JP3095771B2 - ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法 - Google Patents

ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1988年12月29日出願の米国特許出願第291,
951号の部分継続出願である1989年４月28日に出願した
米国特許出願第345,952号の部分継続出願であり、前記
両出願の内容は参照により本出願に含まれる。
発明の背景 本明細書中では、カッコ内にアラビア数字で示し種々
の文献を参照している。これら参考文献の引用に関して
は明細書の最後、請求の範囲のすぐ前に示してある。本
発明が関係する当業界の状態をより充分に記すために、
これら文献の開示内容は全て参照により本明細書に含む
ものとする。
本発明は、ヒトフィブロネクチン類似体のクローニン
グ及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用
法に関する。
フィブロネクチンは各々の分子量が約220,000である
２つの同一のサブユニットからなる糖タンパク質であ
る。２つの主要な形のフィブロネクチンが培養及びin v
ivoでヒト細胞内で産生され、分泌されている（１）。
細胞会合したフィブロネクチンは比較的不溶性であり、
細胞付着、傷の治癒、細胞分化及び食作用に関与してい
る。主として肝臓で産生される血漿フィブロネクチンは
可溶性の血清タンパク質であり、細胞フィブロネクチン
と同様の生物学的特性を有している。
フィブロネクチンを限定的にタンパク質分解して開裂
させると個々の活性を有するポリペプチドが得られるこ
とから、フィブロネクチンは多機能性のモジュラータン
パク質と考えられている。部分的タンパク質分解消化に
よりフィブロネクチン分子の種々の機能性ドメインが明
らかにされてきており、ヘパリン−、DNA−、フィブリ
ン−、ゼラチン−及び細胞−結合ドメインが含まれる
（２〜６）。1987年１月７日に発行された欧州特許第20
7,751号（Baralle,F.E.）は、フィブロネクチンの完全
なcDNA配列を開示している。Baralleは、大腸菌タンパ
ク質β−ガラクトシダーゼに融合したフィブロネクチン
のコラーゲン結合ドメインの一部を含有する融合タンパ
ク質の発現も開示している。同様の融合タンパク質がOw
ens及びBaralleにより開示されている（７）。Obaraら
（1987）は、大腸菌β−ガラクトシダーゼに融合したヒ
トフィブロネクチンの細胞結合ドメインの一部の発現を
開示している（８）。更に、Obaraら（1988）は、変異
誘発した、β−ガラクトシダーゼに融合した細胞結合ド
メインの部分の発現を開示しており、すなわち、融合タ
ンパク質として、細胞結合ドメインの部分の座位特異的
欠損が得られた（９）。
上記の参考文献は融合タンパク質の発現のみを開示し
ており、非融合タンパク質の発現は開示していない。
1985年５月21日発行の米国特許第4,517,686号及び198
7年４月28日発行の米国特許第4,611,111号（Ruoslahti
及びPierschbacher）は、フィブロネクチンの細胞接着
活性を示すアミノ酸108個のポリペプチドを開示してい
る。このポリペプチドは細胞培養又は医療器具で、基体
への細胞接着を促進させるために使用しうる。ポリペプ
チドは、補綴デバイスの表面を被覆して、細胞接着を促
進させるためにも使用できる。
1986年３月25日発行の米国特許第4,578,079号及び198
6年９月30日発行の米国特許第4,614,517号（Ruoslahti
及びPierschbacher）は、式Ｘ−Arg−Gly−Asp−Ｒ−Ｙ
−（RGD）を有し、フィブロネクチンの細胞接着活性を
示すテトラペプチドを開示している。好ましいＲはSer
であるが、Cys又はThrのような他のアミノ酸でもよい。
テトラペプチドは、基体にペプチドを固定化することに
より（補綴デバイスのような）基体への細胞接着を促進
するために、溶解又は懸濁した形態のペプチドを使用す
ることにより基体への接着を阻害するために、そして細
胞の食作用を増強するために使用しうる。
これらのテトラペプチドはHaverstickら（19）及びGi
nsbergら（20）によっても開示されている。
1986年５月20日発行の米国特許第4,589,881号（Piers
chbacher及びRuoslahti）は、フィブロネクチンの細胞
接着活性を示すアミノ酸30個のポリペプチドを開示して
おり、このポリペプチドにはアミノ酸108個のポリペプ
チドについて上記したような用途が提起されている。
上記特許出願に開示されているペプチドはフィブロネ
クチンの細胞結合ドメインの活性を有してはいるもの
の、より大きなフィブロネクチンポリペプチドほどの細
胞結合活性は有していない。より小さいペプチドは完全
なフィブロネクチン分子を充分に模倣する正確な立体配
置を得ることができないと考えられている。又、これら
ポリペプチドは、フィブロネクチン分子の細胞接着活性
の増強に重要な細胞結合ドメインの他の部位又は部分を
欠いているとも考えられている。
本出願人の発明である、短かい合成ペプチド（RGD）
の代りに細胞結合ドメイン全体又は細胞結合ドメインの
大きな断片をin vivo実験に使用することには多くの利
点があり、それには次のものを含んでいる：（ｉ）血漿
由来の細胞結合ドメイン（75,000ダルトン）は短かいRG
Dペプチドと比べフィブロネクチン受容体との親和性が
約200倍高い；（ii）全細胞結合ドメインは短かい合成
ペプチドに比べプロテアーゼ、特にエキソペプチダーゼ
に対するin vivoの安定性が高い；そして（iii）より大
きなタンパク質では合成の短かいペプチドに比べ腎クリ
アランス速度が非常に遅いため細胞結合ドメイン（CB
D）のより大きな断片の半減期が長くなる。
本出願人の発明によりポリペプチドを製造するために
使用するプラスミドが提供される。ポリペプチドは血小
板凝集反応の阻害にも使用しうる。凝集反応を阻害する
ためにこれまでに開発された薬剤では、完全に阻害する
ことなく血小板の生理的機能を妨害していた。本出願人
の発明のポリペプチドは、血小板間の相互作用及び血小
板と基体との間の相互作用に関与する天然分子との競合
を介して血小板凝集機構に障害を与えることによりこれ
らの難点を克服している。
本出願人のポリペプチドは治療薬剤として使用するこ
とができ、プロスタサイクリンよりかなり長い半減期を
有し得る。又、アスピリン又は他の常用されている抗血
小板凝集剤よりはかなり半減期が短かい。従って、これ
らの薬剤による副作用はないであろう。負傷した内腔血
管の修復の重大な段階に作用しても、本出願人のポリペ
プチドは傷の修復に必要な必須の凝固誘発を妨害するこ
とはないであろう。従って、制御不能な出血は起こり得
ない。これは、本出願人のポリペプチドが、血小板凝集
の生理学的機能を妨害する既存の治療薬剤とは異なり、
付着機構を特異的に妨害し、凝集に関与する種々の部位
を引き離すことにより作用しうることによるものであ
る。治療薬剤の薬動力学は設計により変更し、それによ
って、確実に過程を可逆的にし、凝固及び血小板凝集の
過程を理想的に管理できるようにすることが可能であ
る。
Grinnell及び共同研究者によるいくつかの論文は、慢
性的な傷の治療へのフィブロネクチンの使用を示唆して
いる（10）。Grinnellは最近、臨床試験に関する科学会
議で、外用使用した血漿由来のフィブロネクチンは傷の
治癒を促進することを報告した。更に、Nishida及び共
同研究者の動物モデルでの研究によると、角膜の潰瘍形
成（再度上層で覆うことの欠落）とフィブロネクチンの
欠損との間の相互関係が示された。このグループはヒト
の角膜潰瘍の治療に外因性血漿由来フィブロネクチンを
使用していた（11）。
最近開発されている傷の治療法は、保存してあるドナ
ーの血液又は自己の血液由来の完全なフィブロネクチン
分子を使用する。本出願人の発明は傷の治癒のために個
々の機能性ドメインを使用する。
例えば、組換え細胞結合ドメインをフィブロネクチン
分子全体の代りに使用し、傷の治癒を促進することがで
きる。組換えポリペプチドはより安定であり、血液夾雑
物質を全く含むことなく、実質的に無限な量製造するこ
とができる。フィブロネクチンのフィブリン結合ドメイ
ンは傷での敗血症を防ぐための抗感染薬として使用でき
る。
Humphriesら（12）は、RGDペプチドとマウスのメラノ
ーマ細胞とを同時注射するとマウスでの肺転移コロニー
の形成が劇的に阻害されることを示した。
1989年４月28日出願の同時係属中の共通譲渡された米
国特許出願No.345,952は1988年12月29日出願の米国特許
出願No.291,951の部分継続出願であり、この各々はヒト
フィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及
び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法を
開示している。
本出願人のポリペプチドは、短かい合成RGDペプチド
と比べ静脈注射後の半減期が長く、転移をより有効に阻
害する。
本出願人のフィブロネクチンポリペプチド類似体は、
高齢者によく見られる臨床症状である足の静脈でのフィ
ブリンクロッティングの検出にも有用でありうる。フィ
ブリン血栓の位置測定は核医学部門で実施される非常に
複雑な手法である。アッセイは、注入した放射性標識フ
ィブリノーゲンの血栓に対する低い親和性に基くもので
ある（21）。しかしながら、標識フィブリノーゲンは大
量（約10g）の血中の内因性フィブリノーゲンで希釈さ
れる。従って、この方法は感受性の高いものではない。
本出願人の発明は、フィブリン血栓検出用トレーサー
としての、フィブリンに対する結合親和性の高い放射性
標識フィブロネクチンアミノ末端ドメイン（31kD）の使
用を提供する。血中のフィブロネクチン量はフィブリノ
ーゲン量よりはるかに低いため、本出願人の発明は血栓
検出用のより感受性の高いトレーサーを提供する。更
に、フィブロネクチンのこのドメインは第XIII因子によ
りフィブリンクロットと共有的に架橋結合するために、
クロット部位に放射性標識ドメインがかなり蓄積される
であろう。
最後に、本発明は、ヒトフィブロネクチン分子のドメ
インと同様の配列を有する新規なフィブロネクチンポリ
ペプチド類似体を提供する。本発明は、脳血管障害、心
血管障害、創傷及び癌のような状態の対象の治療におけ
るフィブロネクチンの個々のドメインの使用も提供す
る。
発明の概要 本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然の
ヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応
しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであっ
て、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポ
リペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコードす
るDNAに関して配置された適当な調節エレメントをコー
ドするDNAとを含むプラスミドを提供する。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然
のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物には
対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドで
あって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するよう
に、ポリペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコ
ードするDNAに関して配置された適当な調節エレメント
をコードするDNAとを含むプラスミドを提供する。
また、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合
ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天
然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に
は対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミド
であって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するよう
な、ポリペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコ
ードするDNAに関して配置された適当な調節エレメント
をコードするDNAとを含むプラスミドを提供する。
本発明の現在の好ましい実施態様では、ポリペプチド
は、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約75kD
ポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインの約40kDポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチ
ンの細胞結合ドメインの約33kDポリペプチド断片；ヒト
フィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約31kDの
ポリペプチド断片；又はヒトフィブロネクチンのフィブ
リン結合ドメインの約20kDポリペプチド断片である。
さらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、アミ
ノ酸1102〜1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、
ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの75kDポリペ
プチド断片；アミノ酸1380〜1851を含むが、アミノ酸16
00〜1689を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメ
インの40kDポリペプチド断片；アミノ酸1329〜1722を含
むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、ヒトフィブロネクチ
ンの細胞結合ドメインの33kDポリペプチド断片；アミノ
酸１〜262を含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結
合ドメインの31kDポリペプチド断片；又はアミノ酸１〜
153と13個の付加アミノ酸とを含むヒトフィブロネクチ
ンのフィブリン結合ドメインの20kDポリペプチドであ
る。
プラスミドは大腸菌の好適株で発現させるのが好まし
い。好適な大腸菌株の例としては、大腸菌株A4255
（F+）〔ATCC受託番号No.67830〕，大腸菌株A1645〔ATC
C受託番号No.67829〕又は大腸菌株A4255〔ATCC受託番号
No.67910〕である。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの
製法も提供し、この方法は、DNAがポリペプチドを発現
するように、ポリペプチドをコードするDNAを含むプラ
スミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのよう
に発現されたポリペプチドを細胞から回収することから
なる。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メイン又はフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実
質的部分を含むポリペプチドの製法も提供し、この方法
は、DNAがポリペプチドを発現するように、ポリペプチ
ドをコードするDNAを含むプラスミドを含有する大腸菌
細胞を処理し、そしてそのように発現されたポリペプチ
ドを細胞から回収することからなる。
本発明の現在の好ましい実施態様では、このように製
造されるポリペプチドは、天然のヒトフィブロネクチン
の細胞結合ドメインの75kD,40kD,又は33kDポリペプチド
断片又は天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合
ドメインの31kDもしくは20kDのポリペプチド断片であ
る。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの領域の１つ
のアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフィブ
ロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒ
ト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポリペプチド
を提供する。好ましいドメインは細胞結合ドメイン及び
フィブリン結合ドメインである。好ましいポリペプチド
は細胞結合ドメインの75kD,40kD及び33kDポリペプチド
並びにフィブリン結合ドメインの31kD及び20kDポリペプ
チドである。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフ
ィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しな
い、細菌産生ポリペプチドを提供する。好ましいドメイ
ンは細胞結合ドメイン及びフィブリン結合ドメインであ
る。好ましいポリペプチドは細胞結合ドメインの75kD,4
0kD及び33kDポリペプチド並びにフィブリン結合ドメイ
ンの31kD及び20kDポリペプチドである。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフ
ィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない
ポリペプチドも提供する。又、天然のヒトフィブロネク
チンの細胞結合ドメイン又はフィブリン結合ドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフ
ィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない
ポリペプチドも提供される。
好ましいポリペプチドは細胞結合ドメインの75kD,40k
D及び33kDポリペプチド並びにフィブリン結合ドメイン
の31kD及び22kDポリペプチドである。
本発明は少なくとも２つの上記ポリペプチドと適当な
担体とを含む組成物及び少なくとも２つのこのようなポ
リペプチドのみから本質的に成るハイブリッドポリペプ
チドを提供する。
本発明は更に、血小板凝集反応を阻害するのに有効な
量の本発明ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体とか
らなる医薬組成物も提供する。又、血小板からのトロン
ボキサンの放出を阻害するのに有効な量の本発明ポリペ
プチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成物
も提供する。
本発明組成物は血小板凝集反応の阻害又は血小板から
のトロンボキサン放出の阻害に使用できる。又、脳血管
障害、心血管障害、創傷、細菌感染、癌を有する対象の
治療又は腫瘍もしくは（血栓のイメージングによる）血
栓の検出にも使用できる。
本発明ポリペプチドは血栓溶解剤、成長因子、血清ア
ルブミン、血液因子、ポリエチレングリコール又はスー
パーオキシドジスムターゼと結合させることができる。
本発明のポリペプチドは、カテーテルのような医療器
具の使用に伴う細胞感染の危険性を最小化するように、
このような医療器具を被覆するためにも使用できる。
また、血漿フィブロネクチンをプロテアーゼで消化す
ることによりポリペプチドを得る、上記のような治療方
法も提供する。
図面の簡単な説明 図中、示した制限酵素部位の隣のカッコ内の数字は、
第41図に示すようなヒトフィブロネクチンcDNAのヌクレ
オチド配列に添って同じく番号を付した位置に対応する
（1987年１月７日発行の欧州特許第207,751号明細書（B
aralle,F.E.）の第３図も参照のこと）。
本出願人がクローニングし発現させたcDNA配列は、Ba
ralleの地図のヌクレオチド4811〜5080（両端を含む）
の270bpのエキストラドメイン（ED）セグメントを欠い
ている（41図参照）。従って、Baralleマップのヌクレ
オチド3317〜5566に亘ると云われているcDNA配列はEDセ
グメントすなわちヌクレオチド4811〜5080（両端を含
む）を欠いているために1980個のヌクレオチドしか含有
していない。この領域は当業界ではED−Ａ領域としても
知られている。同様に、そのDNA断片で発現したタンパ
ク質はBaralleマップのアミノ酸1102〜アミノ酸1851を
コードするであろうが、ED領域で、コードされる90個の
アミノ酸すなわちアミノ酸1600〜1689（両端を含む）を
欠いているだろう。そのため、これは660個のアミノ酸
しか含有しないであろう。ED領域に及ぶ本明細書中に記
載された全ての断片についてこれはあてはまる（当業界
でED−Ｂ領域として知られている領域はBaralleの配列
でも出願人のcDNAでも欠けている）。
40kD,31kD,75kD,33kD及び20kDとして表現されるタン
パク質の定義は分子量が既知であるマーカーと比較した
SDSポリアクリルアミドゲル上での移動度を基とした操
作上の定義である。
第１図 第１図の上部は単離された種々のフィブロネクチンcD
NAクローン並びに相互の及びフィブロネクチンcDNAの全
長配列に対するこれらcDNAクローンの配列を示してい
る。第１図の下部はヒトフィブロネクチンポリペプチド
内に存在する種々のドメインを図式的に表わしている。
第２図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpBR3
22とpFN919からのプラスミドpFN100の構築を示してい
る。
プラスミドpFN100は、ヌクレオチド3317〜4090に対応
する、フィブロネクチンの細胞結合ドメインに対応する
cDNAの５′末端をコードする。
第３図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpBR3
22とpFN919からのプラスミドpFN101の構築を示してい
る。プラスミドpFN101はフィブロネクチンのヌクレオチ
ド3611〜4090に対応するcDNAを含有する。
第４図 この図は、合成リンカーを使用したプラスミドpBR322
とpFN916からのプラスミドpFN102の構築を示している。
ヌクレオチド4151〜5566に対応するEcoR I−Bgl II断片
を（図に示すような）合成リンカー及びpBR322をEcoR I
−Sal I消化して得た大きなpBR322断片に連結させた。
プラスミドpFN102は細胞結合ドメインに対応するcDNAの
３′末端をコードする。
第５図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpFN1
00（第２図）とpFN102（第４図）からのプラスミドpFN1
03の構築を示している。プラスミドpFN103は、ヌクレオ
チド3317〜5566のフィブロネクチン細胞結合ドメインに
対するcDNA領域をコードする。
第６図 この図は、プラスミドpFN103（第５図）とプラスミド
pTV301（第７図）からのプラスミドpFN105の構築を示し
ている、細胞結合ドメインに対応するcDNAをプラスミド
をpFN103から取り出し、λPLプロモータ及びc IIリボソ
ーム結合部位の制御下のプラスミドpTV301の断片に挿入
した。プラスミドpFN105は全細胞結合ドメイン（75kD）
を発現するであろうと予期された。しかし、4030位に１
つのチミジン欠失があるため、cDNAのコード部位内の終
結コドンが生じ、プラスミドpFN105は分子量39kDのポリ
ペプチドを発現した。
第７図 この図は、プラスミドpTV104（２）とp579からのプラ
スミドpTV301の構築を示している。プラスミドpTV301は
λPLプロモータ及びc IIリボソーム結合部位の制御下で
ヒト成長ホルモン類似体を発現する。プラスミドはヒト
成長ホルモンをコードするcDNAの下流にT1T2転写ターミ
ネータも含有している。
第８図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpFN1
