KR100219115B1 - 피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법 - Google Patents

피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린에 결합할 수 있는 능력을 보유하며, 영상화 가능한 마커에 의해 표지화된 폴리펩티드를 함유하는 영상화제를 제공한다.
본 발명은 또한 영상화제를 사용하여 피브린-함유 물질, 즉 혈전 또는 동맥경화성 플라크를 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 나아가 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 가지며 피브린 결합능이 있는 폴리펩티드를 발현시키기 이한 플라스미드, 이들 플라스미드를 함유하는 숙주, 폴리펩티드의 제조방법, 폴리펩티드를 이용한 치료방법 및 폴리펩티드를 회수하여 재폴딩시키고 재산화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린 결합이 있으며, 인간 유래의 다른 물질들이 실질적으로 함유되어 있지 않은 정제된 폴리펩티드를 제공한다.

Description

[피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법]
본 출원은 1990년 5월 21일자 출원된 미국특허출원 제526,397호의 일부 계속 출원이다.
[발명의 배경]
본 출원서류 전반에 걸쳐 여러 문헌들을 괄호안에 아라비아 숫자로 표기하여 인용하였다.
이들 참고문헌들의 상세한 출처는 특허청구의 범위 직전, 명세서의 말단에 나타내었다.
이들 간행물들의 총체적인 개시 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 현황을 보다 상세히 기술하기 위하여 본 출원서류에 참고 자료로서 삽입된 것이다.
내피의 손상은 혈전 형성의 제1단계인 것으로 믿어지며, 예를들면 혈액동력학적 긴장, 과콜레스테롤혈증, 고혈압증 및 면역복합체 질환에 의해 야기될 수 있다.
내피의 손상은 동맥 내막을 두꺼워지게 하고, 세포 증식, 콜레스테롤 축적 및 연결조직 섬유의 형성을 일으킨다.
손상된 내피 세포 및 내피화되지 않은 동맥내막에서 IgG와 보체인자 C3가 축적되는 것이 관찰되고 있다.
혈액에서 유도된 단핵 세포 역시 동맥경화증적 병변에 존재하는 세포 집단의 일부를 이룬다.
플라크 형상의 기작은 완전히 규명되어 있지 않다.
그러나, 가능한 메카니즘은 T세포와 단핵-유도 거대세포의 혼합물로 이루어진 최초의 병변인 지방층이 내피하층에 형성되고 이어 각종 사이토키닌이 방출되며, 이러한 사이토키닌의 방출에 의해 평활 세포들이 동맥 내막으로 이동하여 그곳에 축적되는 것이다.
현존하는 대부분의 동맥경화증 및 혈전증의 진단 및 치료방법은 건강한 세포에 대해서도 영향을 미치고, 비용이 많이들며 상당한 수의 환자에 있어서 그 효율이 제한적이다.
색소를 이용하여 플라크를 보다 잘 보일수 있도록 하는 개념이 보고되어 있다[sp-ears, J. et al., J. Clim. Invest. 71 : 395∼399(1983)].
이들 색소는 플라크의 표면을 형광 화합물로 표시한다.
관강내로 레이저를 투과시키는 광학 섬유를 이용하여 헤마토포르피린 유도체를 광활성화시켜 플라크를 파괴하는 방법이 제안되어 있다[Abela, G. et al., Am. J. Cardial. 50 : 1199∼1205(1982)].
또한, 테트라사이클린 색소도 제안되어 있다[Murphy-Chutorian, D. et al., Am J. Cardiol. 55 : 1293∼1297(1985)].
상술한 색도들은 동맥경화성 플라크의 성분에 결합할 수 있는 이들 색소들의 능력때문에 선택되어진 것이며, 원칙적으로, 색소들은 염색된 표면에 집중되는 레이저광을 흡수한다.
건강한 조직이 염색될 수도 있으며, 이 경우 주변 조직에 손상을 가져올 수 있다.
레이저광의 파장이 색소의 흡수파장에만 한정되기 때문에, 최선의 조절된 절제가 이루어지기 위해서는 레이저광을 최적으로 흡수하는 발색단이 사용되어야만 한다. 관상동맥 혈전, 폐 색전증, 심부정맥 혈전증 및 동맥경화증 등을 영상화하고 검출하는 것은 최근에 개발된 새로운 혈전용해제의 관점에서 볼때 특히 임상학적 중요성이 크다.
방사제약학적 시약을 이용하여 주위의 건강한 세포를 손상시키지 않으면서 혈전을 검출하고자 하는 몇몇 실험적인 시도가 이루어졌지만, 이들은 모두 시약과 관련된 고유한 결점들이 있기 때문에 그 어느것도 임상학적으로 널리 인정받고 있지 못한 실정이다.
혈관내의 동맥경화 병변을 초기에 검출하고자 하는 방세제약학의 기본적인 특징은 다음과 같다.
(i) 혈전성분에 대한 높은 친화력; (ii) [혈액증의 (결합되지 않은) 방사능표지화 추적자에 대한 혈전(결합된)의 비율을 높게 하기 위한] 비교적 빠른 약역학적 혈증 제거율; (iii) 안정성; 무독성 및 무면역원성; 및 (iv) 제조와 사용의 간편함.
문헌에 기재된 혈전 영상화를 위한 각종 시약과 그들의 단점은 다음과 같다; (a)111In으로 표지화한 자기 조직의 혈소판 : 절차가 까다롭고, 시간이 많이 소요되며 혈증 제거율이 비교적 길어서 약 2일이다.
(2) ; (b)131I-피브리노겐 : 이 분석법은 주입된 방사능 표지화된 피브리노겐이 갖는 혈전에 대한(낮은) 친화성에 근거를 두고 있으나, 혈중 체류 시간이 길기 때문에 신속한 영상화 시험에는 적절하지 못하며, 더우기 오래된 혈전에는 혼입되지 않거나 헤파린의 존재하에서 혼입된다(3, 36);
(c) 인간 피브린의 E1 단편 : 이것은 피브리노겐보다 우수한 것같이 보이지만, 광범위한 임상학적 응용에 충분한 양을 만드는 것은 어렵다.
(4) ; (d) 생쥐 항-피브린 단클로성 항체 : 이들은 특이적이고 혈전에 대한 친화력이 높지만 혈중 제거시간이 상당히 길고 인체에 대해 강력한 면역원이다(5, 33, 34) ; (e) 활성화 혈소판에 대해 특이적인 생쥐의 단클론성 항체(6, 7) : (d)와 동일한 단점을 갖는다; 및 (f) 표지화 피브로넥틴(1) : 후술하는 피브로넥틴은 혈전에 존재하는 수많은 물질에 대해 친화성을 나타내지만, 혈중 제거시간이 상당히 길며 혈전에서 방사능을 형성하는 것이 느리다.
따라서, 혈전을 신속하게 영상화하기 위한 혈전-특이적 방사능약제가 요구되어 있다.
미국특허 4,343,743호(Lian 등)는 조직내에 있는 감마-카르복시클루타민산(GLS)의 존재를 검출하기 위해 조직을 면역 형광 염색하기 위한 플로오레세인으로 표지화할 수 있는 특이적 GLA 항체를 기술하고 있다.
특이적 GLA 항체는 칼슘 침전물이 있는 진전된 동맹경화성 플라크에 존재하는 GLA에 결합된다.
라이안등은 GLA는 석회화되지 않은 플라크에서는 발견되지 않으며, 심장 판막 및 대동맥, 그리고 프로트롬빈, 응혈인자 Ⅶ, Ⅸ 및 Ⅹ, 단백질 C와 단백질 S와 같은 순환 단백질에서 발견된다고 보고하고 있다.
그러나, 라이안등의 GLA 결합 항체는 동맥경화성 플라크에는 선택적으로 결합하지 않는다.
피브로넥틴은 각각 분자량이 대략 220,000인 두 개의 동일한 서브유니트로 이루어진 당단백질이다.
배양된 인간 세포 및 생체내에서는 두개의 중요한 형태의 피브로넥틴이 생성 및 분비된다(8).
세포-연관된 피브로넥틴은 비교적 불용성으로 세포흡착, 상처 치유, 세포 분화 및 식작용에 관여한다.
간에서 주로 생성되는 혈장 피브로넥틴은 세포 피브로넥틴과 생물학적으로 비슷한 특성을 갖는 수용성 혈청 단백질이다.
피브로넥틴은, 한정된 단백분해 절단에 의해 각각 고유한 활성을 갖는 폴리펩티드들이 생성되기 때문에 다기능성 조절 단백질인 것으로 간주된다.
피브로넥틴 분자중 주요한 기능성 도메인이 부분 단백 분해 절단에 의해 확인 및 정의되었으며, 이 도메인은 헤파린, DNA, 피브린, 콜라겐 또는 겔라킨, 및 세포 결합 도메인을 포함한다(8∼13).
배럴(Baralle, F. E)의 유럽특허공개 207,751호(1989년 1월 7일 공개)에는 피브로넥틴의 완전한 cDNA 서열이 개시되어 있다.
배럴은 또한 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 단백질-갈락토시다제에 융합시킨 피브로넥틴의 콜라겐 결합 도메인의 일부분을 함유하는 융합 단백질의 발현도 개시하고 있다.
오웬스와 배럴(Owens, Baralle)에 의해 비슷한 융합 단백질이 개시되어 있다(14). 오바라 등(Obara, 1987)은 에세리키아 콜리-갈락토시다제에 융합시킨 인간 피브로넥틴의 세포 결합 도메인의 일부의 발현을 개시하고 있다(15).
덧붙여 오바라등(1988)은 돌연변이시킨-갈락토시다제에 융합된 세포 결합 도메인의 일부의 발현을 개시하고 있는데, 즉 세포 결합 도메인의 일부가 부위 특이적으로 결실된 것을 융합 단백질로 얻고 있다(16).
인간 피브로넥틴의 카복시 말단 피브린-결합 도메인이 인간 단백질 C 억제제의 시그널 서열과 융합된 융합 단백질로서 생쥐 L 세포내에서 발현되어 있다(17).
상술한 참고 문헌중 어느 것도 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인의 발현을 개시하고 있지 않으며 더우기 이들이 개시하고 있는 모든 재조합 단백질들은 융합 단백질이다.
본 발명은 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
이들 폴리펩티드들은 환원 조건하에 SDS 겔상에서 비교 마커 단백질과 비교하여 정의한 바에 따르면 대략 31KD, 20KD,18.5KD 및 12KD의 분자량을 가지며, 제약학적 시약으로 사용될 수 있는 다음과 같은 특성을 갖는다 : (i) 인간 단백질내에 존재하는 아미노산 서열을 갖고 따라서 면역원성을 갖지 않을 것으로 예측되며 : (ii) 트랜스-글루타미나제 촉매된 반응에서 신생의 혈전과 기형성된 혈전(혈괴)에 공유결합적으로 교차 결합되는 능력을 근거로 할때 피브린에 대한 특이성을 갖고; (iii) 동맥경화성 플라크를 검출하기 위해 그 특성을 연구해 볼 수 있는 세포의 매트릭스에 결합하며; (iv) 혈중 제거시간이 비교적 짧고; (v) 헤파린의 존재하에 혈괴내에 혼힙되며; 및 (vi) 재조합 기술에 의해 생산할 수 있으며 따라서 다량으로 제조할 수 있다.
본 발명은 생체외 및 생체내 모두에 있어서 피브린-함유 물질, 즉 혈전과 동맥경화성 플라크를 값싸고 정확하게 영상화할 수 있는 방법을 제공한다.
덧붙여, 본 발명은 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산을 가지며 피브린 결합능이 있고, 표지화되어 있으며 피브린-함유 물질의 영상화에 사용되는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드와 이러한 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
[발명의 개요]
본 발명은 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린 결합능이 있으며, 영상화 가능한 마커에 의해 표지화된 폴리펩티드를 함유하는 영상화제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 영상화제가 피브린-함유 물질에 결합되는 조건하에서 영상화하고자 하는 피브린-함유 물질과 영상화제를 접촉시키고, 결합된 영상화제를 영상화하여 피브린-함유물질을 영상화함을 특징으로 하는, 피브린-함유 물질, 즉 혈전 또는 동맥경화성 플라크의 영상화 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산을 갖고, 피브린 결합능이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 이 폴리펩티드-코딩 DNA에 대하여 적절한 숙주 세포내에서 상기 폴리펩티드의 발현을 수행할 수 있도록 위치해 있는 적절한 조절 요소를 코딩하는 DNA를 함유함을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 발현을 위한 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린 결합능이 있으며, 인간 유래의 다른 물질들이 실질적으로 함유되어 있지 않은 정제된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 나아가 상기 폴리펩티드를 회수하여 재폴딩시키고 재산화시키는 방법 및 상기 폴리펩티드를 이용한 치료 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
도면에서, 특정 제한 효소 부위에 인접한 괄호내의 숫자는 제2도에 나타낸 인간 피브로넥틴 cDNA의 누클레오티드 서열을 따라 동일하게 번호를 매긴 위치에 해당한다(배럴의 유럽특허공개 제207,751호(1987년 1월 7일 공개)의 제3도 참고).
다음 도면들은 피브로넥틴의 아미노-말단 피브린 결합 도메인(FBD)에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하기 위한 폴라스미드의 제작을 설명한다.
FBD는 성숙한 피브로넥틴의 아미노산 번호 1, 즉 글루타민으로서 제2a도에 나타낸 네번째 아미노산(Q)에 해당하는 아미노산에서 시작한다.
즉, FBD 서열의 N-말단은 Q-A-Q-Q(글루타민-알라닌-글루타민-글루타민)이다; 따라서, 제2a도의 cDNA 서열에서 상응하는 첫번째 누클레오티드는 번호 14이며, 화살표로 표시하였다.
이들 도면 및 명세서 전반에 걸쳐 기술된 모든 재조합 FBD 폴리펩티드들은 이 첫번째 글루타민으로 부터 아미노산 번호 1로 하여 번호를 매겼으며, 상응하는 cDNA 서열은 제2도에 나타낸대로 번호를 매겼다.
도면중 몇몇은 1의 c-말단의 피브로넥틴의 세포 결합 도메인(CBD)부분에 연결되어 있는 FBD 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드의 제작을 기술하고 있다.
본 출원인이 클로닝 및 발현시킨 CBD에 해당하는 cDNA 서열은 배럴의 지도상에서 누클레오티드 4811에서 5080(양쪽 말단 포함)에 이르는 270bp의 여분 도메인(ED : Extra Domain)이 빠져 있다(제2도 참조).
즉, 배럴의 지도상에서 누클레오티드 3317에서 5566에 걸쳐있다고 하는 cDNA 서열은, ED 단편의 270 누클레오티드, 즉 양말단을 포함하는 누클레오티드 4811∼5080이 빠져있기 때문에 1980 누클레오티드만을 포함한다.
이 영역은 당업계에서 ED-A 영역으로 알려져 있다.
누클레오티드 5081이 G에서 A로 변경되었기 때문에, 아미노산 1690은 알라닌에서 트레오닌으로 변경되었다.
비슷하게, 상기 DNA 단편에 의해 발현되는 폴리누클레오티드는 배럴의 지도상에서 아미노산 1102에서 아미노산 1851까지를 코딩하지만 ED영역에 의해 코딩되는 90아미노산, 즉 아미노산 1600~1689(양 말단 포함)가 결실되어 있으므로 660개의 아미노산만을 함유한다.
이러한 것은 본 출원서류에 기술된 ED영역에 걸쳐있는 모든 CBD 폴리펩티드의 경우에 동일하게 적용된다(이 영역은 당업계에서 ED-B영역으로 알려져있으며, 배럴의 서열과 본 출원인의 DNA 모두에 있어서 빠져있다).
31KD, 20KD, 18.5KD, 12KD 및 33KD로 표현되는 폴리펩티드의 정의는 환원 조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드겔 상에서 공지된 분자량의 마커 단백질과 비교하여 결정한 대략적인 분자량을 근거로 한 기능적 정의이다.
[제1도]
이 도면은 각종 피브린넥틴 도메인과 제작된 재조합 폴리펩티드를 도식적으로 설명한다.
[제2도]
이 도면은 인간 피브로넥틴 cDNA의 누클레오티드 서열을 보여준다.
[제3도]
화학적으로 합성된 올리고머 7쌍을 제조하였다.
이 합성 올리고머에는 인간 피브로넥틴(FN)의 처음 153N-말단 아미노산을 코딩한다.
이 도면은 이들 7쌍의 합성 올리고머의 서열을 나타낸다.
[제4도]
제3도에 나타낸 화학적으로 합성된 7쌍의 올리고머로 부터 다음과 같은 방법으로 인간 FN의 N-말단 도메인의 아미노산 1~153을 코딩하는 DNA 단편을 수득하였다. 각 쌍마다 별개의 튜브에 들어있는 올리고머 3/4, 5/6, 7/8 및 9/10을 어닐링 시키고, T4 폴리누클레오티드 키나제 효소를 이용하여 5' 말단을 인산화시켰다.
제2단계에서는, T4 DNA 리가제를 이용하여 3/4쌍 및 5/6쌍을 서로 연결시켰다. 비슷하게, 반응쌍 7/8과 9/10을 서로 연결시켰다.
각 연결반은 단계후에, 연결반응 혼합물의 부분표본을 겔상에서 분석하여 새로이 형성된 단편의 크기와 연결 효율을 측정하였다.
제3단계에서는 상술한 두 연결반응 혼합물을 서로 혼합하고, 미리 별도의 튜브에서 어닐링 및 인산화시킨 올리고머 11/12로 된 쌍 6을 혼합물에 첨가하였다.
상기 연결반응 혼합물에서 얻은 326 염기쌍의 DNA 단편을 아가로스 겔에서 분리하고 정제하였다.
정제된 합성 326 단편을 부가적인 두쌍의 합성 링커, 즉 올리고머 1/2의 쌍 1과 올리고머 13/14의 쌍 6에 가하였다.
쌍 1에서는 올리고머 2만이 5' 말단에 인산화가 일어나고, 쌍 7에서는 올리고머 13만이 5' 말단에 인산화가 일어났다.
T4 DNA 리가제에 의한 연결반응 후에, 더이상 분리하지 않은 혼합물을 EcoR I과 BamH I 엔도누클아제로 분해시킨 pBR322 벡터 DNA에 가하였다.
pFNB 932-18이라고 명명된 얻어진 플라스미드는 pBR 322 벡터내에, 인간 FN의 N-말단폭 153 아미노산을 코딩하는 합성 EcoR I(5' 말단)-BamH I(3' 말단)제한 단편 전체를 포함하고 있다.
[제5도]
[FN의 N말단의 153아미노산 서열의 발현]
플라스미드 pFN 932-18을 Nde I과 BamH I 엔도누클레아제로 분해하였다.
FN(처음 153 아미노산+부가적인 N-말단 메티오닌)을 코딩하는 Nde I-BamH I DNA 단편을 분리하고, 플라스미드 pIV 301을 NdeI과 Bgl II 엔도누클레아제로 분해시켜 얻은 큰 단편에 연결시켰다(플라스미드 pIV301은 λ PL프로모터와 cII RBS의 조절하에 인간 성장 호르몬(hGH)을 발현한다).
얻어진 플라스미드는 pFN 949-2로 명명하였다.
[제6도]
[FN의 N-말단 도메인의 3' 말단(아미노산 262)에의 종결 코돈 TAA의 삽입]
TAA 종결코돈과 Bagl II 부위를 가지며 다음 서열;
을 갖는 합성 올리고누클레오티드를 cDNA 플라스미드 p931-5(제6도 참조)를 EcoR I과 Pvu II로 분해시켜 분리한 EcoR I - Pvu II FN 단편의 3' 말단(Pvu II 부위)에 연결시켰다.
연결반응은 EcoR I과 BamH I으로 분해시킨 DNA 벡터 플라스미드 pBR 322(큰 단편)의 존재하에 실시하였다.
얻어진 플라스미드는 pFN935-12로 명명하였다.
[제7도]
[피브로넥틴(FN)과 r31KD FBD의 쥐에서의 약물동태학적 비교]
125I-FN(0.1mg/kg : 5×106cpm) 또는125I-r31 FBD(0.1mg/kg : 5×106cpm)을 정맥내 주사하고 지정된 시간마다 혈액시료를 채취하였다.
혈액시료증을 불용성 방사능을 트리클로아세트산 침전법에 의해 측정하였다.
시간에서, 100% 값은 FN의 경우 40,000cpm/ml를, FBD의 경우에는 46,000cpm/ml를 나타낸다.
