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳの溶液に溶解した小アリコートにして一２０℃で保存した。シリコン処理微小遠心管中の完全反応混合物は、２５０μｌの最終容量で次の成分を含有した：２０〜２０Ｇμ！ヒト全血（図面の説明に示されているように、新鮮、非りエン酸塩加、又は１〜７日目、クエン酸塩前）０．１％ＢＳＡ５ａ＋Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２１Ｕ／ｍｌトロンビン１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ非りエン酸塩加血液を用いて結合を測定する場合、Ｃａ　Ｃ１２及びトロンビンは添加しなかった（“無処理（ｎｉｉマｅ）血栓”）。全成分を、ＰＢＳ中で調製した。反応混合物は、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（２５ｍＭ）を加えて反応を終結し、小型遠心分離機中で最大速度で３分間、遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１ｍｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、５ｍＭＥＤ’ＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ中で２回洗浄した。ペレット中の放射能は、ガンマ計数器でモニターした。非放射性タンパク質と競合させた場合、競合するタンノくり質を図面の説明に示された濃度で　１２５■−標識タン／＜り質とともに加えた。反応混合物は、１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤ以外は、反応Ｉに示されたと同じ成分を含有した。最初のイシキュベーションは３７℃で３０分実行し、次に　■−ｒ　３１ｋＤのみを加えて、反応混合物をさらに３０分間（２回目）インキュベートした。反応■は、反応Ｉに関して上記したのと同様に終結させ、測定した。葭！１２５１−　ｒ　３１ｋＤの、クロット形成中の２フイブリンとの結合（反応Ｉ）又は前形成（ｐｒｅ［ｏ＋ｍｅｄ）クロットとの結合（反応■）に及ぼすトロンビンとＣａ”＋の作用を、クエン酸塩間ヒト全血で研究した（第５７図）。トロンビンの特異的阻害剤であるヒルジン（３２）は、反応工における　１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤのフィブリンクロットとの結合を低減したが、これはトロンビンが結合に必要であることを示して０る。トロンビンが阻害される場合、クロット形成の低減が認められ、結合のためのフィブリンが少なくなる。クエン酸塩を血液に添加すると、血清中の遊離Ｃａ　濃度が有意に低減し、したがってフィブリンクロット形成のためのＣａ　の添加は必須である。しかしながら、ｒ３．ｌｋＤの前形成りロットとの結合は、前形成りロットにより遊離Ｃａ”＋イオンが既に枯渇して０る血清中で実行される場合には低減する。Ｃａ　をＣａ　枯渇血清に添加すると、ｒ３１ｋＤ結合は増大する。結合に及ぼすＣａ　のこの作用は、ＰＢＳ中で結合を測定した場合には、劇的に立証された。Ｃａ　の添加は、反応Ｉにおいて観察されたよりも高程度にさえ、結合を増大させた。したがって、クロット形成及びｒ　３１ｋＤ結合はともに、Ｃａ＋＋イオン依存性である。このように、反応■における　１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤのフィブリンとの結合は、血清の代わりにＰＢＳ　（燐酸塩緩衝塩水）中でアッセイを行う場合に増大する。１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤがクロット中でフィブリンと共有結合で結合するか否かを測定するために、アミノ酸Ａｒｇ２５９とＴｈｒ２６０との間で血漿由来ＦＮのＮ末端ドメインを切断することが公知であるプラスミン（３３，３４）を　Ｉ　ｒ３１ｋＤが結合した後にクロットに添加した。プラスミンとともに種々の間隔でインキュベーションを実施した（第５８図）。その結果は、プラスミンがクロット（ペレット）に結合した放射能の低減を引き起こすことを立証した。ペレット中の放射能の低減は時間依存性であって、プラスミンがｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄを切断したという事実に帰せられた。上清中でモニタリングされた放射能量は、時間とともに増大した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にプラスミン可溶性反応分画（上清）をロードすると、短縮形の切断１２５１−　ｒ　３１ｋＤを検出することができる。フィブリンクロットからの１２５１−　ｒ　３１ｋＤの放出は、プラスミン切断によってのみ生じ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、及びβ−メルカプトエタノールを含有する溶液を用いて１００℃に加熱することによっては生じない。したがってこのことは、１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤが共有結合でフィブリンクロットと結合することを立証している。異なる濃度での種々の非放射性組み換え型及び血漿由来ＦＢＤｌｌ製物、並びにヒト血漿由来フィブロネクチンの、クロット形成中の１２５１−ｒＦＢＤのフィブリンとの結合（反応Ｉ）を妨害する能力を調べた（第５９図）。得られた結果は、０．１５μＭ１２５Ｉ−ｒＦＢＤのフィブリンとの結合は、非標識ｒ　３１ｋＤ、非標識血漿由来３１ｋＤ、又は非標識ＦＭの存在下では、２０倍過剰の濃度（３μＭ）までで、同様であるか、もしくは増大することさえあった、ということを立証している。しかしながら、新しく形成されたフィブリンクロットの量を、次善の濃度のＣａ　Ｃ１２及びトロンビン（それぞれ１ｍＭ及び０３単位／ｍｌ）を用いるか、もしくは反応における血液量を本来規定された量の　１／１０に低減することによって低減した場合、クロットへの結合に関する非標識ＦＢＤと　Ｉ−ＦＢＤの結合との間の競合は有意になった。ＦＢＤ結合反応の特異性をさらに研究するために、われわれは、ｒ　３１ｋＤの結合とその還元型の結合（実施例２４）とを比較した。これらの研究のために、還元−カルボキシアミド化血漿由来３１ｋＤのあるバッチ、還元−カルボキシアミド化ｒ　３１ｋＤのあるバッチ、及び十分に還元されたｒ　３１ｋＤのあるバッチを用いたが、これらは全て、実施例２４の記載と同様に調製した。意外にも、これらの種々の還元型の３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄは、Ｉ− ＦＢＤの結合において劇的低減を引き起こした（０．３〜３．０μＭによって４０〜８０％の低減：第５９図）。また、十分還元されたＦＢＤの存在下で新規に形成されたクロット（反応りのサイズの劇的縮少にも注目した。クロット形成は、高濃度の十分還元型Ｆ　Ｂ　Ｄ　（５μＭ超）の存在下で総体的に阻害された。同様の阻害作用は、再生”Ｉ−ＦＢＤの前形成フィブリンクロットとの結合（反応■）における種々の還元型３１ｋＤタンパク質が示したため、血清トランスグルタミナーゼＸＩＩ［ａ因子が触媒するＦＢＤのフィブリンクロットとの架橋反応を妨害する可能性が示唆された。トランスグルタミナーゼは、ペプチドのグルタミニル残基のカルボキサミド基及びペプチドのリシル残基のε−アミノ基を含む第一アミンが架橋されるアミド化反応を触媒するある種のカルシウムイオン依存酵素である。