01とpFN102からのプラスミドpFN104の構築を示してい
る。プラスミドpFN104はヌクレオチド3611〜5566の細胞
結合ドメインをコードするcDNAを含有している。
第９図 この図は、プラスミドpTV310とpFN104からのプラスミ
ドpFN106の構築を示している。プラスミドpFN106はλPL
プロモータとc IIリボソーム結合部位との制御下に65kD
ポリペプチドを発現すると予想されていた。65kDポリペ
プチドはRGD配列を含むと予想された。しかし、4030位
で１つのチミジンが欠失しているため、cDNA内の終結コ
ドンが生じ、プラスミドpFN106は35kDタンパク質を発現
した。
第10図 この図は、プラスミドpFN105とpFN114−４からのプラ
スミドpFN126−３の構築を示している。プラスミドpFN1
14−４はcDNAライブラリーから独立して単離されたFNcD
NAを有するその他のプラスミドである。pFN114−４では
4030位でのチミジンの欠失はない。プラスミドpFN114−
４からのSst I−Bgl II断片を使用してプラスミドpFN10
5からのSst I−Bgl II断片を置き換えた。得られたプラ
スミドpFN117−４は75kDの細胞結合ドメインタンパク質
の全長を発現したが、プラスミドは翻訳終結コドンを含
有せず、pBR322配列内で終結する。この誤りを正すため
に次のリンカーを構築した： このリンカーはBgl II及びHind III部位を各々５′及び
３′末端に有し、翻訳終結コドンを含む75kD CBDの３′
末端をコードする。これを、Bgl II及びHind IIIで開裂
させたプラスミドpFN117−４に連結させた。得られたプ
ラスミドpFN126−３は真正なＣ−末端を有する75kDの細
胞結合ドメイン全体を発現した。
第11図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpTV3
01とpFN102からのプラスミドpFN118（又はPFN118−２と
表わす）の構築を示す。プラスミドpFN118は40kDの細胞
結合ドメインタンパク質を発現するよう設計されてい
た。しかし、リンカー合成での誤りのため、タンパク質
はリンカー内で終結せず、むしろベクターpBR322由来の
配列中でのみ終結した。従って、得られたタンパク質は
融合タンパク質であった。
第12図 この図は、合成リンカーを使用した、プラスミドpFN1
18とプラスミドpTV301からのプラスミドpFN132−５の構
築を示す。合成リンカーを使用して、プラスミドpFN118
中の欠陥合成リンカーの部分を置き換えた。得られたプ
ラスミドpFN132−５は40kDの細胞結合ドメインタンパク
質を発現した。
第13図 この図は、本出願人らの創傷治癒モデルでのコラーゲ
ン及びDNAの合成を示している。スポンジ当り40kDタン
パク質50μｇを使用し、実施例10及び22に記載したよう
に実験を行なった。陰性対照としてスポンジ当り100μ
ｇの牛血清アルブミン（BSA）と食塩水を使用した。
第14図 この図は40kDの組換えCBDタンパク質の薬物動力学を
示している。
第15図 この図は、細胞結合ドメインのサブクローニングに使
用するBamH I−EcoR I合成断片のヌクレオチド配列を示
している。
第16図 この図はプラスミドp579の構築を示す。rRNAオペロン
T1T2転写終結断片を、Hind IIIで消化してあるプラスミ
ドpPS1（受託番号No.39807としてATCCに寄託）から単離
した。T1T2断片を、Hind IIIで消化してあるpRO211（第
17図）の独自Hind III部位に挿入した。得られた発現ベ
クターp579はλPLプロモータ及びcIIリボソーム結合ム
部位、次にT1T2転写終結配列を含有する。
第17図 この図はプラスミドpRO211及びpRO12の構築を示す。
プラスミドpJH200（受託番号No.39783でATCCに寄託）を
Nde Iで部分消化し、DNAポリメラーゼＩ（クレノウ）で
処理して末端を充填し、得られた末端を再び連結させて
発現ベクターpRO211を形成した。発現ベクターpRO211を
Nde I及びHind IIIで消化し、大断片を単離し、pAL500
（受託番号No.39782としてATCCに寄託）から単離したNd
e I−Hind IIIウシ成長ホルモン（bGH）断片に連結して
pRO12を得た。（Nde I−Hind III断片は、pAL500をEcoR
Iで消化し、消化産物の末端に配列： の合成リンカーを連結することにより製造した。連結混
合物をNde I及びHind IIIで消化し、得られたNde I−Hi
nd IIIbGH断片を単離した。） 第18図 この図は、細胞結合ドメインを含有する種々のフィブ
ロネクチンプラスミド、及び相互の及び細胞結合ドメイ
ンの全配列に対するプラスミドの配列を示す（フィブロ
ネクチンcDNAに対する細胞結合ドメインの配列は第１図
に示す。）。各プラスミドにより発現したタンパク質の
分子量は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
移動度で測定し、右の欄にキロダルトン（kD）で示す。
各タンパク質は分子量に従って表わし、例えば75kDタン
パク質とする。
カッコ内の番号は第41図に示すヒトフィブロネクチン
cDNAのヌクレオチド配列に添って同じく番号を付した位
置と対応する（1987年１月７日発行の欧州特許第207,75
1号明細書（Baralle,F.E.）の第３図も参照）。エキス
トラドメイン（ED）は欠けている。これはアミノ酸1600
〜1689（両端を含む）の90個のアミノ酸をコードするヌ
クレオチド4811〜5080（両端を含む）の270個のヌクレ
オチドに対応する。（このED領域は当業界ではED−Ａ領
域としても知られている。Baralleの配列及び本出願人
のcDNAの両者ともED−Ｂを欠いている。） CBD I＝細胞結合ドメインＩ（RGD配列を含む） CBD II＝細胞結合ドメインII（Obaraら,Cell 53:649〜
657（1988）に開示されている） 第19図 この図は、細胞結合ドメインの種々の断片をコードす
るプラスミド及びそれらにより発現されるタンパク質に
ついての情報を概説している。
第20図 この図は、プラスミドpFN117−４（第10図）をEcoR V
及びBgl IIで消化して産生した大断片に合成リンカーＡ
（第26図）を連結することによるプラスミドpFN128−４
の構築を示す。プラスミドpFN128−４はヌクレオチド33
17〜5179の細胞結合ドメインをコードするcDNAを含有し
ている。３′末端はリンカーＡにより形成される。プラ
スミドはλPLプロモータ及びc IIリボソーム結合部位の
制御下で65kD細胞結合ドメインタンパク質を発現する。
このプラスミドは、細胞結合ドメインをコードする。cD
NAの３′末端のみがプラスミドpFN117−４と異なるプラ
スミドpFN126−３（ATCC受託番号No.67829）から同様に
構築し得るであろうことを特記する。
第21図 この図は、プラスミドpFN117−４をBamH I及びHind I
IIで消化して得た大断片に合成リンカーＢ（第26図）を
連結することによるプラスミドpFN130−11の構築を示
す。プラスミドpFN130−11はヌクレオチド3317〜4090の
細胞結合ドメインをコードするcDNAを含有する。３′末
端はリンカーＢで形成した。このプラスミドはλPLプロ
モータ及びc IIリボソーム結合部位の制御下で28kD細胞
結合ドメインタンパク質を発現する。このプラスミド
は、細胞結合ドメインをコードするcDNAの３′末端のみ
がプラスミドpFN117−４と異なるプラスミドpFN126−３
（ATCC受託番号No.67829）から同様に構築し得るであろ
うことを特記する。
第22図 この図は、合成リンカーＣ（第26図）、合成リンカー
Ｄ（第26図）及びプラスミドpFN117−４をNde I及びBam
H Iで消化して得た大断片を三分節連結することによる
プラスミドpFN135−12の構築を示す。プラスミドpFN135
−12はヌクレオチド3998〜約5566の細胞結合ドメインを
コードするcDNAを含有し、５′末端はリンカーＣ及びＤ
で形成した。このプラスミドはλPLプロモータ及びc II
リボソーム結合部位の制御下で45kD細胞結合ドメインタ
ンパク質を発現する。親プラスミドpFN117−４で発現さ
せた75kDタンパク質（第10図の説明参照のこと）におけ
ると同様の誤りがこのタンパク質のＣ−末端にあり、す
なわち、フィブロネクチンcDNAの末端には翻訳終結コド
ンがなく、従って、pBR322コード配列で翻訳が終結する
ことを特記しておく。
第23図 この図は、プラスミドpFN135−12（第22図）のEcoR V
及びBgl I消化により産生した大断片に合成リンカーＡ
（第26図）を連結することによるプラスミドpFN137−２
の構築を示す。プラスミドpFN137−２はヌクレオチド39
98〜5179の細胞結合ドメインをコードするcDNAを含有
し、３′末端はリンカーＡで形成した。このプラスミド
はλPLプロモータ及びc IIリボソーム結合部位の制御下
で33kD細胞結合ドメインタンパク質を発現する。プラス
ミドpFN137−２は受託番号67910としてATCCに寄託して
ある。
第24図 この図は、合成リンカーＥ（第26図）、プラスミドpF
N137−２のNde I及びBamH I消化により得た大断片並び
にプラスミドpFN126−３のSst II及びBamH I消化により
得た小断片の三分節連結によるプラスミドpFN143−１の
構築を示す。プラスミドpFN143−１はヌクレオチド3602
〜5179の細胞結合ドメインをコードするcDNAを含有し、
５′末端はリンカーＥで形成した。このプラスミドはλ
PLプロモータ及びc IIリボソーム結合部位の制御下で55
kD細胞結合ドメインタンパク質を発現する。
第25図 この図は、合成リンカーＡ（第26図）、プラスミドp5
78（下記参照）のNde I及びBgl II消化による大断片、
並びにプラスミドpFN118（第11図）のNde I及びEcoR V
消化により小断片の三重連結によるプラスミドpFN134−
９の構築を示す。プラスミドpFN134−９はヌクレオチド
4151〜5179の細胞結合ドメインをコードするcDNAを含有
しており、ｃ′末端はリンカーＡで形成した。３′末端
の下流はT1T2転写終結配列である。
プラスミドはλPLプロモータ及びc IIリボソーム結合
部位の制御下に28kD細胞結合ドメインタンパク質を発現
する。
プラスミドp578はp579を作製したのと同じ連結（第16
図参照）からのもう１つの単離物である。プラスミドp5
78とp579は同様であると理解される。
プラスミドpFN134−９は、細胞結合ドメインをコード
するcDNAの３′末端のみがプラスミドpFN118と異なるプ
ラスミドpFN132−５（ATCC受託番号No.67830）から同様
の方法で構築し得るであろうことを特記しておく。
第26図 本発明プラスミドの構築には合成リンカーを使用し
た。この図はこれまでの図で記載したプラスミドの構築
でリンカーとして使用した合成オリゴヌクレオチドA,B,
C,D及びＥの塩基配列を示す。
第27図 この図は、放射性標識した33kDタンパク質をラットに
静脈注射したときの薬動力学を示す。
第28図 この図は、33kD及び40kDタンパク質、血漿性75kDタン
パク質（Ｐ−75kD）並びに合成ペンタペプチドGRGDS（S
igma）の、実施例７に記載のin vitroでのヒト血小板凝
集アッセイ系に対する用量−応答作用を示す（血漿性75
kDタンパク質は、Hayashi,M.及びYamada,K.M.（28）に
記載の方法を使用してフィブロネクチンのトリプシン消
化物から精製した）。PBS溶液中、示した量のタンパク
質（及びGRGDS）を、（ドナーＴからの）血小板の豊富
な血漿（PRP）125μを含有する別々の反応管に加え
た。平衡化後PBSを加えて最終の反応容量を250μとし
た。最終濃度が10μＭ ADPとなるようにADP溶液を加え
て血液凝固反応を誘発した。各反応管の透過率を（３分
間の反応時間の間に）測定し、最大透過率の割合（％）
として計算した血小板凝集反応阻害をタンパク質濃度に
対してプロットした（凝集実験では新鮮な血液を使用し
た。又、血漿板の挙動のその起源に依存する変動のた
め、ドナー（Ｔ又はＲ）を示した。）。
第29図 この図は、実施例７に記載のin vitro血小板凝集アッ
セイ系を下記のような変更を行って使用した、全血の血
小板凝集に対する33kD及び40kDタンパク質の用量−応答
作用を示す：反応管の混合物は（Ｒからの）全血500μ
とPBS又はPBS中のタンパク質溶液500μとを含んで
いた。33kDタンパク質０（対照）、0.65μＭ及び2.6μ
Ｍの存在下、並びに40kDタンパク質０（対照）、1.5μ
Ｍ及び7.5μＭの存在下で実験を実施した。溶液を37℃
で３分間平衡化し、次に、最終濃度10μＭ ADPとなる
ようADP溶液を加えて血小板凝集反応を誘発した。
全血溶液については、透過率の代りにインピーダンス
をモニターした。インピーダンス法では、血液サンプル
中に浸漬した２枚の電極の間に非常に小さな電流を流
し、電極間の電気的インピーダンスを測定することによ
り凝集を検出する（22）。上記実験でのインピーダンス
の結果を（対照の反応管での最大インピーダンスの割合
（％）として計算した）阻害率に変換し、33kD及び40kD
タンパク質の濃度（μＭ）に対しプロットした。
実施例20に記載のように尿素処理して40kDタンパク質
サンプルを再活性化させた。
第30図 この図は、実施例７に記載のin vitro血小板凝集系で
の33kD及び40kDタンパク質の作用を示す。血小板の豊富
な血漿（Ｒ由来）を使用し、示した濃度で33kD及び40kD
タンパク質を反応管混合物に加えた。40kDタンパク質の
２つの異なる調製物をテストした。「TSK−１−尿素−P
BS」と表わす40kDサンプルは、（実施例15に記載のよう
に）Fractogel濾過した後、実施例20に記載のように尿
素処理して再活性化した。もう一方の40kD調製物は再活
性化しなかった。0.5分間反応させた後の凝集を比較し
て凝集阻害を計算した。
第31図 実施例19に記載の方法を使用して、33kD及び40kDタン
パク質並びにヒト血漿性フィブロネクチンの血小板との
結合に対するタンパク質濃度の作用を調べた。反応混合
物は５×108の洗浄した血小板とトロンビンを含有して
いた。各例中の標識タンパク質量は図中に示す通りであ
った。
第32図 実施例19に記載の方法を使用し、刺激剤としてトロン
ビンを用いて、ヒト血漿フィブロネクチン（ｈ−FN）並
びに40kD及び33kDタンパク質の洗浄血小板への結合に対
する合成ペンタペプチドGRGDS（Sigma）の作用を調べ
た。0.1μＭの125I−標識40kD,33kD並びに血漿性FNを使
用し、単独並びに10倍過剰の非放射性（非標識）同種タ
ンパク質（各々40kD及び33kDタンパク質）の存在下及び
50μＭ GRGDSペンタペプチドの存在下で実験を行っ
た。図は各標識タンパク質のみによる結合を100％とし
て標準化した。
第33図 実施例19に記載の方法を使用して、40kD及び33kDタン
パク質の洗浄血小板への結合に対するトロンビン存否の
作用を調べた。血小板濃度は５×108血小板/mlであっ
た。
A.図示したように、トロンビン存在又は不在下及び追加
の１μＭ非標識40kDの存在又は不在下で、各反応混合物
は100nMの125I−40kDを含有していた。
B.図示したように、トロンビンの存在又は不在下及び追
加の１μＭ非標識33kDの存在又は不在下で、各反応混合
物は100nMの125I−33kDを含有していた。
示した結合率は結合した添加放射活性標識の割合
（％）である。
第34図 フィブリノーゲンの洗浄血小板への結合に対する40kD
及び33kDタンパク質、血漿性75kD（ｐ−75kD）並びにGR
GDSの作用を研究した。方法は、次の点を除き、実施例1
9に記載した通りであった。反応混合物は５×108の血小
板を含有しており、トロンビンの存在下及び不在下の両
方で実験を行った。25℃で10分間プレインキュベートし
た後、1ml当り４単位のヒルジン（Bio−Makor,イスラエ
ル）を加え、更に５分間25℃でプレインキュベートし
た。反応混合物に100μＭの125I−フィブリノーゲンを
加えた。対照サンプルはこれ以外の添加物を含まず、テ
ストサンプルは125I−フィブリノーゲンと同時に加えた
５μＭの40kD,5μＭの33kD,5μＭの血漿性75kD又は50μ
Ｍ GRGDSペンタペプチドを含有していた。これらは全
て図中に示す通りであった。更に20分間インキュベーシ
ョンを続け、反応を終結し、放射活性を測定した。示し
た結合率は結合した添加放射活性標識の割合（％）であ
る。
第35図 実施例19に記載の方法を使用して、トロンビンの存在
下及び不在下での40kD及び33kDタンパク質の洗浄血小板
への結合の用量応答を測定した。反応混合物は５×108
の血小板を含有していた。
A.示した量の125I−40kDを反応混合物に加えた。
B.示した量の125I−33kDを反応混合物に加えた。
第36図 実施例19に記載の方法を使用して、33kD組換えタンパ
ク質の洗浄血小板への結合の時間的推移を得た。反応混
合物は100nMの125I−33kDを含有しており、インキュベ
ーション時間は5,15,25及び35分であった。示したよう
にトロンビンの存在下及び不在下の両方で実験を行っ
た。
第37図 実施例19に記載の方法を使用して、FN,40kDタンパク
質及び33kDタンパク質の洗浄血小板に対する結合を研究
した。反応混合物は５×108の血小板と各100nMの125I−
FN又は125I−40kD又は125I−33kDのいずれかを含んでい
た。示したように、トロンビンの存在下又は不在下でイ
ンキュベーションを行った。
A.インキュベーション時間＝30分間 B.インキュベーション時間＝10分間 第38図 40kDタンパク質の細胞結合活性を血漿性フィブロネク
チン（FN）と比較する。
A.尿素再活性化前後の40kDタンパク質、40kD及び40kD
（Ｕ）並びに血漿性フィブロネクチンFNの細胞結合活性
を、BALB/C3T3繊維芽細胞系（ATCC受託番号No.CCL163）
を用いて、細胞接着アッセイ系（23）（実施例16参照）
により測定した。実施例20に記載の通りに尿素再活性化
を行った。
B.上記の3T3線維芽細胞系又はNRK−52E細胞系（ATCC受
託番号No.CRL1571）のいずれかを使用して、細胞接着ア
ッセイ系により、40kDタンパク質及び血漿性フィブロネ
クチン（FN）の細胞結合活性を測定した。アッセイ手法
は上記Ａに記載の通りであった。
第39図 第38図に記載したように、細胞接着アッセイ系によ
り、40kD及び33kD組換えタンパク質並びに血漿性フィブ
ロネクチン（FN）の細胞結合活性を測定した。使用した
BHK細胞はYamadaが記している。最大の半分の接着は、
フィブロネクチンについては0.8μg/mlで、40kDタンパ
ク質では2.4μg/mlで得られる。
第40図 この図は、ラットのスポンジ（sponge）創傷治癒モデ
ルにおける40kDタンパク質のコラーゲン及びDNA合成に
対する作用を示す。実施例22に記載のように実験を実施
した。陽性対照として、血漿フィブロネクチン（FN）及
び表皮成長因子（EGF,Biomedical Technologies Inc.）
を各々スポンジ当り100μｇ及び８μｇを使用した。
第41図 この図はヒトフィブロネクチンcDNAのヌクレオチド配
列を示す。
第42図 ７対の化学合成オリゴマーを製造した。合成オリゴマ
ーはヒトFNの最初の153N−末端アミノ酸をコードする。
この図はこれら７対の合成オリゴマーの配列を示す。
第43図 次のように、第42図に示す７対の化学合成オリゴマー
から、ヒトFNのＮ末端ドメインのアミノ酸１〜153をコ
ードするDNA断片を組立てた。
別々の試験管内でオリゴマー3/4,5/6,7/8及び9/10を
アニール（anneal）し、次にT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ酵素を使用して５′末端をリン酸化した。
第２ステップでは、T4DNAリガーゼを用いて対3/4及び
5/6を互いに連結させた。同様に、反応対7/8及び9/10を
互いに連結させた。連結の各ステップ後に連結混合物の
アリコートをゲルで分析し、新しく形成された断片の大
きさと連結の有効性を測定した。
第３ステップでは、２つの上記の連結混合物を混合
し、別の試験管で予めアニールし、リン酸化した対６、
オリゴマー11/12を混合物に加えた。上記連結混合物か
ら得た326塩基対のDNA断片をアガロースゲルから単離
し、精製した。
精製した合成326断片を構成リンカーの２つの他の対
すなわち対１（オリゴマー1/2）及び対７（オリゴマー1
3/14）に加えた。対１ではオリゴマー２のみを５′末端
でリン酸化し、対７ではオリゴマー13のみを５′末端で
リン酸化した。
T4DNAリガーゼで連結した後、混合物は更に精製する
ことなく、EcoR I及びBamH Iエンドヌクレアーゼで消化
したpBR322ベクターDNAに加えた。
得られたpFN932−18と表わすプラスミドは、pBR322ベ
クター内に、ヒトFNのＮ−末端153アミノ酸をコードす
る合成EcoR I（５′末端）−BamH I（３′末端）制限断
片全体を含有していた。
第44図 FNのＮ−末端153アミノ酸配列の発現 プラスミドpFN932−18をNde I及びBamH Iエンドヌク
レアーゼで消化した。FN（最初の153アミノ酸＋追加の
Ｎ−末端メチオニン）をコードするNde I−BamH I DNA
断片を単離し、プラスミドpTV301をNde I及びBgl IIエ
ンドヌクレアーゼで消化して得た大断片に連結した。
（プラスミドpTV301（第７図）はラムダPLプロモータ及
びc II RBSの制御下でヒト成長ホルモンhGHを発現す
る）。
得られたプラスミドをpFN949−２と表わした。
第45図 FNのＮ−末端ドメインの３′末端（アミノ酸26
2）での終結コドンTAAの挿入 EcoR I及びPvu IIで消化したcDNAクローンプラスミド
p931〜５（第１図参照）から単離したEcoR I−Pvu II F
N断片の３′末端（Pvu II部位）に、次の配列： を有するBgl II部位とTAA終結コドンとを含有する合成
オリゴヌクレオチドを連結させた。EcoR I及びBamH Iで
消化したDNAベクタープラスミドpBR322（大断片）の存
在下で連結を行った。得られたプラスミドをpFN935−12
と表わした。
第46図 λPL発現ベクター内のFBDのカルボキシ末端領
域のサブクローニング プラスミドpFN935−12をEcoR I及びHinc IIで消化し
た。FNをコードするEcoR I−Hinc II断片を単離し、DNA
すなわちプラスミドpTV194−80をEcoR IとSma Iで消化
して得た大断片に連結させた。（プラスミドpTV194−80
はλPLプロモータ及びβ−ラクタマーゼプロモータ及び
RBSの制御下でヒトApoEを発現する）。得られたプラス
ミドをpFN946−12と表わした。このプラスミドはPBLA配
列を欠いており、そのためFBDのカルボキシドメインは
発現しない。
第70及び71図に、プラスミドp579（第16図）からのpT
V194−80の構築を示す。
第47図 ヌクレオチド14〜599のFBDをコードするDNA断
片の構築 次のDNA配列： を有する３対の化学合成オリゴマーを使用してこの構築
を行った。
各々別の試験管内で、オリゴマー15/16及び17/18をア
ニールし、５′末端をリン酸化し、次に混合して、T4DN
Aリガーゼを使用し連結させた。３時間連結させた後、
（予めアニールし、５′末端でリン酸基転移した）オリ
ゴマー19/20を加え、更に室温で３時間連結させた。
得られた合成DNA断片を使用して、プラスミドpFN932
−18をEcoR I及びDde Iで消化して得たEcoR I−Dde I F
Nコード配列と更に連結させた。EcoR I及びXba Iで消化
したプラスミドpUC19（大断片）の存在下で連結を実施
した。
得られたプラスミドをpFN948−４と表わした。
第48図 全FBD領域の構築 プラスミドpFN948−４をEcoR I及びXba Iで消化し
た。FBDのＮ末端領域をコードするEcoR I−Xba I断片を
単離し、プラスミドpFN946−12をEcoR I及びXba Iで消
化して（大断片を使用し）FBDのカルボキシ末端領域に
連結させた。得られたプラスミドをpFN957と表わした。
第49図 λPLプロモータ及びλc II RBSの制御下での全