[제8도]
[카테테르에의 에스. 아우레스의 결합]
FN이 도포된 우노(Uno) 기관지용 플라스틱 카테테르(각 반응마다 3cm식 2개)에 3.0×106PFU/ml의125I-에스.아우레우스(S. aureus)(1 CPM/3 PFU)가 결합하는 실험을 방법란에 기술한대로 실시하였다.
경쟁반응이 수행되면, 세균과 첨가 단백질을 실온에서 30분간 예비보온한 후 방법란에 기재된 대로 카테테르에 첨가하여 더 보온하였다.
경쟁반응에서 사용된 폴리펩티드는 P-31(p31 KD), r-20(재조합 20KD FBD 폴리펩티드 단편) 및 r-31(재산화 및 재폴딩된 r31 KD)이었다.
어떤 반응들은(도면참조) 5㎛ 헤파린(돼지의 내장 점막에서 유래된 분자량 10,000의 것; Sigma)의 존재하에서 실시하였다.
경쟁자의 부재하에 실시된 대조 반응의 결합(도입된 세균의 8.8%)을 100%로 하였다.
[제9도]
[플-랭쓰 피브로넥틴과 비교한 피브로넥틴 도메인의 재조합 폴리펩티드]
이 도면은 각종 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론들을 서로서로, 그리고 플-랭쓰(full-length)서열의 피브로넥틴 cDNA 및 인간 피브로넥틴 분자내에 존재하는 각종 도메인을 도식적으로 나타낸 그림과 비교하여 정렬한 상태를 보여준다.
[제10도]
[r-12KD FBD 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pFN 196-2의 제작]
플라스미드 pFN 975-25(제10도)를 BspM I과 Hing III로 분해하여 얻은 큰 BspM I과 Hind III 단편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 합성 링커 A의 쌍(제15도 참도)에 연결시켰다.
플라스미드 pFN 196-2를 얻고, 에세리키아 콜리 A1645주에 형질 전환시킨 후 다시 에세리키아 콜리 A4255주에 재형질 전환시켰다.
플라스미드 pFN 196-2는 누클레오티드 14부터 누클레오티드 340에 이르는 피브로넥틴 cDNA의 5'-말단 서열을 함유한다.
즉, 이것은 피브로넥틴의 FBD의 처음 109 아미노산을 코딩하며 아르기닌 잔기로 종결된다.
최종 폴리펩티드에는 부가적인 N-말단 메티오닌이 존재한다.
플라스미드 pFN 196-2는 λ 프로모터와-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에 r12KD FBD 폴리펩티드를 잘 발현시키며 ATCC에 수탁번호 68328로 기탁되어 있다.
[제11도]
[변형된 12KD FBD 폴리펩티드(12KD')를 발현하는 플라스미드 pFN 197-10의 제작]
링커쌍 B(제15도를 참조)를 사용하는 것을 제외하고 제10도에 기재된 것과 동일하게 플라스미드 pFN 975-25를 처리하였다.
연결반응에 의해 플라스미드 pFN 197-10이 얻어지며, 이 플라스미드는 FN의 FBD의 N-말단 서열을 코딩한다.
그러나, 누클레오티드 340 이후에 변형을 가하여 종결 코돈전에 Nde I 부위(CATATG)를 도입함으로써 111개의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 코딩하게 되는데, 111아미노산중 처음 109 아미노산은 r12KD 폴리펩티드의 아미노산에 해당하며, I에 이어지는 두개의 아미노산 잔기는 히스티딘과 메티오닌이다.
부가적인 N-말단 메티오닌 잔기가 최종 폴리펩티드내에 존재한다.
플라스미드 pFN 197-10을 에세리키아 콜리 A1645주로 형질 전환시키고 이어 에세리키아 콜리 A4255주에 재형질전환시켰다.
이 플라스미드는 λ 프로모터와-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에 변형된 r12 KD(12KD')FBD 폴리펩티드를 잘 발현시킨다.
[제12도]
[피브로넥틴의 r33 KD 세포 결합 도메인(CBD)에 융합된 r12 KD' FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 202-5의 제작]
플라스미드 pFN 197-10(제11도)를 Nde I과 Hind III로 분해시켜 얻은 큰 단편을 플라스미드 pFN 137-2의 Nde I-Hind III CBD(세포 결합 도메인)에 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결시켰다.
ATCC에 수탁번호 67910호로 기탁되어 있는 플라스미드 pFN 137-2는 본출원의 모 출원인 미국특허출원 제345,952호에 기술되어 있다.
r33 KD CBD 서열은 피브로넥틴에서 1329~1722로 번호가 매겨진 아미노산을 함유하는데(제2도), ED-A 영역에 의해 코딩되는 1600~1689로 번호가 매겨진 90 아미노산은 제외되어 있다(도면의 간단한 설명중 머릿말 참조).
얻어진 플라스미드 pFN 202-5를 에세리키아 콜리 A1645주 및 이어서 에세리키아 콜리 A4255주에 형질 전환시켰다.
플라스미드 pFN 202-5는 플라스미드 pFN 197-10에 의해 코딩되는 111 아미노산의 cDNA 서열 및 그에 이어서 r33 KD CBD의 첫번째 아미노산인 세린의 코돈으로 시작되는 r33 KD CBD의 cDNA 서열을 함유한다.
이 플라스미드는 피브로넥틴의 r12 kD 피브린 결합 도메인과 33KD 세포 결합 도메인을 함유하는 대략 45KD 폴리펩티드를 잘 발현시킨다.
이 융합 폴리펩티드는 λ 프로모터와-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에 발현된다.
[제13도]
[DG RGDS 서열에 융합된 r31 KD FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 195-4의 제작]
플라스미드 pFN 975-25를 Pvu II와 Hind III로 분해시켜 얻은 큰 단편을 분리하고, 한 쌍의 합성링커 C(제15도 참고)에 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결시켰다.
pFN 195-4로 명명된 얻어진 플라스미드를 에세리키아 콜리 A 1645주와 이어서 에세리카아 콜리 A4255주에 형질 전환시켰다.
플라스미드 pFN 195-4는 누클레오티드 14에서 누클레오티드 793까지의 풀-랭쓰 FBD cDNA 서열(260 아미노산 코딩)과 그에 이어 asp-gly-arg-gly-asp-ser을 코딩하는 서열을 함유한다.
즉, 이 플라스미드에 의해 코딩되는 폴펩티드는 총 260 아미노산과 그에 뒤이은 서열 DGRGDS를 갖는다.
최종 폴리펩티드에는 부가적인 N-말단 메티오닌 잔기가 존재한다.
플라스미드 pFN 195-4는 λ 프로모터와-락타마제에 리보솜 결합 부위의 통제하에, 서열 asp-gly-arg-gly-asp-ser(DGRGDS)에 융합된 r31 KD 피브린 결합 도메인의 고수율 발현자이다.
[제14도]
[융합된 31KD FBD-33KD CBD 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pFN 194-2의 제작]
플라스미드 pFN 975-25를 Pvu II와 Hind III로 분해시켜 얻은 큰 Pvu II-Hind III 단편을 분리하고, T4 DNA 리가제를 이용하여 한쌍의 링커 D(제15도)에 연결시킨 후, 플라스미드 pFN 137-2(ATCC 수탁번호 67910)를 Nde I과 Hind III로 분해하여 얻은 세포 결합 도메인(CBD) 단편에 연결시켰다.
CBD 도메인의 정의에 대하여는 제12도 참조.
pFN 194-2로 명명된 생성된 플라스미드를 에세리키아 콜리 A1645주 및 이어서 에세리키아 콜리 A4255주에 형질 전환시켰다.
플라스미드 pFN 194-2는 λ PL프로모터와-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에, 분자량이 대략 64KD인 융합된 r31 KD FBD-r33 KD CBD 폴리펩티드를 낮은 효율로 발현시킨다.
플라스미드 pFN 194-2에 의해 코딩된 폴리펩티드는 메티오닌 코돈에 융합된 피브로넥틴의 처음 265 아미노산 서열을 코딩하는 DNA와 그에 이은, CBD의 위치 1에 있는 아미노산 세린의 코돈으로 시작하는 피브로넥틴의 CBD를 코딩하는 cDNA 서열을 함유한다.
당업자는 플라스미드 pFN 194-2에 의해 발현되는 폴리펩티드를 고효율로 발현시키는 방법을 알 것이다.
그 한에는 제25도에 나타낸 고효율 발현자인 플라스미드 pFN 205-5를 사용하는 것이다.
[제15도]
[플라스미드의 제작에 사용되는 올리고누클레오티드 링커]
4쌍의 화학적으로 합성된 올리고머(A, B, C 및 D)를 제조하여 각각 제10도, 제11도, 제13도 및 제14도에 기술된 플라스미드를 제작하는데 사용하였다.
[제16도]
[스테인레스 스틸 코일에 의해 유도된 정맥 혈전에 의한 표지화 r31 KD FBD의 흡수]
막대와 수직으로 표시한 까치발 표시는 분리된 혈전, 혈전을 보유하는 혈관 절편(원위치 혈전(thrombi in-situ)) 또는125I-31 KD FBD를 투여하고 24시간후에 채취한 말초 혈액 시료와 관련된 비방사능의 평균 ±SEM(N=10)을 나타낸다.
상세한 것은 실시예 7의 A란 참조.
[제17도]
쥐의 정맥 혈정 모델에 있어서, 표지화 r12 KD, r20KD 및 r31 Kd FBD 폴리펩티드의 비교
막대와 수직으로 나타낸 까치발 표시는 125 I-표지화 재조합 폴리펩티드를 투여하고 24시간 후의 분리된 혈정(T)또는 혈액(B)과 관련돈 비방사능의 평균 ±SEM(N=5)을 나타낸다.
상세한 것은 실시예 7의 B란 참조.
[제18도]
[쥐에서의125I-표지화 r31 KD FBD의 대사 안정성]
제7도에 기술한 것과 유사한 실험방법으로 쥐에게125I-31 KD FBD(5×106cpm/쥐)를 정맥내 주사하였다.
지정된 시간 간격으로 혈액 시료를 채취하고, 구연산나트륨을 함유하는 튜브(최종구연산나트륨 농도=0.38%)에 넣고 다음과 같이 혈액 부분 표본을 처리한다.
(a) 20% TCA로 처리한 후 TCA 침전후에 TCA 불용성 양을 측정하거나; 또는 (b) 미리 형성된 응괴(대조 쥐에서 얻은 20μl의 전혈을 이용하여 형성)와 함께 보온한 후,125I-31 KD FBD가 상기 기 형성된 응괴에 결합하는 것을 실시예의 2단계 반응 II의 조건하에 측정한다.
감마 계수기를 이용하여 방사능을 측정하고 각 시료의 활성을 반응 혼합물중에 존재하는 총 cpm의 백분율로 계산하였다(통상적으로 YCA 침전법은 시료 부분표본을 필터위에 놓아 총 cpm을 계수하고, 필터를 20% TCA로 3회 세척후 이어서 20% 에탄올로 2회 세척하여 TCA를 추출하고, 필터위의 TCA 불용성 양을 재계수하는 단계를 포함하므로써 TCA-불용성 양의 백분율을 계산할 수 있다.)
[제19도]
[피브린 응괴에의 피브린 결합 도메인 폴리펩티드의 결합]
이 실험은 2단계 반응 II(실시예 6)에 기술한 것과 동일하게 실시하였다.
각각 0.15㎛125I의 후술하는 피브린 결합도메인 폴리펩티드를 구연산염처리된 전ㅎ혈 20μl에서 유도된 기형성된 피브린 응괴와 함께 37℃에서 보온하였다.
5mM CaCl2와 0.02단위/ml 트랜스글루타미나제의 존재하에 결합을 측정하였다.
45분간의 보온후에 원심분리하여 반응을 종결하고, 펠릿을 PBS로 3회 세척하고, 감마 계수기를 이용하여 방사능을 측정하였다.
1. 혈장 31KD FBD(p31 KD)
2. r12 KD
3. r20 kD
4. r31 KD(배치 A)
5. r31 KD(배치 B)
6. r31 KD(배치 C)
[제20도]
[125I-r12 KD가 신선한 피브린 응괴 및 동결된 피브린 응괴에 결합되는 것의 비교]
이 실험은 2단계 반응 II(실시예 6)에서 기술된 것과 동일하게 실시하였다. 구연산염으로 처리한 전혈 20μl에서 유도된 예비 형성된 피브린 응괴를 -70℃에서 7일간 동결하거나(동결 혈괴) 또는 형성 직후에(신선한 혈괴) 사용하였다.
피브린 응괴는 0.02 단위/ml의 기니아 피그 간의 트랜스글루타미나제(Sigma)의 존재 또는 부재하에 0.15μM125I-r12 KD와 함께 보온하였다.
피브린 응괴에의 결합율은 실시예 6에 기술된대로 측정하였다.
[실시예 21]
[FPLC에 부착된 수퍼로스 12 컬럼으로 부터의 용출 프로필에 의해 모니터링한 r20 KD 폴리펩티드의 재폴딩 및 정제]
재폴딩(refolding)과 정제 공정중의 각종 단계에서 취한 r20 KD 폴리펩티드 200μl의 부분 표본을 FPLC에 부착된 수퍼로스(Superose)12컬럼의 꼭대기에 주입하였다. 컬럼은 0.8ml/분의 유량으로 150mM Nacl.20mM 트리스 HCL(pH 7.8)로 평형화 및 용출하였다.
FPLC 콘트롤러 LCC-500을 사용하면 트레이스가 적어진다.
A : 6M 구아니딘-HCl에 용해되고 50mM-머캅토에탄올에 의해 환원되는 r20 KD 폴리펩티드의 펠릿; B : 재폴딩되고 공기-재산화된 r20 KD 폴리펩티드; C : Q-세파로스에 결합된 폴리펩티드, 즉 정제된 r20 KD로 부터 분리된 물질; D : Q-세파로스 컬럼에서 얻은 최종 용출분획, E : 헤파린-세파로스 컬럼에서 얻은 최초 용출분해, 즉 정제된 r20 KD에서 분리된 물질; F : 헤파린-세파로스 컬럼을 0.5mM NaCl로 용출시켜 얻은 정제된 20KD 폴리펩티드(머무름 시간=18.16분) 물질이 환원된 형태로 있는 프로필 A에서 이 18.16분의 머무름 시간에 피크가 없고, 또한 물질이 잘못 폴딩된 형태들의 20KD 폴리펩티드를 함유하는 프로필 C와 E에서도 피크가 없는 것에 유의해야 한다.
[제22도]
[워터스(Waters) HPLC 시스템에 부착된 수퍼로스 12컬럼으로 부터 용출 프로필에 의해 모니터링한 r12 KD 폴리펩티드의 재폴딩 및 정제]
재폴딩과 정제 공정중의 각종 단계에서 취한 r12 KD 폴리펩티드 25~100μl의 부분표본을 워터스(Waters) HPLC 시스템에 부착된 수퍼로스 12 컬럼의 꼭대기에 주입하였다.
컬럼은 0.8ml/분의 유량으로 150mM NaCl/20mM 트리스 HCl(pH 7.8)로 평평화 및 용출하였다.
A. 6M 구아니딘-HCl에 용해되고 50mM-머캅토에탄올에 의해 환원되는 r12 KD 폴리펩티드의 펠릿; B. 재폴딩되고 공기-재산화된 r12 KD 폴리펩티드 C. Q-세피로스에 결합된 폴리펩티드, 즉 정제된 r12 KD로 부터 분리된 물질; D. Q-세파로스 컬럼과 헤파린-세파로스 컬럼 모두에서 얻은 최종 용출 분획(이 경우에, 컬럼은 일렬로 연결되어 있고, 따라서 Q-세파로스 컬럼의 최초 용출 분획은 자동적으로 헤파린세파로스 컬럼에 로딩된다), 즉 정제된 r12 KD로 부터 분리된 물질; E. 헤파린-세파로스 컬럼을 0.5M NaCl로 용출시켜 얻은 정제된 r12 KD폴리펩티드(머무름 시간=18.83분).
물질이 환원된 형태로 있는 프로필 A에서나, 또는 잘못 폴딩된 형태들의 r12 KD 폴리펩티드를 함유하는 프로필 C와 D에서는 모두 이 18.83문의 머무름 시간에 피크가 없는 것에 유의해야 한다.
[제23도]
[플라스미드 pFN 208-13의 제작]
플라스미드 pFN 975-25(ATCC No. 67832)의 두 부분표본을 각각 Xmn I과 Xba I-Sty I을 이용하여 별개로 분해하였다.
각 분해산물로 부터 큰 단편들을 분리하고, 제8도에 나타낸 합성 올리고머와 함께 혼합하였다.
혼합물을 2.5분간 끓인 후, 60분에 걸쳐 서서히 30℃로 냉각하고, 다시 60분에 걸쳐 4℃로 냉각하고, 마지막으로 30분에 걸쳐 0℃로 냉각하였다.
이렇게 재어닐링된 DNA를 클레노프(Klenow) 단편을 이용하여 염기쌍을 메꾸고(fill-ing-in) T4 DNA 리가제로 연결하였다.
DNA를 이. 콜리 A1645에 형질 전환시키고, 올리고머에 대해 양성을 나타내는 클론을 얻기위해 형질전환체를 스크리닝하였다.
양성 클론으로 부터 얻은 플리스미드를 pFN 208-13으로 명명하고, 이. 콜리 A4255에 도입하여 ATCC에 수탁번호 68456호로 기탁하였다.
이 플라스미드는 λ PL프로모터와-락타마제 리보솜 결합부위의 통제하에 분지의 아미노 말단인 18.5 KD FBD 폴리펩티드를 발현시킨다.
[제24도]
[플라스미드 pFN 208-13의 제작에 사용된 합성 링커]
이 도면은 플라스미드 pFN 208-13의 제작(제23도)에 사용된 합성 올리고머를 나타낸다.
[제25도]
[플라스미드 pFN 205-5의 제작]
플라스미드 pFN 194-2(제14도)를 Xba I-Hind III로 분해한 후 작은 단편을 분리하였다.
플라스미드 pFN 962-3(이 플라스미드는 본원의 출원인과 동일한 출원인에게 양도된 특허출원 PCT/US89/05875호(국제 공개 제WO/90/07577호, 1990년 7월 12일)의 제45도~제49도 및 도면의 설명란에 개시되어 있다)을 Nde I-Hind III 분해한 후 작은 단편을 분리하였다. 이들 두단편을 플라스미드 pMLK-100(ATCC 수탁번호 68605)의 Nde I-Hind III 분해에 의해 얻은 큰 단편과 연결시켰다.
얻어진 205-5로 명명된 플라스미드는 λ PL프로모터와 CII 리보솜 결합부위의 통제하에, 33KD CBD에 융합된 31KD FBD를 함유하는 64KD 폴리펩티드를 고효율로 발현하며, 구조 유전자의 바로 하류에 ter로 명명된 trp 전사 터미네이터를 함유한다. 이 폴리펩티드는 상기 언급한 PCT 공개에 개시된 31KD FBD 폴리펩티드와 관련된 기재와 동일하게 정제 및 재폴딩하였다.
[제26도]
[플라스미드 pFN 201-3의 제작]
플라스미드 pFN 949-2(ATCC 수탁번호 67831)를 HIND III-Sty I으로 분해하고 큰 단편을 분리한 후, 플라스미드 pFN 196-2(ATCC 수탁번호 68328)을 Hind III-Sty I으로 분해해서 분리한 작은 단편과 연결시켰다.
pFN 201-3이라고 명명된 생성된 플라스미드 λ PL프로모터와 cII 리보솜 결합 부위의 통제하에 12KD FBD 폴리펩티드를 발현한다.
[제27도]
[플라스미드 pFN 203-2의 제작]
플라스미드 pMLK-100(이. 콜리 4300에 도입되어 ATCC 수탁번호 68605호로 기탁되어 있음)을 Nde I-Hind III로 분해하고 큰 단편을 분리한 후, 플라스미드 pFN 201-3을 Nde I-Hind III 로 분해해서 분리한 작은 단편과 연결시켰다.
pFN 203-2로 명명된 생성된 플라스미드는 λ PL프로모터, cII 리보솜 결합부위 및 ter로 명명된 trp 전사 종결 서열의 통제하에 12KD FBD 폴리펩티드를 발현하며, 이. 콜리 A4255주에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68606으로 기탁되어 있다.
플라스미드 pFN 203-2는 pFN 203-2-3으로도 알려져 있다.