血漿ＦＮは、血漿トランスグルタミナーゼ、すなわちＸＩＩＩａ因子（トロンビン活性化凝血Ｘ■因子）、又は肝臓トランスグルタミナーゼの基質であり、ＦＮは、それ自体、フィブリン、及びコラーゲンと架橋され得る。Ｘ■因子架橋をされ易いグルタミニル残基は、ＦＮのＦＢＤ領域に局在する（３５）。種々の濃度の第一アミン、即ち古典的グルタミナーゼ阻害剤であるスペルミジンとプトレシンの存在下での　１２５Ｉ−ＦＢＤの前形成フィブリンクロットとの結合（反応■）を研究した（第６０図）。反応は、約５ｍＭのスペルミジン又はプトレシンによって５０％阻害された。第一アミンによる予測された阻害と同様に、結合の劇的阻害が、約２．５μＭで１／２最大減少を生じる還元−カルポキシサミド化ＦＢＤによっても観察された。イメージングのためには、ＦＢＤ結合能力に及ぼすクロット熟成の作用を測定することが重要であった。１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤの前形成フィブリンクロットとの結合を測定した。　 ”　Ｉ　−ｒ　３１ｋＤを前形成りロットに加え（１，４又は２４時間）、フィブリンとの結合をモニターした（第６１図）。１２５１　、３１ｋ［ｌのフィブリンクロットとの結合度は、１又は４時間後よりも２４時間後の方が高かったが、これはおそら（、形成されたクロットが経時的に大きくなったという事実によるものと考えられた。本実施例の実験工で示されたように、クエン酸塩加血中の遊離Ｃａ　イオンの存在は、１２５Ｉ　−ｒ３１ｋＤのフィブリンクロッ＋＋　、トとの最適結合及び架橋を得るために重要である。したがって、Ｃａ＋＋が前形成りロットによって既に枯渇した血清中では、１２５１−　ｒ　３１ｋＤのフィブリンクロットとの結合度は低く、一方、５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中では、結合度は全インキュベーション時間で高かった。３００Ｉｇ　／　ｍｌの血漿由来ＦＮをＣａ”＋存在下で競合剤として付加した場合、フィブリンクロットと結合する　ｒ　−ｒ　３１ｋＤが２０％低減したが、これはおそらく、有効なフィブリン結合部位における何らかの競合によるものと思われた。 “古い”　（前形成）血栓と“新規形成“血栓とを区別する能力は、血栓イメージングのためのプローブの重要要件である。第６２図は、“古い”クロット及び”新規形成“クロットと結合する　１２５Ｉ　−ｒ　３１ｋＤを比較するために計画した実験を示す。第一の実験では、１２５１−　ｒ　３１ｋＤをクロット形成（“新規形成”）の開始と同時に加え、７日間のインキュベージラン中、クロットと相互作用させた。ＦＢＤが効果的に取り込まれ、取り込まれる量は最初の２日間は増大することが示され、おそらくこれは、その期間中にクロットのサイズが増大したことを示すものと考えられる。第二の実験では、　１２５１−　ｒ　３１ｋＤを、２時間の限定期間の間、熟成りロット（生成後１〜７日目）に加えた（“前形成”）。ＦＢＤ取り込みの程度は、クロット熟成時間にかかわらず、一定のままであった。しかしながら、本プロトコルでの結合度は、第一実験の場合よりも低いことに留意されたい。これらの実験は、プローブ１２５ｒ　−ｒ　３１ｋＤが、“古い”クロット−血栓と、依然として成長過程にあるものを区別するために２つの異なるプロトコルに用い得ることを示唆している。７、血漿“トロンビン時間”　（“ＴＴ”）全血の凝血に及ぼすｒ　３１ｋＤタンパク質の作用を、トロンビン時間として定義される臨床的実験パラメータを用いて測定した。この反応においては、１００μｌのクエン酸塩加健常ヒト血漿のアリコートを１００μ１ＰＢＳ、及びトランスグルタミナーゼ阻害剤スペルミジンかあるいは、還元−カルボキシアミド化ｐ３１ｋＤ又は再酸化−再生ｒ　３１ｋＤと混合した。絶えず混合しながら、２００μ！トロンビン溶液を各アリコートに加えた。トロンビン添加からクロット形成までの時間を測定した。これを、 “ＴＴ”として秒で表わす（表■）。トランスグルタミナーゼ及び“還元−カルボキサミド化”ＦＢＤの作用本実施例の第４項で、トランスグルタミナーゼ阻害剤が１２５１−　ｒ　３１ｋＤのクロットとの結合を低減することを立証した。本項では、結合反応に及ぼすブタ肝臓からの外因性トランスグルタミナーゼの作用を研究した。第６３図に示した結果は、外因性トランスグルタミナーゼを付加すると　１２５ｒ　−ｒ　３１ｋＤのクロットとの結合が劇的に増大することを立証するが、これは、この酵素がこの反応の律速段階であるかもしれないことを示している。さらに、内因性及び外因性の両トランスグルタミナーゼ依存結合活性は、還元− カルボキサミド化ＦＢＤによって等しく低減した（それぞれ、０．３μＭ及び１．５μＭ“還元”ＦＢＤにより約５６％及び７２％阻害）。これらの結果は、“還元”型のＦＢＤが、グルタミン転移及び架橋反応を妨害することによって、再生型のＦＢＤのフィブリンクロットへの結合を阻害することを示す。これはおそら（、フィブリンクロットの不安定化を引き起こすものと思われる。ｙｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒ’ｓｎｄ因子、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンポスポンジン、コラーゲン、及びラミニンのような接着性分子は、内皮細胞の除去によって形成されるＥＣＭと結合する。ｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄは、損傷部位でのプラーク形成の初期段階をイメージングするために役立ち得る。種々の濃度での１２５！−ｒ　３１ｋＤのＥＣＭとの結合を、トロンビンの存在下又は非存在下で調べた。結果は、低濃度での１２５１−　ｒ　３１ｋＤのＥＣＭとの結合がトロンビン（０，３μＭ）の影響を受けないことを立証した。高濃度のトロンビンの場合には、ｒ３１ｋＤの結合度はわずかに高く、これは、自然に存在する結合部位の数が限定されていて、トロンビン消化により付加的結合部位が露出されたのかもしれないことを示す（東６４図）。１２５１’　−ｒ　３１ｋＤがＥＣＭと結合し得るという事実は、それが裸化血管における初期プラーク形成をイメージングするのに有用であることを示す。表　■ トロンビン濃度　添　加　“ＴＴ”値（μ／ｍ１）（秒）　（％）（〉）１２．５　２５．５　１ｏｏ　− １ｍＭスペルミジン　４４　１７２　７２Ｉ［１，２５５５，４１００− １ｍＭスペルミジン　１１４　２０５　１Ｇ５″Ｒ”　ＦＢＤ＝還元−カルボキサミド化ｐ３１ｋＤ″Ｆ”ＦＢＤ＝再生ｒ　３１ｋＤ広範なグラム陽性細菌の創傷への付着及び侵入にフィブロネクチンが関与することは十分に確定されている（３６）。真正血漿由来ＦＭのフィブリン結合ドメインは、細菌表面上の特異的受容体と高親和性を伴って相互作用することが示されている。黄色ブドウ球菌Ｓ［！ｐｂ７１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ＋ｅａｓが一般的に感染を開始する部位は、ＦＮが豊富である。例えば血餅中、及び内皮下である。さらに、外因性ＦＮは、これらの部位への細菌の付着を増強する。ＦＮは、可飽和、特異的表面タンパク質受容体を介の結合定数を有する高親和性受容体及び１細菌当たり　１００〜２０、０００の範囲の受容体数が示された（３７）。ＦＮ受容体の発現は、臨床的単離体の侵入性及び病原性に相関する。機械的手段による、又は抗生物質存在下での細菌の増殖によるＳ、　＊ａｒｅａｓからの受容体の除去は、ＦＮに付着するそれらの能力を低減する。ＦＮは、細菌結合活性に加えて、細胞結合活性及びコラーゲン結合活性を有する多機能ドメインから成る　２価の分子であるので、細胞外基質の種々の成分により、並びに組繊細胞中のＦＮ受容体によって創傷に細菌を固定することができる。