FBDタンパク質の発現 プラスミドpFN957をNde I及びHind IIIで消化した。F
BDをコードするNde I−Hind III断片を単離し、単離精
製したHind III−Hind III T1T2コードDNA断片の存在下
で、Nde I及びHind IIIで消化したプラスミドpTV301の
単離したベクター断片に連結させた。得られたプラスミ
ドをpFN962−３と表わした。
第50図 λPLプロモータ及びPBLAリボソーム結合部以下
での全FBDタンパク質の発現 プラスミドpBLA11（ATCC No.39788）をEcoR I及びAl
u Iで消化した。β−ラクタマーゼプロモータ及びβ−
ラクタマーゼRBSをコードするEcoR I−Alu I断片を単離
し、Nde Iで消化し、次に４つの全てのdNTRの存在下で
クレノー酵素で処理してNde I部位を充填し、EcoR Iで
消化したプラスミドpFN962−３（第49図）（大断片を使
用）に連結させた。得られたプラスミドはpFN975−25と
表わした。
第51図 還元及び非還元条件下でのSDS−PAGEで追跡し
たr31kDの再生／再酸化及び精製 （β−メルカプトエータノール（ME）を用いる）還元
条件下でのゲル（12％アクリルアミド）は精製過程をモ
ニターし、（MEを用いない）非還元条件は再生（refold
ing）／再酸化を示し、より早く移動し、拡散のより少
ないバンドを導く。（MEの不在下では）「フェニル−Ｓ
後」のバンドは「再生」のバンドより鋭く、このことは
精製の間でさえも再酸化が続いていることを示している
ことを特記しよう。
再生（GSH/GSSG）:pH8.0、GSH/GSSG3mM/0.3mMの存在
下で粗ペレットから抽出した後に、再生／再酸化したr3
1kD;フェニル−S;フェニル−セファロース;Q−S;Q−セ
ファロース;p31kD;（トリプシン消化により得た）血漿
由来の31kD;分子量マーカー：分子量94kD,67kD,43kD,30
kD,20.1kD及び14.4kDのマーカーを含む低分子量タンパ
ク質較正キット（Pharmacia Fine Chemicals）。
第52図 フェニル−セファロースクロマトグラフィに
よるGSH/GSSG−再生r31kDの精製 ペレット10グラムから抽出した再生／再酸化し「スク
ランブルした」31kDと不溶性夾雑物質の懸濁液を13,000
rpmで遠心した（実施例24の3.1参照）。上清（1,280m
l）を硫酸アンモニウム（AS）で0.2Mとし、0.2M ASを
含むpH8.5の緩衝液Ａで予め平衡化したフェニル−セフ
ァロースの45mlカラムにロードした。カラムを150mlの
同じ溶液で洗った後、緩衝液A150ml,水50ml及び6M GuC
l50mlで洗った。精製されたr31kDは緩衝液Ａの画分に表
われ、この段階で85％以上の純度を有していた。280nm
で吸光度を測定した。
第53図 ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーに
よるr31kDの濃縮及び精製 フェニル−セファロースステップからの緩衝液Ａのピ
ーク（第52図参照）の約1/2を、10mlのヘパリン−セフ
ァロースカラムで濃縮及び精製し、緩衝液Ａ中の0.5M
NaCl溶液で溶出した。この段階のr31kDの純度は90％以
上である。280nmで吸光度を測定した。
第54図 Ｑ−セファロースクロマトグラフィーによるr3
1kDの精製 緩衝液Ａ（pH8.5）に対して透析した濃縮r31kD（第53
図）を、同じ緩衝液で予め平衡化した40mlのＱ−セファ
ロースカラムにロードした。流出及び洗浄画分に溶出し
た精製されたr31kDを凍結乾燥で濃縮した。カラムを1M
NaClで洗い、混在するタンパク質を完全に除去した。
この段階での精製r31kDの純度は95％以上である。280nm
で吸光度を測定した。
第55図 スーパーロース12カラムでのr31kDの分析的FPL
C−ゲル浸透 ランニングバッファ（20mM Tris Hcl−150mM NaCl
pH7.8）中の血漿由来及び組換え31kDの混合物（0.8mg
/mlで100μ）を、ランニングバッファで予め平衡化し
たセファロース12カラム（HR 10/30）にかけ、同じバ
ッファで溶出した。流速0.4ml/分；チャート速度0.25cm
/分；吸収単位フルスケール0.1;検出波長280nm;操作時
間60分間。別々に操作したときの、血漿由来及び組換え
31kDの両者の保持時間は混合物について得られたものと
同じであった。
第56図 ラットにおけるp31kDの薬動力学 図は、時間の関数としての、ラット血清中での血漿由
来31kDの薬動力学を示している。ラットに体重1kg当た
り0.5mgのp31kDを静脈注射した。
第57図 フィブリンへの125I−r31kDの結合：トロンビ
ン及びCa++イオンの作用 20μのクエン酸塩添加した全血、0.15μM 125I−ｒ
−FBD（r31kD）（5.6×105cpm/μｇ）を使用して、実施
例26に記載のように反応Ｉを実施した。
実施例26に記載のように、20μのクエン酸塩添加し
た全血を使用して、非標識フィブリンクロットの形成に
より反応IIを開始した。最初のインキュベートの後、既
存の反応管（「血清」）又はフィブリンペレットに0.15
μＭの125I−ｒ−FBDを加えた後、遠心し、PBSに再懸濁
させた（「PBS」）。CaCl2及びヒルジンを加えるときの
各々の濃度は5mM及び3U/mlであった。その後、実施例26
に記載のように反応IIを続けた。
第58図 プラスミンによるフィブリンクロットからの
125I−FBD（p31kD）の放出 100μのクエン酸塩添加全血及び0.3μM 125I−Ｐ−
FBD（5.0×104cpm/μｇ）を含有するいくつかの試験管
を使用して反応Ｉを実施した。インキュベーションの最
後に、ペレットを遠心により集め、次に、１μ/mlのプ
ラスミン（豚血液由来、Sigma）を含有するPBS溶液に再
懸濁させ、さらに指示した時間の間隔で33℃でインキュ
ベートした。冷却し、直ちに遠心して反応を終了させ
た。上清及びペレット中の放射活性をガンマカウンター
で計測した。
ペレットと上清をゲル電気泳動サンプルバッファ（最
終濃度：グリセロール３％,BME2％,SDS1％，ブロモフェ
ノールブルー0.2％）に再懸濁させ、15分間沸騰させ、1
0％PAGE−SDS中で電気泳動した。次に、ゲルをＸ線フィ
ルム上でオートラジオグラフィーにかけた。ペレットか
らは放射活性は検出されなかった。上清の放射活性は、
プラスミンと共にインキュベートした対照125I−FBDに
対応する位置で検出された（結果は示していない）。
第59図 反応Ｉの条件（実施例26参照）を使用して、0.15μM
125I−ｒ−FBD（125I−r31kD;5.6×105cpm/μｇ）を20
μクエン酸塩添加全血に結合させた。競合剤（Ｃ）な
しで、或いは種々の濃度の非標識「折りたたみ（folde
d）タンパク質」、「還元」FBD及び関連分子の存在下で
反応を実施した。
r I＝「完全に還元した」r31kD FBD r II＝「還元し、カルボキシアミド化した」r31kD F
BD ｐ＝血漿由来フィブロネクチンをトリプシンで切断し
た31kD FBD 第60図 フィブリンへの125I−r31kDの結合（反応I
I）。トランスグルタミナーゼ阻害剤及び関連分子の作
用 20μのクエン酸塩添加全血を用い、実施例26で反応
IIについて記載した条件を使用して非標識フィブリンク
ロットを形成した。
最初のインキュベーション期間の終り、ｒ−125I−FB
D（0.15μM;2.9×104cpm/μｇ）添加前に、指示した濃
度のスペルミジン、プトレシン及びFBD−「Ｒ」（「還
元−カルボキシアミド化」血漿由来FBD）を特定の反応
物に加えた。
第61図 前形成したフィブリンクロットへの125I−r31k
Dの結合（反応II）：フィブリンクロット熟成時間（ag
e）の作用 20μのクエン酸塩添加全血を用い、実施例26で反応
IIについて記載した条件を使用して非標識フィブリンク
ロットを形成させた。
最初のインキュベーション期間の終りに、サンプルの
半分を遠心し、フィブリンペレットを、5mM CaCl2含有
PBS溶液（反応「Ｃ」）又は5mM CaCl2及び300μg/ml
FN含有PBS（反応「Ｄ」）に再懸濁させた。「Ａ」と表
わすサンプルには添加も変更も行わなかった。「Ｂ」と
表わすサンプルには300μg/mlのFNを加えた。次に、反
応混合物を37℃で（図中に示すように）１時間,4時間又
は24時間インキュベートした。次に、125I−r31kD（最
終濃度0.15μＭ、5.4×105cpm/μｇ）を加え、更に30分
間インキュベートした。実施例26に記載したように反応
を終了させた。
第62図 「無処理（naive）」血栓への125I−r31kDの結
合（反応Ｉ及びII）：結合に対する血栓熟成時間の作用 20μのクエン酸塩非添加の新鮮なヒト全血アリコー
トを0.15μM 125I−r31kDと共に又は単独で（各々、反
応Ｉ及びII）、37℃で、非シリコン化試験管内でインキ
ュベートした。指示した時間の間隔で、反応を終了させ
（反応Ｉ）又は0.15μM 125I−r31kD（2.9×104cpm/μ
ｇ）を加え、更に２時間の後にインキュベートを終了し
た（反応II）。
第63図 フィブリンへの125I−r31kDの結合（反応
Ｉ）：外因性トランスグルタミナーゼ及び「還元」FBD
の作用 クエン酸塩添加していないヒト全血の20μアリコー
トを、0.15μM 125I−r31kD（2.9×104cpm/μｇ）のみ
と（対照）、又はそれに加えて豚の肝臓のトランスグル
タミナーゼ（「対照＋T.G.」、0.2単位/ml;Sigma）と共
にインキュベートした。
試験管のいくつかは図中に示すように「還元」（カル
ボキシアミド化した）p31kDを含有していた。
結合反応に外因性トランスグルタミナーゼを加えると
結合値が２倍以上増加した。反応物に「還元−カルボキ
シアミド化」r31kDを加えると、外因性III a因子と同様
の程度の阻害作用（0.3μＭと3.0μＭでは各々53％と71
％の阻害率）が観察され、このことは、両方の型のトラ
ンスグルタミナーゼに対し還元FBDは同じ阻害作用を持
つことを示していた。
第64図 ECMへのFBDの結合 培養内皮細胞の細胞外マトリックス「ECM」を使用
し、実施例18に示すような血管損傷モデルでFBDの生物
学的活性を研究した。
PBSで３回洗った33mmのECMプレートを、CO2インキュ
ベータ中、37℃で、2.5mM CaCl2,トロンビン１μ/ml及
び指示した濃度の125I−Ｐ−FBD（約4.4×105cpm/μ
ｇ）を含有するDMEM−10％FCS0.5mlと共にインキュベー
トした。図に示すように、トロンビンの不在下で、対応
のプレートをインキュベートした。45分間インキュベー
トした後、プレートを1ml PBSで３回洗い、0.1％SDS−P
BS溶液0.5mlで抽出し、ガンマカウンターで放射活性を
測定した。図中に示す値は２枚のプレートの平均を表わ
している。
第65図 S.aureusに対するFN及びFBDの結合 ５×108PFU/mlのS.aureus SA113（ATCC受託番号No.35
556）及び図中に示す濃度の125I−FN（４×104cpm/μ
ｇ）又は125I−FBD（1.3×105cpm/μg;r31kD FBD、
「再酸化−再生」）を用いて溶液中で、方法に記載した
ように結合反応を実施した。記載した標識分子の濃度は
FN及びr31kDについて各々220,000及び31,000ダルトンの
分子量を使用して計算する。
第66図 S.aureusへのFBDの結合：折りたたみ形及び還
元形との競合 示した濃度の次の非標識タンパク質:p−FBD（p31k
D）,r−FBD（r31kD FBD「再酸化−再生」）,r−FBD−
Ｒ（r31kD FBD「還元、カルボキシアミド化」），及び
ｒ−CBD（FNのｒ−33kD細胞結合ドメイン）の存在下
で、1.25μｇの125I−p31kD（2.3×105cpm/μｇ）を溶
液中で５×108PFU/mlのS.aureus SA113に結合させた。
方法の部分に示すように結合反応を実施した。
第67図 S.aureusの固定化FNへの結合 方法に記載したように、ヒト血漿FN、ｒ−FBD（r31kD
FBD「再酸化−再生」）、Ｐ−FBD（p31kD）又はBSA
（牛血清アルブミン,Sigma）の存在下で、プラスチック
バイアルに固定化したFNに7.5×108PFU/mlの3H−ロイシ
ン−S.aureus（5.8cpm/105PFU）を結合させた。競合剤
（加えた殺菌の9.3％）の不在下での「対照」反応の結
合が100％となるように標準化した。
第68図 S.aureusのカテーテルへの結合 方法に記載したように、FNで被覆した「Uno」気管支
プラスチックカテーテル（各反応に3cmずつ、デュープ
リケート）に3.0×106PFU/mlの125I−S.aureus（1CPM/3
PFU）を結合させた。競合反応を実施したときには、方
法に記載のように、細菌と添加タンパク質とを室温で30
分間インキュベートし、カテーテルに加え、更にインキ
ュベートした。
競合反応に使用したタンパク質は次の通りであった:P
−31（p31kD）,r−20（組換え体由来の20kD FBD）及び
ｒ−31（再酸化し、再生したr31kD）。反応のいくつか
（図参照）は５μｍのヘパリン（豚の小腸粘膜からのも
の、分子量10,000;Sigma）の存在下で測定した。
競合剤（加えた細菌の8.8％）の不在下での「対照」
反応の結合を100％と標準化した。
第69図 ウサギ大動脈病変モデルでのp31kDの付着 図は、バルーンカテーテル挿入したウサギからの連続
的に分割した大動脈切片での放射活性分布を示す。125I
−標準フィブロネクチン（FN）又は血漿由来の31kD FB
D（31kD）を注射した72時間後に測定した。
第70図 pTV−170の構築 Nde I−Nde I ApoE断片をラスミドpApoE−EX2（ATCC
受託番号No.39787）から単離し、Nde Iで消化した発現
ベクターp579（第16図）の独自Nde I部位に挿入した。
得られたプラスミドpTV−170はＮ−末端にメチオニン残
基を加えた天然のヒトApoEタンパク質の類似体を発現す
る。
第71図 pTV−194−80の構築 EcoR I及びAlu Iで消化した後にプラスミドpBLA11（A
TCC受託番号No.39788）からβ−ラクタマーゼプロモー
タ及びリボソーム結合部位断片を単離した。Nde Iで消
化し、DNAポリメラーゼＩ（クレノー）で充填し、そし
てEcoR Iで消化しておいたpTV−170（第70図）プラスミ
ドの大断片にこの断片を連結させた。
発明の詳細な説明 プラスミドpFN126−3,pFN132−5,pFN975−25,pFN949
−２及びpFN137−２は特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の要件に従い、又、これ
を満たして、American Type Culture Collection（ATC
C）,12301 Parklawn Drive,Rockirlle,Maryland 20852
に各々ATCC受託番号No.67829,67830,67832,67831,及び9
7910として寄託されている。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然の
ヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応
しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであっ
て、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、ポ
リペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコードす
るDNAに関して配置された適当な調節エレメントをコー
ドするDNAとを含むプラスミドを提供する。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天然
のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対
応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドであ
って、適当な宿主内でポリペプチドを発現するように、
ポリペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコード
するDNAに関して配置された適当な調節エレメントをコ
ードするDNAとを含むプラスミドも提供する。
さらに、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリ結合
ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、かつ、天
然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に
対応しないポリペプチドを発現するためのプラスミドで
あって、適当な宿主内でポリペプチドを発現するよう
に、ポリペプチドをコードするDNAとポリペプチドをコ
ードするDNAに関して配置された適当な調節エレメント
をコードするDNAとを含むプラスミドを提供する。
本出願人はフィブリン結合ドメインポリペプチド類似
体の３つの例を提供している。これらにはp31kD,r31kD
及びr20kDポリペプチドがある。これらのポリペプチド
は天然のヒトフィブロネクチンの部分の結合及び付着特
性を示す。本出願の請求の範囲はこれら３つのFBDアナ
ログに限定されることを意図しているのではなく、これ
ら３つのFBDアナログは単に好ましい実施態様の例であ
る。
また、本出願人はr31kDフィブリン結合ドメインポリ
ペプチドという用語を、次のような実施例24で定義して
いるタンパク質の３つの形を包含するように使用してい
る： （ａ） 洗浄ペレットから、6M CuClに溶解した後に得
られる、すなわち「スクランブル」形のタンパク質； （ｂ） 6M GuClの存在下でGSHのような還元剤で処理
した後に存在する完全に還元されたタンパク質； （ｃ） 実施例24に記載のようにGSH/GSSGで処理して得
た再酸化−再生タンパク質。
「スクランブル」r31kDポリペプチドは、１つ以上の
誤ったジスルフィド結合が形成されたために明らかに不
適正に折りたたまれているr31kDタンパク質である。
本発明の現在の所好ましい実施態様では、ポリペプチ
ドは、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの約75
kDポリペプチド断片；ヒトフィブロネクチンの細胞結合
ドメインの約40kDポリペプチド断片；ヒトフィブロネク
チンの細胞結合ドメインの約33kDポリペプチド断片；ヒ
トフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの約31kD
のポリペプチド断片；又はヒトフィブロネクチンのフィ
ブリン結合ドメインの約20kDポリペプチド断片である。
さらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、アミ
ノ酸1102〜1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、
ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインの75kDポリペ
プチド断片；アミノ酸1380〜1851を含むが、アミノ酸16
00〜1689を欠く、ヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメ
インの40kDポリペプチド断片；アミノ酸1329〜1722を含
むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、ヒトフィブロネクチ
ンの細胞結合ドメインの33kDポリペプチド断片；アミノ
酸１〜262を含むヒトフィブロネクチンのフィブリン結
合ドメインの31kDポリペプチド断片；又はアミノ酸１〜
153個と13個の付加アミノ酸とを含むヒトフィブロネク
チンのフィブリン結合ドメインの20kDポリペプチドであ
る。
天然ヒトフィブロネクチンは人体（血漿中）で生じる
ようなものである。
本明細書では、実質的部分とは少なくとも1/4であ
る。天然のヒトフィブロネクチンの生物学的活性を有す
るポリペプチドは、このような活性をアッセイ又は測定
すると、天然のヒトフィブロネクチンと同様の結合又は
付着特性を示す。細胞結合ドメインのような天然のヒト
フィブロネクチンの領域の１つの生物学的活性を有する
ポリペプチドは、このような活性をアッセイ又は測定す
ると、天然のヒトフィブロネクチンの領域と同様の結合
又は付着特性を示す。
本発明では、種々の機能性ドメインのヌクレオチド配
列は制限酵素による開裂で決定しており、フィブロネク
チンのタンパク質分解消化で規定したようなヌクレオチ
ド配列には対応しない。
本発明のプラスミドは更に、プロモータ及びオペレー
タ例えばλPLOL、リボソーム結合部位例えばCII及びレ
プレッサのような、適当な宿主細胞内でポリペプチドを
発現させるための、ポリペプチドをコードするDNAに関
して配置された適当な調節エレメントを含んでいる。他
の適当な調節エレメントには、例えばlac,trp,tac,lpp
及びdeoプロモータがある（1989年２月22日発行の欧州
特許出願No.0303972）。
適当な調節エレメントは、適当な細菌宿主細胞内でポ
リペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードす
るDNAに関して配置される。本発明の好ましい実施態様
では、調節エレメントはポリペプチドをコードするDNA
の近く且つ上流に配置する。
本発明は、第10図に示す制限地図を有し、ATCC受託番
号No.67829として大腸菌株A1645中で寄託してある、pFN
126−３と表わされるプラスミドを提供する。プラス
ミドpFN126−３はアミノ酸1102〜1851を含み、アミノ酸
1600〜1689を欠くヒトフィブロネクチン細胞結合ドメイ
ンの75kDポリペプチド断片をコードする。
又、第12図に示す制限地図を有し、ATCC受託番号No.6
7830として大腸菌A4255（F+）中で寄託されているpFN13
2−５と表わされるプラスミドも提供する。プラスミドp
FN132−５は、アミノ酸1380〜1851を含み、アミノ酸160
0〜1689を欠くヒトフィブロネクチン細胞結合ドメイン
の40kDポリペプチド断片をコードする。
本発明は、第23図に示す制限地図を有し、ATCC受託番
号No.67910として大腸菌株A4255中で寄託されているpFN
137−２と表わされるプラスミドを提供する。プラスミ
ドpFN137−２は、アミノ酸1329〜1722を含み、アミノ酸
1600〜1689を欠くヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメ
インの33kDポリペプチド断片をコードする。
本発明はpFN975−25と表わされ、ATCC受託番号No.678
32として寄託されているプラスミドも提供する。プラス
ミドpFN975−25はアミノ酸１〜262からなるヒトフィブ
ロネクチンフィブリン結合ドメインの31kDポリペプチド
断片をコードする。
更に、pFN942−２と表わされ、ATCC受託番号No.67831
として大腸菌株A1645中で寄託されているプラスミドも
提供される。プラスミドpFN949−２はアミノ酸１〜153
及び13個の追加アミノ酸を含みヒトフィブロネクチンフ
ィブリン結合ドメインの20kDポリペプチド断片をコード
する。
本発明のプラスミドは適当な細胞宿主細胞、好ましく
は大腸菌に導入することができる。適当な大腸菌細胞の
例には、株A4255（F+）〔ATCC受託番号No.67830〕、株A
1645〔ATCC受託番号No.67829〕及び株A4255〔ATCC受託
番号No.67910〕があるが、他の大腸菌株及び他の細菌も
プラスミドの宿主細胞として使用できる。このような細
菌にはPseudomonas aeruginosa及びBacillus subtilis
がある。
宿主として使用する細菌は、（A1645のような）栄養
要求株、（A4255のような）原栄養株及び溶菌株;F+及び
F-株；（A1645及びA4255のような）プロファージのc I
857レプレッサー配列を有する株；並びにdeoレプレッサ
ーとdeo遺伝子が欠損している株（1989年２月22日発行
の欧州特許出願No.0303972参照）を含むいずれの株でも