[제28도]
[FBD 폴리펩티드 단편의 혈관 성분에의 결합]
이 도면은 실시예 9에 기재된 31KD와 비교하였을때, 12KD 폴리펩티드가 내피세포, 세포외 매트릭스 및 고정화 피브로넥틴 같은 혈관 성분에 결합되는 율이 낮은 것을 나타낸다.
외래서 트랜스글루타미나제를 첨가하였을때 조차도, 12KD의 결합은 증가되기는 하지만 31KD와 비교할때는 그래도 비교적 낮은 결합율을 보인다.
[제29도]
[에스. 아우레우스가 내피세포(EC)에 결합되는 것에 미치는 각종 FBD 폴리펩티드 단편의 영향]
표지화, 에스. 아우레우스의 준비와 내피 세포(EC) 결합 분석법은 실시예 8에 기술되어 있다.
에스. 아우레우스가 EC에 결합하는 것에 미치는 혈장 및 재조합 31KD, 재조합 18.5 KD, 그리고 재조합 12KD의 영향을 시험하였다.
이 도면은 태내 송아지 혈청(FCS)의 존재 또는 부재하에 4℃에서 에스.아우레우스가 내피 세포에 결합되는 것에 미치는 각종 FBD 폴리펩티드의 용량에 의한 영향을 보여준다(이전의 실험에서는 37℃에서는 FCS의 존재하에 에스.아우레우스가 EC에 결합되는 것이 2~3로 급격히 증가하지만 4℃에서 약간만 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 증가는 아마도 FCS 내에 혈장 피브로넥틴이 존재하기 때문인 것 같다.). 4℃에서 수행된 본 실험에서는 FCS의 첨가가 결합에 별다른 영향을 주지 않았다. 혈장 31KD와 재조합 31KD 모두 강하게 용량 의존적을 결합을 억제한 반면, 재조합 18.5KD와 12KD 폴리펩티드 단편은 실질적으로 결합을 억제하지 않았는데, 이는 이들의 에스. 아우레우스 결합 친화성이 낮거나 또는 친화성이 없음을 시사한다.
[제30도]
[기형성된 피브린 응괴에의 각종 FBD 폴리펩티드 단편의 결합(반응 II)]
이 도면은 실시예 9에 기술된 것과 같은 기 형성된 피브린 응괴에 대한 각종 FBD 폴리펩티드의 특이성을 보여준다.
시험된 FBD 폴리펩티드는 31KD, 20KD, 18.5KD 및 21KD이다.
덧붙여 33KD CBD에 융합된 12KD FBD 단편의 45KD 융합 폴리펩티드(실시예 40)도 시험하였다.
33KD CBD 폴리펩티드(본원 발명의 출원인과 동일한 양수인에게 양도된 PCT 공개 제WO/90/0757호 공보, 62~64면)를 대조로 사용하였다.
45KD 융합 폴리펩티드를 비롯한 모든 FBD 폴리펩티드가 비슷한 비율로(25~38%의 결합율)로 예비 형성된 피브린 응괴에 결합하였다.
33KD CBD만 낮은 비율로 혈괴에 결합하였다.
트랜스글루타미나제의 억제제인 요오도아세 테이트(IAC)는 결합을 50~75% 억제하는데, 이는 트랜스글루타미나제는 결합 반응에 있어서 유효한 성분임을 시사하는 것이다.
33KD CBD 폴리펩티드의 결합은 요오도아세테이트에 의해 별다른 영향을 받지 않는데, 이는 33KD CBD 폴리펩티드가 상이한 메카니즘에 의해 결합한다는 것을 시사한다.
[제31도]
실시예 13에 12KD와 18.5KD FBD 폴리펩티드 단편을 이용하여 생체내에서 혈전을 표지화하는 것을 기술하였다.
이 도면은 스테인레스 스틸 코인을 보유하는 쥐에게111In-표지화 재조합 FBD 단백질을 정맥내 투여하고 24시간후에 채취한 혈액(무늬없는 막대기)과 혈전(빗금친 막대기)의 비방사능을 보여준다.
막대기와 수직으로 표시한 까치발 표시하는 각각 cpm/g 습체중의 평균 및 SEM을 나타낸다.
혈전 대 혈액의 비는 제32도에 나타내었다.
[제32도]
제31도에 기술한 쥐 코일 모델에 있어서,111In-표지화 12KD-, 18.5 KD- 및 31KD-FBD를 투여하고 24시간 후의 비방사능에 관한 혈전 대 혈액의 비를 나타내었다.
[제33도]
이 도면은 활성화제로서 SK 또는 FBD-SK 복합체를 이용하여, pH 7.4 및 37℃에서 측정한 인간 Glu-플라스미노겐 활성화 동태학에 관한 라인위버-벅크(Lineweaver-Burke) 곡선이다.
96웰 플레이트에 들어있는 200μl 부피에 있어서, 플라스미노겐 기질 농도는 0.9×10-6내지 2.7×10-6M의 범위내에 있다.
S-2251 기질(H-D--Val-Leu-Lys-pNA)의 최종 농도는 5×10-4M 이었고, 최종 활성화제의 농도는 2×10-9M이었다.
반응율인 v는 시간t(분)당 405nm에서의 흡광도A(흡광단위)의 변화를 나타낸다.
[제34도]
모두 이미다졸-완충된 식염수(pH 7.4)에 용해시킨 5ml(2mg/ml) 피브리노겐, 5ml(0.4%) 노블-아가(Noble-agar), 0.5ml(1M)의 CaCl2및 0.5ml(10u/ml)의 트롬빈을 혼합하여 피브린-아가 플레이트를 제조하였다.
중합화후에, 파스퇴로 피펫과 진공을 이용하여 작은 웰들을 만든후, 102~104ng/ml 농도의 SK 또는 FBD-SK 복합체의 부분표본을 거기에 첨가하였다.
37℃에서 밤새 보온한 후, 용해 영역을 측정하였다.
[제35도]
[기니아 피그 트랜스글루타미나제에 의해 촉매된 [14C] 푸트레신의 FBD 또는 FBD-SK 복합체에의 혼합]
6μM FBD SK 또는 FBD-SK 복합체, 0.05u/ml 트랜스글루타미나제, 6μM[14C] 푸트레신, 6μM 냄 푸트레신, 50mM 트리스 HCl(pH 7.5) 및 10mM CaCl2를 이용하여 실온에서 30분간 분석을 행하였다.
20mM EDTA(점선)이나 5mM DTT(긴 점선)을 함유하는 대조에 대해서도 분석을 행하였다.
()SK, (▣) FBD, (□) FBD-SK 복합체.
[발명의 상세한 설명]
플라스미드 pFN 975-25, pFN 949-2, pFN 137-2 및 pFN 196-2는 특허출원 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약의 요건에 따라 그 요건을 만족시키는 조건하에, 미국 매릴랜드 20852, 록빌 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐콜렉션(American Type Culture Collection : ATCC)에 각각 수탁번호 67832, 67831, 67910 및 68328로 기탁되어 있다.
비슷하게, 본 출원서류에 언급된 다른 많은 ATCC 기탁 미생물들도 또한 부다페스트 조약의 요건에 따라 그 요건을 만족시키는 조건하에 기탁되어 있다.
인간 피브로넥틴의 일차 서열은 세가지 형태의 상동 반복서열, 즉 타입 I, II 및 III 으로 형성되어 있다는 것이 밝혀져 있다.
겉보기 분자량이 31KD이고 259 아미노산으로 이루어진 피브린-결합 도메인(FBD)은 다섯개 미만의 타입 I 반복서열(핑커(finger))로 이루어져 있는데, 이들 반복서열은 각각 두개의 디설파이드 결합을 갖는 약 45아미노산으로 되어있으며, 단백질의 N-과 C-말단 각각에서 약 20 아미노산으로 된 두개의 가지에 연결되어 있다. 피브로넥틴의 도메인들과 제작된 재조합 분자들의 총괄적인 개략도는 제1도에 나타나있다.
본 발명에서 청구되고 있는 재조합 피브린-결합 도메인(FBD)폴리펩티드는 피브린 결합 도메인(r20 KD, r18.5 KD 및 r12 KD 폴리펩티드)의 폴리펩티드 단편을 함유한다.
이들 폴리펩티드들은 31KD 폴리펩티드보다 작으며, 피브린 결합 도메인 서열의 일부를 포함한다.
피브린 결합 도메인의 많은 다른 폴리펩티드들은 본 출원서류에 기술한 플라스미드로 부터 제작된 부가적인 플라스미드들에 의해 당업계에 공지된 방법에 따라 발현될수 있으며, 이들 폴리펩티들은 본 출원서류에 기재된 방법에 따라 재폴딩, 재산화 및 정제될수 있다.
본 출원서류에 기재된 풀 랭쓰 재조합 피브린 결합 도메인(r31KD 폴리펩티드)은 카복시 말단에 arg-ala-ala-val의 서열을 갖는 피브로넥틴의 처음 26 아미노산을 포함한다.
모든 최종 폴리펩티드 및 FBD의 폴리펩티드 단편의 아미노 말단에는 부가적인 메티오닌 잔기가 존재한다.
혈장 피브로넥틴을 트립신으로 분해하여 얻은 혈장 피브린 결합 도메인은 피브로넥틴의 처음 259 아미노산을 함유하는데, 즉 카복시 말단에 아르기닌이 있고, 맨 처음에 코딩되어 있는 아미노산인 글루타민이 피로글루타메이트 잔기로 전환되어 있다.
r31KD 폴리펩티드는 상술한 다섯개의 타입 I 상동성 고리(또는 핑거), 즉 10개의 디설파이드 결합을 갖고 있는데, r20KD 폴리펩티드와 r18.5KD 폴리펩티드는 모두 세개의 고리, 즉 6개의 디설파이드 결합을 갖고, r12KD 폴리펩티드는 2개의 고리, 즉 4개의 디설파이드 결합을 갖는다.
이들 디설파이드 결합의 존재는, 올바른 디설파이드 결합을 갖는 올바르게 폴딩된 FBD 폴리펩티드를 얻고 정제하기 위해 개발된 재폴딩/재산화 공정의 필요성과 나아가 어려움을 설명한다.
올바르게 폴딩된 FBD 폴리펩티드는 생물학적으로 활성을 나타낸다.
즉, 이들은 피브린에 결합될수 있고, 부가적으로 r31KD 폴리펩티드는 스타필로코커스 아우레우스(Staphy lococcus aureus)에 결합될수 있다.
재조합 FBD 폴리펩티드는 세포 덩어리의 파괴후에 생산되는 펠릿의 형태로 얻어지는 봉입체내에서 생산할수 있다.
본 발명은 혈전의 영상화와 혈전 형성을 예방을 위해 사용되는, 피브로넥틴 피브린 결합 도메인(FBD)의 재조합 폴리펩티드 단편의 생산을 개시하고 있다.
이들 폴리펩티드들은 또한 약제를 혈전에 타게팅하기 위한 혈전용해제에 결합시킬 수도 있다.
FBD의 폴리펩티드 단편을 생산하는 재조합 세포는 FBD 폴리펩티드 단편을 코팅하는 DNA 서열이 재조합 DNA 기술에 의해 도입되어 있는 세포이면 어느것이든 무방하다.
이러한 세포는 DNA 서열을 발현하고 폴리펩티드 산물을 생산할수 있어야 한다.
이러한 세포는 포유동물 세포, 효모 세포같은 균류세포, 또는 세균 세포일수 있다.
세균 세포로는 영양요구성, 원영양요구성 및 용해성 균쥬, F+와 R-균주,프로파아지의 cI857 리프레서 서열을 보유하는 균주 및 deo 리프레서 또는 deo 유전자가 결신된 균주를 비롯하여 그 어느 것이라도 무방하다.
야생형 에세리키아 콜리주의 예로는 원영양요구성인 ATCC 12435호 균주와 영양요구성인 MC 1061(ATCC 수탁번호 67361호)균주를 들수있다.
cI857 리프레서 서열을 보유하는 에세리키아 콜리 균주의 예는 플라스미드 pTV R 279-8을 보유하는 영양요구성 주 A1645(ATCC No. 53216), 플라스미드 pTV 104(2)를 보유하는 영양요구성 A1637주(ATCC No. 39384), 플라스미드 pSOD2를 보유하는 영양요구성 A2097주(ATCC No. 39786), 플라스미드 pFN 975-25를 보유하는 원영양요구성 A4255주(ATCC No. 67832) 및 플라스미드 pHG44를 보유하는 비오틴-독립성 A4346주(ATCC No. 53218)이다.
용해성 에세리키아 콜리주의 예는 플라스미드 pHG44를 보유하는 A4048주(ATCC No. 53217)이다.
F-균주의 예는 플라스미드 pMF 5534를 보유하는 에세리키아 콜리 S930(F-)(ATCC No. 67703) 및 플라스미드 pMFS 929를 보유하는 에세리키아 콜리 W31100(F-)(ATCC No. 67705)이다.
deo 유전자 또는 deo 리프레서가 결실된 에세리키아 콜리주의 예는 플라스미드 pMF 2005를 보유하는 S732주(ATCC No. 67362), 플라스미드 pJBF 5401을 보유하는 S540(ATCC No. 67359) 및 플라스미드 pEFF 920을 보유하는 S930(ATCC No. 67706)(유럽특허출원 공개 제0303972호, 1989년 2월 22일 공개0이다.
본 발명의 플라스미드는 적절한 세균 숙주세포, 바람직하게는 에세리키아 콜리내로 도입될수 있다.
적절한 에세리키아 콜리 세포의 예는 A4255(F+)[ATCC 수탁번호 67832]이지만, 다른 에세리키아 콜리 주와 다른 세균들도 플라스미드의 숙주세포로 사용될수 있다.
상살훈 모든 에세리키아 콜리 숙주 균주들은 당업게에 주지된 방법, 예를들면 문헌[R.P. Novick, Bacteriol. Rev33 : 210(1969)]에 기재된 방법에 따라 그들이 보유하는 플라스미드를 정착(cured)시킬수 있다.
세균 세포들은 FBD 폴리펩티드를 코딩하는 FBD 서열을 플라스미드 같은 벡터 DNA 분자내에 갖고 있을 수 있다.
벡터나 플라스미드는 FBD 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 분자내의 적절한 위치에 혼입될수 있도록 재조합 DNA 기술에 의해 제작된다.
FBD 폴리펩티드의 생산에 사용하기 위한 플라스미드는프로모터나 deo 프로모터 같은 각종 프로모터를 보유할 수 있다.
FBD 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있는 플라스미드들은 다음과 같다; a)r31KD FBD를 발현하며 에세리키아 콜리 주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 67832호 기탁되어 있는 플라스미드 pFN 975-25; b) r20KD FBD를 발현하며 에세리키아 콜리주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 67831로 기탁되어 있는 플라스미드 pFN 949-2; c) r12KD FBD를 발현하며 에세리키아 콜리주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68328로 기탁되어 있는 플라스미드 pFN 196-2; d) 변형된 12KD FBD 폴리펩티드를 발현하며 본 출원서류의 제11도에 기술되어 있는 플라스미드 pFN 197-10; e) 서열 DGRGDS에 융합되어 있는 r31 KD 폴리펩티드를 발현하며, 본 출원서류의 제13도에 기술되어 있는 플라스미드 pFN 195-4; f)PL과 CⅡ rbs의 통제하여 12KD FBD 폴리펩티드를 발현하며 본 출원서류의 제26도에 기술되어 있는 플라스미드 pFN 201-3; g)PL과 CⅡ rbs의 통제하에 12KD FBD 폴리펩티드를 발현하며 ter라고 명명된 전사 터미네이터를 더 함유하고 있고, 본 출원서류의 제27도에 기술되어 있으며, 에세리키아 콜리주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68606으로 기탁되어 있는 플라스미드 pEN 203-2; h) 피브로넥틴 세포-결합 도메인(CBD)의 33KD 단편에 융합되어 있는 31KD 풀-랭쓰 FBD 폴리펩티드를 함유하는 64KD 폴리펩티드를 발현하며, 본 출원서류의 제25도에 기술되어 있는 플라스미드 pEN 205-5; i) 18.5KD FBD 폴리펩티드를 발현하고 본출원서류의 제23도에 기술되어 있으며, 에세리키아 콜리주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68456으로 기탁되어 있는 플라스미드 pEN 208-13; j) 상기 플라스미드에 의해 코딩되는 FBD 서열을 함유하는, 상기 플라스미드에서 유도된 모든 플라스미드; 및 k) 상기 플라스미드에 의해 코딩되는 FBD 서열을 함유하는 모든 플라스미드.
본 발명은 영상화 가능한 마커에 의해 포지화 되어있고, 천연의 인간 피르보넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고 피르린 결합능이 있는 폴리펩티드를 함유함을 특징으로 하는 영상화제를 제공한다.
본 발명은 또한 영상화에 유효한 양의 상기 영상화제와 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물을 제공한다.
영상화 가능한 마커에 의해 표지화된 단백질은 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인의 폴리펩티드 단편일 수 있으며; 이들은 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산할 수 있거나; 또는 DNA 합성장치내에서 합성된 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
본 출원인은 이러한 폴리펩티드중 세가지 예시를 나타냈으며, 바람직한 구현예는 18.5KD와 12KD 폴리펩티드이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖는 이란 용어는, 즉 천연의 대립형질성변형 및 부위 특이적 변이 같은 재조합적 변형을 포함한다.
이러한 모든 변형은 본 출원인의 폴리펩티드에 포함되는데, 피브린에의 결합능만이 유일한 제한인자이다.
사용되는 영상화 가능한 마커는 당업자가 선택하기 나름이다.
마커는 방상성 동위원소, X-선을 통과시키지 않는 원소 또는 상자성 이온인 것이 바람직하다.
방사성 동위원소는 의료분야에서 널리 사용되며 당업자에게 주지되어 있다.
마커로는 임듐-111, 테크네튬-99m, 요오드0123, 요오드-125, 요오드-131, 크립톤-81m, 크세논-133 또는 갈륨-67, 또는 이들의 혼합물들이 바람직하다.
가장 바람직하게는 마커는 테크네튬-99m 또는 인듐-111이다.
검출 가능한 마커는 또한 상자성 이온일수 있다.
상자성 이온 역시 의료분야에서 통상적으로 사용된다.
이러한 마커의 예는 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 닉켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 프라세오디뮴(Ⅲ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 기도리늄(Ⅲ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ), 에르븀(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ)의 킬레이트화 금속 이온 또는 이들의 혼합물이다.
바람직하게는, 영상화제는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하여, 제2도에 나타낸 아미노산 1∼153의 아미노산 서열과 약 20개의 부가적인 아미노산을 갖는 20KD 폴리펩티드; 또는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하면 제2도에 나타낸 아미노산 서열 1∼154의 아미노산 서열을 갖는 18.5KD 폴리펩티드; 또는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 서열 1∼109의 아미노산 서열을 갖는 12KD 폴리펩티드를 함유한다.
부분적 아미노산 서열 분석법에 의해, 본 발명자들은 이미 전술한 바있는 31KD 폴리펩티드뿐만아니라 12KD와 20KD 폴리펩티드들도 모두 부가적인 N-말단 메티오닌을 포함하고 있음을 밝혀내었다.
FBD의 모든 폴리펩티드 단편들은 동일한 N-말단 서열을 갖기 때문에, 18.5KD, 45KD와 64KD 폴리펩티드들도 부가적인 N-말단 메티오닌을 가질 것으로 추측할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 청구된 화합물들은 부가적인 N-말단 메티오닌을 갖지 않는 폴리펩티드들도 포함한다.
본 발명은 또한 영상화체가 피브린-함유 물질에 결합되는 조건하에서 영상화 하고자 하는 피브린-함유 물질과 영상화제를 접촉시키고, 결합된 영상화제를 영상화하여 피브린-함유 물질을 영상화함을 특징으로 하는, 피브린-함유 물질, 즉 혈전 또는 동맥경화성 플라크의 영상화 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 또한 (a) 영상화제 조성물내의 영상화제가 혈류로 들어가 혈관중에 존재하는 피브린에 결합될수 있는 조건하에 상술한 영상화제 조성물을 피투여자에게 투여하고; (b) 혈관내에 있는 결합된 영상화제를 영상화하며; 그럼으로써 (c) 피브린-함유 물질을 영상화함을 특징으로 하는 피투여자내의 피브린-함유 물질을 영상화하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상술한 피브린-함유물질의 영상화방법에 사용된 시약의 폴리펩티드는 인간 피브로넥틴의 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼153의 아미노산 서열을 갖는 20KD 폴리펩티드; 약 20개 미만의 부가적인 아미노산을 포함하는 20KD 폴리펩티드; 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며, 제2도에 나타낸 아미노산 1∼154의 아미노산 서열을 갖는 18.5KD 폴리펩티드; 또한 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼109의 아미노산 서열을 갖는 12KD 폴리펩티드이다.