材料と方法溶液中での細菌の標識したＦＮ又はＦＢＤとの結合Ａ、直接結合反応種々の濃度の１２５ｒ　−ｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ又は１２５■−ＦＮを、付加的に０．１％Ｔｖｓｅｎ及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液中の５×における総放射能量を、細菌付加直後に採取した２０μ！アリコートを用いてアッセイした。その混合液を２０℃で２時間インキュベートした。結合量は、１００μ！のインキュベージコン混合液を取り出シ、５ｍｌのシリコン処理した試験管中の３ｍｌの１０％パーコール、０．１５Ｍ　ＮａＣｊ上に積層した０、５ｍ１ＰＢＳの上に積層することによって、アッセイした。つぎに、これを２０℃で１５分間、１．３５０Ｘ　ｇ　（ＳＷパケットローターで４．０００ｔｐｉ）で遠心分離した。上溝を吸い出し、放射能に関してベレットをアッセイした。Ｂ。非標識ＦＮ、ＦＢＮ及び関連分子の競合以下の操作は、３μｇ　／　ｍｌの　Ｉ　−１）　３１ｋＤを用いたことと、規定量の競合分子（ＦＮ又はＦＢＤ）も最初の結合混合液に加えたことを除いては、上記操作と同じであった。 ■、放射能標識細菌の固定化ＦＮとの結合プラスチックバイアルを０．３ｍｌの５０Ｍｇ　／　ｒｓｌ　Ｆ　Ｎ又は１％ＢＳＡでコートした。その管を、振盪しながら　４℃で一晩インキユベートした。つぎにその管を５ａＩＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳに溶解した１％Ｂ５Ａ３ｍ１を加え、その管を、振盪しながらさらに２０℃で２〜３時間インキュベートした（遊離部位のブロッキングのため）。間接的結合実験では、細菌を阻害剤とともに４℃で２時間ブレインキュベートした。その細菌（４Ｘ　１０６ｐｆｕ　／ｍ１．３ｐｆｕ／ｃａ１１）ヲ、図（７）　説明テ指示した濃度でびんに加えた。アッセイ混合液の最終容量はＧＪｍｌＰＢＳであった。その混合液を、４℃で９０〜１２０分間、ゆっくり撹拌した。つぎにその管をデカントし、５ａＩＰＢＳで３回洗浄した。３Ｈ−標識細菌の結合に関してアッセイする場合は、５ｍｌのシンチレーション液を加えた。 ■、標識細薦とカテーテルとの結合カテーテル〔ＵＮＯ”滅菌気管支用プラスチックカテーテル（１８ｃＨサイズ；　ＵｎｏｐｌｘＮ　Ａ／Ｓ、　Ｄｅ＋＋＋ｎａ＋ｋ）　）を１ｃｆｆＩ片と２工片に切断し、計量した後、縦方向に一度切断した。カテーテル片を５０μｇ　／　ｍｌＦ　Ｎとともに４℃で一晩、振盪しながらインキュベートした。対象は、同一条件下でＰＢＳを用いてインキュベートした。つぎにＦＮ溶液をデカントし、カテーテルをＰＢＳ中で３回洗浄した。ＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡを２０℃で１〜２時間加えることにより、ＢＳＡブロッキングを実施した。カテーテルを再び、ＰＢＳで３回洗浄した。カテーテル片を検定混合液に加えることを除いては、前項に記載されたと同様に細菌結合を実施した。使用した最終容量は３ｍｌであった。反応は、ｌＧｍ１試験管内で実施した。反応液は、２０℃で２時間インキュベートした。結合アッセイのために、（Ｈ３−ロイシン標識Ｓ、ｘｕｒｅｏｓを用いた場合、比活性はＩｃｐｉ／　３．３　Ｘ　１Ｇ３ＮＩＩであった。標識化は、Ｐ、　Ｂ、　Ｒｕｇｔｅｌ等（３８）に従って実施した。１２５■−標識ｓ、ｉａｒ…を用いた場合は、比活性はｌｅｐｍ／３ｐ＋ａであった。標識化は、Ａ、　Ｅ、８ｏｌｔｏｎ及びＷ、　Ｍ。Ｈｕｎｔｅｒ　（３９）に従って実施した）。指示濃度での競合分子を細菌とともに、２０℃で３０分間ブレインキュベートした。そしてカテーテルをＰＢＳで３回洗浄し、ガンマ計数器で直接計数した。結　果懸濁液中の　Ｉ−ＦＮ又は　Ｉ−ｒＦＢＤとＳ、ａｕｒｅｕ＋菌との結合を測定するために実験を行なった。種々の量の放射性ＦＮ又はｒ　３１ｋＤを５Ｘ１Ｇ８個の細菌に加えて２時間インキュベートし、１０％Ｐｅ＋ｃｏ！ｌ−塩水に入れて遠心分離した。ペレット中の放射能をモニターした（東６５図）。結果は、Ｉ−ＦＮの結合に比して、懸濁液中の１２５　■−ＦＢＤ（ｒ３１ｋＤ）と細菌との結合が増大することを示した。Ｓ、ｘｕｒｅｏｓとの　Ｉ−ＦＮ結合と比較した場合のＳ、ａａｒｅｏｔに対する　Ｉ　ｒＦＢＤのこの結合増大は、無傷血漿由来ＦＭの　２価のマルチドメインと比較すると、　１価のドメインの高親和性に帰し得る。結合：　°天然“非標ａｌｌＦＮ、ＦＢＤ、及び関連分子の競合一定量の　Ｉ　 −ｐ　３１ｋＤ（３Ｈｇ／ｍｌ）を、競合剤としての漸増量の種々のＦＢＤ分子の存在下で５Ｘ１ｆ１８１１１の細菌とともにインキュベートした（東６６図）。結果は、“天然”　ＦＮ、ｐ３１ｋＤ又はｒＦＢＤが　Ｉ−ｐ３１ｋＤと５ｌｏｒｅｕｓとの結合を同様の様式で阻害することを立証し、これはｒＦＢＤが天然血漿由来分子と同様に活性であることを示している。しかしながら、還元形の組み換え又は血漿由来ＦＢＤは　Ｉ−ＦＢＤと細菌との結合を最小限に阻害するに過ぎず、これは適正な折りたたみが結合に必要であることを示している。細菌結合部位をもたない関連組み換え型タンパク買（ＦＮの３３ｋＤＣＢ　Ｄ　）は、Ｓ、　ｉｎ＋ｅｎ＋との　Ｉ−ｐＦＢＤ結合を阻害しなかった。Ｂ、標識Ｓ９ｇｏｒｅｎ＋と固定化ＦＮとの結合創傷における細胞外基質への細菌の付着を妨害するｒＦＢＤ（ｒ　３１ｋＤ）の能力を評価するために、競合アッセイを開発した。このアッセイにおいては、Ｓ、　＊ｕｒｅＩｌｓのＦＮでコートされたプラスチック表面への付着、及びＦＢＤの結合妨害を測定した（第６７図寮照）。結果は、５２ｕｒ！口ｓのＦＮでコートされたプラスチックバイアルへの付着が、ＦＮ、ｐＦＢＤ又はｒＦＢＤとともにＳ、ａａ’＋ｅｕ＋をブレインキュベーションした後に阻害されたことを立証する。これらの分子による阻害程度は同様であった。Ｓ、ｘａｒｅａｓ結合部位を有していない非関連タンパク質ＢＳＡは、アルへの付着に際して、いかなる阻害をも引き起こさなかった。合併症の高出現率に関与する。に高く、約１ｆｌ’　ＰＦσ／ａｔ１であることを示す。細菌を漸増濃度のｒ　３１ｋＤとともにブレインキュベートすると、細菌とカテーテルとの結合が低減する。この阻害に関するＩＣ５ｏは０．０８〜０．８ｕ　Ｍである（＄６８図）。同様の阻害は、ｒ２０ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ及びり　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄを用いても得られた。ヘパリンの全身投与、及び／又はヘパリン結合ポリウレタンカテーテルの使用は、血栓の出現率を低減することが報告されている。したがって、５μＭヘパリンの存在下でのカテーテルに付着（第６８図）は、ヘパリンは細菌のカテーテルとの結合に影響を及ぼさなかった、ということを示しているが、しかしながら、細菌結合のｒ−ＦＢＤ阻害は、ヘパリン存在下であっても、依然として一定である。これは、ヘパリン存在下でさえ、臨床的環境でのＳ、ｘｕｒｅｕ＋のコロニー形成及び敗血症の阻害にはｒ　３１ｋＤが有用であることを示している。結　論これらの結果は、ｒ　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ又は血漿由来３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄが、創傷の細菌コロニー形成を防止する際に治療的に用い得ることを示す。種々のＦＢＤタンパク質は、平均的当業者に十分公知の適当な製薬的処方で処方し、つぎに適当な期間、創傷領域を“潅注（ｉｒ＋ｉｇＩｔｅｌ″又は“浸液（ｆｆｏｏｄ）”又は治療するために用い、それによって創傷の細菌コロニー形成を防止する。実施例２７ウサギ大動脈病変モデルにおける血漿由来３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄの血栓とを立証するために、ウサギにおける血栓形成モデルを用いた。