よい。大腸菌株A4255（F+）は各々ATCC受託番号No.6783
0及び67910としてプラスミドpFN132−５及びPFN137−２
を含有して寄託されている。大腸菌株A1645はATCC受託
番号No.67829としてプラスミドpFN126−３を含んで寄託
されている。
現在の所好ましい実施態様では、本発明はpFN126−３
と表わされるプラスミドを含有する大腸菌細胞を提供
し、この細胞はATCC受託番号No.67829として寄託されて
いる。
又、pFN132−５と表わされるプラスミドを含有する大
腸菌細胞も提供され、この細胞はATCC受託番号No.67830
として寄託されている。
さらに好ましい実施態様で、本発明はpFN137−２と表
わされるプラスミドを含有している大腸菌細胞を提供
し、この細胞はATCC受託番号No.67910として寄託されて
いる。
又、pFN975−25と表わされるプラスミドを含有する大
腸菌細胞も提供され、この細胞はATCC受託番号No.67832
として寄託されている。
本発明はpFN949−２と表わされるプラスミドを含有す
る大腸菌細胞を提供し、この細胞はATCC受託番号No.678
31として寄託されている。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチドの
製法も提供し、この方法は、DNAがポリペプチドを発現
するように、ポリペプチドをコードするDNAからなるプ
ラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてそのよ
うに発現されたポリペプチドを細胞から回収することか
らなる。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペプチド
の製法も提供し、この方法は、DNAがポリペプチドを発
現するように、ポリペプチドをコードするDNAからなる
プラスミドを含有する大腸菌細胞を処理し、そしてその
ように発現されたポリペプチドを細胞から回収すること
からなる。
更に、本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのフィ
ブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む
ポリペプチドの製法も提供し、この方法は、DNAがポリ
ペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードする
DNAからなるプラスミドを含有する大腸菌細胞を処理
し、そしてそのように発現されたポリペプチドを細胞か
ら回収することからなる。
好ましくは、このように製造されたポリペプチドは細
胞結合ドメインの75kD,40kDもしくは33kDポリペプチ
ド、又はフィブリン結合ドメインの31kDもしくは20kDポ
リペプチドである。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフ
ィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しな
い、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポリペ
プチドを提供する。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒト
フィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しな
い、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない純粋なポリ
ペプチドも提供する。
さらに、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結
合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然の
ヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応
しない、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製ポ
リペプチドを提供する。
好ましくは、精製ポリペプチドは、天然のヒトフィブ
ロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸1102〜1851を
含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、天然のヒトフィブ
ロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、ヒ
ト由来の他の物質を実質的に含まない75kDポリペプチド
である。
もう１つの好ましい精製ポリペプチドは、天然のヒト
フィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸1380〜
1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、天然のヒト
フィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しな
い、ヒト由来の他の物質を実質的に含まない40kDポリペ
プチドである。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ド
メインのアミノ酸1329〜1722を含み、アミノ酸1600〜16
89を欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分
解消化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的
に含まない33kDの精製ポリペプチドも提供する。
又、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消
化産物に対応しない、ヒト由来の他の物質を実質的に含
まない、天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合
ドメインの精製31kDポリペプチド、及び天然のヒトフィ
ブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しない、
ヒト由来の他の物質を実質的に含まない天然のヒトフィ
ブロネクチンのフィブリン結合ドメインの精製20kDポリ
ペプチドが提供される。
本発明は、天然のヒトフィブロネクチンのドメインの
１つのアミノ酸配列の実質的部分を含み、天然のヒトフ
ィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応しな
い、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない細菌産生ポ
リペプチドも提供する。好ましいドメインは天然ヒトフ
ィブロネクチンの細胞結合ドメイン及びフィブリン結合
ドメインである。好ましいポリペプチドには次のものが
ある：天然のヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメイン
のアミノ酸1102〜1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を
欠く、天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消
化産物対応しない細菌産生75kDポリペプチド；天然のヒ
トフィブロネクチンの細胞結合ドメインのアミノ酸1380
〜1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く、天然のヒ
トフィブロネクチンのタンパク質分解消化産物に対応し
ない細菌産生40kDポリペプチド；天然のヒトフィブロネ
クチンの細菌結合ドメインのアミノ酸1329〜1722を含む
が、アミノ酸1600〜1689を欠く、天然のヒトフィブロネ
クチンのタンパク質分解消化産物に対応しない細菌産生
33kDのポリペプチド；天然のヒトフィブロネクチンのタ
ンパク質分解消化産物に対応しない、天然のヒトフィブ
ロネクチンのフィブリン結合ドメインの細菌産生31kDポ
リペプチド；天然のヒトフィブロネクチンのタンパク質
分解消化産物に対応しない、天然のヒトフィブロネクチ
ンのフィブリン結合ドメインの細菌産生20kDポリペプチ
ド。
本発明は、ヒトフィブロネクチンのタンパク質分解消
化産物に対応しない、天然のヒトフィブロネクチンのド
メインの１つのアミノ酸配列の実質的部分を含むポリペ
プチドを提供する。ドメインは好ましくは細菌結合ドメ
イン又はフィブリン結合ドメインである。好ましくは、
ポリペプチドは、アミノ酸1102〜1851を含むが、アミノ
酸1600〜1689を欠く75kDポリペプチド；アミノ酸1380〜
1851を含むが、アミノ酸1600〜1689を欠く40kDポリペプ
チド；アミノ酸1329〜1722を含むが、アミノ酸1600〜16
89を欠く33kDポリペプチド；アミノ酸１〜262を含む31k
Dポリペプチド；又はアミノ酸１〜153と13個の付加のア
ミノ酸を含む20kDポリペプチドである。
本発明は、上記開示のポリペプチドの少なくとも２つ
と適当な担体を含む組成物を提供する。このような組成
物中のポリペプチドは互いに結合していてもよい。
本出願中では、「結合」とは共有的、非共有的に結合
した、又は連結したポリペプチドを含んでいる。ポリペ
プチドは、本発明の属する業界で標準的に使用され、よ
く知られているアミノ酸又はポリペプチドリンカーを含
む他の化学部分を介して連結されていてよい。
又、少なくとも２つの上記開示ポリペプチドから本質
的になるハイブリッドポリペプチドも提供する。
本発明は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量の
少なくとも２つのポリペプチドと医薬的に許容可能な担
体とからなる医薬組成物及び血小板凝集反応を阻害する
のに有効な量のハイブリッドポリペプチドと医薬的に許
容可能な担体とからなる医薬組成物も提供する。
更に、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のいず
れか１つの開示ポリペプチドと医薬的に許容可能な担体
とからなる医薬組成物及び血小板からのトロンボキサン
放出を阻害するのに有効な量のいずれか１つの開示ポリ
ペプチドと医薬的に許容可能な担体とからなる医薬組成
物が提供される。
本発明は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量の
いずれか１つの開示ポリペプチドを適当な条件下で血小
板と接触させることからなる血小板凝集反応阻害法；及
び血小板からのトロンボキサン放出を阻害するのに有効
な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを適当な条件下
で血小板と接触させることからなる血小板からのトロン
ボキサン放出阻害法も提供する。
本発明は脳血管又は心血管疾患を有する対象の治療法
も提供し、この方法は血小板凝集反応を阻害するのに有
効な量のいずれか１つの開示ポリペプチドを対象に投与
することからなる。
治療できる心血管疾患の例には、急性心筋硬塞又はア
ンギナが含まれる。血管形成法（angioplasty）又は冠
動脈バイパス手術を受けた対象又は血栓溶解療法を受け
た対象も、血小板凝集反応を阻止するために本発明ポリ
ペプチドで治療することができる。
本発明は創傷を有する対象の治療法も提供し、この方
法は創傷の治癒を促進するのに有効な量のいずれか１つ
の開示ポリペプチドを対象に投与することからなる。
創傷は切開、皮膚の失欠、皮膚移植又は火傷のような
皮膚の創傷でありうる。創傷は又、角膜上皮の創傷もし
くは角膜固有失の創傷のような眼球の創傷又は腱の創傷
でもありうる。
本発明は又、細菌感染に感染しやすい又は感染した対
象の治療法も提供し、その方法は、細菌感染を予防又は
治療するのに有効な量のいずれかの開示ポリペプチドを
対象に投与することからなる。このような細菌感染は対
象の体内にカテーテル内はインプラントが存在するため
に起るものでありうる。
本発明は又、腫瘍の転移を遅延させるのに有効な量の
いずれかの開示ポリペプチドを対象に投与することから
なる癌を有する対象の治療法、及び腫瘍検出に有効な量
のいずれかの開示ポリペプチドを対象に投与することか
らなる対象での腫瘍の検出法を提供する。
本発明ポリペプチドは血栓を検出するのに有効な量の
ポリペプチドを対象に投与することからなる対象での血
栓を検出する方法も提供しうる。
これらの腫瘍及び血栓の各検出法では、ポリペプチド
を腫瘍又は血栓を検出する診断薬として使用する。この
ような検出の分野では多くの方法が公知であり、例えば
放射性標識（アイソトープの核医学的使用）、放射線不
透過標識（例えばCATスキャン）、及び磁気共鳴イメー
ジング（MRI）がある。これらの標識法のいずれも腫瘍
又は血栓の検出用の本発明方法に使用できる。
本発明は血栓溶解剤に結合したいずれかの開示ポリペ
プチドも提供する。血栓溶解剤は組織プラスミノーゲン
アクチベータ（TPA）、ウロキナーゼ、ストレプトキナ
ーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化（Anisoylate
d）プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベー
タ複合体（EminaseTM）又はTPA類似体からなる群から選
択される。
本発明は、EGF,PDGF,α−TGF,β−TGF,FDGF,TNF,イン
ターロイキン，インターフェロン，エリスロポエチン，
コロニー刺激因子（CSF）,GM−CSF,G−CSF又はCSF−Ｉ
のような成長因子と結合したいずれかの開示ポリペプチ
ドを提供する。ポリペプチドは血清アルブミン、第VIII
因子もしくは第XIII因子のような血液因子、ポリエチレ
ングリコール、又はスーパーオキシドジスムターゼにも
結合しうる。
本発明は医療器具と医療器具表面に被覆として塗られ
た天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメイ
ンのポリペプチドからなる被覆医療器具を提供する。被
覆しうる医療器具の例には、カテーテル、医療用インプ
ラント（例えば腰部代替物（hip replacement）及び補
綴物）、チューブ及びシリンジがある。
本発明は医療器具の使用に伴う細菌感染の危険性を最
小化する方法を提供し、その方法は、 （ａ） 器具表面の被覆としてフィブロネクチンのフィ
ブリンの結合ドメインのポリペプチドを塗り；そして （ｂ） 非被覆器具よりむしろ得られた被覆器具を使用
することからなる。
本出願人の発明はフィブリン結合ドメインのトリプシ
ン分解断片の使用も提供する。このようなトリプシン分
解断片は血漿由来のフィブロネクチンをタンパク質分解
消化することにより得られる。このようなトリプシン分
解断片は血小板凝集反応阻害法に使用でき、この方法
は、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のポリペプ
チドを適当な条件下で血小板と接触させることからな
り、このようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネク
チンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的
部分を含む。
又、血小板からのトロンボキサンの放出を阻害するの
に有効な量のポリペプチドを適当な条件下で血小板に接
触させることからなる血小板からのトロンボキサン放出
の阻害法を提供し、このようなポリペプチドは天然のヒ
トフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ
酸配列の実質的部分を含む。
又、血小板凝集反応を阻害するのに有効な量のポリペ
プチドを対象に投与することからなる脳血管疾患を有す
る対象の治療法も提供し、このようなポリペプチドは天
然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメインの
実質的部分を含む。
フィブリン結合ドメインのポリペプチドは心血管疾患
を有する対象の治療にも使用でき、治療法は血小板凝集
反応阻害に有効な量を対象に投与することからなり、こ
のようなポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンの
フィブリン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を
含む。心血管疾患には心筋梗塞又はアンギナが挙げられ
る。血管形成法又は冠動脈バイパス手術を受けた対象又
は血栓溶解治療を受けた対象も血漿由来のフィブリン結
合ドメインポリペプチドで治療することができる。
本発明は、創傷の治癒を促進するのに有効な量のフィ
ブリン結合ドメインポリペプチドを対象に投与すること
からなる創傷を有する対象の治療法も提供し、このよう
なポリペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブ
リン結合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。
創傷は切開、皮膚の失欠、皮膚移植又は火傷のような
皮膚の創傷であってよい。創傷は又、角膜上皮の創傷も
しくは角膜固有質の創傷のような眼球の創傷又は腱の創
傷であってもよい。
本発明は細菌感染を予防又は治療するのに有効な量の
ポリペプチドを対象に投与することからなる細菌感染し
やすい又はした対象の治療法も提供し、このようなポリ
ペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結
合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。細菌感
染は対象の体内にカテーテル又はインプラントが存在す
ることによるものでありうる。
更に、腫瘍転移を遅延させるのに有効な量のフィブリ
ン結合ドメインポリペプチドを対象に投与することから
なる癌を有する対象の治療法を提供し、このようなポリ
ペプチドは天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結
合ドメインのアミノ酸配列の実質的部分を含む。
本発明の腫瘍を検出するのに有効な量のFBDポリペプ
チドを対象に投与することからなる対象での腫瘍の検出
法を提供し、このようなポリペプチドは天然のヒトフィ
ブロネクチンのフィブリン結合ドメインのアミノ酸配列
の実質的部分を含む。血栓を検出するのに有効な量のこ
のようなポリペプチドを対象に投与することからなる対
象での血栓検出法も提供され、このようなポリペプチド
は天然のヒトフィブロネクチンのフィブリン結合ドメイ
ンのアミノ酸の実質的部分を含む。
実施例 マップ位置に対する全ての参照は、第41図に示したヒ
トフィブロネクチンcDNAのヌクレオチド配列に沿って等
しく番号付けされた位置に対応する（1987年１月７日公
開のBaralle,F.E.の欧州特許公開第207,751号の第３図
も参照されたい）。
本出願人らがクローニングし発現させたcDNA配列は、
Baralleマップにおいてヌクレオチド4811から5080まで
にわたる270bpのエキストラドメイン（extra domain）
（ED）が欠失している。従ってBaralleマップにおいて
ヌクレオチド3317から5566までにわたるとされているcD
NA配列は、上記270個のヌクレオチドのED断片、即ちヌ
クレオチド4811から5080までが欠失しているので、1980
個のヌクレオチドしか含んでいない。この領域は当業者
にはED−Ａ領域としても公知である。同様に、上記DNA
断片によって発現されるタンパク質は、Baralleマップ
におけるアミノ酸1102からアミノ酸1851までをコードす
るだろうが、ED領域によってコードされる90個のアミノ
酸、即ちアミノ酸1600〜1689は欠失しているだろうか
ら、このタンパク質は660個のアミノ酸のみを含むだろ
う。このことは、ED領域にまたがる本明細書に記載の全
ての断片に対して当てはまる（当業者にはED−Ｂ領域と
して公知の領域はBaralleの配列及び本出願人らのcDNA
両方において欠失している）。
本出願人らは、EcoR Iリンカーを使用してクローニン
グ過程の間に、位置3317に示したEcoR I切断部位を構築
した。位置3313から3318にあるこの配列GAATTCは、対応
するBaralle配列GATTCとヌクレオチドが１つ異なってい
る。即ち、ヌクレオチド3315において単一のヌクレオチ
ドＣがＡに変更されている。このことから対応するアミ
ノ酸はThrからAsnへと変更される。
実施例１ フィブロネクチンcDNAライブラリーの作製 公開方法（13,14）に従ってヒト肝臓から単離したポ
リＡ＋mRNAからgt11においてcDNAライブラリーを作製し
た。EcoR Iリンカーを使用してcDNA断片をクローニング
し、cDNAライブラリーをフィブロネクチン（FN）陽性プ
ラスミドに対して以下の合成DNAプローブを使用してス
クリーニングした。
フィブリン、コラーゲン、ヘパリン及び細胞結合ドメ
インの全領域をカバーする一連のFN cDNA及びクローン
を同定及び単離した（第１図）。cDNA断片をpBR322のEc
oR I部位にサブクローニングした。
FNのmRNAは択一的にスプライシングされており、従っ
て種々の長さのcDNAが文献において報告されている。本
出願人らのcDNAは、FN物理マップ（完全な非スプライシ
ングcDNA）において塩基4811から塩基5080までの270塩
基対が欠失している。
実施例２ Escherichia coliにおけるCBDの発現 FNの75kD及び40kD細胞結合ドメイン（CBD）タンパク
質の発現を得るために、種々の部分cDNAクローンを、実
施例１に記載した種々のFN cDNAクローンから誘導したD
NA断片から構築した。
A.CBDの５′末端のサブクローニング 配列 を有する合成オリゴマーをcDNAクローンpFN919由来のEc
oR I−BamH I断片（塩基3317〜4151）に連結してNde I
部位を生成した。この連結断片をNde I−BamH I消化し
たpBR322中に挿入した（第２図）。
得られたプラスミドをpFN100と命名した。プラスミド
クローニングは、Escherichia coli株MC 1061中で実施
した。
配列 を有する合成オリゴマーをcDNAクローンpFN919由来のSs
t I−BamH I断片（塩基3611〜4090）に連結してNde I部
位を生成した。この連結断片をNde I−BamH I消化したp
BR322に挿入した（第３図）。
得られたプラスミドをpFN101と命名し、Escherichia
coli株MC1061中に維持した。
B.CBDの３′末端のサブクローニング 終結コドンとHind III及びSal I制限部位を含む合成
オリゴマーをcDNAクローンpFN916由来のEcoR I−Bgl II
断片（塩基4151〜5566）の３′末端に連結した。この連
結断片をEcoR I−Sal I消化したpBR322プラスミド中に
挿入した（第４図）。得られたプラスミドをpFN102と命
名し、Escherichia coli株MC1061中に維持した。
この合成オリゴマーは配列： を有した。
C.CBD全体のサブクローニング ５′末端に（開始コドンATGを含む）Nde I部位を有し
且つ３′末端に（終結コドンを含む）Hind IIIを有する
CBD全部のサブクローンを得るために、プラスミドpFN10
2をEcoR I及びHind III酵素で消化し、CBDの３′未満Ec
oR I−Hind IIIを単離し、BamH I及びHind IIIで消化し
たプラスミドpFN100に連結した（第５図）。この連結
は、第15図に示した配列を有するBamH I−EcoR I合成断
片の存在下に実施した。
得られたプラスミドをpFN103と命名し、Escherichia
coli株MC1061中に維持した。
D.CBD全体の発現 Escherichia coliにおけるCBD全体の発現を得るため
に、Nde I−Hind III断片をプラスミドpFN103から単離
し、Nde I及びHind IIIで消化したプラスミドpTV301中
に連結した（第６図）。
得られたプラスミドをpFN105と命名し、Escherichia
coli株A1645中に維持した。
ヒト成長ホルモン（hGH）発現体プラスミドpTV104
（２）のNde I切断によって第７図に示したプラスミドp
TV301を構築した。プラスミドpTV104（２）はATCCに受
託番号39384で寄託されている。Nde I−Nde I hGH断片