상술한 피브린-함유 물질을 영상화하는 방법에서 사용되는 바람직한 마커는 방사성 동위원소, X-선을 투과시키지 않는 원소 또는 상자성 이온이다.
가장 바람직한 마커는 인듐-111, 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 크립톤-81m, 크세논-133과 칼륨-67 같은 방사성 동위 원소이다.
영상화 공정은 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 실시할 수 있다.
이러한 방법으로는 X-선, CAT 스캐닝, PET 스캐닝, NMRI 및 형광분광법등의 포함되지만 이들에만 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 방법에 의한 피브린-함유 물질의 영상화는 감마 카메라를 이용하여 수행한다.
본 발명에 따르면 또한 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산을 갖고, 피브린 결합능이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 이 폴리펩티드-코딩 DNA에 대하여 적절한 숙주 세포내에서 상기 폴리펩티드의 발현을 수행할수 있도록 하는 위치에 놓여있는 적절한 조절 요소를 코딩하는 DNA를 함유함을 특징으로 하는 폴리펩티드 발현용 플라스미드가 제공된다.
본 출원인은 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 있는 세가지의 폴리펩티드 단편의 예를 제공하였다.
이들로는 r20KD, r18.5KD 및 r12KD 폴리펩티드가 포함된다.
이들 폴리펩티드들은 천연의 인간 피브로넥틴의 일부에 결합 및 부착되는 특성을 나타낸다.
본 출원의 특허청구의 범위의 범위는 이들 세가지의 FBD 폴리펩티드 단편에 의해 제한되지 않는다.
이들 예는 단지 바람직한 구현예일 뿐이다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 피브로 넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 20KD 폴리펩티드; 인간 피브로 넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 약 18.5KD의 폴리펩티드; 또는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 약 12KD의 폴리펩티드이다.
보다 바람직한 구현예에서는, 폴리펩티드는 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼154의 아미노산 서열을 갖는 18.5KD 폴리펩티드; 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아ㅁ노산 1∼153의 아미노산 서열을 갖는 20KD 폴리펩티드; 약 20개 미만의 부가적인 아미노산을 포함하는 20KD 폴리펩티드; 또는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인중에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼109의 아미노산 서열을 갖는 12KD 폴리펩티드이다. 상술한 대로, 상기 폴리펩티드들은 부가적인 N-말단 메티오닌을 가질수 있다. 그러나, 본 발명의 특허청구의 범위는 부가적인 N-말단 메티오닌을 갖지 않는 폴리펩티드들도 포함한다.
천연의 인간 피브로넥틴은 인체(혈장)에 존재하는 그대로의 피브로넥틴이다.
본 출원서류 전반에 걸쳐, 실질적인 부분은 적어도 1/5이다.
천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드는, 그 활성을 분석하거나 측정해보면 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인의 것과 유사한 결합 또는 부착 특성을 나타낸다.
본 발명에 있어서는, 도메인들을 코딩하는 cDNA를 제한효소로 분해하여 각종 기능성도메인의 아미노산 서열을 결정하였으며, 이 아니모산 서열을 피브로 넥틴을 단백분해법에 의해 얻고 결정한 도메인의 아미노사 서열에 반드시 상응할 필요는 없다. 본 발명의 플라스미드는 또한 적절한 숙주세포내에서 폴리펩티드를 발현시킬수 있도록 폴리펩티드-코딩 DNA에 대해 위치하고 있는 적절한 조절 요소들, 예를들면 λPLOL같은 프로모터와 오퍼레이터, CⅡ같은 리보솜 결합 부위 및 리프레서를 포함한다.
그외 다른 적절한 조절 요소로는 예를들면 lac, trp, tac, lpp 및 deo 프로모터들이 포함된다(유럽특허출원 고개 제0303972호, 1989년 2월 22일 공개).
적절한 조절 요소들은 적절한 세균 숙주세포내에서 폴리펩티드를 발현시킬수 있도록 폴리펩티드-코팅 DNA에 대하여 위치해 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 조절 요소들은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 가깝게 상류에 위치해 있다.
본 발명에 따르면, pEN 949-2로 명명되고, 에세리키아 콜리 주 A1645에 도입되어 ATCC 수탁번호 67831로 기탁되어 있는 플라스미드가 제공된다.
플라스미드 pEN 949-2는 제2도의 아미노산 1∼153과 부가적인 N-말단 메티오닌, 그리고 20개 미만의 부가적인 아미노산을 포함하는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합도메인의 20KD 폴리펩티드 단편을 코딩한다.
본 발명에 따르면, 또한 pEN 196-2로 명명되고, 에세리키아 콜리주 A4255에 도이비 되어 ATCC 수탁번호 68328로 기탁되어 있는 플라스미드가 제공된다.
플라스미드 pEN 196-2는 아미노산 1∼109를 포함하는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인의 12KD 폴리펩티드 단편을 코딩한다.
본 발명에 따르면, pEN 208-13으로 명명되고, 에세리키아 콜리 A4255에 도입되어 ATCC 수탁번호 68456으로 기탁되어 있는 플라스미드가 제공된다.
플라스미드 pEN 208-13은 제2도의 아미노산 1∼154를 함유하는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합도메인의 18.5KD 폴리펩티드 단편을 코딩하며, 상술한대로 부가적인 N-말단 메티오닌을 갖는 것으로 추정할 수 있다.
본 발명에 따르면, pEN 203∼2로 명명되고, 에세리키아 콜리 A4255에 도입되어 ATCC 수탁번호 68606으로 기탁되어 있는 플라스미드가 제공된다.
플라스미드 pEN 203-2는 제2도의 아미노산 1∼109 및 부가적인 N-말단 메티오닌을 포함하는 인간 피브로넥틴의 피브린-결합 도메인의 12KD 폴리펩티드를 발현한다.
본 발명에 따르면, 피브로넥틴 CBD(제25도에 기술)의 33KD 단편에 융합되어 있는 31KD 풀-랭쓰 FBD 폴리펩티디ㅊ를 함유하는 64KD 폴리펩티드를 발현한다.
상기에서 논의한 대로, 본 발명의 플라스미드에 의해 생산되는 폴리펩티드 모두는 부가적인 N-말단 메티오닌을 포함하는 것으로 추정할 수 있다.
현재로서 바람직한 구현예에서는, 본 발명은 pEN 975-25로 명명된 플라스미드를 함유하며 ATCC 수탁번호 67832로 기탁되어 있는 에세리키아 콜리 세포; pEN 949-2로 명명된 플라스미드를 함유하며 ATCC 수탁번호 67831로 기탁되어 있는 에세리키아 콜리 세포; pEN 196-2로 명명된 플라스미드를 함유하며 ATCC 수탁번호 68328로 기탁 되어있는 에세리키아 콜리 세포; pEN 203-2로 명명된 플라스미드를 함유하여 ATCC 수탁번호 68606으로 기탁되어 있는 에세리키아 콜리 세포; 및 pEN 208-13으로 명명되고 ATCC 수탁번호 68456으로 기탁되어 있는 에세리키아 콜리 세포르 제공한다.
본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA-함유 플라스미드를 포함하는 세포를 DNA가 폴리펩티드의 발현을 감독하고 세포가 폴리펩티드를 발현할 수 있도록 처리하고 세포로 부터 이렇게 발현된 폴리펩티드를 회수함을 특징으로 하는, 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고 피브린 결합능이 있는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 이렇게 하여 생산된 폴리펩티드는 피브린 결합 도메인중 18.5KD, 20KD 또는 12KD 폴리펩티드 단편이다.
본 발명에 따르면, 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린 결합능이 있으며, 인간 유래의 다른 물질들이 실질적으로 함유되어 있지 않는 정제된 폴리펩티드가 제공된다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼153의 아미노산 서열을 갖는 20KD 폴리펩티드; 약 20개 미만의 부가적인 아미노산을 포함하는 20KD 폴리펩티드; 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도의 아미노산 1∼154의 아미노산 서열을 갖는 18.5KD 폴리펩티드; 또는 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하며 제2도에 나타낸 아미노산 1∼109의 아미노산 서열을 갖는 12KD 폴리펩티드이다.
상기에서 논의한 대로, 이들 폴리펩티드들은 부가적인 N-말단 메티오닌을 포함한다.
그러나, 본 발명에서 청구한 화합물들은 부가적인 N-말단 메티오닌을 함유하지 않는 폴리펩티드들도 포함한다.
이들 짧은 FBD 폴리펩티드 단편, 즉 20KD, 18.5KD 및 12KD는 31KD FBD 폴리펩티드에 비해 유리하다.
이들은 31KD 폴리펩티드와 비교할때, 31KD 폴리펩티드와 유사한 피브린 결합 활성을 유지하면서 쉽게 재폴딩되며, 세균의 결합 도메인을 갖지 않고, 상피 세포, 세포외 매트릭스 및 피브로넥틴같은 기타 혈관 성분에 대한 결합 특이성이 훨씬 감소되어 있다.
본 발명은 또한 천연의 인간 피브로넥틴의 세포 결합 도메인의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 함유하고 있는 두번째 폴리펩티드에 융합되어 있으며, 인간 유래의 다른 성분들은 실질적으로 함유되어 있지 않는 정제된 폴리페티드를 제공한다.
바람직하게는, 융합된 폴리펩티드는 45KD 융합 폴리펩티드이며, 정제된 폴리펩티드는 12KD 폴리펩티드이고, 천연의 인간 피브로넥틴의 세포 결합 도메인의 실질적인 부분을 포함하는 두번째 폴리펩티드는 33KD 폴리펩티드이다.
이 융합된 폴리펩티드는 또한 31KD의 정제된 폴리펩티드와, 아미노산 서열 DGRGDS를 포함하는 두번째 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 또 다른 바람직한 융합 폴리펩티드는 64KD의 융합 폴리펩티드로서, 이 융합 폴리펩티드는 31KD의 폴리펩티드인 정제된 폴리펩티드와, 천연의 인간 피브로넥틴의 세포결합 도메인의 실질적인 부분을 함유하는 33KD 폴리펩티드인 두번째 폴리펩티드로 이루어져 있다.
본 발명은 또한, 상술한 바와 같이 45KD의 융합 단백질을 발현하기 위한 플라스미드(pFN 202-5로 명명), 상술한 31KD/GRGDS 융합 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드(pFN 195-4로 명명); 및 상술한 64KD의 융합 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드(pFN 194-2로 명명)를 제공한다.
본 출원서류 전반에 걸쳐 사용된 융합된 또는 결합된은 공유적으로, 비공유적으로 결합되어 있거나 또는 접합되어 있는 폴리펩티드들을 포함한다.
폴리펩티드는 당업계에서 널리 사용되고 있으며 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진자에게 주지되어 있는, 아미노산 또는 폴리펩티드 교차 결합제를 비롯한 기타 화학적 시약을 통하여 접합될 수 있다.
방사능 표지화(동위원소의 핵 의약적 이용), 방사능-불투과성 표지화(CAT 스캐닝) 및 자기공명 영상화(MRI)같은 각종 방법이 혈전의 검출분야에 공지되어 있다.
본 발명에 있어서, 혈전을 검출하기 위한 방법에 있어서, 이들 표지화 방법중 어느것도 이용할 수 있다.
이들 검출방법중 각각에 있어서, 폴리펩티드는 혈전을 검출하기 위한 진단제로 사용된다.
본 발명에 따르면, 디설파이드의 존재 또는 부재하에 폴리펩티드와 티올-함유 화합물을 접촉시켜 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시킴으로 특징으로 하는, 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산을 갖지만 천연의 인간 피브로넥틴의 디설파이드 결합이 결핍되어 있고 피브린 결합능을 갖는 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시키는 방법이 제공된다.
바람직하게는 티올-함유 화합물은 글루타치온, 티오레독산,-머캅토에탄올 및 시스테인으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는, 티올-함유 화합물은-머컵토에탄올이며, 공기를 도입하여 현장에서 디설파이드를 생산한다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 18.5KD 폴리펩티드, 20KD 폴리펩티드, 12KD 폴리펩티드 및 45KD 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
33KD CBD에 융합된 12KD FBD로 이루어진 45KD 키메라 폴리펩티드는 보다 작은 FBD 폴리펩티드에서와 완전히 동일한 방법을 이용하여 재폴딩 및 재사화시키다.
재폴딩 및 재산화시키는 방법은 부가적으로 폴리펩티드와 변성제를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 변성제는 구아니딘 히드로클로라이드와 우레아이다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 1,000㎍/㎖ 이하의 낮은 농도로 사용된다.
본 발명은 또한, (a) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 발현시켜 세균 세포내에 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖지만 디설파이드 결합이 결핍되어 있는 첫번째 폴리펩티드를 생산하고; (b) 세포를 파쇄하여 첫번째 폴리펩티드를 함유하는 분해액을 얻고, (c) 분해액을 원심분리하여 첫번째 폴리펩티드를 농축하고; (d) 농축된 첫번째 폴리펩티드를 분리하고; (e) 분리 및 농축된 첫번째 폴리펩티드를 용해시키고; (f) 가용화한 첫번째 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시켜 생물학적으로 할성을 갖는 폴리펩티드를 형성하고; (g) 재폴딩 및 재산화된 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리하고; (h) 정제, 재폴딩 및 재산화된 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하고; 및 (i) 이렇게 회수한 생물학적으로 활성을 갖는 폴리누클레오티드를 정제함을 특징으로 하는 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고 피브린 결합능이 있는 생물학적으로 활성을 갖는정제된 폴리펩티드를 회수하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 재폴딩 및 재산화 단계는 디설파이드의 존재 또는 부재하에 폴리펩티드를 티올-함유 화합물과 접촉시켜 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시키는 것을 포함한다.
바람직하게는, 티올-함유 화합물은 글루타치온, 티오레독신,-메캅토에탄올 및 시스테인으로 이루어진 군으로 부터 선택된다.
한가지 바람직한 구현에에서, 티올-함유 화합물은-머캅토에탄올이며, 공기를 도입하여 디설파이드를 현장에서 제조한다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 18.5KD 폴리펩티드, 20KD 폴리펩티드, 12KD 폴리펩티드 및 45KD 폴리펩티드로 이뤄진 군에서 선택된다.
33KD CBD에 융합된 12KD FBD로 이루어진 45KD 카메라 폴리펩티드는 보다 작은 FBD 폴리펩티드에서와 완전히 동일한 방법을 이용하여 재폴딩 및 재산화시킨다.
재폴딩 및 재산화시키는 방법은 폴리펩티드와 변성체를 접촉시키는 단계를 부가적으로 포함할 수 있다.
바람직한 변성제는 구아니딘 히드로클로라이드와 우레아이다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 1,000㎍/㎖ 이하의 낮은 농도로 사용된다.
바람직하게는, 단계(c)에서 농축된 폴리펩티드를 분리함에 있어서, 크로마토그래피, 바람직하게는 헤파린-세파로스 크로마토 그래피를 행한다.
본 발명은 또한, 혈전 형성이 일어나기 쉬운 피투여자에게 혈전 형성을 억제하기에 유효한 양의(상술한 폴리펩티드와 융합 폴리펩티드로 부터 선택된)폴리펩티드를 투여함을 특징으로 하는, 혈전 형성이 일어나기 쉬운 피투여자에 있어서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공한다.
폴리펩티드는 환원시키거나, 또는 재산화를 방지하기 위하여 카복시메틸화 또는 카복사미도메틸화 반응에 의해 S-H기를 차단할수 있다.
본 발명은 또한 혈전용해제를 타게팅하기 위해, 혈전옹해제에 결합된 상술한 폴리펩티드를 제공한다.
혈전 용해제는 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA), 우로키나제, 스트렙토키나제, 프로우로키나제, 아니조일화 플라스미노겐-스트렙토키나제 활성화인자 복합체(에미나제TM, EminaseTM), TPA 유사체 또는 프로테아제로 부터 선택할 수 있다.
본 발명의 한가지 구현예에서, 폴리펩티드는 천연의 인간 피브로넥틴의 피브린결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖고, 피브린에 결합할 수 있으며, 약 6KD 내지 약 20KD의 분자량을 갖고, 폴리펩티드의 N-말단에 아미노산 서열 gln-ala-gln-gln 또는 met-gln-ala-gln-gln을 가지며, 혈전 용해제는 스트렙토키나제이다.
바람직한 구현에에서는, 폴리펩티드는 12KD 폴리펩티드이고, 혈전용해제는 스트렙토키나제이다.
본 발명에 따르면, 혈전 용해가 일어나기에 유효한 양의 혈전 용해제에 결합된 폴리펩티드를 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 혈전을 용해시키는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 인간 유래의 다른 물질이 실질적으로 함유되어 있지 않고, 천연의 인간 피브로 넥틴에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 가지며, 피브린 결합능이 있으면서, 천연의 인간 피브로 넥틴의 세포 결합 도메인의 실질적인 부분을 함유하는 폴리펩티드에 접합되어 있는 정제된 폴리펩티드를 상처를 치료하는데 유효한 양으로 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는, 상처의 치료방법을 제공한다.
이 방법의 한 구현예에서는, 세포 결합 도메인 폴리펩티드는 40KD 폴리펩티드 또는 33KD 폴리펩티드이다.
본 발명에 따르면, 또한 인간 유래의 다른 물질이 실질적으로 함유되어 있지 않고, 천연의 인간 피브로 넥틴에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열을 가지며, 피브린 결합능이 있으면서, 천연의 인간 피브로 넥틴의 세포 결합 도메인의 실질적인 부위를 함유하는 두번째 폴리펩티드에 융합되어 있는 정제된 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드를 피투여자의 처지에 유효한 양으로 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 상처의 치료방법이 제공된다.
이 방법의 한 구현예에서는, 융합돈 폴리펩티드는 그의 폴리펩티드는 12KD 폴리펩티드이고, 두번째 폴리펩티드는 33KD 폴리펩티드인 45KD의 폴리펩티드일 수 있다.
또 다른 구현예에서는, 융합된 폴리펩티드는, 그의 폴리펩티드는 31KD 폴리펩티드이고 두번째 폴리펩티드는 33KD, 폴리펩티드인 64KD의 융합 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 치료되는 상처의 피부의 상처, 절개된 상처, 피부의 결손 상처, 피부 이식 상초 또는 화상일 수 있다.
상처는 또한 눈의 상처일수 있는데, 눈의 상처란 각막 상피 세포의 상처 또는 각막간질의 상처등이다.
나아가, 상처는 힘줄의 손상일 수 있다.
[실시예]
지도의 위치에 관한 모든 부호들은 제2도에 나타낸 인간 피브로넥틴 cDNA의 누클레오티드 서열을 따라 동일하게 번호를 매긴 위치와 상응한다(배럴의 유럽특허 207,751호, 1987년 1월 7일 간행).
본 특허출원은 N-말단의 피브린 결합 도메인(FBD)의 폴리펩티드 단편에 관한 것이다.
31KD 폴리펩티드를 이용한 실험 결과는, 보다 짧은 단편과 비교하기 위해 제시하였다.
설명된 폴리펩티드중 몇몇은 세포 결합 도메인(CBD)의 N-말단에 그의 C-말단이 연결된, FBD 단편을 함유하는 융합 단백질이다.
본 출원인이 클로닝 및 발현시킨 CBD에 해당하는 cDNA 서열을 배럴 지도상에서, 누클레오티드 4811∼5080(양 말단 포함)에 걸쳐있는 270bp의 여분 도메인(ED)이 결손되어 있다(제2도 참조).
따라서 cDNA 서열을 누클레오티드 4811∼5080(양 말단 포함)이 결여되어 있기 대문에 배럴 지도상에서 누클레오티드 3317∼5566에 뻗어있다고 말해지는 cDNA 서열은 ED 절편의 270 누클레오티드를 포함하고 있으며, 상기 영역은 당업계에서 ED-A 영역으로 알려져있다.
누클레오티드 5081이 G에서 A로 변경되었기 때문에, 아미노산 1690은 알라닌에서 트레오닌으로 변경되어 있다.