このモデルにおいては、大動脈壁の一部分の内皮層をバルーンカテーテルで除去して、内膜を露出した。これによって、病変域に血栓の薄膜が続いて形成する。ウサギに全身投与された標識ＦＮは、隣接非処置部分に比して大動脈の病変部分の比放射活性が高いことからも示されるように、このような血栓と大量に結合をすることがＵｅｈ！ｒｘら（４０）によって示されている。血漿由来３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ断片と無傷血漿由来ＦＮとを比較するために、■ＣＬ法を用いて２つの分子を１２５■でヨード化した。除内皮化の２時間後に、放射能標識分子をウサギに静脈注射した（２０μＣｉ；１ＧＧマイクログラム／ｌｑｒ；１群につき　３匹）０注射後７２時間目に、大動脈を取り出し、有傷（腹部）域と無傷（胸部）域を分離し、各部分を数個の切片に切断した（病変域に関しては５〜６切片、対照部分に関しては２切片）。組織片を計量し、放射能を計数した。第６９図は、　１２５Ｉ−ＦＮ（ウサギ！＆Ｌ１〜３）、又は　ｔ−ｐ３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄ　（ウサギ４〜６）を注射したウサギにおける連続大動脈切片において判明した比活性値をまとめたものである。第６９図に示されているように、標識分子の局在化の増強は、除内皮化切片で認められた（血栓域）。さらに、放射活性は、標識１）　３１ｋＤＦ　Ｂ　Ｄを用いた場合は、標識ＦＮを用いた場合よりもクロット中に局在した。これらの結果は、ＦＢＤ部分を包含する分子は動脈血栓クロットのイメージングに有用であることを示している。イメージングのために用いる場合は、酵素又は放射線不透過性不活性分子のようなイメージングに有用な他のマーカーをＦＢＤ　（血漿由来又は組み換え型）に結合させるのが望ましい。血小板凝集に及ぼす組み換え３３ｋＤ細胞結合ドメインの作用を分析するために、さらに別の試験を実施した。特記した場合を除いて、実験は実施例７と同様に実施した。富血小板血漿（ＰＲＰ）又は全血（血液）の凝集は、ＡＤＰ（１０ｕＭ）によって誘発した。ＰＲＰにおける凝集の程度は、光透過率によって測定した。全血における凝集の程度は、インピーダンス法によって測定した。組み換えヒトフィブロネクチン細胞結合ドメイン（３３ｋＤ）　、又はペンタペプチドＧＲＧＤＳを反応混合液に加えて表に示された最終濃度にした。表■に示された結果は、組み換え３３ｋＤＣＢ　Ｄがヒト及び霊長類（例えばヒト）の血小板の凝集に対して強力な阻害剤であることを立証している。表　■ 種々の種から得られた血小板のフィブロネクチン血小板　ＦＮ誘導体　濃　度　阻　害調製物　（μＭ）　（％）ＰＲＰ　３３ｋＤ　７−１５　５０、ト　ＧＲＧＤＳ　１１５　５Ｇ血　液　３３ｋｌ）　＋　５０ＧＲＧＤＳ　４０　５０、、ＰＲＰ　３３ｋＤ　５　５０ＧＲＧＤＳ　１２５　５［ＩＰＲＰ　３３ｋＤ　３０　０〃６Ｇ　３０イ、　ＧＲＧＤＳ　２００　５５血　液３３ｋＤ　２　０ブタ　Ｐ　ＲＰ　３３ｋＤ　６０　０ＧＲＧＤＳ　２Ｈ５！」−礼属１、　入ｋｉｙａｍａ、Ｓ、に、ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ、Ｋ、Ｍ、、入ｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、５１：　ｌ−５７（１９８７）。２、Ｐｉａｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　Ｍ、Ｄ、、　ａｔ　ａ馳Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｙ、　工：９５９コー９５９７　（１９８２）。コ、　Ｐａｎｄ＠、Ｈ，ａｎｄ　５ｈｉｖｔｌｙ、Ｊ、Ｅ、、　入ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、λエコ：２５８−２６５　（１９８２）。４、Ｈａｙａｓｈｉ、ｉｌｌ、ａｎｄ　ｙａｊ！Ｌａｄａ、＊、ｘ、、　、ｙ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２．ｉｆ：］ココ２−３３４０　（１９８コ）。５、　Ｓｓｋｉｇｕｃｈｉ、に、ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｓ、−工、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ。ＵＳλｌｌ：　２６６１−２６６５　（１９１１０）。６、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、、ａｔ　ａ４．、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　Ｅマ：　７２７７−７２８１（１９８す。７、　０ｖｅｎｓ、Ｒ，Ｊ、　ａｎｄ　Ｂａｒａｌｌｍ、　Ｆシ、、ＥにＢＯＪ、：２：　２１１１２５−２８３゜（１９８１８）　。ａ、　Ｑｂａｒａｔ　Ｎ−ｒ　ａｔ　ａｌ、ｔ　？ｔＢＳ　ｘＡｔｔａｒｓ　λ 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１．３４．３６．３７．４０．４２、及び４３に記載のポリペプチドの少なくとも１種と、請求項２９．３２．３３．３５．３８．３９．４１．４４及び４５に記載のポリペプチドの少なくとも１種とからなるハイブリッドポリペプチド。４つ、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項４６または４７に記載の組成物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。５０、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項４８に記載のハイブリッドポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。５１、　血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。５２、　血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量の請求項２８．３ｏ、３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。５３、　血小板を、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる血小板凝集を阻害する方法。５４、　血小板を、血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板からのトロンボキサン放出を阻害する方法。５５、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、脳血管疾患を有する対象を治療する方法。５６、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、心血管疾患を有する対象を治療する方法。５７、　前記心血管疾患が急性心筋梗塞である請求項５６に記載の対象を治療する方法。５８、　前記心血管疾患がアンギナである請求項５６の記載の対象を治療する方法。５９、　対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、血管形成法、血栓溶解療法または冠動脈バイパス手術を受けた対象において血小板凝集を阻害する方法。６０、対象に、創傷の治癒を促進するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。