を発現ベクタープラスミドp579のNde I部位に挿入し
た。プラスミドp579はプラスミドpRO211及びpPS1から構
築した（第16図）。プラスミドpPS1はATCCに受託番号39
807で寄託されている。プラスミドpRO211はプラスミドp
JH200から構築した（第17図）。プラスミドpJH200はATC
Cに受託番号39783で寄託されている。
実施例３ 細胞結合ドメイン（CBD）の部分のサブクローニング及
び発現 RGD配列を含む約65kDのCBDタンパク質の発現を得るた
めに、プラスミドpFN102をEcoR I−Hind IIIで消化し、
CBDを含む断片を単離し、プラスミドpFN101に、第15図
に示した配列を有するBamH I−EcoR I合成断片の存在下
（実施例２参照）に連結した（第８図）。得られたプラ
スミドをpFN104と命名し、Escherichia coli株MC1061中
に維持した。
Escherichia coliにおいてCBDの発現を得るために、F
NのNde I−Hind III断片をプラスミドpFN104から単離
し、Nde I及びHind IIIで消化したプラスミドpTV301に
連結した（第９図）。得られたプラスミドをpFN106と命
名し、Escherichia coli株A1645中に維持した。
実施例４ 発現タンパク質のタンパク質解析 プラスミドpFN105及びpFN106を使用してEscherichia
coli株A1645を形質転換した。得られたクローンを、ア
ンピシリン（100μg/ml）を含むLB培地において30℃で
O.D.が0.7になるまで増殖させた。42℃で１〜３時間誘
導すると発現が得られた。
誘導後の細菌細胞を回収し、10,000RPMで５分間遠心
分離した。ペレットを10容積の50mM Tris−HCl pH＝8.0
/0.5mM EDTA,1mM PMSF中に懸濁させた（即ち、ペレット
が1gであるならば10容積の溶液を加えた）。（SDS及び
β−メルカプトエタノールを含有する）試料緩衝液を加
えた。試料を10分間沸騰させ、次いで小型遠心分離器内
で最高速度で２分間回転した。得られた上澄み15μを
10％SDSポリアクリルアミドゲル上にロードした。CBD全
部及び部分の予想サイズはそれぞれ75kD及び65kDであっ
たが、誘導に際して得られたタンパク質は切端（trunca
ted）されており、サイズはそれぞれ45kD及び35kDであ
った。
実施例５ 非切端タンパク質を発現するプラスミドの構築 なぜ切端タンパク質が得られたかを明らかにするため
に、クローンpFN105及びpFN106のDNAを再度配列決定す
ると、１つのヌクレオチド、即ち位置4030にあるＴの欠
失が認められた。この障害を克服するために、原cDNAラ
イブラリーを、FNの細胞結合ドメインプローブにハイブ
リッド化する更なるcDNAクローンに対して再度スクリー
ニングした。陽性のcDNAクローンを単離し、そのDNAを
配列決定した。pFN114−４と命名したcDNAクローン（bp
3573〜6720）は正しいDNA配列を有することが判った。
非切端の75kDタンパク質の発現 非切端のCBDタンパク質を得るために、クローンpFN10
5のSst I−Bgl II断片をクローンpFN114−４のSst I−B
gl II断片と置き換えた（第10図）。プラスミドpFN114
−４は、cDNAライブラリーから独立に単離したFN cDNA
を有する他のプラスミドであり、pFN114−４には位置40
30のチミジンの欠失はない。プラスミドpFN114−４由来
のSst I−Bgl II断片を使用してプラスミドpFN105由来
のSst I−Bgl II断片を置き換えた。得られたプラスミ
ドp117−４は全長75kDの細胞結合ドメインタンパク質の
発現を誘導したが、翻訳終結コドンを含まず、pBR322配
列内で終わっていた。この欠陥を修正するために、リン
カー： を構築した。このリンカーは５′末端及び３′末端にそ
れぞれBgl II部位及びHind III部位を含み、翻訳終結コ
ドンを含む75kDのCBDの３′末端をコードする。これ
を、Bgl II及びHind IIIで切断したプラスミドpFN117−
４に連結した（第10図）。得られたプラスミドpFN126−
３は、真正なＣ末端を含む全長75kDの細胞結合ドメイン
タンパク質の発現を誘導した。プラスミドpFN126−３
は、Escherichia coli A1645中でAmerican Type Cultur
e Collectionに受託番号67829で寄託されている。発現
されたタンパク質は、フィブロネクチン分子のアミノ酸
1102から始まりアミノ酸1851（但しアミノ酸1600〜1689
は除く）にわたるタンパク質のアミノ末端に付加したア
ミノ酸Met−Asp−Gln−Phe−Asn−Ser（MDQFNS）を有す
る。この分子は、フィブロネクチンの部分トリプシン消
化によって得られる75kDのタンパク質とは異なる。トリ
プシンポリペプチド断片は873番目のアミノ酸から1555
番目のアミノ酸にわたる。
非切端の40kD部分CBDタンパク質の発現 プラスミドpFN102をEcoR I及びHind IIIで消化し、FN
のEcoR I−Hind III断片を単離し、Nde I及びHind III
で消化しておいたプラスミドpTV301に、配列： を有する合成DNA断片の存在下に連結した。
得られたプラスミドをpFN118と命名し、Escherichia
coli株A1645中に維持し、40kD CBDタンパク質を発現さ
せた。Bgl II−Hind III終結リンカーの合成の誤りのた
めに、このタンパク質はBal II部位で終結せず、pBR322
からのDNA配列において終結した（第11図）。
翻訳を正しく終結させるために、プラスミドpFN118を
Bgl II及びNde Iで消化し、FNのBgl II−Nde I断片を単
離し、プラスミドpTV301から単離したNde I−Hind III
大断片及び合成リンカーの両方に連結した（第12図）。
合成リンカーは配列： を有していた。得られたプラスミドpFN132−５は、正し
い位置で終結した40kD CBDタンパク質を発現したことが
判った。プラスミドpFN132−５の最初の形質転換はEsch
erichia coli株A1645中で実施した。プラスミド解析
（制限酵素、DNA配列決定及び40kDタンパク質発現の決
定）の後、このプラスミドを使用してEscherichia coli
株4255（F+）を形質転換した。プラスミドpFN132−５は
Escherichia coli中で、American Type Culture Collec
tionに受託番号67830で寄託されている。発現したタン
パク質は、フィブロネクチンアミノ酸1380から開始しフ
ィブロネクチン分子のアミノ酸1851（但しアミノ酸1600
〜1689は除く）に達するポリペプチドのアミノ末端に付
加したアミノ酸Met−Asp−Gln−Phe（MDQF）を有する。
この分子は、フィブロネクチンの部分トリプシン消化に
よって得られる75kDタンパク質とは異なる。トリプシン
ポリペプチド断片は873番目のアミノ酸から1555番目の
アミノ酸にわたっている。
成長条件 40kD FN CBDを発現するEscherichia coli株4255
（F+）中のクローンpFN132−５を、アンピシリンを含有
するLB培地において30℃で、O.D.が0.7になるまで増殖
させた。42℃で１〜３時間誘導すると発現が得られた。
40kD CBDタンパク質の精製 42℃で２時間誘導した後に細胞を回収し、遠心分離
し、ペレット化した材料5gを緩衝液（50mM Tris−HCl p
H＝8.0,5mM EDTA,1mM PMSF,25mM NaCl）50ml中に懸濁さ
せ、４℃で５回（１回１分）超音波処理した。遠心分離
後、40kD CBDタンパク質がペレット画分中に存在するの
が認められた。
この40kDのCBDタンパク質を更に、ペレットを（上記
緩衝液中の）6M尿素中に溶解し、DEAEセルロースイオン
交換カラムクロマトグラフィーにより分離することによ
り精製した。40kDのタンパク質をプールし、PBSに対し
て透析した。40kDのタンパク質用の優れた精製方法は実
施例15に示す。
実施例６ 40kDのCBDポリペプチドの細胞結合活性 精製した40kD CBDの生物学的活性をアッセイした。真
正な血漿FNを陽性コントロールとして使用した。血漿FN
及び組換え40kD CBDをプラスチック表面上に固定し、ト
リチウム標識マウス3T3細胞の上記層への結合を、Piers
chbacher,M.ら（15,18）が記載したように固定タンパク
質濃度の関数として決定した。この結果から、40kDタン
パク質による結合の程度は真正な血漿FNのものに匹敵し
得ることが判った。その他の結果は実施例16で説明す
る。
実施例７ 血小板凝集アッセイ 種々のフィブロネクチン組換え断片の血小板凝集を阻
害する能力を評価するために、血漿タンパク質の存在下
のin vitroアッセイにおいて実験を実施した。
血小板を豊富に含む血漿（PRP）及び血小板の乏しい
血漿（PPP）の調製（16,17）は以下のように行なった。
1.室温のヒト血液20mlに4.8％クエン酸ナトリウム2mlを
加え、 2.Beckman遠心分離器において1,200RPM,20℃で10分間遠
心分離した後、上澄み（PRP）を回収し、 3.上記上澄み1mlを更に10,000RPM,室温で２分間遠心分
離し、上澄み（PPP）を分離した。
アッセイ PRP及びPPPを使用し、それぞれ0.1及び0.9透過率単位
において凝集検出計を較正した。
反応管混合物 a.PRP 125μ、 b.PBS溶液中のタンパク質試料０μ〜125μ、 c.37℃で２〜３分間溶液を平衡させ、 d.PBSを加えて最終容積250μとする。
ADP溶液を最終濃度10μＭになるまで加える（0.5mM A
DP溶液５μ）ことにより血小板凝集を誘導した。この
結果は表Ｉにまとめて示すが、これらの結果は、40kD C
BD及び31kD FBDタンパク質の両方がADP誘導の血小板凝
集を一部阻害するが、未消化の全血漿フィブロネクチン
は効果がないことを示している。
ADP誘導の血小板凝集を防止する上でのrCBDドメイン
の活性は、このポリペプチドが有効な阻害剤であること
を明らかに示している（精製ポリペプチド0.5μＭを用
いて40％阻害が得られた（表II））。無傷（intact）の
血漿精製フィブロネクチンはこのアッセイ条件下では全
く効果を示さなかった。それに反して、制限的なタンパ
ク質加水分解を行って別個のフィブロネクチンドメイン
を生成した同じ調製物は、強力な阻害活性を得た。
RGD含有合成ペンタペプチドは、文献に報告されてい
るように、比較的高いモル濃度で阻害効果を示した。２
種のタンパク質、即ち組換えbGH及び組換えアポリポタ
ンパク質Ｅを陰性の対照として試験したが、予想通り、
血小板凝集を防止しなかった。精製血漿FBDは血小板凝
集をin vitroで阻害した。この知見は、組換えFBDを使
用して更に確証される。血小板凝集における40kDタンパ
ク質の作用を示す他の結果は実施例17で説明する。
実施例８ 31kDフィブリン結合ドメインの単離及び血小板に対する
その抗凝集作用の証明 要約 血漿FN由来の31kDトリプシン分解断片を単離し、DEAE
−セルロース、CM−セファロース及びヘパリン−セファ
ロース上のクロマトグラフィーによって精製した。精製
した断片は、血小板凝集を防止する上で有効であること
が判った（0.5〜1.1μＭの濃度で40％阻害）。
断片の調製及び精製 （ゼラチン−セファロースカラム上で溶出させて精製
し、1Mグアニジニウムヒドロクロリド中に保存した）血
漿FNを切断することにより31kD断片を得た。次いで、10
mM Tris−HClに対して透析した後、FN206mgを0.01％のT
PCK−トリプシンを用いて37℃で５分間消化した。トリ
プシン消化物をDE52カラム（6ml）にロードし、1/5の流
出画分（50ml）をCM−セファロースカラム（3ml）に供
し、NaCl勾配（０〜0.5M）で溶出させた。塩勾配におい
て約80％のタンパク質が回収された（ピークは約220mM
であった）。透析して塩を除去した後、約1/2のタンパ
ク質をヘパリン−セファロースカラム（1.5ml）にロー
ドし、0.5M NaClで溶出させた。この画分においては約7
5％、即ち約1mgのタンパク質が回収された（理論的収率
の約40％）。この画分は90％以上純粋な31kD断片であ
り、血小板凝集をin vitroで防止することが判った。
血小板凝集のin vitro防止 ヒトPRP及びADP（10μＭ）誘導の凝集を使用し、２種
の別個の実験を実施すると、その結果は以下のようにな
った。31kDの濃度（μＭ） ％阻害 実験番号 4.0 100 １ 2.0 91 0.5 38 1.1 39 ２ 0.3 12 特性調査 還元及び非還元条件下のSDS−PAGE、Superose 12（分
子量26kD）上のゲル過クロマトグラフィー及びＮ末端
配列決定（Ｎ末端は、ピログルタメート残基に対して予
想されたように、ブロックされていることが判った）に
よって、精製断片の特性を調査した。更に、この材料
は、抗FN及び抗rec20kD抗体とイムノブロット（immunob
lot）中で反応した（rec20kDはアミノ酸１〜190を含む
組換えFN分子を表す）。そのヘパリン−セファロースへ
の結合特性もその性質を証明するものである。この31kD
断片は更に、細菌結合アッセイにおいてStaphylococcus
aureusに反応した。
実施例９ フィブリン結合ドメイン（FBD）類似体の発現及び精製 A.20kD部分FBDタンパク質の発現 実施例１に記載したように得られ、第１図に図示した
FN cDNAクローンは、FN分子のアミノ酸１〜190をコード
するDNAを含んでいなかった。これらのアミノ酸はFBDの
部分である。ヌクレオチド14〜472に対応し、アミノ酸
１〜153をコードするDNA（第41図）を、７対の化学合成
ヌクレオチドを連結することにより構築した（第42図及
び第43図）。この合成DNA断片には、５′末端にATG開始
コドンが含まれ、また種々の発現ベクターに挿入するの
に都合の良い制限部位も含まれていた。FBDをコードす
るDNA配列を更に操作できるように、ヌクレオチド番号1
9のチミジン（Ｔ）をアデニン（Ａ）に変え、それによ
ってアミノ酸配列を変更することなくDde I制限部位を
除去した（このヌクレオチド交換部位は第42A図に示し
たリンカー＃１においてはアスタリスクで表されてい
る）。上記合成DNA断片を、EcoR I及びBamH Iで消化し
たpBR322プラスミドベクター中にクローニングする種々
のステップを第43図に記載した。得られたプラスミドを
pFN932−18と命名した。プラスミドpFN932−18由来のフ
ィブロネクチンの最初の153個のＮ末端アミノ酸をコー
ドするDNA断片をpTV301、即ちλPL発現ベクターのNde I
及びBgl II部位間に挿入し、プラスミドpTV301における
ヒト成長ホルモン（hGH）をコードするDNA配列を置換し
た（第44図）。得られたプラスミドpFN949−２は、Amer
ican Type Culture Collectionに受託番号67831で寄託
した。プラスミドpFN949−２を使用してEscherichia co
li原栄養株A4255を形質転換した。これらの形質転換し
たEscherichia coli細胞は、全細胞タンパク質の約５％
を占める量において部分FBDタンパク質を発現すること
が判った。このタンパク質は、サイズマーカー（size m
arker）の移動度から決定される還元SDSポリアクリルア
ミドゲル上で約20kDの移動度を有した。このタンパク質
は、メチオニンに続くフィブロネクチンの最初の153個
のアミノ酸と、それに続く合成リンカーによってコード
された４個のアミノ酸と、さらにpBR322ベクター中まで
読取られることにより生成された９個のアミノ酸、即ち
合成167個のアミノ酸からなる。この明細書においては
このタンパク質をr20kDタンパク質またはr20kD FBDと表
記する。
B.「完全」FBDタンパク質類似体の発現 アミノ酸１〜262を含む全FBDタンパク質の発現を得る
ために、以下のプラスミドを構築した。
1.3′末端における終結コドンTAAの挿入 第45図に示したように、TAA終結コドン及びBgl II部
位を含む配列： を有する合成オリゴヌクレオチドを、FN cDNAクローンp
931−５から単離したEcoR I−Pvu II断片の３′末端
と、EcoR I及びBamH Iで消化したpBR322ベクターとに連
結した。得られたプラスミドをpFN935−12と命名した。
2.λPL発現ベクターにおけるFBDのカルボキシ末端領域
のサブクローニング 第46図に示したように、FBDのカルボキシ末端領域を
コードするEcoR I−Hinc II DNA断片をプラスミドpFN93
5−12から単離し、EcoR I及びSma Iで消化したプラスミ
ドpTV194−80に連結した。得られたプラスミドをpFN946
−12と命名した。
3.FNのヌクレオチド468〜599に対応するDNAの合成及び
クローニング 第47図に詳細に示したように、３対の化学合成ヌクレ
オチドを、プラスミドpFN932−18（第43図）から単離し
たEcoR I−Dde I FN断片に、EcoR I及びXba Iで消化し
たpUC19ベクターDNA（GIBCO BRL Co.から購入）の存在
下に連結した。得られたプラスミドをpFN948−４と命名
した。
4.完全FBD領域をコードするプラスミドの構築 全FBD、即ちアミノ酸１〜アミノ酸262までをコードす
るプラスミドを構築するために、第48図に示したよう
に、FNをコードするEcoR I−Xba I DNA断片をpFN948−
４から単離し、EcoR I及びXba Iで消化したプラスミドp
FN946−12中に挿入した。得られたプラスミドをpFN−95
7と命名した。このプラスミドはFBDを完全にコードする
配列を含むが、リボゾーム結合部位（RBS）が欠如して
いるのでFBDタンパク質を発現しない。
5.λPLプロモーター及びc II RBS下のFBDの発現 第49図に示したように、FBDをコードする領域及びT1T
2転写終結因子を含むNde I−Hind III断片をプラスミド
pFN−957から単離し、Nde I及びHind IIIで消化したプ
ラスミドpTV301（第７図）中に挿入した。得られたプラ
スミド（pFN962−３と命名した）は、λPLプロモーター
及びc IIリボゾーム結合部位の制御下にFBD類似タンパ
ク質の発現を誘導した。このプラスミドを用いて形質転
換したEscherichia coli株A1645及びA4255は少量のFBD
タンパク質のみ発現した。FBDタンパク質の発現は、ヒ
ト血漿由来のFNに対するポリクローナル抗体を使用する
ウェスタンブロット分析によってのみ検出可能であっ
た。
6.λPLプロモーター及びβ−ラクタマーゼプロモータ及
びリボゾーム結合部位下のFBD類似タンパク質の発現 プラスミドpFN962−３を用いて得られるFBD類似タン
パク質の発現レベルは低いので、β−ラクタマーゼプロ
モーター及びβ−ラクタマーゼRBS（PBLA）をコードす
るDNA断片を加えた。第50図に示したように、PBLAをコ
ードするDNA断片をプラスミドpBLA11（ATCC受託番号397
88）から単離し、Nde Iで消化したプラスミドpFN962−
３中に挿入し、クレノウ（Klenow）酵素で充填し、EcoR
Iで消化した。得られたプラスミドはpFN975−25と命名
し、American Type Culture Collectionに受託番号6783
2で受託した。このプラスミドを使用してEscherichia c
oli原栄養株A4255（F+）を形質転換した。
これらのEscherichia coli細胞は、全細胞タンパク質
の約５〜８％のレベルで「完全」FBD類似タンパク質を
発現することが判った。見掛けの分子量31kDを有するタ
ンパク質がSDS−PAGEゲル上を移動し、従ってこれを、3
1kDタンパク質またはr31kD FBDと表記する。
C.発酵及び増殖条件 r31kD FBDタンパク質を発現するクローンを、アンピ
シリンを含む富培地（酵母抽出物及びカゼイン加水分解
産物）中で発酵させた。増殖は30℃で行った。42℃で２
時間誘導すると発現が得られた。
D.組換えフィブリン結合ドメイン（r31kD）タンパク質
の再生及び精製 このプロセスは３つの段階： 1.細菌ケーキの粗処理、 2.再生／再酸化、 3.精製。
からなる。
1.粗処理 まず、細菌ケーキを５容積の50mM Tris−HCl/50mM Na
−EDTA,pH8（緩衝液１）中で破壊し、次いで、１当た
りリゾチーム100mgを含む緩衝液１の1.2容積で処理（37
℃で２時間撹拌）した。得られた懸濁液にTriton X 100
を（１％になるまで）加え、室温で30分後、懸濁液を遠
心分離し、ペレットを再懸濁させ、水で２回洗浄した。
これらのステップ全てはペレットの破壊及び遠心分離に
よって行われ、SDS−PAGEゲルから立証されたように、3
1kDはペレット中に存在した。
洗浄したペレットを14容積の10mM Tris−HCl/5mM EDT
A/2mM PMSF/2mM 6−アミノカプロエート,pH7.5（緩衝液
Ａ）中に懸濁させ、次いで、１％硫酸デシル、１％硫酸
デシル/5％グリセロール及び５％グリセロールを含む緩
衝液Ａで順次処理し、最後に、添加剤を含まない緩衝液
Ａで処理した。
2.再生／再酸化 原則：ペレットは6Mグアニジン−HCl〔GuCl〕中に、グ
ルタチオン〔GSH〕のようなチオール系還元剤の存在下
に溶解し、また再生／再酸化は、酸化グルタチオン〔GS
SG〕を加えることによってより低いGuCl濃度で行なう。
上記ステップ１で洗浄したペレットを緩衝液Ａ中の6M
GuCl/3mM GSH 150〜700容積に溶解した。GuClの濃度を
次第に低める、即ち、まず2M、次いで1M及び0.5Mとする
が、他の全ての成分の濃度は一定に維持した。但し容積
は、この段階ではペレットの容積より500〜1000倍大き
くなった。GuClの中間濃度の１つ、即ち0.5Mと2Mとの間
において、0.3mM GSSGを加えることにより再生を開始さ
せ、室温で24〜48時間インキュベートした。次いで再生
した31kDを、添加剤を含まない緩衝液Ａに対して透析し
た。
3.精製 濃度：大容積の再生31kDを遠心分離して、31kDを含まな
い不溶性のペレットを除去し、次いでTris−HCl,pH7.8
に対して透析し、濃縮し、まずヘパリン−セファロース
カラム上で精製した。
実施例10 創傷治癒 ラットの創傷治癒モデルにおいてr40kD CBD断片ドメ
インを試験した。このモデルにおいて、ポリビニルスポ
ンジを皮下に移植し、試験物質をin situ注射した。走
化性及び細胞外基質形成についての試験物質の効果は、
スポンジ中のDNAの増大及びコラーゲンの蓄積によって
表される（第13図参照）。
実施例11 細菌結合活性 r31kD FBDのStaphylococcus aureus細菌浮遊物への結
合について実験を実施した。無傷の放射性ヨウ素化血漿
フィブロネクチン、ヒト血漿フィブロネクチン由来のタ
ンパク質加水分解31kDアミノ末端断片（p31kD）及びr31
kD FBDに対して同一の結合曲線が得られた。
［125I］p31kDによる細菌結合の阻害は、組換え31kD
FBDが真正なタンパク質加水分解断片と拮抗することを
示唆した。
実施例12 細菌付着の阻害 r31kD FBDの、細菌の創傷中の細胞外基質への付着に
干渉する能力を評価するために、競合アッセイを実施し
た。このアッセイにおいては、Staphylococcus aureus
のフィブロネクチンで被覆したプラスチック表面への付
着及びFBDの付着への干渉を測定した。真正なFBD及びr3
1kD FBDは両方ともフィブロネクチン被覆表面への細菌
付着を阻害する上で活性であった。
実施例13 フィブロネクチンの組換え40kD細胞結合ドメインの薬物
動力学 ラットにおいて40kD組換えタンパク質の薬物動力学的
挙動を調査した。精製した40kD CBDを放射性ヨウ素で標
識し、体重1kg当たり1mgの投与量で静脈注射した。血中
放射能レベルは、まず最初の１時間は半減期約１時間で
減少し、１〜８時間はより長い半減期（t1/2＝3.2時
間）のよりゆっくりしたクリアランス期が続いた。従っ
て、組換えタンパク質の体内滞留時間は比較的長い（第
14図参照）。
これに比較し、RGDペプチドの半減期は８分である。
実施例14 細胞結合ドメインの種々の領域に対応する組換えタンパ
ク質に対する発現ベクターの構築、及びこれらの組換え
タンパク質の発現 以下に記載するCBDの種々の領域の発現に対するベク