비슷하게 상기 DNA 단편에 의해 발현되는 폴리펩티드는 배럴 지도상에서 아미노산 1102∼아미노산 1851을 포함하지만 ED 영역에 의해 코딩되어 있는 90 아미노산, 즉 아미노산 1600∼1689(양 말단포함)은 결여되어 있으며, 따라서 660개의 아미노산만을 포함한다.
이러한 것은, ED 영역에 걸쳐있는 본 출원서류에 기재된 모든 CBD 단편의 경우에도 적용한다(당업계에서 ED-B 영역으로 알려져 있는 이 영역은 배럴의 서열과 본 출원인의 cDNA 모두에 있어 결여되어 있다).
위치 3317에 나타낸 EcoR I 절단부위는 본 출원인이 EcoR I 링커를 이용하여 클로닝 과정중에 제작한 것이다.
3313∼3318 위치에 있는 GAATTC 서열은 대응하는 배럴 사열 GATTC와는 하나의 누클레오티드가 상이하다.
이에 의해서 누클레오티드 3315에서 하나의 누클레오티드 C가 A로 변화된다.
이 변화는 대응하는 아미노산 번호 1100을 Thr에서 Asn으로 변화시킨다.
[실시예 1]
[피브로넥틴 cDNA 라이브러리의 제조]
공지된 방법(13, 14)에 따라 인간의 간으로 부터 분리한 폴리 A+mRNA를 이용하여gt11에서 cDNA 라이브러리를 제조하였다.
EcoR I 링커를 이용하여 cDNA 단편을 클로닝하고, 다음의 합성 DNA 탐침을 이용하여 cDNA 라이브러리로 부터 피브로넥틴(FN) 양성 플라스미드를 스크리닝 하였다.
[세포 결합 도메인(CBD)용 탐침]
[N-말단 피브린 결합 도메인(FBD)용 탐침]
피브린, 콜라겐, 헤파린과 세포 결합 도메인의 전 영역을 포함하는 일련의 FN cDNA 클론을 동정 및 분리하였다(제9도).
cDNA 단편을 pBR322의 EcoR I 부위에 서브클로닝하였다.
FN의 mRNA는 다른 방식으로도 스플라이싱되며 따라서 문헌에 여러길이의 cDNA가 보고되어 있다.
세포 결합 도메인에 상응하는 본 출원인의 cDNA는 FN 물리적 지도(전혀 스플라이싱 되지 않는 완전한 cDNA)상에서 염기 4811∼염기 5080의 270 염기쌍이 결실되어 있다.
[실시예 2]
[피브린 결합 도메인(FBD) 폴리펩티드의 발현과 정제]
A. 부분적 FBD 20KD 폴리펩티드의 발현
실시예 1에서 기술한 대로 얻고 제9도에 나타낸 FN cDNA는 FN 분자의 아미노산 1∼190을 코딩하는 DNA를 함유하지 않는다.
이들 아미노산은 FBD의 일부분이다.
누클레오티드 14∼472에 해당하며 아미노산 1∼153을 코딩하는 DNA(제2a도)는 화학적으로 합성된 누클레오티드 7쌍(제3도 및 제4도)을 연결하여 제작하였다.
합성 DNA 단편은 5' 말단에 ATG 개시 코돈을 함유할 뿐만아니라 각종 발현 벡터 내에 도입하기 위한 통상의 제한 부위를 갖도록 설계하였다.
FBD를 코딩하는 DNA 서열을 더 조작하기 위하여, 누클레오티드 번호 19인 티미딘(T)를 아데닌(A)로 변경시킴으로써 아미노산 서열은 변화시키지 않으면서 Dde I 제한부위를 제거할 수 있었다(누클레오티드가 변경된 부위는 제3a도에 나타낸 링커 ＃1에 별표를 하여 표시하였다).
EcoR I과 BamH I으로 분해시킨 pBR322 플라스미드 벡터내에 상기 합성 DNA 단편을 클로닝 하는 각종 단계를 제4도에 기술하였다.
얻어진 플라스미드는 pEN 932-18로 명명하였다.
플라스미드 pFN 923-18로 부터 얻는 피브로넥틴의 처음 153 N-말단 아미노산을 코팅하는 DNA 단편은PL발현 벡터인 pTV 301에서 Node I과 Bgl Ⅱ부위 사이에 삽입시켰는데 이에 의해 플라스미드 pTV 301내의 인간 성장 호르몬(hGH)-코딩 DNA 서열이 대치된다(제5도).
생성된 플라스미드 pFn 949-2는 아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션에 수탁번호 67831호 기탁되어 있다.
플라스미드 pFN 949-2는 에세리키아 콜리 원영양요구성 주A455를 형질 전환하는데 사용되었다.
이들 형질전환된 에세리키아 콜리 세포들은 총 세포 단백질중 약 5％에 해당하는 양으로 부분적 FBD 폴리펩티드를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
이 폴리펩티드는 표준 마커의 이동성을 기준으로하여 환원 SDS 폴리아크릴아미드겔상에서 결정하였을때 약 20KD의 이동성을 나타내었다.
이 폴리펩티드는 피브로넥틴의 처음 153 아미노산, 합성 링커에 의해 코딩되는 4 아미노산 및 TAA 종결 코돈이 없어서 pBR 322 벡터까지 발현된 것에 기인하는 4개의 아미노산을 차례로 함유한다.
즉, 총 153 아미노산과 20개의 부가적인 아미노산 및 부가적인 N-말단 메티오닌을 함유한다.
본 출원서류 전반에 걸쳐, 이 폴리펩티드는 r20KD 폴리펩티드 또는 R20KD FBD로 표시하였다.
B. 완전한 FBD 폴리펩티드의 발현
아미노산 1∼262를 함유하는 완전한 FBD 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 다음의 플라스미드를 제작하였다:
1. 종결코돈 TAA의 3' 말단에의 삽입
TAA 종결코돈과 Bgl Ⅱ 부위를 갖는 하기 서열:
의 합성 올리고누클레오티드를 FC cDNA 클론 p931-5에서 분리한 EcoR I-Pvu Ⅱ 단편의 3' 말단 및 제6도에 기술된대로 EcoR I과 BamH I으로 분해시킨 pBR322 벡터에 연결하였다.
얻어진 플라스미드는 pFN 935-12로 명명하였다.
2.PL발현 벡터내에서 FBD의 카복시 말단의 서브클로닝
플라스미드 pFN 935-12로 부터 FBD의 카복시 말단 영역을 코딩하는 EcoR I-Hind Ⅱ DNA 단편을 분리하고, 본 출원인과 동일한 출원인에게 양도되어 있는 PCT 공개 제 WO 90/07577호(제46도)에 기술된 대로 EcoR I과 Sma I으로 분해시킨 플라스미드 pTV 194-80에 연결하였다.
얻어진 플라스미드는 pFN 946-12로 명명하였다.
3. FN의 누클레오티드 468∼599에 해당하는 DNA의 합성 및 클로닝
상기한 언급한 PCT 공개(제47도)에 상세히 기술되어 있는대로 EcoR I과 Xba I으로 분해시킨 pUC19 벡터 DNA(GIBCO BRL Co. 에서 구입)의 존재하에서, 플라스미드 pFN 932-18에서 분리한 EcoR I-Dde I FN 단편에 화학적으로 합성한 누클레오티드 3쌍을 연결하였다(제4도).
얻어진 플라스미드는 pFN 948-4로 명명하였다.
4. 완전한 FBD 영역을 코딩하는 플라스미드의 제작
아미노산 1∼아미노산 262에 이르는 완전한 FBD를 코딩하는 플라스미드를 제작하기 위하여, FN을 코딩하는 EcoR I-Xba I DNA 단편을 플라스미드 pFN 948-4에서 분리하고, 상기 언급한 PCT 공개(제48도)에 기술된 대로 EcoR I과 Xba I으로 분해시킨 플라스미드 pFN 946-12에 삽입하였다.
얻어진 플라스미드는 pFN-957로 명명하였다.
이 플라스미드는 FBD의 완전한 코딩 서열을 함유하지만, 리보솜 결합 부위(RBS)가 없기 때문에 FBD 폴리펩티드를 발현하지 않는다.
5.PL프로모터와 C Ⅱ RBS하의 FBD의 발현
FBD 코딩 영역과 T1T2전사 터미네이터를 함유하는 Nde Ⅰ-Hind Ⅲ 단편을 플라스미드 pFN 957로 부터 분리하고, 상기 언급한 PCT 공개(제49도)에 기술된 대로 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 분해시킨 플라스미드 pTV 301에 삽입하였다.
pFN 962-3으로 명명된 생성된 플라스미드는PL프로모터와 CⅡ 리보솜 결합부위의 통제하에 FBD 폴리펩티드를 발현한다.
이 플라스미드에 의해 형질전환된 에세리키아 콜리주 A 1645와 A 4255는 소량의 FBD 폴리펩티드만을 발현한다.
FBD 폴리펩티드의 발현은 인간 혈장 유래 FN에 대한 폴리클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해서만 검출 가능하다.
6.PL 프로모터,-락타마제 프로모터와 리보솜 결합 부위의 통제하의 FBD폴리펩티드의 발현
플라스미드 pFN 962-3에 의해 얻은 FBD 폴리펩티드의 발현율이 낮았기 때문에, 본 발명자들은-락타마제 프로모터가-락타마제 RBS(PBLA)를 코딩하는 DNA단편을 부가하였다.
플라스미드 pBLA11(ATCC 수탁번호 39788)로 부터 pBLA를 코딩하는 DNA 단편을 분리한후, Nde I으로 분해하고, 클레노프 효소로 염기쌍 메꿈을 하고 EcoRI으로 분해한 플라스미드 pFN 962-3(상기 언급한 PCT 공개)에 삽입하였다.
pFN 975-25로 명명된 얻어진 플라스미드는 아메리칸 타입 걸쳐 콜렉션에 수탁번호 67832호로 기탁되어 있다.
이 플라스미드는 에세리키아 콜리 원영양요구성주 A4255(F+)의 형질절환에 이용되었다.
이들 에세리키아 콜리 세포들은 총 세포 단백질의 약 5-8％에 해당하는 수준으로 완전한 FBD폴리펩티드를 발현하는 것을 밝혀졌다.
이 폴리펩티드는 환원 조건하에서 SDS-PAGE 겔상에서 겉보기 분자량 31KD로 이동하며, 따라서 31KD 폴리펩티드 또는 r31KD FBD로 명명하였다.
C. 배양 및 생육 조건
r31 KD FBD 폴리펩티드를 발현하는 클론을 암피실린-함유 풍부 배지(효모 엑기스와 카제인 기수분해물)에서 배양하였다.
생육은 30℃에서 실시하였다.
42℃에서 2시간 동안 유도시켜 발현이 이루어졌으며, 이어서 r31KD FBD 폴리펩티드를 함유하는 세균 균제가 얻어졌다.
비슷하게 r20KD FBD를 발현하는 클론을 배양하여 r20KD FBD 폴리펩티드를 함유하는 세균 균체를 얻었다.
D. 재조합 피브린 결합 도메인(r31 KD)폴리펩티드의 재폴딩 및 정체
이 방법은 다음 세 단계롤 이루어져 있다.
1. 세균 균체의 조 가공
2. 재폴딩/재산화
3. 정제
1. 조정제
균체를 먼저 50mM 트리스 HCl/50mM Na-EDTA, pH(완충액1) 5부피에서 파쇄하고, 이어 100㎎/l 리소자임을 함유하는 완충액 1 1.2부피로 펠릿을 처리하였다(37℃에서 2시간 동안 교반).
생성된 현탁액에 트리톤×100을 1%의 농도로 첨가하고, 30분후에 실온에서 그 현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 재현탁하고 물로 2회 세척하였다.
이들 모든 단계들은 펠릿을 파쇄하고, 원심분리하여 수행하였으며, SDS-PAGE 겔에서 입증되듯이 31KD가 펠릿에서 얻어졌다.
세척된 펠릿을 10mM 트리스-HCl/5mM EDTA/2mM PMSF/2mM 6-아미노카프로에이트, pH 7.5(완충액 A) 14부피에 현탁시키고, 이어서 1% 데실 설페이트, 1% 데실 설페이트/5% 글리세롤과 5% 글리세롤을 함유하는 완충액 A로 연속적으로 처리하였다.
첨가제없이 완충액 A를 이용하여 최종적으로 처리하였다.
2. 재폴딩/재산화
원리 : 글루타치온-GSH-같은 티올 환원제의 존재하에 6M 구아니딘-HCl-GuCl-에 펠릿을 용해시키고, 산화된 글루타치온-GSSG의 첨가에 의해 낮은 GuCl 농도에서 재폴딩/재산화시킨다.
상기 단계 1에서 얻어진 세척된 펠릿을 완충액 A에 용해시킨 6M GuCl/3mM GSH 150-170부피에 용해하였다.
부피를 제외하고 모든 다른 성분의 농도를 일정하게 유지하면서 GuCl의 농도를 서서히, 즉 처음에는 2M, 그다음에는 1M및 0.5M 등으로 낮춘다.
이 단계에서 부피는 펠릿의 부피보다 500-100배 높다.
GuGl의 중간 농도, 즉 0.5와 2M 사이에서, 0.3mM GSSG의 첨가 및 실온에서의 24-48 시간동안의 보온에 의해 재폴딩이 개시된다.
재폴딩된 31KD를 이어서, 첨가제를 함유하지 않는 완충액 A로 투석하였다.
3. 정제
농축 : 많은 부피의 재폴딩된 31KD를 처음에는 원심분리하여 31KD를 함유하지 않는 불용성 펠릿을 제거하고, 농축전에 트리스-HCl, pH7.8을 이용하여 투석하고, 최초로 헤파린-세파로스 컬럼상에서 정제하였다.
FBD의 폴리펩티드 단편은 재폴딩/재산화 및 정제에 관한 개선된 방법은 실시예 5와 실시예 10에 기재되어 있다.
[실시예 3]
[r31KD, r20KD, r18.5KD 및 r12KD 피브린 결합 도메인 폴리펩티드 단편의 약역학]
혈괴(혈전)영상의 강도와 해상도는 방사능 약제의 혼입율과 그의 혈중 제거울간의 상호작용에 의해 결정된다.
r31KD 피브린-결합 도메인의 대사적 행동을 규명하고 이것과 피브로넥틴(FN)을 비교하기 위하여, R31KD 피브린 결합 도메인과 혈장 피브로넥틴을 모두 ICl법(24)에 의해125I로 요오드화하고 쥐에서 정맥내 투여하였다.
결과를 제7도에 나타내었는데, 제7도는125I-r31KD FBD와125I-FN의 약물동태학적 행동을 표시한다.
혈액시료는 그래프상에 나타낸 시간에 채취하였다.
제7도는 두 방사능 분자의 제거율이 서로 상이하며 5시간 후에는 r31KD FBD의 3％만이, 그러나 FN은 20％가 각각 혈액중에 남아 순환하는 것을 입증한다.
몇몇 쥐를 개별적 대사 케이지에서 보관하고, Ⅱ를 축적시킨후 7시간과 24시간후에 배설물을 모았다.
처음 7시간 동안에는 주입된125I-r31KD 방사능중 약 30％만이 Ⅱ에 배출되는 반면 24시간 후에는 90％ 이상이 배출되었다.
Ⅱ중의 방사능은 모두 트리클로로아세트산에 가요성이었는데, 이는 폴리펩티드가 단백분해적으로 분해되었을 시사하는 것이다.
각종 기관(신장, 위, 간장, 폐, 자궁, 난소, 부신, 직장, 회장, 피부, 뇌, 눈, 근육, 방광, 심장, 이자, 기관, 대동맥 및 정맥)을 분석한 결과 특별한 축적은 관찰되지 않았으며, 방사능의 소멸 동태학은 혈액에서의 소멸 동태학과 비슷한 형태를 보였다.
대부분의 기관에서, 비방사능(cpm/g 조직)은 혈청에서보다 낮은 값을 나타냈다.
이런 결과는 FN의 외래성 재조합 31KD 아미노말단 폴리펩티드가 적절히 분해되어 체외로 배출되는 것을 시사하는 것이다.
약물동태학정 행동은 1차 역학과 일치하지 않는데, 이는 폴리펩티드가 혈액이외에 조직과 몸 곳곳에 적절히 분포되어 있는 것을 시사하는 것일 수 있다.
이것은 또한 4-24시간 기간동안에는 분해정조가 증가하지 않는다는 발견에 의해서도 입증이 되는데, 이는 폴리펩티드가 몸의 곳곳에서 서서히 방출되는 것을 반영한다.
대사물질이 독점적으로 그리고 상대적으로 일찍 Ⅲ에서 발견되는 것은 폴리펩티드가 신장을 통해 쉽게 배출되는 것을 시사한다.
물질이 간장에서 축적되지 않는 것은 이 기관이 주요 분해 장소이며 해독작용에는 관여하지 않는다는 것을 시사하는 것일 수 도 있다.
r31 KD FBD의 비교적 짧은 반감기는 혈전의 진단적 영상화에 그것을 사용할수 있다는 가능성 때문에 중요하다.
재조합 31KD FBD(r31 KD)를 방사능 물질 또는 그외의 수단으로 표지화한후 혈전을 영상화하기 위한 목적으로 혈액내에 도입시킬 수 있다.
분자의 짧은 반감기는 또한 이것을 혈괴 형성의 예방을 위해 사용하는 경우에도 중요하다.
반면, 현재 널리 쓰이고 있는 치료제인 헤파린은 매우 긴 반감기의 단점을 갖는다. 혈장 피브로넥틴의 31KD 피브린 결합 도메인을 요오드화한 후 비슷한 실험을 행하고, 비슷하게 방사능의 약물동태학 및 분포를 관찰하였다.
31KD 폴리펩티드는 혈장 FN을 다음과 같이 절단하여 수득하였다.
혈장 FN을 겔라틴-세파로스 컬럼상에서 정제하고, 용출한후 1M 구아니디늄 히드로 클로라이드에 보관하였다.
그후에, 10mM 트리스-HCl에서 투석한 후 206㎎의 FN을 37℃에서 5분간 0.01％ TPCK-트립신으로 분해하였다.
트립신 분해물을 DE52컬럼(61ml)의 1/5을 CM-세파로스 컬럼(3ml)에 넣고 NaCl 구배(0∼0.5M)하에 용출시켰다.
염 농도 구배하에서 약 80%의 폴리펩티드가 회수되었으며(약 220mM에서 피크), 염을 제거하기 위한 투석후에, 약 1/2의 폴리펩티드를 헤파린-세파로스 컬럼(1.5ml)에 로딩하고 0.5M NaCl로 용출하였다.
대략 75%의 폴리펩티드가 이 컬럼의 분획으로 부터 회수된다.
즉 약 1㎎(이론적 수율의 약 40%)이 얻어진다.
이 분획은 90% 이상 순도의 31KD 폴리펩티드이며, 상술한 방법대로 요오드화 하였다.
개량방법에서는 CM-세파로스 단계가 생략되고, DE52 컬럼후에 직접 헤파린-세파로스 단계를 실시하고 있다.
혈장 31KD FBD는 FN의 처음 259 아미노산을 포함하는 반면, 재조합 31KD FBD는 FN의 처음 262 아미노산과 부가적인 N-말단 메티오닌을 함유한다.
[r20KD, r18.5KD 및 r12KD 피브린 결합 도메인 폴리펩티드의 약물동태학]
실시예 2, 4, 5 및 10에 기재된 대로 제조한 표지화된 r20KD, r18.5KD 및 r12 KD 피브린 결합 도메인 폴리펩티드를 이용하여 비슷한 실험을 행하였다.
이들 폴리펩티드의 약물동태학은 r31KD 폴리펩티드의 그것과 아주 유사한 것으로 밝혀졌다.
[실시예 4]
[부가적인 피브린 결합 도메인(FFBD) 폴리펩티드의 발현 및 발효]
실시예 2에는 부분적 r20KD FBD와 풀-랭쓰 r31KD FBD의 발현이 기술되어 있어, 본 출원인과 동일한 출원인에게 양도된 PCT 공개 제 WO 90/07577, 실시예 24에는 31KD FBD를 재폴딩 및 정제하기 위한 개량방법에 개시되어 있다.
FBD의 부가적인 폴리펩티드 단편의 발현을 위한 플라스미드의 제작을 이하에 설명한다.
A. r21KD FBD 폴리펩티드의 발현
플라스미드 pFN 975-25(ATCC 67832)는 피브로넥틴의 풀-랭쓰 r31 KD FBD를 발현하며, 제10도에 나타낸 바와 같이 이 플라스미드로 부터 부분적 FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 196-2가 제작된다.