６１　前記創傷が皮膚創傷である請求項６０に記載の対象を治療する方法。６２、　前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失火による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項６１に記載の対象を治療する方法。６３、　前記創傷が眼球創傷である請求ＩＪｊ６０に記載の対象を治療する方法。６４、　前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜上皮創傷である請求項６３に記載の対象を治療する方法。６５、　前記創傷が鍵損傷である請求項６０に記載の対象を治療する方法。６６、　対象に、細菌感染を予防または治療するのに有効な量の請求項３２．３８及び４４のいずれか一項に記載のたは細菌感染した対象を治療する方法。６７、　前記対象が、その体内にカテーテルまたはインブラントが存在するが故に細菌感染し易いまたは細菌感染した請求項６６に記載の方法。６８、　対象に、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。６９、　対象に、腫瘍を検出するのに有効な量の請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。７０、対象に、血栓を検出するのに有効な量の請求項２９．３２．３３．３５．３８．３９．４１．４４及び４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。７１、　血栓溶解剤に結合した請求項２９．３２．３３．３５．３８．３９．４１．４４及び４５のいずれが一項に記載のポリペプチド。７２、　前記血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲンアクチべ一タ（ＴＰＡ）　、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナ−ゼアクチベータ複合体（Ｅｍｉｎａｓｅ（登録商標））またはＴＰＡ類似体から成る群から選択される請求項７１に記載の血栓溶解剤に結合したポリペプチド。７３、　成長因子に結合した請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。７４、　前記成長因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、α−ＴＧＦ、β−ＴＧＦ、ＦＤＧＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、インターフェロン、エリスロボエチン、コロニー刺激因子（Ｃ成る群から選択される請求項７３に記載の成長因子に結合したポリペプチド。７５、　血清アルブミンに結合した請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。７６、　血液因子に結合した請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。７７、　前記血液因子が、因子ｖｒｒｒまたは因子ＸＩＩＩである請求項７６に記載の血液因子に結合したポリペプチド。７８、　ポリエチレングリコールに結合した請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。７９、　スーパーオキシドジスムターゼに結合した請求項２８．３０．３１．３４．３６．３７．４０．４２及び４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。８０、　医療器具と、前記医療器具の表面に被膜として塗られた請求項３２．３８または４４のいずれか一項に記載のポリペプチドとからなる被覆医療器具。８１、　前記医療器具がカテーテルである請求項８ｏに記載の被覆医療器具。８２、　請求項３２．３８または４４のいずれが一項に記載のポリペプチドを被膜として器具表面に塗り、（ｂ）未被覆の器具ではなく、得られた被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。８３、　前記医療器具がカテーテルである請求項８２に記載の方法。８４、　未被覆の器具ではなく、請求項８０または８１に記載の被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。８５、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、創傷の治癒を促進するのに有効な量投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。８６、　前記創傷が皮膚創傷である請求項８５に記載の対象を治療する方法。８７、　前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失火による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項８６に記載の対象を治療する方法。８８、　前記創傷が眼球創傷である請求項８５に記載の対象を治療する方法。８９、　前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜上皮創傷である請求項８８に記載の対象を治療する方法。９０、　前記創傷が履損傷である請求項８５に記載の対象を治療する方法。９１、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。９２、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、腫瘍を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。９３、　対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血栓を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。国＠調香謡失参ｍｅｕｖ１＋１１１１ｓ嗜＾−＋ｅｌ”＋＊−＊Ｉｌａ、ｌコーｉ／１１！’ 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Claims

【特許請求の範囲】

１．天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主細胞において前記ポリペプチドの発現をもたらすように、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡと、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含む該プラスミド。
２．天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主細胞において前記ポリペプチドの発現をもたらすように、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡと、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含む該プラスミド。
３．天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであって、適当な宿主細胞において前記ポリペプチドの発現をもたらすように、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡと、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに関して配置された適当な調節エレメントをコードするＤＮＡとを含む該プラスミド。