ターの全ては、実施例２〜５に記載した75kD及び40kDタ
ンパク質をコードするプラスミドから構築した。第18図
は、各プラスミドにおけるcDNAの長さ及び位置を模式的
に示しており、細胞結合ドメインＩ及びII（CBD I及びC
BD II）をコードするcDNAの存在及び不在を示してい
る。第19図は、得られたプラスミドによって発現される
タンパク質についての情報をまとめたものである。
以下に記載するタンパク質の発現は（特に記載のない
限りは）全ての場合において以下のように達成された。
最初にプラスミドを使用してEscherichia coli株A1645
を形質転換し、プラスミドを解析（制限酵素データ及び
発現の決定）後、このプラスミドを使用してEscherichi
a coli株A4255（F+）を形質転換した。
75kDタンパク質に類似であるが切端のＣ末端を有する
タンパク質を発現するプラスミドを構築するために、第
20図に示すように、発現プラスミドpFN128−４を構築し
た。このプラスミドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定すると、分子量65kDを有するタンパク質を発現
した。従ってこのタンパク質を「65kDタンパク質」と表
記する。65kDタンパク質は、第19図に示したようにアミ
ノ酸531個の長さであると考えられる。
プラスミドpFN128−４よりも大きい（CBD I領域の欠
失を含む）Ｃ末端セクションの欠失を含むタンパク質を
発現するプラスミドを第21図に示すように構築した。得
られたプラスミドpFN130−11は、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で測定すると分子量28kDを有するタン
パク質を発現した。「28kDタンパク質」と表記されるこ
の組換えタンパク質は、第19図に示したように258個の
アミノ酸を含むと考えられる。
65kDタンパク質に類似であるがＮ末端が切端である組
換えタンパク質を生産するために、第22図〜第24図に示
すように発現プラスミドpFN143−１を構築した。このプ
ラスミドは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると分子量55kDを有するタンパク質を発現した。
「55kDタンパク質」と表記されるこのタンパク質は、第
19図に示したように436個のアミノ酸を含むと考えられ
る。
75kDタンパク質に類似であるが、CBD II領域を含むＮ
末端領域が欠失している組換えタンパク質を生産するた
めに、第22図に示すように発現プラスミドpFN135−12を
構築した。親プラスミド（pFN117−４）及びその子プラ
スミド（pFN135−12）は両方とも、翻訳終結コドンを欠
いた同じ３′末端を含む。従って、翻訳はpBR322 mRNA
内で終結し、得られたタンパク質は更にそのＣ末端に非
フィブロネクチン由来アミノ酸を含んでいた。
発現されたタンパク質の分子量は、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で測定すると45kDであり、従って
このタンパク質を「45kDタンパク質」と表記する。この
タンパク質は、非フィブロネクチン誘導Ｃ末端を含み、
第19図に示したように約433個のアミノ酸を含むと考え
られる。
45kDタンパク質に類似であるが切端のＣ末端を有する
タンパク質を生産するために、第23図に示したようにプ
ラスミドpFN137−２を構築した。プラスミドpFN137−２
は、Escherichia coli宿主A4255中でATCCに受託番号679
10で寄託した。このプラスミドは、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で測定すると分子量33kDを有するタ
ンパク質を発現した。従ってこのタンパク質を「33kDタ
ンパク質」と表記する。このタンパク質は、第19図に示
したように304個のアミノ酸を含むと考えられる。
33kDタンパク質に類似であるがＮ末端において切端で
ある組換えタンパク質を生産するために、第25図に示す
ように発現プラスミドpFN134−９を構築した。このプラ
スミドは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測
定すると分子量28kDを有するタンパク質を発現した。こ
のタンパク質を「28（＊）kDタンパク質」と表記する。
28（＊）kDタンパク質は、第19図に示したように253個
のアミノ酸を含むと考えられる。
実施例15 40kD及び33kDタンパク質の精製 （ａ）40kDタンパク質の精製 実施例５で生産した40kDタンパク質は、実施例５の最
後部分に40kDタンパク質に対して記載したように精製す
ることができるが、以下に記載する変法で精製した。
湿潤な細菌ケーキ10gを、100mlの緩衝液A: 50mM Tris−HCl pH8.0 5mM EDTA 25mM NaCl 1mM PMSF 10mM エチレンジアミン 中に再懸濁させ、得られた懸濁液を氷中で８分間超音波
処理した。この超音波処理は２回繰り返した。得られた
超音波処理後の液を15,000rpm,4℃で30分間遠心分離し
た。
得られた細菌ペレットを、6M尿素を含む緩衝液A100ml
中に再懸濁させ、４分間音波処理し、音波処理後の液を
15,000rpmで30分間遠心分離し、得られた上澄み液500 O
D単位を、緩衝液Ａで平衡させたDE52セルロースカラム
（250ml）にロードした。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、
画分を回収した。精製された40kDタンパク質（Pool I＋
II）が流出容積の1/6内で溶出した。この組換えタンパ
ク質の調製物を緩衝液Ａに対して透析し、精製された40
kDタンパク質画分をプールし、PBSに対して透析した。
次に、大量の40kDタンパク質調製物を実質的に前記し
たのと同様に精製した。但し、DE52セルロースカラムに
代えてDEAE−Sepharose Fast Flowカラム（Pharmacia）
を使用した。次いで、部分精製40kDタンパク質を高分子
凝集物（aggregates）及び低分子量夾雑物から、仕様書
に従って発熱物質除去処理をしておいたFractogel TSK
HW−55（Ｆ）カラム（E.Merck）上でサイズ排除クロマ
トグラフィーによって精製した。典型的には、硫酸アン
モニウム沈澱によって約4mg/mlに濃縮し、緩衝液Ａ中の
6M尿素中に再溶解した部分精製40kDタンパク質100mlをF
ractogel TSK 55カラムにロードし、尿素不在の緩衝液
Ａ中で溶出させた。
凍結保存した精製40kDタンパク質のプールは濃度1.6m
g/mlを有し、92％以上純粋であった。
（ｂ）33kDタンパク質の精製 33kDタンパク質を発現するプラスミドpFN137−２を有
するEscherichia coli株A4255（F+）を、アンピシリン
を含むLB培地中で30℃で増殖させた。42℃で１〜３時間
誘導すると発現が得られた。湿潤な細菌ケーキを上記
（ａ）に記載のごとく超音波処理した。洗浄した細菌ペ
レット（70g）を、（前記のごとく）新たに脱イオン化
した6M尿素を緩衝液Ａに溶解した溶液1600ml中に溶解し
た。
次いで遠心分離し、無視し得る量の33kDタンパク質を
含む不溶性物質を除去し、予め同じ緩衝液で平衡させて
おいた10×63cmDEAE−Sepharose Fast Flow（Pharmaci
a）カラム上でクロマトグラフィー操作を２回実施し
た。溶出は尿素不在の緩衝液Ａを用いて行なった。この
ような条件下で、33kD断片はカラム上で遅延し、ほとん
どの夾雑細菌タンパク質は結合し、0.5M NaClを緩衝液
に加えるとカラムから溶出した。カラムのSDS−PAGEプ
ロフィールに従って画分をプールし、２回の操作から得
られた精製画分のプールを組み合せた（DEAE−S 3,
4）。これらのプールのタンパク質濃度をBradfordの変
法（24）によって決定し、純度を、SDS−PAGEプロフィ
ールのクーマシーブリリアンブルー染色から評価した。
結果を表IIIにまとめて示す。
実施例16 細胞接着系における33kD及び40kDタンパク質の作用 細胞接着（cell attachment）における33kD及び40kD
タンパク質の作用を、僅かに改変した細胞接着アッセイ
（23）を使用して調査した（更に15,18を参照）。予備
結果は実施例６に記載した。簡単に述べると、PBS溶液
中の試験タンパク質リガンドのプラスチック表面への固
定を４℃で16時間実施し、未結合のタンパク質をPBSで
洗い落とし、非特異的な部位をPBS中のBSAでブロックし
た後、3H−チミジン標識したトリプシン処理増殖真核細
胞を前記表面上に置き、37℃で45分間インキュベートし
た。
洗浄後、皿上に残っている放射能レベルを測定した。
これを、種々の濃度の試験タンパク質リガンドにおいて
実施し、第38図及び第39図に示した用量−応答曲線を作
成した。
驚くべきことに、40kDタンパク質は、血漿フィブロネ
クチンと同様に3T3繊維芽細胞及びBHK細胞に（NRK細胞
には結合しなかったが）結合した。しかしながら、33kD
タンパク質はBHK細胞に極めて少ししか結合しなかっ
た。40kDタンパク質は、血漿フィブロネクチンと同様
に、追加実験からその結合がペンタペプチドGRGDSによ
って完全に阻害されることが判ったので、解析した真核
細胞の細胞表面上に存在するインテグリン（integrin）
受容体に結合することが判った。
40kDタンパク質は、CBD I（RGD）部位と相乗的に作用
すると考えられているCBD II部位を含まないので、無傷
のフィブロネクチンと同様の程度に細胞接着に関与する
ことは予想外であった（25参照）。40kDタンパク質中に
存在するヘパリン結合部位（第１図参照）の３分の２は
予想外にも細胞接着機能を果たすことができ、CBD II部
位欠失を補償し得る。この仮説は、ヘパリンは40kDタン
パク質の結合と拮抗するがフィブロネクチンの結合とは
拮抗しないことを示す細胞接着の追加実験によって立証
された。
33kD及び40kDタンパク質は両方ともCBD I領域は含む
がCBD II領域は含まないことに留意されたい（第18図参
照）。40kDタンパク質はＣ末端において（387塩基対＝1
29個のアミノ酸だけ）拡張されており、この領域は、33
kDタンパク質中には存在しないヘパリン結合ドメインの
３分の２を含んでいる。
実施例17 血小板凝集アッセイにおける40kD及び33kDタンパク質作
用 実施例７に記載したin vitroアッセイを使用し、40kD
及び33kDタンパク質の血小板凝集を阻害する能力を評価
した。40kDタンパク質のADP誘導血小板凝集を一部阻害
する能力は実施例７に示した（表Ｉ及びII）。
in vitro血小板凝集アッセイ系における33kDタンパク
質、40kDタンパク質、血漿75kD及びペンタペプチドGRGD
Sの用量−応答作用を第28図に示す。PRPを使用したこれ
らの結果は、試験した全てのタンパク質が血小板凝集を
阻害するが、33kDタンパク質が最も強力な作用を有する
ことを示している。
同様の実験をまとめて表IVに示す。血漿75kDは第28図
の説明において記載したように調製した。
（第20図に示したように尿素処理の前後の）40kDの作
用と比較して33kDタンパク質の作用を調査するために、
PRPを使用する類似のin vitro凝集研究を行った。この
結果、40kDタンパク質の尿素処理は血小板凝集における
阻害作用を増大させること、及び33kDタンパク質ははる
かに高い阻害作用を有することが判った。
全血中における40kD及び33kDタンパク質による血小板
凝集の阻害を、前記と同様であるが但し第29図の説明に
記載のごとく改変したin vitroアッセイ系において調査
した。タンパク質濃度の関数としてのパーセント阻害の
グラフを第29図に示す。
これらの結果は、33kD及び40kDタンパク質がヒト全血
中において血小板凝集を阻害すること、及び33kDタンパ
ク質の阻害作用が驚くほど強力であることを示す。33kD
タンパク質1.5μＭまたは40kDタンパク質2.5μＭを使用
して80％阻害が得られ、これは、33kDタンパク質では50
mg/及び40kDタンパク質では100mg/に相当する。
更に33kDタンパク質に、コラーゲン誘導血小板凝集を
防止し得るか決定する試験を行なった。前記と同様であ
るが但しADPの代わりに８μg/mlのコラーゲン（タイプ
I,Sigma）を用いて誘導する血小板凝集アッセイ系を使
用し、実験を実施した。33kDタンパク質はコラーゲンに
よる血小板凝集を阻害した。凝集を防止するのに必要な
33kDタンパク質の有効量は、ADPに刺激された細胞に対
するよりも約５〜10倍高かった。ラット由来のPRPを使
用しても同様の結果が得られた。
種々の種における血小板凝集に及ぼす40kD及び33kDポ
リペプチド並びにGRGDSポリペプチドの作用を調査し
た。PRPは、ラット、ウサギ、モルモット（guinea pig
s）、イヌ及びヒト由来の血液から調製し、前記凝集ア
ッセイを使用して凝集阻害を測定した。この結果を表Ｖ
に示す。
表Ｖは、ヒトフィブロネクチンと相同である33kD及び
40kDタンパク質が種々の哺乳動物種由来の血小板の凝集
を阻害することを示す。血小板凝集の50〜100％阻害に
必要な平均濃度は、GRGDSのそれと比較してはるかに低
く、血小板機能を遮蔽する上でのこれらの組換えフィブ
ロネクチン断片の効能を示している。
実施例18 血管損傷モデルにおける40kD及び33kDタンパク質の作用 40kD及び33kDタンパク質の生物学的活性を血管損傷モ
デルにおいて調査した（26）。簡単に述べると、培養し
た内皮細胞は、除内皮化（de−endothelialized）血管
切片と同様に血小板を活性化する細胞外基質（ECM）を
産生する。ヒト血小板をこれらECM上でインキュベート
すると血小板の付着、凝集、トロンボキサンA2（TXA2）
形成、及び放出反応を誘発する。
血小板を豊富に含む血漿（PRP）をECM被覆プレート上
でインキュベートすると、大きな血小板凝集が形成され
る。このモデル系における血小板の相互作用を、Eldor
らが記載したように（26）、位相差顕微鏡検査法及びラ
ジオイムノアッセイによるトロンボキサンB2（TXB2）の
測定によってモニターする。まず不安定なトロンボキサ
ンA2（TXA2）が放出され、迅速にトロンボキサンB2（TX
B2）に変換されることに留意されたい。このモデル系
は、血小板付着、凝集及び放出に干渉する種々の物質を
試験するのに使用することができる。
このモデル系におけるGRGDSペンタペプチドと、40kD
及び33kDタンパク質の作用を調査した。PRP 30μ及び
PBS 700μを含むPRP混合物1mlを試験化合物の存在下
または不在下に、ECMで被覆した培養皿に与えた。45分
間インキュベートした後、血小板凝集物のサイズ及びTX
B2放出を決定した。小さな凝集物（＋）は面積１〜２×
103μ２の大きさであり、大きな凝集物（＋＋＋＋）は
面積１〜2.5×105μ２の大きさであった。このアッセイ
系の他の詳細はEldorらが記載している（26）。
この結果を表IVに示す。
上記結果は、40kD及び33kDタンパク質が血小板凝集を
強力に、ほぼ完全に阻害することを示している。更に、
40kD及び33kDタンパク質は、トロンボキサン放出をほと
んど完全に（それぞれ92％及び96％）阻害するが、これ
とは全く対照的に、GRGDSペンタペプチドはTXB2放出を
かろうじて（25％）阻害するにすぎない。更に、33kDタ
ンパク質の存在下のECMプレートの顕微鏡検査解析か
ら、ほとんどの血小板が浮遊しており、ECMに付着して
いないことが明らかになり、このことは、33kDタンパク
質がECMへの血小板付着に特異的に作用することを示唆
している。この作用は40kDタンパク質を用いるほうがよ
り顕著でなかった。
以上をまとめると、33kDタンパク質は静止（restin
g）及び活性化血小板に、時間及び用量に依存して特異
的に結合し、更に溶液中及びECM表面上での血小板凝集
を阻害し、ECMへの血小板付着及びトロンボキサンB2放
出を阻害する。この驚くべき特性の組合せは、33kDタン
パク質の独自性及びその抗血栓薬剤としての有用性を示
すものである。
実施例19 40kD及び33kD組換えタンパク質の血小板への結合 40kD及び33kD組換えタンパク質の血小板へのin vitro
結合を研究した。
方法： 組換えタンパク質の血小板への結合を、Ginsbergらが
記載の方法（27）を以下のように改変した方法でアッセ
イした。Sepharose 2Bカラムは使用せず、代わりに、Is
rael Blood Bankから得た24時間濃縮血小板（約２×109
血小板/ml）5mlをSorvall遠心分離器において1,500rpm
で10分間遠心分離した。得られたペレットをACD:生理食
塩水緩衝液の1:7溶液（下記参照）中に再懸濁させ、も
う一度Sorvall遠心分離器において1,500rpmで10分間遠
心分離した。得られたペレットをタイロード緩衝液（下
記参照）2.5ml中に再懸濁させ、血小板の数を数えた
（約４×109血小板/ml）。この血小板調製物を、「洗浄
血小板（washed platelets）」と称し、記載した全ての
血小板結合実験に使用した。
反応混合物は、 ａ）133.3μの洗浄血小板（５×108血小板）、 ｂ）10〜600nMの125I標識タンパク質、 ｃ）記載のごとき非標識タンパク質 ｄ）（特に記載のない限り刺激としての）１単位のトロ
ンビン ｅ）最終反応容積（200μ）までのPBS を含有した。
上記反応混合物10μを合計放射能測定のために取り
出し、残りを（特に記載がなければ）37℃で30分間イン
キュベートした。トリプリケートで、反応混合物50μ
を、1mlの20％スクロース0.65％BSA/タイロード緩衝液
を含むシリコーン処理遠心分離管内に入れた。
小型遠心分離器において最高速度で３分間遠心分離し
た後、溶液を吸い出し、血小板を含むペレットの放射能
をガンマカウンターで測定した。これは、血小板に結合
した放射性タンパク質の量を示す。
ACD緩衝液：クエン酸8g/ クエン酸ナトリウム22g/ グルコース2g/ タイロード緩衝液: 5mM Hepes pH＝7.5 0.137M NaCl 2.7mM MgCl2・6H2O 2mM CaCl2 3.8mM NaH2PO4 グルコース1g/ BSA3.5g/ 結果： 上記アッセイを使用した結合実験の結果を第31図から
第38図に示し、図の説明において記載する。第31図及び
第35図は、血小板１つ当たり40,000〜125,000個の33kD
または40kDタンパク質分子が結合したことを示してい
る。
組換え40kD及び33kDタンパク質の血小板への結合は、
非放射性相同タンパク質または合成ペンタペプチドGRGD
S（Sigma）のいずれかを加えることにより破壊され（第
32図）、これらの結果は、血漿FNを使用して得られるも
のと同様である。これらの結果は、40kD及び33kD組換え
タンパク質は、GRGDSが認識する血小板受容体部位に特
異的に結合することを示唆している。上記受容体はイン
テグリンとして公知である。
組換え40kD及び33kDタンパク質のトロンビンの刺激を
受けた及び刺激を受けていない血小板への結合を研究し
た（第33図）。これらの結果は、33kDタンパク質は刺激
を受けていない血小板に結合することができ、一方40kD
タンパク質は刺激を受けていない血小板により低いレベ
ルで結合することを示した。更に、これらの結果は、非
標識相同タンパク質が標識された40kD及び33kDタンパク
質と拮抗することも示しており、33kDタンパク質が刺激
を受けていない血小板に結合している場合もこの特異的
な拮抗が生じた。
フィブリノーゲンのトロンボン刺激を受けた及び刺激
を受けていない血小板への結合における組換え40kD及び
33kDタンパク質の作用を調査した（第34図）。かかる実
験は、トロンビンによるフィブリノーゲンのフィブリン
への変換を回避するために、ヒルジンの存在下に25℃で
実施した。この結果は、40kD及び33kDタンパク質が血小
板結合においてフィブリノーゲンと拮抗することを示し
た。GRGDSペンタペプチドは同様に血小板結合において
フィブリノーゲンと拮抗し、このこともまた、40kD及び
33kDタンパク質は血小板に結合し、主血小板リガンド
（フィブリノーゲン）と、恐らくはGRGDS認識部位で拮
抗することを示唆する。
40kD及び33kD組換えタンパク質の血小板への結合の用
量−応答作用を研究した（第35図）。40kDタンパク質
は、血小板がトロンビン刺激されているときのみうまく
結合し（第35A図）、一方33kDタンパク質は刺激を受け
ていない血小板に、刺激を受けていない血小板で得られ
る最大結合の最高50％までのレベルで結合する。
33kDタンパク質の刺激を受けた及び刺激を受けていな
い血小板への結合の経時変化は同様の結果を与えた（第
36図及び第37図）。33kDタンパク質の刺激を受けていな
い血小板への結合は、その刺激を受けた血小板への結合
レベルの約80％であり、即ち33kDタンパク質は、それら
の活性状態とはほとんど無関係に血小板に結合する。更
にこれらの実験は、この結合のほとんどが反応物質混合
の10分以内に起こることを示した。
更に、40kD及び33kDタンパク質の血小板への結合の研
究を、GP II b/III a受容体に対するマウスモノクロー
ナル抗体（Dakopatt a/s,デンマーク）の存在下に実施
した。タンパク質の血小板への結合は前記のごとく測定
した。この結果から、40kD及び33kDタンパク質は刺激を
受けた血小板にGP II b/III a部位で結合でき、また33k
Dタンパク質は、インテグリンスーパーファミリーの他
の幾つかのRGD従属部位で刺激を受けていない血小板に
結合できることが判った。
実施例20 尿素による40kD組換えタンパク質の再活性化 40kDタンパク質は、保管時の凝集のための抗血小板凝
集アッセイにおいては不活性となった。再活性化は以下
の手順により達成することができる。
ｉ）40kDタンパク質を含む溶液を50％硫酸アンモニウム
を使用し、４℃で撹拌しながら0D280が2.0〜3.0になる
まで濃縮した。
ii）得られた溶液を10,000rpm,4℃で30分間遠心分離し
た。
iii）得られたペレットを、新たにAG−501−x8分析用混
合床樹脂（Biorad）で処理した、6M尿素を含む緩衝液Ａ
中に再度懸濁させた。
緩衝液Ａ 50mM Tris−Hcl,pH8.0 5mM EDTA 25mM NaCl 1mM PMSF 10mMエチレンジアミン これは、４℃で３〜16時間放置することができる。
iv）得られた溶液を、100倍容積の以下の溶液に対して
順次透析した： ａ）3M尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３時
間） ｂ）1.5M尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３
時間） ｃ）0.5M尿素を含む緩衝液Ａ（３回交換）（合計２〜３
時間） ｄ）緩衝液Ａ（３回交換）（合計３〜16時間） ｅ）PBS（２回交換） ｆ）「逆浸透（reverse osmosis）」（RO）水中のPBS
（２回交換）合計透析時間は約48時間であった。
実施例21 33kD及び40kDタンパク質の特徴付け ａ）33kDタンパク質の予備的特徴付け 33kDタンパク質を実施例15に記載されたと同様に精製
し、次のように特徴づけた。33kDタンパク質は、Bradfo
rd法の変法（実施例15参照）によって確定されるタンパ
ク質濃度を基礎として、280nmでＥ１％＝16.2という吸
収係数と、Ｒ＝2.3というスペクトル最大（278nm）と最
小（252nm）との間の吸光度の比率（Ｒ）を示す。
サイズ排除プロフィールの主要画分（約80％,280nm吸
収による）は、superose12カラム（Pharmacia）と装備
したFPLCにかけると、47kDの明白な分子量を示した。残
りの吸収は、次のように配分される:10％までは高分子
（約103kD）の凝集体から成り、約10％は低分子（10kD
未満）成分から成る。33kD断片は、pH3.5〜6.5で最小溶
解度を有するＵ字形溶解度曲線を示した。
アミノ酸配列 33kDタンパク質のＮ末端配列は、Met−Ser−Pro−Thr
−Glyであることが判明した；大腸菌Escherichiacoliメ
チオニンアミノペプチダーゼは、ATGコーティング配列
に由来する付加的メチオニン残基を除去しない。
ｂ）40kDタンパク質の予備的特徴付け 40kDタンパク質を実施例15に記載されたと同様に92％
以上の純度に精製し、つぎに以下のように特徴づけた。
40kDタンパク質の吸収スペクトルを測定した；それ