이 플라스미드는 에세리키아 콜리 주 A 1645 및 이어 에세리키아 콜리 주 A4255에 형질 전환되어 있으며, A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68328로 기탁되어 있다.
이들 형질 전환된 세포들은 부분적 FBD 폴리펩티드를 우수하게 발현하여 그 양이 총 세포 단백질의 약 5％에 해당된다.
이 폴리펩티드는 표준 크기 마커의 이동성을 기준으로 하여 결정했을때, 환원 조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드겔상에서 약 14.4KD의 이동성을 갖는다.
이 폴리펩티드는 피브로넥틴의 처음 109 아미노산을 함유한다.
부가적인 메티오닌 잔기는 최종 폴리펩티드의 N-말단에 존재한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 이 폴리펩티드는 r21KD 폴리펩티드 단편 또는 r21KD FBD로 표시된다.
B. 변형된 12KD(12KD')부분 FBD 폴리펩티드의 발현
풀-랭쓰 r31KD FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 975-25(ATCC No.67832)를 이용하여, 제11도에 나타낸대로 변형된 r12KD 폴리펩티드(r12KD')를 발현하는 플라스미드 pFN 197-10을 제작하였다.
피브로넥틴 FBD 서열을 변형시켜 누클레오티드 340 직후에 Nde I 부위가 생기도록 하였다.
이 플라스미드는 에세리키아 콜리주 A1645와, 이어서 에세리키아 콜리주 A4255에 형질 전환되었다.
이들 형질 전환된 세포들은 변형된 R12KD 부분 FBD를 잘 발현하며, 총 세포 단백질의 약 5％에 해당하는 양으로 발현한다.
이 폴리펩티드는 환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 결정했을때, 미변형된 12KD FBD와 유사한 이동성을 갖는다.
이 폴리펩티드는 피브로넥틴의 처음 109 아미노산 및 그뒤에 부가적인 아미노산 히스티딘과메티오닌을 포함한다.
부가적인 메티오닌 잔기는 최종 폴리펩티드의 N-말단에 존재한다.
이 폴리펩티드는 r12KD' 폴리펩티드 또는 r12KD' FBD로 표시하였다.
C. 33KD 세포 결합 도메인에 융합된 변형 r12KD' FBD의 발현
변형된 12KD FBD의 3' 말단에 Nde I 부위를 갖는 플라스미드 pFN 197-10을 이용하여, 33KD 세포 결합 도메인(CBD)에 융합된 변형 12KD FBD를 코딩하는, pFN 202-5로 명명된 플라스미드를 제작하였다.
이 제작은 33KD CBD단편을 플라스미드 pFN 137-2(ATCC에 수탁번호 67910호로 기탁)로 부터 얻도록 되어이는 제12도에 나타낸대로 수행하였다.
플라스미드 pFN 202-5는 에세리키아 콜리주 A1645 및 이어서 에세리키아 콜리주 A4255에 형질 전환되었으며, 우수한 발현자이다(총 단백질의 8％).
이 45KD 폴리펩티드는 33KD CBD에 융합된 12KD' FBD(FBD이 처음 109 아미노산, 그뒤에 이는 아미노산 잔기 히스티딘과 메티오닌 및 세린부터 시작되는 CBD로 이루어져 있다.
부가적인 메티오닌 잔기가 최종 폴리펩티드의 N-말단에 존재한다)로 구성되어 있다.
D. 아미노산 서열 DGRGDS에 융합된 31KD FBD 폴리펩티드의 발현
서열 asp-gly-arg-gly-asp-ser(DGRGDS)의 카복시 말단에 융합된 31KD FBD 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 다음과 같이 플라스미드를 제작하였다.
31 KD FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 975-25를 Pvu Ⅱ와 Hind Ⅲ로 분해시키고, 제13도에 나타낸 것과 같은 합성 링커에 연결하였다.
pFN 195-4로 명명된 얻어진 플라스미드를 이용하여 에세리키아 콜리주 A1645 및 이어서 에세리키아 콜리 주 A4255를 형질 전환시켰다.
이들 균주들은 31KD-DGRGDS 폴리펩티드의 우수한 발현자인 것으로 밝혀졌으며, 그 양은 총 세포 단백질의 약 8％에 해당되었다.
이 폴리펩티드의 서열은 제13도의 설명란에 기재되어 있다.
E. 융합 31KD FBD-33KD CBD의 발현
r33 KD CBD에 융합된 풀-랭쓰' r31 KD FBD 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 플라스미드를 다음과 같이 제작하였다.
31KD FBD를 발현하는 플라스미드 pFN 975-25를 Pvu Ⅱ와 Hind Ⅲ로 분해시키고, 큰 단편을 합성 링커 및 플라스미드 pFN 137-2를 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 처리하여 얻은 r33KD 세포 결합 도메인(제14도)에 연결시켰다.
플라스미드 pFN 194-2로 명명된 생성된 플라스미드 33KD CBD에 연결된 R31KD FBD를 코딩한다.
플라스미드 pFN 194-2는 에세리키아 콜리 주 A1645 및 이어서 에세리키아 콜리 주 A4255에 형질 전환되어 있으며, 생성된 군주들은 33KD CBD에 융합된 31KD FBD를 포함하는 64KD 폴리펩티드를 낮은 수율로 발현시킨다.
이 폴리펩티드의 서열은 제14도의 설명란에 기술되어 있다.
[발효와 생육조건]
r12 KD FBD 폴리펩티드를 발현하는 클론을 암피실린을 함유하는 풍부 배지(효모 추출액과 카제인 가수분해물)내에서 배양하였다.
생육조건은 30℃이다.
42℃에서 2시간동안 유도시키면 폴리펩티드가 발현되며, 이어 r12 KD FBD 폴리펩티드를 포함하는 세균 균체가 얻어졌다.
비슷하게, 상술한 다른 단백질들을 함유하는 균체가 얻어졌다.
F. 부가적인 플라스미드들의 제작
1. 18.5KD FBD 폴리펩티드 단편 : 상술한 대로(실시예 2A), 플라스미드 pFN 949-2(ATCC No. 68456)에 의해 발현된 20KD FBD 단편은 적당한 위치에 TAA 전사 종결코돈이 없기 때문에 FN 유전자의 말단을 통과해서 전사가 이루어지고 그에 의해 pBR322 벡터의 아미노산 20개 미만을 부가적으로 함유한다.
실시예 2A에 기술된 20KD 단편보다 더욱 표품에 가까운 세개의 핑거를 갖는 FBD 폴리펩티드 단편을 얻기위해, 18.5KD FBD 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 제작하였다.
제작 과정은 제23도에 나타내었으며 도면의 설명란에 설명되어 있다.
pFN 208-13으로 명명된 생성된 플라스미드는 PL프로모터와 β-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하여 18.5KD FBD 폴리펩티드 단면을 발현한다.
플라스미드 pFN 208-13은 이. 콜리 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68456으로 기탁되어 있다.
이 플라스미드는 피브로넥틴의 처음 154 아미노산과 부가적인 N-말단 메티오닌을 발현시킨다.
12KD FBD 폴리펩티드 단편의 개량 발현자 :
λ PL프로모터와 β-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에 12KD FBD 폴리펩티드 단면(λ 핑거)을 발현하는 플라스미드 pFN 196-2(ATCC No. 68328)는 상술한 바 있다.
12KD 단편의 발현율을 더욱 개량하기 위하여, 제26도 제27도에 나타내고 도면의 설명란에 설명한 바와 같이 플라스미드 pFN 203-2을 제작하였다.
플라스미드 pFN 203-2는 λ PL프로모터, C II 리보솜 결합 부위 및 36 bp trp전사 종결 서열의 통제하에 12KD 단편을 발현시킨다.
플라스미드 pFN 203-2는 이. 콜리 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 68606호로 기탁되어 있다.
이들 형질 전환된 균주들은 12KD FBD 폴리펩티드 단편의 고수를 발현자인 것으 밝혀졌으며, 그 양은 총 세포 단백질의 약 12∼18%에 해당된다.
융합된 31KD FBD-33KD CBD 폴리펩티드의 고수율 발현 :
λ PL프로모터 및 β-락타마제 리보솜 결합 부위의 통제하에 64KD 융합 FBD-CBD 폴리펩티드를 저수율로 발현하는 플라스미드 pFN 194-2는 상술한 바있다.
λ PL프로모터, C II 리보솜 결합부위 및 36bp trp 전사 종결 서열의 통제하에 64KD 폴리펩티드를 고수율로 발현하는 플라스미드를 제작하였다.
pfN 205-5로 명명된 이 플라스미드는 제25도에 나타내고 도면의 설명란에 설명한 대로 제작 하였다.
이들 모든 발현 플라스미드(상기 1∼3)의 발효 및 생육 조건을 본질적으로 다른 FBD 폴리펩티드의 생산과 관련해 기술된 것과(실시예 2C 참조)동일하다.
정제와 재폴딩 방법은 실시예 5 및 실시예 10에 기재된 대로이다.
[실시예 5]
피브로넥틴의 재조합 20KD 및 12KD 및 12KD 피브린-결합 폴리펩티드의 재폴딩 및 정제
r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드를 재폴딩하고 정제하는 공정은 다음의 3단계로 이루어져 있다.
1. 세균 균체의 조 가공
2. 재폴딩/재산화
3. 정제
1. 조가공
1-1. 펠릿의 세척과 추출 : r20 KD 폴리펩티드와 관련하여 실시예 2 및 r12 KD 폴리펩티드와 관련하여서는 실시예 4에 기재된 대로 얻은 세균 균체를 r31 KD 폴리펩티드의 경우와 실질적으로 동일한 방법(본출원인과 동일한 출원인에게 양도된 PCT 공개 제90/07577호, page 121 및 그 이하)으로 파쇄 및 세척하였다; 그러나 r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드 모두에 있어서 추출방법을 변경하였다.
다음은 r20 KD 폴리펩티드의 세균 균체에 대해 수행한 세척 및 추출 과정이며 r12 KD 폴리펩티드 비슷한 방법으로 추출하였다.
1-2. 방법 : 플라스미드 pFN 949-2를 보유하는 에세리키아 콜리 주 A4255를 배양하여, 실시예 2에 기재된 대로 r20 KD 폴리펩티드를 함유하는 세균 균체를 얻었다.
이 세균 균체중 일부(14.8g)를 10부피의 50mM 트리스 HCl, 50mM EDTA(완충액 B), pH 7.5에 현탁시켰다.
현탁액을 중간 속도에서 15∼30초간 균등질화 하고, 펄스진동에 의해 4분간씩 3회 초음파 처리하고, 15,000rpm에서 30분간 원심분리하였다.
펠릿을 2.4 부피(36ml)의 완충액 B에 재현탁시켰다.
리소자임(0.1mg/ml)을 가하고, 현탁액을 37℃ 물중탕욕에서 2시간 동안 교반하게 보온하였다.
트리톤 X-100을 1%의 최종 농도로 가하고, 실온에서 30분간 교반하고 원심 분리하였다.
펠릿을 148ml의 물(즉, 원래 펠릿의 10배 부피)에 3회 재현탁하고, 균등질화하고, 실온에서 30분간 교반하고 원심분리하엿다.
세척된 최종 펠릿은 대락 1.5g, 즉 원 중량의 10%에 불과하였다.
그러나, r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드는 모두 펠릿속에 잔류하는데, 이는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 입증되었다.
세척 및 추출된 펠릿을 더 처리하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
2. 추출된 펠릿의 가용화 및 재폴딩
2-1. 여기에서 재폴딩/재산화에 사용된 시약과 방법은 r31 KD 폴리펩티드의 경우에 사용된 것과 다르다.
r20 KD 또는 r12 KD 폴리펩티드의 추출된 펠릿을 50mM β-머캅토에탄올의 존재하에 6M 구아니딘-HCl(GuCl)에 용해시키고, 10배로 희석한 후 공기에 의해 재산화되도록 한다.
2-2. 방법 : 동결된 r20 KD 펠릿(1.5g)을 가용화하고 6M 구아니딘-HCl을 부가적으로 함유하는 10mM 트리스 HCl, 5mM EDTA(완충액 C)의 10부피내에서 균등질화하였다.
57㎕의 희석되지 않은 β-머캅토에탄올을 첨가하여(최종농도 : 50mM)시료를 환원시키고, 공기의 부재하에, 즉 밀봉 용기내에서 30분간 교반하였다.
이어 이것을 약 50ml/분의 속도로 10부피(148ml)의 완충액 C, pH 8.0에 적하하고, 계속적으로 부드럽게 교반하면서 개방 비이커내에서 실온에서 48∼72시간 동안 산화되도록 하였다.
또는, 0.3mM GSSG의 존재하에 폐쇄된 용기내에서 산화를 실시할 수도 있다. 이 단계에서, 약간의 폴리펩티드 침전이 이미 형성되긴 하지만, 침전을 포함한 현탁액을 15부피의 완충액 C, pH 8.5을 이용하여 완충액을 세번 바꾸어 가면서 24시간에 걸쳐 투석하였다.
투석액을 JA-17 로터가 구비된 고속 벡멘(Beckman) 원심 분리기내에서 15,000rpm(22,500×g)에서 45분간 원심 분리하였다.
이에 의해 재산화 공정중에 형성된 r20 KD 또는 r12 KD의 오염 단백질과 응집물이 제거된다.
3. 정제 및 특성지적
피브린 결합 도메인내에 있는 헤파린 결합 부위의 위치가 알려져 있지 않기 때문에 새로운 보다 짧은 r20 KD 및 r12 KD 폴리펩티드가 헤파린-세파로스에 결합될지의 여부를 미리 알 수는 없다.
그러나, 보다 짧은 분자는 사실 헤파린-세파로스에 결합하지 않는다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 r31 KD의 경우에서와 같이, 재산화된 r20 KD 또는 r12 KD 폴리펩티드를 정제하기 위하여 페닐-세파로스 컬럼이 필요하지 않다.
사실, 이 물질은 헤파린-세파로스상에서 직접 정제할 수 있지만, 오염물질, 잘못 폴딩딘 분자와 다이머들의 제거와 관련하여 시료를 헤파린-세파로스 컬럼에서 크로마토그래피하기전에 Q-세파로스 컬럼 크로마토그래피하면 상단한 개량이 달성된다. 어떤 경우에는, Q-세파로스 컬럼에 로딩하기 전에, 적절한 분자량 분획점, 예를들면 r20 KD 폴리펩티드의 경우에는 10 KD, 그리고 r12 KD 폴리펩티드의 경우에는 3KD의 분자량 분획을 갖는 막을 이용하는 펠리콘 시스템(Millipore Corp)상에서 폴리펩티드를 농축할 수 있다.
두 폴리펩티드를 농축하기 위하여 헤파린-세파로스 컬럼을 이용할 수도 있다.
다음은 r20K20 폴리펩티드의 경우에 사용되는 정제 과정의 한예이다.
3-1. Q-세파로스 크로마토그래피 : 재산화된 r20 KD의 1/3(47ml)을 완충액 C, pH 8.5로 예비 평형화한 Q-세파로스 고속 통액 컬럼의 10ml의 컬럼에 1.2ml/분의 용출 속도로 공급하였다.
최초 용출 분획을 수집하였다(70ml).
컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 0.5M NaCl을 함유하는 완충액 C, pH 8.5로 용리시키고 컬럼을 0.5M NaOH로 재생시켰다.
3-2. 헤파린-세파로스 크로마토그래피 : Q-세파로스 컬럼에서 나온 최초 용출 분획을 pH 8.5 완충액으로 예비 평형화한 헤파린-세파로스의 10ml 컬럼에 0.5ml/분의 용출속도로 공급하였다.
최초 용출 분획은 주로 오염물질과 잘못 폴딩된 r20 KD 폴리펩티드를 함유한다.
정제된(95％ 순도) r20 KD 폴리펩티드를 0.5M NaCl-함유완충액 C, pH 8.5로 용출시키고, 6M 구아니딘-HCl을 부가적으로 함유하는 동일 완충액으로 컬럼을 재생시켰다.
r20 KD(표 A)와 r12 KD(표 2) 폴리펩티드에 대한 대표적인 정제표를 나타내었다.
3-3. 특성지적 : r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드를 얻기위한 세균 균체의 처리에서 얻은 상층액과 그 이후의 컬럼 분획에서 얻는 부분표본에 대해 폴리펩티드를 분석하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하였으며, FPLC 또는 HPLC에 부착된 수퍼로스 12컬럼에 의해 프로필을 제21도(r20 KD) 및 제22도(r12 KD)에 나타내었다.
정제된 r20 KD 또는 r12 KD 폴리펩티드는 단일의 뾰족한 밴드로 용출된다. 이러한 프로필은 비환원 조건하의 SDS-PAGE 겔에서 얻어진 결과를 보정해준다 즉 r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드 시료의 벤드는 모두 번져있지 않고, 이는 단일 분자 형태를 시시하는 것이다.
r20 KD의 경우에, 비환원된 폴리펩티드의 밴드는(r31 KD 폴리펩티드의 경우에서 처럼)환원된 형태보다 파르게 이동하며; 이는 r31 KD 폴리펩티드의 경우에서 보는 것과 비슷하다.
그러나, r12 KD 폴리펩티드의 경우에는 이러한 차이점이 관찰되지 않는다. FBD 폴리펩티드의 특성 지적에 관한 부가적인 세부 사항은 실시예 11에 기재하였다.
이들 FBD 폴리펩티드들은 혈전 및 동맥경화성 병변을 영상화하기 위한 방사능약제로 사용하기 위해 방사능으로 표지를 할수 있다.
보다 큰 r31 KD 폴리펩티드를 이용하는 것과는 반대로, 상술한 목적을 위해, 보다 작은 FBD 폴리펩티드(r20 KD 및 r12 KD)를 사용하는 장점은, 상당한 노력을 기울인끝에 보다 작은 분지를 제조하기 위한 단순한 방법을 개발하였다. 즉, r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드를 재폴딩하고 정제하기 위한 상술한 방법은 r31 KD 폴리펩티드를 재폴딩 및 정제하는 방법보다 빠르고 쉽다.
덧붙여, 이들 방법은 r31 KD 폴리펩티드의 방법보다 수율이 높으며, 보다 짧은 FBD 폴리펩티드 단편을 보다 높은 폴리펩티드 농도로 얻을수 있다(10mg 이하/ml).
FBD 폴리펩티드 단편을 재폴딩 및 정제하기 위한 이 방법의 개량 구현예는 실시예 10에 기재되어 있다.
a : 환원 조건하에 SDS-PAGE 겔로 부터 또는 세파로스 12용출 프로필로부터 추정 이표는 실시예 5, 2항 및 3항에 기술된 대로 처리한, r20 KD 폴리펩티드의 재폴딩과 정제를 보여주는 대표적인 정제 표이다.
a : 환원 조건하에 SDS-PAGE 겔로 부터 또는 세파로스 12 용출 프로필로부터 추정
b : 펠리콘 시스템상에서 농축
이 표는 실시예 5, 2항 및 3항에 기술된 대로 처리한, r12 KD 포릴펩티드의 재폴딩과 정제를 부여주는 대표적인 정제 표이다.
[실시예 6]
r31 KD, r20 KD 및 r12 KD 피브린 결합 도매인 폴리펩티드의 생물학적 특성
r31 KD FBD의 생체 및 생체외에서의 피브린 용괴에의 결합, 세균에의 결합 및 세포외 매트릭스에의 결합과 관련된 r31 KD FBD의 생물학적 특성은 본출원인과 동일한 출원인에게 양도된 PCT 공개 제WO 90/07577호, 134면 이하에 기술되어 있다.
이 실시예에서는, r31 KD 폴리펩티드와 관련된 부가적인 결가를 제시하였으며, 20KD와 12KD FBD 폴리펩티드의 생물학적 활성을 입증하였다.
본 실시예에서, 피브린 용괴에 재조합 피브린 결합도메인이 결합하는 것은 다음과 같이 측정하였다.
기형성된 피브린 응괴에의125I-rFBD(r31 KD, r20 KD 또는 r12 KD)의 결합(2단계 반응 II)
단계 1 피브린 응괴의 형성 : 다음 두가지중 한가지 방법에 의해 행할수 있다.
(a) 구연산염 처리한 인간의 전혈 20㎕를 5mM CaCl, 1단위/ml의 트롬빈 및 최종 부피 250㎕의 PBS와 함께 37℃에서 보온하였다.