４．前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約７５ｋＤのポリペプチド断片である請求項２に記載のプラスミド。
５．前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約４０ｋＤのポリペプチド断片である請求項２に記載のプラスミド。
６．前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約３３ｋＤのポリペプチド断片である請求項２に記載のプラスミド。
７．前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約３１ｋＤのポリペプチド断片である請求項３に記載のプラスミド。
８．前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約２０ｋＤのポリペプチド断片である請求項３に記載のプラスミド。
９．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含むヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋＤのポリペプチド断片である請求項４に記載のプラスミド。
１０．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含むヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの４０ｋＤのポリペプチド断片である請求項５に記載のプラスミド。
１１．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含むヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの３３ｋＤのポリペプチド断片である請求項６に記載のプラスミド。
１２．前記ポリペプチドが、アミノ酸１〜２６２を含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤのポリペプチド断片である請求項７に記載のプラスミド。
１３．前記ポリペプチドが、アミノ酸１〜１５３と１３個の付加アミノ酸とを含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤのポリペプチド断片である請求項８に記載のプラスミド。
１４．図１０に示した制限マップを有し、ＡＴＣＣ受託番号６７８２９でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株Ａ１６４５中において寄託されたｐＦＮ１２６− ３と称される請求項９に記載のプラスミド。
１５．図１２に示した制限マップを有し、ＡＴＣＣ受託番号６７８３０でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ａ４２５５（Ｆ＋）中において寄託されたｐＦＮ１３２−５と称される請求項１０に記載のプラスミド。
１６．図２３に示した制限マップを有し、ＡＴＣＣ受託番号６７９１０でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ａ４２５５中において寄託されたｐＦＮ１３７−２と称される請求項１１に記載のプラスミド。
１７．ＡＴＣＣ受託番号６７８３２でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ａ４２５５（Ｆ＋）中において寄託されたｐＦＮ９７５−２５と称される請求項１２に記載の２プラスミド。
１８．ＡＴＣＣ受託番号６７８３１でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ａ１６４５中において寄託されたｐＦＮ９４９−２と称される請求項１３に記載のプラスミド。
１９．請求項１から１８のいずれか一項に記載のプラスミドを含む細胞。
２０．細菌細胞である請求項１９に記載の細胞。
２１．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞である請求項２０に記載の細胞。
２２．プラスミドがｐＦＮ１２６−３と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８２９で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。
２３．プラスミドがｐＦＮ１３２−５と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３０で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。
２４．プラスミドがｐＦＮ１３７−２と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７９１０で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。
２５．プラスミドがｐＦＮ９７５−２５と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３２で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。
２６．プラスミドがｐＦＮ９４９−２と称されるプラスミドであり、細胞がＡＴＣＣ受託番号６７８３１で寄託されている請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞。
２７．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。
２８．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。
２９．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項２１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを生産する方法。
３０．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項９に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの７５ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。
３１．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１０に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ１１細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの４０ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。
３２．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１１に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの３３ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。
３３．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１２に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。