は、上記（ａ）と同様に測定されたタンパク質濃度を基
礎とした、280nmでＥ１％＝15.9の吸収係数と、Ｒ＝2.3
というスペクトルの最大（278nm）及び最小（250nm）の
間の吸光度の比率（Ｒ）を示す。
Superose12カラム（Pharmacia）上でのFPLC実施によ
り測定した場合、40kDタンパク質調製物の約60％は300k
Dより小さい分子量のオリゴマー型から成り、調製物の4
0％以上は約1000kDの分子量の可溶性凝集体型から成
る。しかしながら、これらの条件下では、40kDタンパク
質はモノマーとしてSuperose12カラム（4M尿素中）から
溶出するため、この凝集は4M尿素中で可逆的であること
が判明した。
アミノ酸配列 40kDタンパク質のＮ−末端配列は、Met−Asp−Gln−P
he−Asn−Ser−Ile−Thr−Leu−Thrであることが判明し
た。Met−Asp−Gln−Phe配列は、次のAsnで開始するフ
ィブロネクチンドメインのＮ末端に付加される（第19図
参照）。
実施例22 In vivoスポンジインプラント創傷治癒系 In vivoでの創傷治療に及ぼす40kDタンパク質の作用
を、スポンジインプラントを用いて研究した。予備的な
結果は実施例10に記載している。
方 法 実施例５及び15に記載されたと同様に調製された精製
40kDタンパク質を、最終濃度0.2〜0.5mg/mlで、等張（2
85ミリオスモル）の、滅菌した、発熱物質無含有塩水と
結合した。滅菌ポリビニルアルコールスポンジ円板、即
ちイヴァロンIvalonTM（Unipoint Industries,ニューカ
ロライナ）を、雌Sprague−dawleyラット（体重150〜20
0g）（生後６〜８週）の背部皮膚の下に、外科的に皮下
植込みした。２〜3cmの長さの単一の縦方向切開を、麻
酔動物の正中線に沿って行ない、毛をそり、消毒した十
分な厚さの皮膚を貫いた。この切開によって、切開部か
ら１〜2cmの距離で、互いに２〜3cm離して、４個のスポ
ンジ（10mm）を挿入し、筋肉層（panniculus carnosu
s）下に置いた。
各動物に４個の滅菌スポンジを植込み、個々のラット
からの等しく処理されたスポンジに関して、各実験条件
の分析を行なった。植込み後５日目に、動物を軽く麻酔
し、スポンジに0.1mlの下記の試験物質の１つを注射し
た:0.9％塩水のみ；塩水中に溶解した40kDタンパク質
（0.5mg/ml）；ヒト血漿から精製され、塩酸グアニジン
中に保存され、使用前にPBS（３回交換）に対して透析
された天然のフィブロネクチン（塩水中に1mg/ml）；及
びウシ血清アルブミン（塩水中に1mg/ml）。注射後48時
間目に動物を屠殺した。植込んだスポンジを切り出して
粗く付着した脂肪や筋肉を除去し、計量した（湿重
量）。スポンジは、DNA、タンパク質及びコラーゲン含
量に関して分析した。各動物からのスポンジ１個を緩衝
ホルマリン液で固定し、組織学的切片を調製して、マッ
ソン三色染色法で染色して、細胞及び基質成分を明示し
た。
DNA含量及びタンパク質含量を測定するために、スポ
ンジを1N NH4OH中でホモジェナイズして、４℃で一晩
抽出した。DNA含量は、Burtonの方法（29）に従って測
定した。タンパク質含量は、Lowryの方法に従って測定
した。コラーゲン含量の測定値としてのヒドロキシプロ
リン含量は、真空中でスポンジを酸加水分解（110℃で
６時間,6N HCl）後、Woessnerの方法（30）によって測
定した。
結 果 第13図に示される結果は、40kDタンパク質で処理した
スポンジのDNA及びコラーゲン含量が塩水処理又はBSA処
理スポンジに比して増大することを立証している。DNA
及びコラーゲンレベルは、40kDタンパク質処理スポンジ
では有意に上昇したが（ｐ＜0.01）、しかしBSA処理ス
ポンジにおいては上昇しなかった。
第40図に示された結果は、40kDタンパク質で処理した
スポンジが、正の対照である血漿フィブロネクチン（F
N）で処理したスポンジと同様に、DNA及びコラーゲンレ
ベルの上昇を生じた、ということを示す。別の正の対照
である表皮成長因子は、同様の効果を示した。
薬物動力学 放射能標識した40kDタンパク質の薬物動力学をラット
で試験し、静脈注射の結果を第14図に示す。静脈注射後
の40kDタンパク質の半減期は3.2時間、腹腔内注射後は
4.2時間である。
実施例23 Ex−vivo血小板凝集に及ぼす33kDタンパク質の作用 ex−vivo系において33kDタンパク質を用いた予備試験
を実施した。試験物質を齧歯類に静脈注射し、血液試料
（注射後種々の時間に採取した）から調製したPRPをin
vitroでの血小板凝集に関して試験した。用いた方法
は、実施例７に記載されたものと同じである。ラットに
おいては、各動物は単一試料のみを供給し得るし、対照
動物は比較のための基準として用いる。対照動物におい
ては、タンパク質の代わりに等量の燐酸塩緩衝塩水を注
射する。ウサギでは、各動物は多重試料として用い得る
し、試験物質の作用時間経過を確定し得る。
ラットの実験では、３〜15mg/kgの33kDタンパク質を
注射するが、いくつかの実験においては、33kDタンパク
質は、注射後10〜15分の範囲の時間で、ADPによる血小
板凝集を完全に阻害する。しかしながら、阻害の程度が
大きく変動するので、さらなる研究が必要である。
ウサギを用いた限定数の試験では、33kDタンパク質の
阻害効力は注射後1/2時間まで観察された。
これらの結果は、抗血栓薬としての33kDタンパク質の
効力をさらに支持するものである。
薬物動力学 ラットに静脈注射した後の放射性標識33kDタンパク質
の薬物動力学を試験した。その結果を第27図に示す。静
脈注射後の血中33kDタンパク質の半減期は40分であるこ
とが判明した。
実施例24 フィブロネクチンの組み換え31kDフィブリン結合断片の
再生及び精製 下記の事項は、実施例９に記載されたのと同様に製造
される組み換え31kDフィブリン−結合ドメイン（r31k
D）の精製の改良手法である。
その工程は次の３段階より成る： 1.細菌ケーキの粗製プロセッシング。
2.再生／再酸化。
3.精製。
1.粗製プロセッシング 1.1 ペレットの洗浄： 細菌細胞ケーキを、先ず５容積の50mMトリス−HCl/50
mM Na−EDTA,pH8（緩衝液１）中で粉砕する。つぎにそ
のペレットを、100mg/リゾチームを含有する緩衝液１
で（37℃で２時間）、１％トリトンＸ−100を含有する
緩衝液１で（室温で30分）、そして水で２回、順次処理
する。これらの工程は全て、ペレットの粉砕と遠心分離
によって実行する;r31kDは、SDS−PAGEゲルにより立証
されるように、ペレット中に留まる。
1.2 ペレットの抽出： 洗浄したペレットを14容積の10mMトリス−HCl/5mM ED
TA/2mM PMSF/2mMエプシロン−アミノカプロン酸塩（緩
衝液Ａ）pH7.5中に懸濁し、つぎに（ａ）１％硫酸デシ
ル；（ｂ）１％硫酸デシル/5％グリセロール、及び
（ｃ）５％グリセロールを含有する緩衝液Ａで順次処理
する。最終処理は、添加物を含まない緩衝液Ａを用い
る。
2.再生／再酸化 組み換え31kD断片（r31kD）に関する再生／再酸化手
法が開発され、改良された。
2.1 原 理： グルタチオン（GSH）のようなチオール還元剤の存在
下で6Mグアニジン−HCl（GuCl）中にペレットを溶解す
ること、及び酸化型グルタチオン（GSSG）の付加によっ
て、より低いGuCl濃度で再生／再酸化すること。
2.2 手 法： 抽出ペレットを、緩衝液A,pH8.0に溶解した6M GuCl/
3mM GSHの100〜700容積に溶解する。透析緩衝液中のGu
Clの濃度を、例えば先ず3M、つぎに1.5M、そして最後に
0.5Mといったように漸次低する一方、他の全ての成分の
濃度は一定に保つ。GuClの中間濃度、即ち2M〜1Mのある
濃度で、再生を、0.3mMのGSSGの付加と、pH8で室温で48
〜72時間のインキュベーションによって、開始する。つ
ぎに再生r31kDを、添加物を用いずに、pH8.5で緩衝液Ａ
に対して透析する。
具体例： 約10グラムの抽出ペレット（1.2参照）をホモジェナ
イズし、１リットルの緩衝液A/6M GuCl/3mM GSH/pH8
に溶解し、その懸濁液をそれが透明溶液になるまで14時
間撹拌した。この溶液を、付加的に3mM GSH及び3M Gu
Cl,を含有する緩衝液Ａ、pH8の４リットルに対して24時
間透析した。つぎに、その結果生じた溶液を、3mM GSH
を含む緩衝液Ａ、pH8の８リットルに対して24時間透析
した。その結果生じた溶液を、0.3mM GSH及び0.3mM G
SSGを含む10リットルの緩衝液A,pH8に対して２回透析し
た。透析工程は約80時間継続したが、この間には再酸化
も起きた。最後に、10リットルの緩衝液A,pH8.3〜8.5に
対する透析によって再生されたタンパク質からグルタチ
オンを除去した。この工程を２回実行した。つぎに、そ
の溶液をフェニル−セファロースカラムにロードした。
2.3 代替手法： グルタチオニンの代わりにシステイン（3mM）を用い
た場合、及び酸化グルタチオニンの代わりにシスチン
（3mM）を用いた場合には、同様の結果が得られてい
る。
2.4 チオレドキシンの使用： チオレドキシンを用いてr31kDの再酸化率を増大させ
ることも試みた。メルカプトエタノール（ME）の非存在
下で処理したSDS−PAGEプロフィールに基づいて、“ス
クランブル（scrambled）”物質のチオレドキシン還元
及び再酸化はr31kDのより均質な調製物を生じると思わ
れるが、しかし使用しなければならなかったチオレドキ
シンの濃度は約100mMであった。“スクランブル物質”
は、r31kDであって、これは、１つ又はそれ以上の間違
ったジスルフィド結合の形成により、明らかに不適当に
折りたたまれる。
3.精 製 3.1 フェニル−セファロースクロマトグラフィ： 先ず、大量の再生r31kDを遠心分離して“スクランブ
ル"r31kDか又は夾雑物を含む不溶性ペレットを除去す
る。上清を緩衝液Ａに溶解した0.2M硫酸アンモニウムと
し、同一濃度の硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで平衡
させたフェニル−セファロースカラムにロードする。つ
ぎに、塩濃度を低下させることにより、即ち緩衝液Ａ中
で溶出させることによって、r31kDタンパク質を精製す
る。
具体例： 10グラムのペレットから抽出した粗製タンパク質混合
物を再酸化後、再生及び“スクランブル"r31kD、並びに
不溶性夾雑物の懸濁液を、Ｊ−14ローターを装備した高
速Beckhman遠心分離機中で、13,000rpm（17,000×ｇ）
で遠心分離する。上清（1,280ml）を硫酸アンモニウム
（AS）で2Mにして、予め0.2MASを含む緩衝液Ａで平衡さ
せたフェニル−セファロースの45mlカラムにロードし
た。そのカラムを150mlの同溶液で洗浄した後、150mlの
緩衝液Ａ、50mlの水、及び50mlの6M GuClで洗浄した
（第51図及び第52図）。
3.2 ヘパリン−セファロース及びイオン交換クロマ
トグラフィ： r31kD断片の精製の最終工程は、それが流出（flow−t
hrough）画分中に溶出するＱ−セファロース上でのクロ
マトグラフィ、もしくはそれが塩勾配の使用によって溶
出されるヘパリン−セファロース上でのクロマトグラフ
ィである。それはＳ−セファロースとも結合するが、し
かし溶出物質は依然として大半の不純物を含んでいる。
具体例： 緩衝液Ａピークの約1/2を、それが緩衝液Ａに溶解し
た0.5M NaClの溶液によって溶出される10mlヘパリン−
セファロースカラム上で濃縮し、精製した（第53図）。
濃縮31kDを、緩衝液A,pH8.5に対して透析し、その後、
予め同一緩衝液で平衡させたＱ−セファロースの40mlカ
ラムにロードした。流出及び洗浄画分中に溶出した精製
r231kD断片を凍結乾燥によって濃縮し、その後特徴付け
を行った。そのカラムを1M NaClのステップによって洗
浄して夾雑タンパク質を除去した（第54図）。精製物質
は純度95％以上である（第51図）。
3.3 ペレットの再抽出： 再生操作後、ペレットはおそらく“スクランブル”形
態で50％以上のr31kD断片を依然として含有するため、
それを再抽出し、上記と同様に処理した。３カラム後の
本工程の総収率（再抽出工程を含む）は、約10％であっ
た（表VII）。
3.4 特徴付け r31kDタンパク質は特徴付けされ、その純度（SDS−PA
GEの還元ゲル上での純度プロフィール）、SDS−PAGEの
非還元ゲルにおける移動位置（第51図）、スペロース21
上での見かけの分子量（約37kD）（第55図）、イムノブ
ロット及びヘパリン−セファロース上での挙動（ヘパリ
ン−セファロースからの両物質の溶出に対するNaCl濃度
は約0.32Mであることが判明した）に関して、その血漿
由来対応物と比較されている。これらの全アッセイにお
いて、r31kDタンパク質は血漿由来フィブリン結合ドメ
インと同様である。
4.その再酸化／再生に関する種々の形態のr31kD間の比
較 ３つの異なる形態のr31kDタンパク質が定義されてい
る： ａ型:6M GuClに溶解後に洗浄済ペレットから得られ
る、即ち“スクランブル”形態の、タンパク質。
ｂ型:6M GuCl存在下でGSHのような還元剤で処理した
後に存在する、十分に還元されたタンパク質。
ｃ型：上記と同様にGSH/GSSGで処理して得られる再酸
化−再生タンパク質。
これら３型は、以下によって相互に区別できる。
（ｉ） 還元試薬の非存在下で（即ちMEを含まず
に）、そしてチオール−捕捉剤のヨードアセトアミドの
存在下での、SDS−PAGEゲル上でのその移動（第51
図）；及び （ii） ME非存在下で処理されたゲルのイムノブロッ
トにおける抗血漿31kDとのそれらの反応。正しく再酸化
−再生された形態のものだけが抗体と反応した。
GSH/GSSG存在下（又はシステイン／シスチン存在下）
での再酸化に関する上記研究は、r31kDタンパク質が経
時的に、血漿由来フィブリン結合ドメインのものと区別
できない（ｃ）型に再生することを示している。
“スクランブル"r31kDタンパク質の特徴付け： 本タンパク質は、抽出後にペレット中に大量に残留す
ることから明らかなように、この形態ではほとんど溶け
ないと考えられる。
さらに、スクランブル型タンパク質は、フェニル−セ
ファロース及びＱ−セファロースの両方とのその結合特
性において、再生タンパク質とは異なる。
十分に還元されたr31kDタンパク質の特徴付け： このタンパク質形態は、“スクランブル”型のものよ
りも可溶性であり、且つより均質である。GSH（又はDT
T、又はシステイン）の存在下で6M GuCl中に溶解後に
変性剤の濃度をほとんどゼロに下げると、“還元型”タ
ンパク質は、GSH存在下でフェニル−セファロース上で
精製可能である。最後に、GSSGを用いて、GSHの濃度の1
/10、即ち0.3mMで、そのタンパク質を“再酸化”する。
これは再生型31kDを生じなかったが、しかし、おそらく
還元型タンパク質は、それがGSSGに露出される前であっ
ても、スクランブル形態に徐々に自動酸化するために、
前項に記載のものとは異なる“スクランブル”タンパク
質の形態を生じた。
5.還元−カルボキシアミド化31kDタンパク質の調製 精製血漿由来又は組み換え31kDタンパク質（約0.6mg/
ml）を室温で24時間、10mMトリス−HCl,pH8.5に溶解し
た4.3M塩酸グアニジニウムヒドロクロリド（GuCl）、40
mM β−メルカプトエタノール（ME）中で24時間室温に
おいて還元した。
カルボキシアミド化は、MEの濃度の４倍以上の濃度で
タンパク質にヨードアセトアミドを添加することによっ
て行なわれ、その溶液を室温で１時間、インキュベート
した。つぎに、GuCl濃度を漸進的透析によって低減し
（3M,2M,1M,及び0.5M GuClに）、その後、緩衝液Ａに
対して透析した。生成した沈澱物を遠心分離し、その結
果生じる上清中の31kDタンパク質の濃度は、血漿由来31
kD及び組み換え31kDのそれぞれに関して、0.34及び0.19
mg/mlであった。
6.生物学的活性 抗血小板凝集活性： 血漿由来31kDを用いた予備試験において、阻害作用
は、血小板凝集アッセイを用いた場合に観察された（実
施例８）。したがって、APAにおける血漿由来31kDの抗
凝集特性を立証する実験を再現するための試みは不成功
に終っている。
実施例25 ラットにおけるヒト血漿性フィブロネクチン（31kD）の
アミノ末端31kD断片の薬物動力学 FNのアミノ末端断片の代謝挙動を解明するために、ヒ
ト血漿由来FN（実施例８に記載されたのと同様に調製）
のトリプシン分解の31kD断片の精製調製物をICl法（Vog
el et al.,PNAS69:180〜184（1972））によって125Iを
用いてヨード化し、９匹のラットに静脈注射した（4.5
×106cpm;0.5mg/kg）。注射して10分後に、次いで注射
後1,4,7及び24時間目に血液試料を回収した。各々３匹
のラットの群を1.7及び24時間目に屠殺し、種々の器官
を切り出して、放射能に関して分析した。24時間群ラッ
トは個別代謝ケージで飼育し、累積尿及び糞を７時間目
と24時間目に収集した。検出された放射能が無傷タンパ
ク質又は小分解断片を示すか否かを調べるために、試料
をTCA沈澱させた。
血清中の総放射能及びTCA沈澱放射能の薬物動力学を
第56図に示す。図示したように、注射した31kDタンパク
質（TCA沈澱性）の血中レベルは、最初の１時間で初期
値の約30％に急速に低下した。その時点での分解の程度
は約40％であった。血中レベルは、その後３時間の間に
初期値の約10％にさらに減少した。TCA沈澱性の値の最
初の3lolipoints（10分,1時間及び４時間）に適合する
一次ラインは、1.5時間の半減期と一致した。その後の
血清中のTCA沈澱性cpmの減少は著しく低速であった（ｔ
1/2＝11時間）が、一方分解程度は増大しなかった（血
清中に約50〜70％TCA可溶性放射能）。
尿中では、注射された放射能の30％は最初の７時間の
間に排出されたが、残り（＞90％）は24時間後に排出さ
れた。
尿の放射能は全て、TCA可溶性であった。種々の器官
（腎臓、胃、肝臓、肺、子宮、卵巣、副腎、結腸、回
腸、皮膚、脳、眼、筋肉、膀胱、心臓、脾臓、気管、大
動脈及び大静脈）の分析は、いかなる特異的蓄積も示さ
ず、放射能の消失の動力学は血液の場合と同様のパター
ンにしたがった。ほとんどの器官において、比放射能
（組織1g当たりのcpm）は血清の場合より低かった；例
外は７時間目の回腸と胃であって、これらは４倍高い値
を示した。７時間目の胃及び回腸組織のホモジェネート
のTAC分析から、ほとんどの標識がタンパク質の小分解
生成物に関連していることが明示された。
結果は、FNの外因性血漿由来31kDアミノ末端断片は体
内で中等度に分解されて、排出されるということを示
す。その薬物動力学的挙動は一次動態と一致せず、これ
は、タンパク質が血液以外の組織及び身体区分中に中等
度に配分されることを示し得る。これは、分解の程度が
４〜24時間の期間中は増大せず、したがって身体区分か
らのタンパク質の漸進的放出を反映する、という所見か
らも明らかである。尿中の代謝物質の排他的且つ相対的
に早期の出現は、タンパク質が腎臓を通じて容易に排出
されることを示す。肝臓にその物質の蓄積が認められな
いことは、この器官が分解の主な場所ではなく、解毒に
関与しないことを示すものと思われる。
31kD FBDの相対的に短い半減期は、血栓の診断イメー
ジングにそれを使用できるかもしれないために、重要で
ある。血漿由来31kD FBD又は組み換え31kD FBD（r 31k
D）を放射能で、又は他の方法によって標識して、つぎ
に血栓をイメージングするために血中に導入することが
できる。
半減期が短い分子はまた、クロット形成を防止するた
めにそれを利用する場合にも重要である。これに対比し
て、一般的に選択される治療薬であるヘパリンは、非常
に長い半減期をもつ。
実施例26 組み換えフィブリン結合ドメイン（r 31kD）の生物学的
活性 精製組み換え31kD FBDタンパク質の生物学的活性を、
ヒト血漿由来FN、又はヒト血漿由来FNの部分的トリプシ
ン消化物（実施例８）から得られた31kD FBDタンパク質
の生物学的活性と比較した。アッセイした生物学的活性
は、in vivo及びin vitroでのフィブリンクロットとの
結合、細菌（黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus）
との結合、及び細胞外基質との結合であった。
I.フィブリン結合 ２組の実験を実施した。１組目の実験では、125I−r
31kDのフィブリンとの結合をクロット形成中モニターし
た（反応Ｉ）が、一方、２組目の実験では、125I−r 31
kDのフィブリンとの結合を、クロット形成後種々の時点
でモニターした（反応II）。クエン酸塩加血液中でクロ
ット形成を可能にするために、トロンビン又はCa++を混
合物に付加した。
材料と方法 フィブロネクチンフィブリン結合ドメイン:FBD A.FBDのフィブリンとの結合： 血漿由来31kD FBDを、ヒトのフィブロネクチンの部分
的トリプシン消化により得た（実施例８参照）。
実施例24にしたがって、大腸菌Escherichia coliにお
いてr 31kD FBDを産生し、その後、細胞溶解産物のペレ
ットから精製した。フィブロネクチンは、ヒト血漿から
得た。FBD及びFNの125I−標識を、ICl法（31）によって
実施した。20〜200cpm/ngの比活性を有する標識タンパ
ク質を0.1％BSA−PBSの溶液に溶解した小アリコートに
して−20℃で保存した。
1.フィブリンクロット形成中の125i−FBDのフィブリン
クロットとの結合（反応Ｉ）： シリコン処理微小遠心管中の完全反応混合物は、250
μの最終容量で次の成分を含有した： 20〜200μヒト全血（図面の説明に示されているよ
うに、新鮮、非クエン酸塩加、又は１〜７日目、クエン
酸塩加） 0.1％BSA 5mM CaCl2 1U/mlトロンビン 125I−r31kD FBD 非クエン酸塩加血液を用いて結合を測定する場合、CaCl
2及びトロンビンは添加しなかった（“無処理（naive）
血栓”）。
全成分を、PBS中で調製した。反応混合物は、37℃で3
0分間インキュベートした。EDTA（25mM）を加えて反応
を終結し、小型遠心分離機中で最大速度で３分間、遠心
分離した。上清を捨て、ペレットを1mlのPBS,0.1％BSA,
5mM EDTA,1mM PMSF中で２回洗浄した。ペレット中の放
射能は、ガンマ計数器でモニターした。
非放射性タンパク質と競合させた場合、競合するタン
パク質を図面の説明に示された濃度で、125I−標識タン
パク質とともに加えた。
2.125I−r 31kD FBDの前形成フィブリンクロットとの結
合（反応II）： 反応混合物は、125I−r 31kD以外は、反応Ｉに示され
たと同じ成分を含有した。最初のインキュベーションは
37℃で30分実行し、次に125I−r 31kDのみを加えて、反
応混合物をさらに30分間（２回目）インキュベートし
た。反応IIは、反応Ｉに関して上記したのと同様に終結
させ、測定した。
結果 A.125I−r 31kDのフィブリンとの結合：トロンビン及び
Ca++の作用 125I−r 31kDの、クロット形成中のフィブリンとの結
合（反応Ｉ）又は前形成（preformed）クロットとの結
合（反応II）に及ぼすトロンビンとCa++の作用を、クエ
ン酸塩加ヒト全血で研究した（第57図）。
トロンビンの特異的阻害剤であるヒルジン（32）は、
反応Ｉにおける125I−r 31kDのフィブリンクロットとの
結合を低減したが、これはトロンビンが結合に必要であ
ることを示している。トロンビンが阻害される場合、ク
ロット形成の低減が認められ、結合のためのフィブリン
が少なくなる。クエン酸塩を血液に添加すると、血清中
の遊離Ca++濃度が有意に低減し、したがってフィブリン
クロット形成のためのCa++の添加は必須である。しかし
ながら、r 31kDの前形成クロットとの結合は、前形成ク
ロットにより遊離Ca++イオンが既に枯渇している血清中
で実行される場合には低減する。Ca++をCa++枯渇血清に
添加すると、r 31kD結合は増大する。結合に及ぼすCa++
のこの作用は、PBS中で結合を測定した場合には、劇的
に立証された。Ca++の添加は、反応Ｉにおいて観察され
たよりも高程度にさえ、結合を増大させた。したがっ
て、クロット形成及びr 31kD結合はともに、Ca++イオン
依存性である。
このように、反応IIにおける125I−r 31kDのフィブリ
ンとの結合は、血清の代わりにPBS（燐酸塩緩衝塩水）
中でアッセイを行う場合に増大する。