45분후에 원심분리 및 1ml PBS를 이용한 펠릿의 세척(2회)에 의해 반응을 종결하였다; 또는 (b) 구연산염 처리하지 않은 인간의 전혈(순수한 혈액 20㎕FMF 37℃에서 보온하였다.
150분후에 (a)와 같이 원심분리 및 세척하여 반응을 종결하였다.
단계 2 기형성된 피브린 응괴에125I-FBD폴리펩티드의 결합
최종 부피 250㎕의 PBS내에서125I-rFBD 폴리펩티드와 함께 혈괴를 37℃에서 보온하였다.
각각의 실험마다 지시된대로 다른 성분들을 첨가한다.
45분후에 원심분리하고 PBS로 3회 세척하여 결합 반응을 종결하였다/
125I-rFBD-피브린 펠릿을 함유하는 튜브에 대해 감마 계수기를 이용하여 그의 방사능을 측정하였다.
결과
A.125I-표지화 r31 KD FBD의 쥐에서의 대사 안전성 : 피브린에의 생체외 결합 대 TCA 불용성
제18도의 설명란에 기재되어 있는 대로125I로 표지화된 r31 KD FBD를 쥐에게 정맥내 투여하고, 간격에 따라 채취한 혈액시료에 구연산나트륨을 첨가하였다.
TCA 불용성 계수를 측정한다 : (a) 20％ TCA로 처리하고 TCA 불용성 계수를 측정한다 : 또는 (b) 기형성된 혈괴(대조 쥐에서 채취한 20㎕ 전혈을 이용하여 형성)와 함께 보온하고; 상술한 2단계 반응(II)의 조건하에서125I-31KD FBD가 기형성된 혈괴에 결합되는 비율을 측정한다.
감마 계수기를 이용하여 방사능을 측정하고, 각 시료의 방사능을 반응 혼합물중에 존재하는 총 cpm의 백분을 계산하였다.
제18도에 나타낸 결과는 (TCA 불용성의 감소로 측정한) r31 KD의 물리적 붕괴와 (기형성된 피브린 응괴에 r31 KD가 결합되는 생체의 결합으로 측정한) 기능적 붕괴 사이에 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
그러나, 비교실험의 초기 단계에서는 현저한 차이가 있다; 즉 30분에서는 기능적 붕괴가 물리적 붕괴 보다 수배 높았다.
기능적 안정성이 물리적 분해보다 훨씬 빠르게 감소함을 시사하는 이러한 결과는, FBD와 피브린 혈괴와의 사이에 일어나는 공유결합 반응의 주요 부위가 아미노산 번호 3인 FBD 분자의 아미노 말단쪽에 위치해있기 때문이라고 설명될수 있다.
이 형태 1의 상동성 구조 바깥에 뻗어있는 20 아미노산 사슬내에 위치해 있는 이글루타민 잔기는, 삼차 구조에 의한 분해로 부터 보호를 받지 못하는데, 이는 나머지 FBD 도메인의 경우에도 전형적으로 발생한다.
B. r31 KD가 피브린에 결합하는 반응의 특이성; 트랜스글루타미나제의 영향
혈괴내의 피브린에 혈장 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인이 공유 결합하는 것은 주로 피브로넥틴의 아미노산 3(글루타민)과 피브린관의 반응에 기인한다.
이 결합 반응은 이 글루타민 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 특이적으로 인지하는 효소 트랜스글라타미나제에 의해 효소적으로 조절된다.
재조합 r31 KD FBD가 혈괴에 결합하는 반응에 있어서 트랜스글루타이만제가 관여하는 지의 여부를 연구하기 위하여 다음의 시험을 행하였다.
본 출원서류에 기재된 시험에서 사용된 모든 외래성 트랜스글루타이마나제는 기니이-피그의 간 트랜스글루타미나제(sigma)이다.
인간의 전혈 20μ에서 유도된 기형성된 피브린 혈괴에 후술하는 분자의 0.3mM 용액이 결합하는 것을 트랜스글루타미나제의 존재 및 부재하에 상술한 2단계 반응 II를 이용하여 측정하였다.
14C-푸트레신-r31 KD FBD,125I-r31 KD FBD 및125I-재조합 소 성장 호르몬(대조),14C-푸트레신-r31 KD 단백질 복합체는 3위치의 글루타민 잔기가14C-푸트레신과의 공유결합에 의해 치단되어 있는 것으로서 다음과 같이 제조하였다.
3μM r31 KD FBD, 10mM CaCl2, 0.015 단위/ml 트랜스글루타미나제 및 60μM14C 푸트레신(비활성 100mc/mmole)을 함유하는 용액을 37℃에서 5시간 동안 보온하였다.
31 KD FBD에 흡수된14C-푸트레신의 양을, 이 반응 용액의 부분표본의 TCA 침전에 의해 측정한 결과 2.8∼3μM 용액의14C-푸트레신과 등가인 양의 r31 KD 단백질에 흡수된 것으로 나타났다.
이는 FBD위 위치 3에 있는 글루타민의 90％ 이상이14C-푸트레신과 공유 결합했음을 나타낸다.
14C-푸트레신 r31 KD 물질을 0℃에서 보관하고, 더 처리하지 않고서 수일내에 사용하였다.
r31 KD FBD와 유럽특허공개 131843호에 기술된 대로 제조한 대조 재조합 소 성장 호르몬 유사체(bGH)를 실시예 3에 기재된 ICl법을 이용하여 125 I로 표지화하였다.
결과
트랜스글루타미나제의 존재 및 부재하에 2단계 반응 II에서 결합된 계수는 측정하고, 각 시험 폴리펩티드마다 트랜스글루타미나제의 존재 및 부재하에 결합된 계수의 비를 계산하였다.
이 값은 고유한(intact) 31 KD FBD를 푸트레신-FBD(차단된 FBD) 또는 대조 bGH와 비교해볼때 극적으로 차이가 난다.
두 후자의 경우에, 계수비는 1에 가까운데, 이는 트랜스글루타미나제가 결합에 영향을 주지 않으며 혈괴내에 존재하는 총 cpm은 반응의 총 cpm의 10-15％이다.
고유한 31 KD FBD의 경우에는 비율이 극적으로 1보다 크며(다른 시험에 있어서는, 이 비율은 혈액의 질과 신선도 그리고 트랜스글루타미나제에 따라 1.8-7 사이에 있다), 혈괴내에서 존재하는 cpm은 반응중의 총 cpm의 40∼70% 이다.
이것은, 트랜스글루타미나제가 r31 KD 폴리펩티드가 혈괴에 결합하는 것을 현저히 증가시킴을 의미한다.
이러한 결과는 트랜스글루타미나제의 존재하에 피브린 혈괴에 r31 KD FBD 폴리펩티드가 결합하는 데 있어서 3위치의 차단되지 않은 글루타민의 강력한 영향을 주는 것을 시사한다.
다른 실험들은 2단계 반응 II에 트랜스글루타미나제를 첨가하면, r31 KD에서 관찰되는 영향과 비견할만한 정도로 r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드가 혈괴에 결합하는 것을 증가시킨다는 것을 입증하였다.
C. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 r31 KD FBD-피브린 복합체의 특성지적
피브린 혈괴에 r31 KD 가 결합하여 형성된 복합체의 크기를 측정하기 위하여, 후술하는 일련의 시험을 행하였다.
20㎕의 인간 전혈(A) 또는 250㎕의 0.8㎕의 0.8μM 인간 피브리노겐 용액(B)으로 부터 혈괴를 유도하였다.
피브리노겐-실험에 있어서, (실시예 7에 기술된 것과 같은) 치과용 코일을 피브리노겐과 함께 튜브에 첨가하였다.
상술한 2단계 반응 II를 이용하여, 0.15μM125-r31 KD FBD와 5mM CaCl2의 존재하에125I -r31 FBD가 피브린 혈괴에 결합하는 것을 측정하였다.
PBS로 3회 세척하여 반응을 종결하였다.
후술하는 대로 각종 처리를 행한후, 펠릿을 원심분리하고 상층액(즉, 가용성 물질)의 부분을 표본 15㎕를 분자량105의 물질과 저분자량 물질로 부터 분자량106의 물징을 분리해내는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다.
그 결과, 트랜스글루타미나제의 존재하에서는, S-S 결합을 환원시키는 강력한 이온성 세성제 SDS와 β-머캅토에탄올의 존재하에 내끊음성을 갖는 고분자량 형태의 r31 KD-피브린 복합체가 나타난다는 사실을 밝혀주는 자동 방사능 사진을 얻었다. 덧붙여, 끊는 반응물중에 4M 우레아가 포함되어 있으면, 고분자량 피브린 혈괴의 소수성 결합 응집물의 경우에 예측되는 바와 같이, 매우 분자량이 큰 고분자량 형태(106)가 중간 분자량 형태(100,000)으로 정량적으로 전환된다.
혈괴내에 있는 자유 r31 KD 폴리펩티드의 양은 통상 적은데, 이는 인산염-식염수 완충액만을 첨가하고 끊였을때 방출되는 물질이다.
우레아를 이용하여 추가로 처리했을때 중간 분자량 형태가 저항성을 나타내는 것은125I-r31 KD와 피브린 사이에 공유 결합이 포함되어 있음을 뒷받침 한다.
D.125I-r31 KD가 기형성된 피브린 혈괴에 결합하는 것에 미치는 피브로넥틴과 헤파린의 영향
(i) 피브로넥틴(FN)의 영향
인간 혈장은125I-r31 KD 폴리펩티드가 기형성된 혈괴에 결합하는 것과 강력하게 경쟁할 수 있는 실질적인 농도의 FN(300㎍/ml)을 함유하고 있다.
이러한 경쟁은 혈괴의 표지화 및 그에 따른 영상화 과정의 효율성에 영향을 줄수 있다.
FN의 영향을 검사하기 위하여, 정제된 FN(1μM)과 함께125I-r31 KD(0.15μM)을 PBS내에 있는 기형성된 혈괴에 첨가하였다.
125I-r31 KD에 대하여 7배 몰을 넘는 과량으로 FN을 첨가하였음에도 불구하고, 폴리펩티드의 결합은 미미하게 영향을 받았을 뿐이다(20% 억제).
과량의 FN이125I-r31 KD 결합과 경쟁을 하지 않는 것에 관한 관찰은 두가지 방식으로 해석할 수 있다.
혈괴내로 교차 결합되는 부위의 수가 FN과의125I-FBD 모두를 수용하기에는 지나치게 많거나, 또는 혈괴에 결합되는 FBD의 친화력보다 훨씬 높다.
여러가지 관찰을 토대로 할 때, 본 발명자들은 과량의 결합 부위와125I-r31 KD의 높은 친화력 모두에 의해 혈장 농도의 FN의 존재하에서도125I-r31 KD가 혈괴내에 결합될수 있도록 한다고 믿는다.
(II) 헤파린의 영향
111In-표지화 혈소판 및 표지화 피브로넥틴 같은 몇몇 방사능 신티그래피 시약은 치료용 헤파린의 존재하에 효력을 상실한다.
따라서,125I-r31 KD가 응괴내에 흡수되는 것에 대한 헤파린의 영향을 분석하는 것은 중요하다.
결과는, r31 KD FBD가 기형성된 혈괴에 결합하는 것과 관련해서 헤파린이 유의할만한 영향을 주지 않는다는 것을 입증하였다.
다른 실험들은 r31 KD가 형성중에 있는 피브린 혈괴에는, 즉 반응 I에서는 피브린 혈괴에 결합하는 것에 대해 소량의 헤파린이 극적으로 영향을 미치는 것을 보여준다.
E. 기형성된 혈괴에 각종 재조합 FBD 폴리펩티드와 혈장 FBD가 결합하는 것의 관찰
기형성된 혈괴에 각종 재조합 FBD폴리펩티드(r31 KD, r20 KD 및 r12 KD) 및 혈장 31KD FBD가 결합하는 것을 비교하기 위하여, 제19도에 기재한 뒤로 2단계 반응 II를 이용하여 일련의 실험을 행하였다.
그 결과는 혈장의 31KD는 r31 KD와 비슷한 수준으로 결합하는 반면, r20 KD와 212 KD 폴리펩티드는 모두 큰(31KD) 분자의 약 반정도의 수준으로 결합하는 것을 보여준다.
r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드의 결합수준은 방사능 표지화 r20 KD와 r12 KD 폴리펩티드가 혈전 영상화를 위한 방사능약제로서 사용될수 있는 가능성을 입증하기에 충분히 높은 값이다.
r31 KD-DGRGDS 폴리펩티드(실시예 4, D 및 제13도)를 이용한 비슷한 실험도 이 폴리펩티드가 r31 KD와 거의 동일한 수준으로 결합됨을 보여준다.
F. 신선한 혈괴 또는 동결 혈괴에의125I-r12 KD의 결합
FBD 폴리펩티드에 의한 결합 실험에 있어서, 사용하기전에 혈괴를 동결하는 것의 영향을 연구하기 위하여 다음의 실험을 행하였다.
실시예 5에 기술한 대로 제조한,125I-r12 FBD를 이용한 2단계 반응 II 결합 실험에 있어서, 신선한 혈괴나 -70℃에서 보존한 혈괴를 사용하였다.
실험은 트랜스글루타미나제의 존재 또는 부재하에 제15도의 설명란에 기재된 대로 행하였다.
제20도는 혈괴가 r12 KD FBD에 결합하는 능력에 있어서, 혈괴의 동결이 적은 영향만을 준다는 것을 보여준다.
통상적으로, 트랜스글루타미나제를 첨가하지 않는 상태하에서, 동결 혈괴는, 트랜스글루타미나제의 존재하에서의 신선한 혈괴와 유사한 결합율을 보여준다.
외래성 트랜스글루타미나제를 동경 혈괴에 첨가하면 결합 반응에 아무런 영향을 주지 않는데, 이는 아마도 동일한 적혈구 세포에서 내재성 트랜스글루타미나제가 방출되기 때문일 것이다.
상기 B항에서 언급한 바와 같이, 반응 II에서 외래성 트랜스글루타미나제의 첨가에 대해 광범위한 반응이 있게된다.
G. 기형성된 혈괴에125I-r31 KD FBD가 결합하기 위한 조건
기형성된 혈괴에125I-r31 KD가 결합하기 위한 조건을 조사하기 위하여, 다음과 같은 일련의 시험을 행하였다.
구연산염으로 처리한 혈액 또는 순수한 혈액으로 부터 형성된 기형성된 혈괴에125I-r31 KD 폴리펩티드가 결합하는 것을 2단계 반응 II법을 이용하여, 그리고 각종 성분(칼슘, 히루딘, 트랜스글루타미나제)의 존재 또는 부재하에 실험하였다. 구연산염 처리된 혈액에 대한 31 KD 폴리펩티드의 결합율이 높긴하지만, 구연산염 처리된 혈액 또는 순수한 혈리를 이용한 결과의 패턴은 유사하다.
히루딘(Sigma)은 모두 트롬빈-중개 반응의 특이적 억제제이며, 결합 반응(단계 2)에 대한 트롬빈의 영향을 조사하기 위하여 히루딘을 첨가하였다.
히루딘의 영향이 전혀 관찰되지 않았으므로, r31 KD 폴리펩티드가 응괴에 결합하는 것에 대해 트롬빈은 전혀 영향을 주지 않는다.
그러나, 피브리노겐으로 부터 피브린이 형성되는 단계 1에 히루딘을 첨가하면, 예측되었던 대로 동일한 양의 히루딘이 결합을 전적으로 억제한다.
이러한 결과는 외래성 트랜스글루타미나제가 r31 KD FBD가 혈괴에 결합되는 것을 증가시킨다는 것을 보여주는 것이며, 나아가 이 트랜스그루타미나제 반응은 칼슘 이온의 존재에 좌우된다는 것을 보여준다.
사용된 외래성 트랜스글루타미나제는 (활성형의)조직 트랜스글루타미나제이기 때문에, 본발명자들은 트롬빈에 의해 활성화되어 인자 XIIIa를 형성하게 되는 인자 XIII인 혈청 트랜스글루타미나제는 히루딘 억제에 대해 매우 민감할 것으로 예측한다.
H.125I-r31 KD FBD가 세포외 매트릭스(ECM)에 결합하기 위한 조건
125I-r31 KD가 상피 세포외 매트릭스(ECM)에 결합하는 것은 본 출원인과 동일한 출원인에게 양도되어 있는 PCT 공개 제 WP 90/07577호 공보, 144면에 입증되어 있다.
이제, 외래성 트랜스글루타미나제의 존재 또는 부재하에 0.3μM125I-r31 KD FBD가 ECM에 결합하는 것을 실험하여 상기 결합의 특성을 더욱 확인하였으며, 나아가 트랜스글루타미나제의 존재하의 결합을 각각 헤파린, 피브로넥틴 또는 스퍼미딘(spermidine)의 존재하에 실험하였다.
에 의해 증가되는 것을 입증해준다.
헤파린은 결합에 별다른 영향을 주지 않는 반면, 공지된 트랜스글루타미나제 억제 제인 스퍼미딘은 결합을 억제한다.
콜라겐 역시 결합을 억제하는데, 이는 콜라겐이 상피세포의 매트릭스상에 있는 수용체 분자로서 관여되어 있는 것을 시사하는 것이다.
피브로넥틴은 결합 반응에 적은 영향을 미친다.
이러한 결과는, 방사능 표지화된 재조합 FBD 폴리펩티드를 노출된 혈관에서의 초기 플라크 형성을 영상화하기 위한 방사능 약제로서 사용할 수 있는 기능성을 보다 강력하게 뒷받침한다.
피브로넥틴의 FBD의 각종 폴리펩티드 단편의 생물학적 활성을 입증하는 추가적인 실험은 실시예 9에 기술하였다.
[실시예 7]
스테인레스 스틸 코일에 의해 유도된 쥐에서의 정맥 혈전에 의한 재조합125I-r31 KD FBD와 그 단편의 흡수
표지화 r31 KD, r20 KD와 r12 KD FBD 폴리펩티드의 흡수를 연구하기 위하여 스테인레스 스틸 코일-유도된 쥐의 정맥 혈전 모델을 사용하였다.
사용된 모델은 마프란드 등[Haffrand et al., Thrombosis and Haemostasis 59 : 225∼230(1988)]에 의해 기술된 것이다.
실험의 세부적 사항
A. 스테인레스 스틸 코일-유도된 정맬 혈전에 의한125I-31 KD의 흡수에 관한 조사 케타민 HCl과 크실라진 HCl을 이용하여 위스타(Wistar)계통의 암컷 쥐(200∼250g)를 마취시켰다.
복부중앙에 절개선을 만들고 하부정맥을 노출시켰다.
스테인레스 스틸 철사 코일(치과용 페이스트 담체, 가는것 번호 31, 길이 21mm)을 접합점 바로 아래에서 정맥의 관광내에 삽입하고, 절개부위를 봉합하였다.
각각 삽입된 기구를 개별적으로 삽입전후에 칭량하고 각 중량을 기록하였다.
시술 3시간후에, 갑상선 요오드 풀을 포화시키기 위하여 0.9％ NaI 용액 1ml를 시험 동물에 정맥내 투여하였다.
1시간후에, 쥐에게125I-r31 KD FBD(5×106cpm : 100㎍/㎏)을 정맥내 투여하였다. r31 KD 폴리펩티드는 실시에 3에 기술한대로 표지화하였다.
표지화 화합물을 투여하고 24시간후에, 심장을 천공하여 혈액을 채취하고 쥐를 희생시켰다.
혈관에 남아있는 나머지 혈액을 조심스럽게 빼내면서 코일이 들어있는 정맥 절편을 들어내었다.
한군에서는, 코일이 들어있는 절편을 있는 그대로 칭량하고 방사능을 측정하였다(원위치 혈전군).
다른 군에서는, 정맥을 종축을 따라 절개하고 혈전을 보유하는 코일을 조심스럽게 꺼내어 칭량하고 방사능을 측정하였다.
말초혈액을 이용하여 혈액 방사능을 측정하였다.
결과의 계산 : 2개의 군에 있어서, 각 코일의 최종 중량에서 초기 중량을 빼고, 각 경우에 있어서의 cpm값을 순 중량으로 나누어 비방사능을 계산하였다.
말초 혈액 시료의 비활성도 계산하였다.
결과
24시간에 있어서, 혈액의 방사능 농도는 5000∼10,000 cpm/g 정도인 반면, 분리된 혈괴에서의 비방사능은 약 300,000cpm/g으로서 30∼60배 높다(제16도 참고).