３４．ＤＮＡがポリペプチドを発現するように請求項１３に記載のプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞を処理し、このように発現させたポリペプチドを細胞から回収することからなる、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤのポリペプチド断片を生産する方法。
３５．天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。
３６．天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。
３７．天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含み且つ天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド。
３８．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない７５ｋＤの精製ポリペプチド。
３９．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない４０ｋＤの精製ポリペプチド。
４０．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない３３ｋＤの精製ポリペプチド。
４１．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤの精製ポリペプチド。
４２．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤの精製ポリペプチド。
４３．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。
４４．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。
４５．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む細菌産生ポリペプチド。
４６．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む７５ｋＤの細菌産生ポリペプチド。
４７．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む４０ｋＤの細菌産生ポリペプチド。
４８．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む３３ｋＤの細菌産生ポリペプチド。
４９．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの３１ｋＤの細菌産生ポリペプチド。
５０．天然ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの２０ｋＤの細菌産生ポリペプチド。
５１．ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのドメインの１つのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。
５２．ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。
５３．ヒトフィブロネクチンのタンパク質加水分解消化産物に対応しない、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド。
５４．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１１０２〜１８５１を含む７５ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。
５５．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３８０〜１８５１を含む４０ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。
５６．前記ポリペプチドが、アミノ酸１６００〜１６８９が欠失したアミノ酸１３２９〜１７２２を含む３３ｋＤのポリペプチドである請求項５２に記載のポリペプチド。
５７．前記ポリペプチドが、アミノ酸１〜２６２を含む３１ｋＤのポリペプチドである請求項５３に記載のポリペプチド。
５８．前記ポリペプチドが、アミノ酸１〜１５３と１３個の付加アミノ酸とを含む２０ｋＤのポリペプチドである請求項５３に記載のポリペプチド。
５９．少なくとも２つの請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な担体とを含有する組成物。
６０．前記ポリペプチドが相互に結合している請求項５９に記載の組成物。
６１．本質的に、少なくとも２つの請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドからなるハイブリッドポリペプチド。
６２．血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項５９または６０に記載の組成物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
６３．血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項６１に記載のハイブリッドポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
６４．血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
６５．血小板からのトロンボキサンの放出を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。
６６．血小板を、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる血小板凝集を阻害する方法。
６７．血小板を、血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板からのトロンボキサン放出を阻害する方法。
６８．対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、脳血管疾患を有する対象を治療する方法。
６９．対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、心血管疾患を有する対象を治療する方法。
７０．前記心血管疾患が急性心筋梗塞である請求項６９に記載の対象を治療する方法。
７１．前記心血管疾患がアンギナである請求項６９の記載の対象を治療する方法。
７２．対象に、血小板凝集を阻害するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、血管形成法、血栓溶解療法または冠動脈バイパス手術を受けた対象において血小板凝集を阻害する方法。
７３．対象に、創傷の治癒を促進するのに有効な量の請求項３５から５８に記載のポリペプチドを投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。
７４．前記創傷が皮膚創傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。
７５．前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失欠による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項７４に記載の対象を治療する方法。