B.プラスミンによるフィブリンクロットからの125I−r
31kDの放出 125I−r 31kDがクロット中でフィブリンと共有結合で
結合するか否かを測定するために、アミノ酸Arg259とTh
r260との間で血漿由来FNのＮ末端ドメインを切断するこ
とが公知であるプラスミン（33,34）を125I−r 31kDが
結合した後にクロットに添加した。プラスミンとともに
種々の間隔でインキュベーションを実施した（第58
図）。
その結果は、プラスミンがクロット（ペレット）に結
合した放射能の低減を引き起こすことを立証した。ペレ
ット中の放射能の低減は時間依存性であって、プラスミ
ンがr 31kD FBDを切断したという事実に帰せられた。上
清中でモニタリングされた放射能量は、時間とともに増
大した。SDSポリアクリルアミドゲル上にプラスミン可
溶性反応分画（上清）をロードすると、短縮形の切断
125I−r 31kDを検出することができる。フィブリンクロ
ットからの125I−r 31kDの放出は、プラスミン切断によ
ってのみ生じ、SDS,EDTA,及びβ−メルカプトエタノー
ルを含有する溶液を用いて100℃に加熱することによっ
ては生じない。したがってこのことは、125I−r 31kDが
共有結合でフィブリンクロットと結合することを立証し
ている。
3.クロット形成中の125I−r 31kDのフィブリンとの結
合：非標識r 31kD及びその他の分子の作用 異なる濃度での種々の非放射性組み換え型及び血漿由
来FBD調製物、並びにヒト血漿由来フィブロネクチン
の、クロット形成中の125I−rFBDのフィブリンとの結合
（反応Ｉ）を妨害する能力を調べた（第59図）。得られ
た結果は、0.15μM 125I−rFBDのフィブリンとの結合
は、非標識r 31kD,非標識血漿由来31kD、又は非標識FM
の存在下では、20倍過剰の濃度（３μＭ）までで、同様
であるか、もしくは増大することさえあった、というこ
とを立証している。
しかしながら、新しく形成されたフィブリンクロット
の量を、次善の濃度のCaCl2及びトロンビン（それぞれ1
mM及び0.3単位/ml）を用いるか、もしくは反応における
血液量を本来規定された量の1/10に低減することによっ
て低減した場合、クロットへの結合に関する非標識FBD
と125I−FBDの係合との間の競合は有意になった。
FBD結合反応の特異性をさらに研究するために、われ
われは、r 31kDの結合とその還元型の結合（実施例24）
とを比較した。
これらの研究のために、還元−カルボキシアミド化血
漿由来31kDのあるバッチ、還元−カルボキシアミド化r
31kDのあるバッチ、及び十分に還元されたr 31kDのある
バッチを用いたが、これらは全て、実施例24の記載と同
様に調製した。意外にも、これらの種々の還元型のr 31
kD FBDは、125I−FBDの結合において劇的低減を引き起
こした（0.3〜3.0μＭによって40〜80％の低減；第59
図）。また、十分還元されたFBDの存在下で新規に形成
されたクロット（反応Ｉ）のサイズの劇的縮少にも注目
した。クロット形成は、高濃度の十分還元型FBD（５μ
Ｍ超）の存在下で総体的に阻害された。
同様の阻害作用は、再生125I−FBDの前形成フィブリ
ンクロットとの結合（反応II）における種々の還元型31
kDタンパク質が示したため、血清トランスグルタミナー
ゼX III a因子が触媒するFBDのフィブリンクロットとの
架橋反応を妨害する可能性が示唆された。
4.125I−FBDのフィブリン血栓との結合（反応II）：ト
ランスグルタミナーゼ阻害剤の作用 トランスグルタミナーゼは、ペプチドのグルタミニル
残基のカルボキサミド基及びペプチドのリシル残基のε
−アミノ基を含む第一アミンが架橋されるアミド化反応
を触媒するある種のカルシウムイオン依存酸素である。
血漿FNは、血漿トランスグルタミナーゼ、すなわちX II
I a因子（トロンビン活性化凝血X III因子）、又は肝臓
トランスグルタミナーゼの基質であり、FNは、それ自
体、フィブリン、及びコラーゲンと架橋され得る。
X III因子架橋をされ易いグルタミニル残基は、FNのF
BD領域に局在する（35）。
種々の濃度の第一アミン、即ち古典的グルタミナーゼ
阻害剤であるスペルミジンとプトレシンの存在下での
125I−FBDの前形成フィブリンクロットとの結合（反応I
I）を研究した（第60図）。反応は、約5mMのスペルミジ
ン又はプトレシンによって50％阻害された。第一アミン
による予測された阻害と同様に、結合の劇的阻害が、約
2.5μＭで1/2最大減少を生じる還元−カルボキシサミド
化FBDによっても観察された。
5.125I−r 31kDの前形成フィブリンクロットとの結合：
結合に及ぼす熟成の作用 イメージングのためには、FBD結合能力に及ぼすクロ
ット熟成の作用を測定することが重要であった。
125I−r 31kDの前形成フィブリンクロットとの結合を
測定した。125I−r 31kDを前形成クロットに加え（1,4
又は24時間）、フィブリンとの結合をモニターした（第
61図）。
125I−r 31kDのフィブリンクロットとの結合度は、１
又は４時間後よりも24時間後の方が高かったが、これは
おそらく、形成されたクロットが経時的に大きくなった
という事実によるものと考えられた。
本実施例の実験Ｉで示されたように、クエン酸塩加血
中の遊離Ca++イオンの存在は、125I−r 31kDのフィブリ
ンクロットとの最適結合及び架橋を得るために重要であ
る。したがって、Ca++が前形成クロットによって既に枯
渇した血清中では、125I−r 31kDのフィブリンクロット
との結合度は低く、一方、5mM CaCl2を含むPBS中で
は、結合度は全インキュベーション時間で高かった。
300μg/mlの血漿由来FNをCa++存在下で競合剤として
付加した場合、フィブリンクロットと結合する。125I−
r 31kDが20％低減したが、これはおそらく、有効なフィ
ブリン結合部位における何らかの競合によるものと思わ
れた。
6.125I−r 31kDの“無処理”血栓との結合（反応Ｉ及び
II）：結合に及ぼす血栓熟成時間の作用 “古い”（前形成）血栓と“新規形成”血栓とを区別
する能力は、血栓イメージングのためのプローブの重要
要件である。第62図は、“古い”クロット及び“新規形
成”クロットと結合する125I−r 31kDを比較するために
計画した実験を示す。第一の実験では、125I−r 31kDを
クロット形成（“新規形成”）の開始と同時に加え、７
日間のインキュベーション中、クロットと相互作用させ
た。FBDが効果的に取り込まれ、取り込まれる量は最初
の２日間は増大することが示され、おそらくこれは、そ
の期間中にクロットのサイズが増大したことを示すもの
と考えられる。第二の実験では、125I−r 31kDを、２時
間の限定期間の間、熟成クロット（生成後１〜７日目）
に加えた（“前形成”）。FBD取り込みの程度は、クロ
ット熟成時間にかかわらず、一定のままであった。しか
しながら、本プロトコルでの結合度は、第一実験の場合
よりも低いことに留意されたい。これらの実験は、プロ
ーブ125I−r 31kDが、“古い”クロット−血栓と、依然
として成長過程にあるものを区別するために２つの異な
るプロトコルに用い得ることを示唆している。
7.血漿“トロンビン時間”（“TT"） 全血の凝血に及ぼすr 31kDタンパク質の作用を、トロ
ンビン時間として定義される臨床的実験パラメータを用
いて測定した。この反応においては、100μのクエン
酸塩加健常ヒト血漿のアリコートを100μPBS、及びト
ランスグルタミナーゼ阻害剤スペルミジンかあるいは、
還元−カルボキシアミド化p 31kD又は再酸化−再生r 31
kDと混合した。絶えず混合しながら、200μトロンビ
ン溶液を各アリコートに加えた。トロンビン添加からク
ロット形成までの時間を測定した。これを、“TT"とし
て秒で表わす（表III）。
8.125I−r 31kDのフィブリンとの結合（反応Ｉ）：外因
性トランスグルタミナーゼ及び“還元−カルボキサミド
化"FBDの作用 本実施例の第４項で、トランスグルタミナーゼ阻害剤
が125I−r 31kDのクロットとの結合を低減することを立
証した。本項では、結合反応に及ぼすブタ肝臓からの外
因性トランスグルタミナーゼの作用を研究した。
第63図に示した結果は、外因性トランスグルタミナー
ゼを付加すると125I−r 31kDのクロットとの結合が劇的
に増大することを立証するが、これは、この酸素がこの
反応の律速段階であるかもしれないことを示している。
さらに、内因性及び外因性の両トランスグルタミナー
ゼ依存結合活性は、還元−カルボキサミド化FBDによっ
て等しく低減した（それぞれ、0.3μＭ及び1.5μＭ“還
元"FBDにより約56％及び72％阻害）。
これらの結果は、“還元”型のFBDが、グルタミン転
移及び架橋反応を妨害することによって、再生型のFBD
のフィブリンクロットへの結合を阻害することを示す。
これはおそらく、フィブリンクロットの不安定化を引き
起こすものと思われる。
9.125I−FBDの細胞外基質（ECM）との結合 von Willebrand因子、フィブロネクチン、フィブリノ
ーゲン、トロンボスポンジン、コラーゲン、及びラミニ
ンのような接着性分子は、内皮細胞の除去によって形成
されるECMと結合する。r 31kD FBDは、損傷部位でのプ
ラーク形成の初期段階をイメージングするために役立ち
得る。種々の濃度での125I−r 31kDのECMとの結合を、
トロンビンの存在下又は非存在下で調べた。結果は、低
濃度での125I−r 31kDのECMとの結合がトロンビン（0.3
μＭ）の影響を受けないことを立証した。高濃度のトロ
ンビンの場合には、r 31kDの結合度はわずかに高く、こ
れは、自然に存在する結合部位の数が限定されていて、
トロンビン消化により付加的結合部位が露出されたのか
もしれないことを示す（第64図）。
125I−r 31kDがECMと結合し得るという事実は、それ
が裸化血管における初期プラーク形成をイメージングす
るのに有用であることを示す。
II.細菌結合 広範なグラム陽性細菌の創傷への付着及び侵入にフィ
ブロネクチンが関与することは十分に確定されている
（36）。真正血漿由来FNのフィブリン結合ドメインは、
細菌表面上の特異的受容体と高親和性を伴って相互作用
することが示されている。黄色ブドウ球菌Staphylococc
us aureusが一般的に感染を開始する部位は、FNが豊富
である。例えば血餅中、及び内皮下である。さらに、外
因性FNは、これらの部位への細菌の付着を増強する。FN
は、可飽和、特異的表面タンパク質受容体を介してS.au
reusと結合する。Scastchard分析により、５×10-9Mの
結合定数を有する高親和性受容体及び１細菌当たり100
〜20,000の範囲の受容体数が示された（37）。FN受容体
の発現は、臨床的単離体の侵入性及び病原性に相関す
る。機械的手段による、又は抗生物質存在下での細菌の
増殖によるS.aureusからの受容体の除去は、FNに付着す
るそれらの能力を低減する。FNは、細菌結合活性に加え
て、細胞結合活性及びコラーゲン結合活性を有する多機
能ドメインから成る２価の分子であるので、細胞外基質
の種々の成分により、並びに組織細胞中のFN受容体によ
って創傷に細菌を固定することができる。
材料と方法 溶液中での細菌の標識したFN又はFBDとの結合 A.直接結合反応 種々の濃度の125I−r 31kD FBD又は125I−FNを、付加
的に0.1％Tween及び１％BSAを含むPBS溶液中の５×10
8S.aureus細菌に加えた。最終容量は1mlであった。反応
における総放射能量を、細菌付加直後に採取した20μ
アリコートを用いてアッセイした。
その混合液を20℃で２時間インキュベートした。
結合量は、100μのインキュベーション混合液を取
り出し、5mlのシリコン処理した試験管中の3mlの10％パ
ーコール、0.15M NaCl上に積層した0.5ml PBSの上に積
層することによって、アッセイした。つぎに、これを20
℃で15分間、1,350×ｇ（SWバケットローターで4,000rp
m）で遠心分離した。上清を吸い出し、放射能に関して
ペレットをアッセイした。
B.非標識FN,FB及び関連分子の競合 以下の操作は、３μg/mlの125I−p 31kDを用いたこと
と、規定量の競合分子（FN又はFBD）も最初の結合混合
液に加えたことを除いては、上記操作と同じであった。
II.放射能標識細菌の固定化FNとの結合 プラスチックバイアルを0.3mlの50μg/ml FN又は１％
BSAでコートした。
その管を、振盪しながら４℃で一晩インキュベートし
た。つぎにその管を5ml PBSで３回洗浄した。次いで、P
BSに溶解した１％BSA3mlを加え、その管を、振盪しなが
らさらに20℃で２〜３時間インキュベートした（遊離部
位のブロッキングのため）。
間接的結合実験では、細菌を阻害剤とともに４℃で２
時間プレインキュベートした。
その細菌（４×106pfu/ml,3pfu/cpm）を、図の説明で
指示した濃度でびんに加えた。アッセイ混合液の最終容
量は0.3ml PBSであった。その混合液を、４℃で90〜120
分間、ゆっくり撹拌した。
つぎにその管をデカントし、5ml PBSで３回洗浄し
た。
3H−標識細菌の結合に関してアッセイする場合は、5m
lのシンチレーション液を加えた。
III.標識細菌とカテーテルとの結合 カテーテル〔“UNO"滅菌気管支用プラスチックカテー
テル（18CHサイズ;Unoplast A/S,Denmark）〕を1cm片と
2cm片に切断し、計量した後、縦方向に一度切断した。
カテーテル片を50μg/ml FNとともに４℃で一晩、振
盪しながらインキュベートした。対象は、同一条件下で
PBSを用いてインキュベートした。
つぎにFN溶液をデカントし、カテーテルをPBS中で３
回洗浄した。PBSに溶解した１％BSAを20℃で１〜２時間
加えることにより、BSAブロッキングを実施した。カテ
ーテルを再び、PBSで３回洗浄した。
カテーテル片を検定混合液に加えることを除いては、
前項に記載されたと同様に細菌結合を実施した。使用し
た最終容量は3mlであった。反応は、10ml試験管内で実
施した。反応液は、20℃で２時間インキュベートした。
結合アッセイのために、125I−S.aureus（４×106pfu/m
l,3pfu/cpm）を用いた（H3−ロイシン標識S.aureusを用
いた場合、比活性は1cpm/3.3×103pfuであった。標識化
は、P.B.Russel等（38）に従って実施した。125I−標識
S.aureusを用いた場合は、比活性は1cpm/3pfuであっ
た。標識化は、A.E.Bolton及びW.M.Hunter（39）に従っ
て実施した）。指示濃度での競合分子を細菌とともに、
20℃で30分間プレインキュベートした。そしてカテーテ
ルをPBSで３回洗浄し、ガンマ計数器で直接計数した。
結 果 A.溶液中での細菌と125I−FN又はFBDとの結合 I.直接結合 懸濁液中の125I−FN又は125I−rFBDとS.aureus菌との
結合を測定するために実験を行なった。種々の量の放射
性FN又はr 31kDを５×108個の細菌に加えて２時間イン
キュベートし、10％Percoll−塩水に入れて遠心分離し
た。ペレット中の放射能をモニターした（第65図）。
結果は、125I−FNの結合に比して、懸濁液中の125I−
FBD（r 31kD）と細菌との結合が増大することを示し
た。
S.aureusとの125I−FN結合と比較した場合のS.aureus
に対する125I−rFBDのこの結合増大は、無傷血漿由来FN
の２価のマルチドメインと比較すると、１価のドメイン
の高親和性に帰し得る。
II.125I−血漿由来31kD FBD（p 31kD）とS.aureusとの
結合：“天然”非標識FN,FBD,及び関連分子の競合一定
量の125I−p 31kD（３μg/ml）を、競合剤としての漸増
量の種々のFBD分子の存在下で５×108個の細菌とともに
インキュベートした（第66図）。
結果は、“天然"FN,p 31kD又はrFBDが125I−p 31kDと
S.aureusとの結合を同様の様式で阻害することを立証
し、これはrFBDが天然血漿由来分子と同様に活性である
ことを示している。しかしながら、還元形の組み換え又
は血漿由来FBDは125I−FBDと細菌との結合を最小限に阻
害するに過ぎず、これは適正な折りたたみが結合に必要
であることを示している。細菌結合部位をもたない関連
組み換え型タンパク質（FNの33kD CBD）は、S.aureusと
の125I−pFBD結合を阻害しなかった。
B.標識S.aureusと固定化FNとの結合 創傷における細胞外基質への細菌の付着を妨害するrF
BD（r 31kD）の能力を評価するために、競合アッセイを
開発した。このアッセイにおいては、S.aureusのFNでコ
ートされたプラスチック表面への付着、及びFBDの結合
妨害を測定した（第67図参照）。
結果は、S.aureusのFNでコートされたプラスチックバ
イアルへの付着が、FN,pFBD又はrFBDとともにS.aureus
をプレインキュベーションした後に阻害されたことを立
証する。これらの分子による阻害程度は同様であった。
S.aureus結合部位を有していない非関連タンパク質BSA
は、放射能標識S.aureusのFNでコートされたプラスチッ
クバイアルへの付着に際して、いかなる阻害をも引き起
こさなかった。C:S.aureusの気管支カテーテルとの結
合:FBD及びヘパリンの作用 種々の種のS.aureusによるカテーテル敗血症は、重症
臨床合併症の高出現率に関与する。
FN被覆カテーテルに結合するS.aureusの能力を調べ
た。第68図は、S.aureusとFN被覆カテーテルとの結合度
が非常に高く、約104PFU/cm2であることを示す。
細菌を漸増濃度のr 31kDとともにプレインキュベート
すると、細菌とカテーテルとの結合が低減する。この阻
害に関するIC50は0.08〜0.8μＭである（第68図）。同
様の阻害は、r 20kD FBD及びp 31kD FBDを用いても得ら
れた。
ヘパリンの全身投与、及び／又はヘパリン結合ポリウ
レタンカテーテルの使用は、血栓の出現率を低減するこ
とが報告されている。
したがって、５μＭヘパリンの存在下でのカテーテル
に付着したS.aureusに及ぼすFBDの阻害作用も測定し
た。結果（第68図）は、ヘパリンは細菌のカテーテルと
の結合に影響を及ぼさなかった、ということを示してい
るが、しかしながら、細菌結合のｒ−FBD阻害は、ヘパ
リン存在下であっても、依然として一定である。これ
は、ヘパリン存在下でさえ、臨床的環境でのS.aureusの
コロニー形成及び敗血症の阻害にはr 31kDが有用である
ことを示している。
結 論 これらの結果は、r 31kD又は血漿由来31kD FBDが、創
傷の細菌コロニー形成を防止する際に治療的に用い得る
ことを示す。種々のFBDタンパク質は、平均的当業者に
十分公知な適当の製薬的処方で処方し、つぎに適当な期
間、創傷領域を“潅注（irrigate）”又は“浸液（floo
d）”又は治療するために用い、それによって創傷の細
菌コロニー形成を防止する。
実施例27 ウサギ大動脈病変モデルにおける血漿由来31kD FBDの血
栓との付着 in vivoでの血栓に付着するフィブリン結合ドメイン
の能力を立証するために、ウサギにおける血栓形成モデ
ルを用いた。このモデルにおいては、大動脈壁の一部分
の内皮層をバルーンカテーテルで除去して、内膜を露出
した。これによって、病変域に血栓の薄膜が続いて形成
する。ウサギに全身投与された標識FNは、隣接非処置部
分に比して大動脈の病変部分の比放射活性が高いことか
らも示されるように、このような血栓と大量に結合をす
ることがUeharaら（40）によって示されている。
血漿由来31kD FBD断片と無傷血漿由来FNとを比較する
ために、ICL法を用いて２つの分子を125Iでヨード化し
た。除内皮化の２時間後に、放射能標識分子をウサギに
静脈注射した（20μCi;100マイクログラム/kg;1群につ
き３匹）。注射後72時間目に、大動脈を取り出し、有傷
（腹部）域と無傷（胸部）域を分離し、各部分を数個の
切片に切断した（病変域に関しては５〜６切片、対照部
分に関しては２切片）。組織片を計量し、放射能を計数
した。
第69図は、125I−FN（ウサギNo.1〜３）、又は125I−
p 31kD FBD（ウサギ４〜６）を注射したウサギにおける
連続大動脈切片において判明した比活性値をまとめたも
のである。第69図に示されているように、標識分子の局
在化の増強は、除内皮化切片で認められた（血栓域）。
さらに、放射活性は、標識p 31kD FBDを用いた場合は、
標識FNを用いた場合よりもクロット中に局在した。
これらの結果は、FBD部分を包含する分子は動脈血栓
クロットのイメージングに有用であることを示してい
る。
イメージングのために用いる場合は、酸素又は放射線
不透過性不活性分子のようなイメージングに有用な他の
マーカーをFBD（血漿由来又は組み換え型）に結合させ
るのが望ましい。
実施例28 血小板凝集に及ぼす33kD細胞結合ドメインの作用 血小板凝集に及ぼす組み換え33kD細胞結合ドメインの
作用を分析するために、さらに別の試験を実施した。特
記した場合を除いて、実験は実施例７と同様に実施し
た。
富血小板血漿（PRP）又は全血（血液）の凝集は、ADP
（10μＭ）によって誘発した。PRPにおける凝集の程度
は、光透過率によって測定した。全血における凝集の程
度は、インピーダンス法によって測定した。組み換えヒ
トフィブロネクチン細胞結合ドメイン（33kD）、又はペ
ンタペプチドGRGDSを反応混合液に加えて表に示された
最終濃度にした。
表IXに示された結果は、組み換え33kD CBDがヒト及び
霊長類（例えばヒヒ）の血小板の凝集に対して強力な阻
害剤であることを立証している。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (73)特許権者 999999999 レバノン，アビグドー イスラエル国、レホボート、モウリバ ー・ストリート・８ (73)特許権者 999999999 ワーバー，モーシエ イスラエル国、テル・アビブ、バーラ・ ストリート・36 (73)特許権者 999999999 ガイ，レイチエル イスラエル国、レホボート、ミラー・ス トリート・23 (73)特許権者 999999999 パネツト，アモス イスラエル国、エルサレム、ハラブ・シ ユリム・ストリート・11 (72)発明者 ボゲル，テイクバ イスラエル国、レホボート、コスオーバ ー・ストリート・４ (72)発明者 レバノン，アビグドー イスラエル国、レホボート、モウリバ ー・ストリート・８ (72)発明者 ワーバー，モーシエ イスラエル国、テル・アビブ、バーラ・ ストリート・36 (72)発明者 ガイ，レイチエル イスラエル国、レホボート、ミラー・ス トリート・23 (72)発明者 パネツト，アモス イスラエル国、エルサレム、ハラブ・シ ユリム・ストリート・11 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，４（７) （1985），ｐ．1755−1759 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然ヒトフィブロネクチンのＮ末端フィブ
    リン結合ドメインのアミノ酸配列の少なくとも４分の１
    を含むポリペプチドであって、Ｎ末端にgln−ala−gln
    −gln又はmet−gln−ala−gln−glnのアミノ酸配列を有
    し、天然ヒトフィブロネクチンの蛋白質加水分解消化産
    物に対応しないポリペプチドを含む血栓の診断イメージ
    ングのための医薬組成物。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが、約20kDから約31kDの
    分子量を有する請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチ
    ンのフィブリン結合ドメインの約20kDのポリペプチド断
    片である請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチ
    ンのフィブリン結合ドメインの約31kDのポリペプチド断
    片である請求項１に記載の医薬組成物。
JP02502804A 1988-12-29 1989-12-29 ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法 Expired - Lifetime JP3095771B2 (ja)

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