７６．前記創傷が眼球創傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。
７７．前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜固有質創傷である請求項７６に記載の対象を治療する方法。
７８．前記創傷が腱損傷である請求項７３に記載の対象を治療する方法。
７９．対象に、細菌感染を予防または治療するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、細菌感染し易いまたは細菌感染した対象を治療する方法。
８０．前記対象が、その体内にカテーテルまたはインプラントが存在するが故に細菌感染し易いまたは細菌感染した請求項７９に記載の方法。
８１．対象に、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。
８２．対象に、腫瘍を検出するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。
８３．対象に、血栓を検出するのに有効な量の請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。
８４．血栓溶解剤に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
８５．前記血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベータ複合体（Ｅｍｉｎａｓｅ（登録商標））またはＴＰＡ類似体から成る群から選択される請求項８４に記載の血栓溶解剤に結合したポリペプチド。
８６．成長因子に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
８７．前記成長因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ａ−ＴＧＦ、β−ＴＧＦ、ＦＤＧＦ、ＴＮＦ、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−Ｉから成る群から選択される請求項８６に記載の成長因子に結合したポリペプチド。
８８．血清アルブミンに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
８９．血液因子に結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
９０．前記血液因子が、因子ＶＩＩＩまたは因子ＸＩＩＩである請求項８９に記載の血液因子に結合したポリペプチド。
９１．ポリエチレングリコールに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
９２．スーパーオキシドジスムターゼに結合した請求項３５から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
９３．医療器具と、前記医療器具の表面に被膜として塗られた請求項３７、４１、４２、４５、４９、５０、５３、５７または５８のいずれか一項に記載のポリペプチドとからなる被覆医療器具。
９４．前記医療器具がカテーテルである請求項９３に記載の被覆医療器具。
９５．（ａ）請求項３７、４１、４２、４５、４９、５０、５３、５７または５８のいずれか一項に記載のポリペプチドを被膜として器具表面に塗り、（ｂ）未被覆の器具ではなく、得られた被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。
９６．前記医療器具がカテーテルである請求項９５に記載の方法。
９７．未被覆の器具ではなく、請求項９３または９４に記載の被覆器具を使用することからなる、医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最小化する方法。
９８．血小板を、血小板凝集を阻害するのに有効な量のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板凝集を阻害する方法であって、前記ポリペプチドが天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む該方法。
９９．血小板を、血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効な量のポリペプチドと適当な条件下に接触させることからなる、血小板からのトロンボキサン放出を阻害する方法であって、前記ポリペプチドが天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含む該方法。
１００．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、脳血管疾患を有する対象を治療する方法。
１０１．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、心血管疾患を有する対象を治療する方法。
１０２．前記心血管疾患が急性心筋梗塞である請求項１０１に記載の対象を治療する方法。
１０３．前記心血管疾患がアンギナである請求項１０１に記載の対象を治療する方法。
１０４．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血小板凝集を阻害するのに有効な量投与することからなる、血管形成法、血栓溶解療法または冠動脈バイパス手術を受けた対象において血小板凝集を阻害する方法。
１０５．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、創傷の治癒を促進するのに有効な量投与することからなる、創傷を有する対象を治療する方法。
１０６．前記創傷が皮膚創傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。
１０７．前記皮膚創傷が、切開による創傷、皮膚失欠による創傷、皮膚移植による創傷または火傷による創傷である請求項１０６に記載の対象を治療する方法。
１０８．前記創傷が眼球創傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。
１０９．前記眼球創傷が、角膜上皮創傷または角膜固有質創傷である請求項１０８に記載の対象を治療する方法。
１１０．前記創傷が腱損傷である請求項１０５に記載の対象を治療する方法。
１１１．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、細菌感染を予防または治療するのに有効な量投与することからなる、細菌感染し易いまたは細菌感染した対象を治療する方法。
１１２．前記対象が、その体内にカテーテルまたはインプラントが存在するが故に細菌感染し易いまたは細菌感染した請求項１１１に記載の方法。
１１３．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量投与することからなる、癌を有する対象を治療する方法。
１１４．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポポリペプチドを、腫瘍を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において腫瘍を検出する方法。
１１５．対象に、天然ヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドを、血栓を検出するのに有効な量投与することからなる、対象において血栓を検出する方法。