혈괴를 보유하는 정맥의 전체 절편을 이 분석에 포함시켜 소의 비방사능값을 측정하면, 얻어지는 값은 혈액의 것보다 4∼5배 높은데, 이는 표지화 r31 KD FBD를 이용하여 생체내에서 혈전을 감마-카메라로 영상화하기 위하 양호한 신호 대 노이즈비를 얻을수 있음을 시사한다.
헤파린 전처리의 영향을 이 모델에서 연구하였다.
혈전 영상화의 후보자가 되는 환자들은 통상 이 헤파린 항응고제에 의한 치료를 받기 때문에 이러한 종류의 시험은 필수적이다.
이러한 의문점을 연구하기 위하여, 한 군의 쥐를 표지화 폴리펩티드를 투여하기 10분전에 헤파린(500단위/쥐, 정맥내)으로 처리하였다.
이러한 헤파린 처리는 24시간후에 측정했을때 표지화 방사능 약제의 흡수에 영향을 주지 않는다.
이들 결과는 FN의 FBD를 이용한 혈전의 영상화를 헤파린의 존재하에 행할수 있다는 것을 입증하는 것이다.
B. 스테인레스 스틸 코일-유도된 정맥 혈전 모델에 있어서의 재조합 12KD, 20KD 및 31KD FBD 폴리펩티드의 비교
실시예 3에 기재된 대로 세개의 재조합 폴리펩티드를125I로 표지화하고 상기 A에 기술한대로 쥐 모델에서 사용하였다.
제17도에 나타낸 이들 결과는, 비방사능을 비교하였을때, 세개의 분자 각각이 혈액과 비교하여 특이적으로 혈괴내에 위치하여 있다는 것을 시사한다.
혈괴의 비방사능은 짧은 폴리펩티드보다 긴 분자의 경우 높게 나타나지만(r31 KD, r20 KD 및 r12 KD 폴리펩티드에 있어서 각각 143,000, 78,500 및 63,000cpm/g 혈괴이다), 그 차이는 만족할만큼 중요하지 않다.
혈액에 대한 비방사능 값(24시간후)도 비슷하게 분자 크기에 관련되어 있으며(r31 KD, r20 KD 및 r12 KD 폴리펩티드에 있어서 각각 7040, 5016 및 3300cpm/g이다). 이는 이들 분자종의 혈종 제거율을 반영하는 것일수도 있다.
따라서, 혈괴 대 혈액 비방사능의 비를 계산하면 세개의 다른 폴리펩티드에 있어서 비슷한 값이 얻어지며 이 값은 20정도이다.
이러한 결과는 세개의 모든 FBD종(또는 다른 FBD 단편)을 혈전 영상화에 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.
[실시예 8]
동맥경화성 병변과 혈전을 영상화하기 위한 피브린 결합 도메인 폴리펩티드의 표지화
본 출원서류에 기재된 피브린 결합 도메인 폴리펩티드(r31 KD, r20 KD 및 r12 KD 폴리펩티드)또는 FBD의 다른 폴리펩티드 단편들은 혈전을 감마 카메라 영상기에 의해 외부에서 검출할 수 있도록 하기 위해 방사성 추적자를 혈전에 전달하기 위해 방사능에 의해 표지화할 수 있다.
본 출원서류에는 실시예 3에서 반감기가 60일로 길은 요오드-125(125I)를 이용하여 세가지 폴리펩티드를 표지화하는 것을 개시하였다.
또 다른 방사성 요오드는 요오드-131(131I)인데, 이것은 우에하라등(Uehara et al., (1))이 기술한 것과 같은 공지방법에 의해 FBD 폴리펩티드를 표지화하는데 사용될 수 있다.
그러나,131I도 또한 반감기가 상대적으로 길어서 8일이다.
최적이기로는, 동맥경화성 병변과 혈전을 임상학적으로 영상화하는데 사용되기 위한 방사능약제는 주사후 처음 수시간안에 양성 결과를 나타내야 한다(33).
이러한 시험을 위하여, 반감기가 짧은 방사성 표지를 사용할 수 있다.
최근의 연구에 따르면 인듐-111(111In)또는 테크네튬-99m(99mTC)이 방사성 추적자로서 보다 적합할 수 있다는 것이 제안되고 있는데, 이는 이들의 반감기가 각각 67시간 및 6시간이기 때문이다.
또 다른 반감기가 짧은 저 에너지 표지는 반감기가 13.3 시간인 요오드-123(123I)이다.
99mTC에 의해 FBD 폴리펩티드를 표지화하는 것은 공지된 방법(21, 33, 34, 35)에 의해 실시할 수 있다.
99mTC는 반감기가 짧고, 감마 계수기를 이용한 검출 수준이 140KeV이며, 특별한 방사능이 없고, 값싸고 편리하게 입수할 수 있다는 점에서 매우 적합한 진단용 단일 광자 방사핵종이다.
이들은 30mCi의 용량을 일상적으로 투여하면, 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층사진촬영에 의해 병변을 검출할 수 있는 수준의 높은 광자속을 발생시킨다(32, 35).
FBD 폴리펩티드를 표지화하는데 사용될 수 있는 다른 방사성 표지에는 나이트(Kni-ght, (4))가 검토한 바 있는 반감기가 5.3일인 크세논-133(133Xe)와 크립톤-81m(81mKr)이 포함된다.
야마모토(Yamamoto, (36))가 기술한 바 있는 또 다른 가능성 있는 방사능 표지는 갈륨-67(67Ga)인데,67Ga은 반감기가 78시간이다.
본발명자들은 문헌[Hnatowich, D.J., Layne, W.W. and Childs. R.L., J. ApplRadiat. Inst. 33 : 327(1982)]에 기술된 인간 혈청 알부민의 경우에 사용되는 방법을 이용하여 r31 KD, r20 KD, r18.5 KD 및 r12 KD 폴리펩티드 및 혈장 31 KD 단편을 표지화하였다.
예비적 실험은, 표지화 FBD 폴리펩티드가 2단계 반응 II(실시예 6)에 의해 측정했을때 생체외에서 미리 형성시킨 혈전에 결합하고, 실시예 7에 기술된 모델에 의해 측정했을때에는 생체내 혈전에 결합되는 것을 보여주었고, 24시간후에 혈전 : 혈액의 비는 80∼200 범위로서 매우 높았다.
12KD와 18.5KD 단백질의 방사능 표지화
기본적으로 문헌 공지의 방법[Hnatowich, D. J. Layne, W.W. and Childs, R. L. (1982). Int. J. Appl. Radiat-Isot. 33 327-332 ; Knight, L. C. Kollman, M. Maurer, A. H. and Budzynski, A. Z.(1987) Biochim, Biophys. Acta 924 45-53]에 따라 DTPA의 고리형 무수물을 이용하여 FBD의 12KD 및 18.5KD 폴리펩티드 단편을 DTPA 변경하였다.
계산된 양의 DTPA 균등체를 함유하는 무수 클로로포름 용액의 부분 표본을 증발시키고, 인산염-또는 중탄산염-완충된 식염수(각각 pH 7.4 및 8.0±0.2)중에서 단백질과 반응을 시켰다.
소모성 투석법에 의해 과량의(가수분해된) DTPA를 제거하였다.
아세트산 나트륨으로 약 pH6으로 중화시킨 HCl 용액중에서 담체가 없는111In으로 표지화를 행하였다.
PBS중에서 행하는 한 실험에서는, 실시예 5에 기술된대로 제조한 12KD 폴리펩티드를 표지화하였는데, (쥐 모델에서 혈전 대 혈액의 비는 86이었고, (하기 참조), 12KD 단백질에 대해 과량의 몰수, 5몰의 DTPA사 사용되었다(12KD 단백질에는 5개의 리실-아미노기와 1의 a 아미노기가 있다).
111In으로 표지화하면, 자유(결합되지 않은)111In(TLC로 검사했을때) 15% 미만인 것으로 추정되었다.
또 다른 실험에서는(PBS 이용), DTPA 무수물과 12KD 단백질 또는 DTPA 무수물과 18.5KD 단백질 사이의 비가 1 : 1이었다.
12KD 1몰당 흡수당 DTPA 잔기의 수를 추정하기 위하여, (과량의 DTPA의 분리전에) DTPA-변형된 단백질을111In로 표지화하였다(상술한 Knight et al.).
흡수된 DTPA 잔기의 수는 12KD 1몰당 0.12인 것으로 나타났다.
DTPA-표지화 된 12KD와 18.5KD 단백질은 대조인 미변형 단백질과 동일한 수퍼로스12(겔-여과)용충 프로필을 갖는다(각각 머무름 시간이 19.17분과 18.29분이다. 대조값은 표 E에 나타내었다).
과량의 DTPA를 분리해낸 후에111In으로 표지화하면, 자유(결합되지 않은)111In의 양은 12KD와 18.5KD 단백질에 대해 각각 28％와 29％인 것으로 나타났는데, 이는(쥐 모델에서의)혈전 대 혈액의 비가 각각 27과 25로 되는 결과를 남는다.
미국특허 4,647,447호에는 NHRI, 초음파 및 금속 킬레이트에 의한 X-선 영상화법이 기재되어 있다.
덧붙여, 금속킬레이트와 결합된 항체는 컬럼 7, 42행에 언급되어 있다.
중합체 상자성 킬레이트에 의해 표지화된 단클론성 항체와 NMRI법에서의 이들의 이용 역시 기술되어 있다[Shreve, P. et al., Magnetic Resonance in Medicine, 3 : 336-340(1986)and Brady, T. et al., Proceedings of the Society of Magnetic Resonance in Medicine, Sec-ond Annual Meeting, Soc. of Magnetic Resonance in Medicine, Inc., San Franci-sco, p 10, 1983 ; Koutcher, J. et al., J. Nucl. Med. 25 : 506∼513(1984)에 의해 인용됨].
[실시예 9]
각종 FBD 폴리펩티드의 생물학적 활성을 입증하는 부가적 실험
r31 KD, r20 KD, r12 KD FBD 폴리펩티드의 생물학적 활성은 실시예 6에 기술되어 있다.
본실시예는 FBD 폴리펩티드 단편들, 즉 실시예 4 및 5에 기술한대로 제조한 12KD 및 실시예 4 및 10에 나타낸대로 제작하고, 산화/재폴딩시키고 정제한 18.5KD를 이용하여 관찰한 부가적인 결과를 개시하는 것이다.
I. 피브린 응괴에의 결합
실시예 6에 기재한 2단계 반응 II를 변형시킨 방식으로 후술하는대로 혈괴 형성과 FBD 결합을 수행하였다.
FBD 폴리펩티드의 인위적인 응집과 침전을 피하기 위하여 최종의 원심분리단계를 생략하고, 혈괴를 새로운 튜브에 옮겨 많이 세척하였다.
a. 기형성된 혈괴의 엉김
감마 계수기의 실리콘 처리된 플라스틱 바이알(7ml)내에서 제조한 반응 혼합물(300㎕)은 150㎕의 혼합물 I[0.2×타이로드 완충액(1×타이로드 완충액 1mM Hepes pH 7.35 : 덱스트로스 0.2％ : 27mM NaCl : 0.76mM NaH2PO4: 0.54mM KCl : 0.2mM MgCl2), 3u/ml트롬빈(Sigma), 0.6％ BSA(Sigma), 15mM CaCl2, 150mM NaCl, 20mM NaHCO3, pH 8.0] 및 150㎕의 구연산염 처리된 신선한 전혈을 포함한다. 프로토콜 : 37℃에서 3시간동안 보온한다.
진공에 의해 혈청을 제거하고, 피브린 응괴를 함유하는 튜브를 -70℃에서 동결 보존한다.
기형성된 혈괴는 수개월간 사용할 수 있다.
b. 기형성된 혈괴에의 FBD의 결합
기형성된 혈괴(실온에서 해동시킴)을 함유하는 바이알에 300㎕ 150mM NaCl, 20mM NaHCO3, pH 8.0(1×타이로드 완충액 : 0.6％ BSA : 5mM CaCl2및 0.15μM125I-FBD 함유)를 첨가한다.
결합 반응은 (외래성 트랜스글루타미나제, 인자 XIIIa의 활성을 억제하기 위해 반응 혼합물에 첨가할 수 있는 0.03％ 요오드아세트산 나트륨의 존재 또는 부재하에)37℃에서 18시간동안 실시한다.
이어 혈괴를 실리콘 처리된 바이알에 옮기고, 1ml의 세척 완충액(20mM NaHCO3, 1％ BSA 1mM PMSF, 2mM EDTA)으로 3회 세척하고 감마 계수기내에서 계수하였다.
혈장 및 재조합 31KF, 그리고 재조합 18.5KD, 12KD(제12도에 나타낸대로 제조한 33KD CBD에 융합된 12KD FBD인) 45KD 및 33KD CBD를 포함하는 결과를 제30도에 나타내었다.
모든 FBD 폴리펩티드 단편들은 비숫한 정도로 결합하는 반면에, CBD 폴리펩티드는 매우 적게 결합할 뿐이다.
트랜스글루타미나제(인자 X III)억제제인 요오드아세테이트의 첨가에 의해 유발된 50-75％ 억제는 결합 반응에 있어서 트랜스글루타미나제가 활성이라는 것을 나타내는 것이다.
33KD CBD가 혈괴에 결합하는 것에 대해 상기 억제제가 영향을 주지 않는 것은, CBD가 혈괴에 결합되는 것이 상이한, 아마도 비특이적인 메카니즘에 의해 중개되는 것을 시사한다.
본출원인과 동일한 출원인에게 양도된 PCT 공개 제 WP 90/07577호(138면, 1-24행)에서 이미 밝힌 바 있듯이, FBD는 피브린 혈괴에 공유적으로 결합한다.
트랜스글루타미나제의 관여와 125 I-FBD-피브린 복합체의 생화학적 특성지적은 적어도 70％의 FBD 폴리펩티드가 피브린에 공유적으로 결합하는 것을 시사한다.
II. 혈관 성분에의 결합
피브린에의 특이적 결합이외에, FBD 폴리펩티드는 그들이 접촉하게 되는 다른 혈관성분들과 어느 정도 비특이적으로 결합한다.
혈관 성분의 예는 상피세포(EC), 세포외 매트릭스(ECM) 및 피브로넥틴(FN)그 자체 일 수도 있다.
이러한 비특이적 결합은 진단적 영상화 절차를 수행할 때 비경 수준을 결정하는 요인중의 하나이다.
비특이적 결합이 낮을수록 영상화의 효율이 높으며, 환자에게 투여되어야 하는 총방사능 시약의 양이 적어진다.
따라서, 12KD FBD 단편과 31KD FBD 폴리펩티드가 비특이적으로 혈관 성분에 결합하는 비교하기 위한 실험을 행하였다.
0.3μM125I-12 KD 또는125I-31 KD의 1ml 부분 표본 0.1％ BSA를 함유하는 PBS에 용해된 형태로 각각 5×105cpm/㎍)를 교회(交會) 상피세포(EC), 세포외 매트릭스(ECM), Eldor et al., Blood 65 : 1477(1985) 또는 고정화 인간 피브로넥틴(FN)을 함유 35mm 페트리 디쉬(Falcon)에 2회 첨가하였다(4℃에서 밤새 보온한후, 이어서 차단하기 위해 1％ BSA-함유 PBS 1ml와 함께 실온에서 2시간 동안 보온한 50㎍/ml FN을 포함하는 PBS 1ml/플레이트).
+TG로 표시하는 경우에는, 플레이트가 트랜스글루타미나제를 0.02u/ml(Sigma)로 함유하는 것을 표시한다.
실험용 플레이트를 CO2배양기내에서 37℃에서 60분간 보온하고, 1ml 세척액(2mM PMSF와 2mM EDTA를 함유하는 PBS)으로 3회 세척하였다.
추출액(1％ 데옥시콜레이트, 2mM PMSF, 2mM EDTA, 2mM NME 및 2mM 요오드아세트산을 함유하는 세척액)과 함께 60분간 보온함으로써 결합 방사능을 추출하였다. 이어 용액을 튜브에 옮기고 감마 계수기내에서 방사능을 측정하였다.
제28도에 요약한 결과는, 31 KD FBD 폴리펩티드의 결합과 비교할때 12 KD FBD 폴리펩티드가 혈관 성분인 상피세포, 세포외 매트릭스 및 피브로넥틴에 약하게 결합되는 것을 보여준다.
III. 세균결합
광범위한 그램-양성 세균이 상처에 흡착 및 침입하는데 있어서 피브로넥틴이 관여하고 있다는 것은 잘 알려져 있다(18).
FN에서 유도된 표폼 혈장의 피브린 결합 도메인은 세균 표면에 있는 특이적 수용체와 높은 친화력으로 상호 작용한다는 것이 밝혀져 있다.
스파틸로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)가 전형적으로 감염을 개시하는 부위는 FN, 예를들면 혈액 및 상피아래에 많이 있다.
나아가 외래성 FN은 세균이 이들 부위에 결합되는 것을 조장한다.
FN은 포화될 수 있는 특이적 표면 단백질 수용체를 통해 에스. 아우레우스에 결합한다.
스캐챠드 분석에 의해 결합 상수가 5×10-9M이고, 세균당 수용체가 100∼20,000개 있는 고친화성 수용체가 밝혀졌다(19).
FN 수용체의 발현은 임상학적 분리물질의 침입성 및 병원성과 상호 관련되어 있다. 기계적 방법에 의해 또는 세균을 항생제의 존재하에 생육시켜 에스. 아우레우스로 부터 FN 수용체를 제거하면 FN에 흡착되는 능력이 감소된다.
FN은 세포 결합 및 콜라겐 활성뿐만 아니라 세균 결합 활성을 갖는 다기능성 도메인으로 이루어진 이가 분자이기 때문에, FN은 세포외 매트릭스의 각종 성분을 통해서, 그리고 조직 세포내의 FN 수용체를 통해서 세균을 상처 부위로 유도할 수 있다.
FN과 에스. 아우레우스 사이의 상호 작용을 이해하기위한 또 다른 접근 방법은 FBD 폴리펩티드 단편에 에스. 아우레우스의 상피세포에의 결합의 억제를 연구하는 것이다.
에스. 아울에우스에 31KD FBD 폴리펩티드가 결합되는 것은 이미(본출원인과 동일한 출원인에게 양도된 PCT 공개 WO 90/07577호, 146∼153면에)개시되어 있다.
후술하는 비슷한 실험은, 31KD FBD 폴리펩티드와 달리 12KD와 18.5KD FBD 폴리펩티드 단편이 에스. 아우레우스에 결합하지 않고 결합실험에서 에스.아우레우스를 억제하지 않는 것을 보여준다.
그러나, 20KD 폴리펩티드는 에스. 아우레우스의 결합을 억제하지 않는데(제8도 참조), 이는 몇몇 특이적 재폴딩을 통하여 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄수있는 부기적인(표품이 아닌) C-말단 아미노산(제2도 참조)대문일 수 있다.
후술하는 난은 에스, 이우레우스에의 직접 결합 및 에스.아우레우스가 상피세포에 결합하는 것의 억제의 측면에서 31KD FBD 폴리펩티드와 기타 다른 FBD 폴리펩티드 단편을 비교하기 위한 것이다.
[재료 및 방법]
A. 표지화 FN 또는 FFBD의 세균에의 결합
1. 용액에서의 직접 결합
부가적으로 0.1％ 트윈 및 1％ BSA를 함유하는 PBS 용액에 들어있는 5×108에스.
아우레우스 세균에 각종 농도의125I-r31 KD FBD 또는125I-FN을 첨가하였다.
최종 부피는 1ml 이었다.
세균의 첨가후 즉시 취한 20㎕ 부분표본을 이용하여 반응의 총 방사능을 분석하였다.
혼합물을 계속 흔들어주면서 20℃에서 2시간동안 보온하였다.
100㎕의 보온 혼합물을 취하여 5ml 실리콘 처리된 튜브에 들어있는 10％ 퍼콜(Percoll)-0.15M NaCl 3ml 위에 층을 이룬 0.5ml PBS의 꼭대기에 놓았다.
이것을 20℃에서 15분간 1,350×g(SW 버켓 로터내에서 4,000 rpm)에서 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 펠릿의 방사능을 분석하였다.
2. 표지화하지 않은 FN, FBD 및 관련 분자들과의 경쟁
후술하는 방법은, 소정량의 경쟁분자(FN 또는 FBD)를 초기 결합 혼합물에 첨가하고 3㎍/ml125I-P31KD를 사용한 것을 제외하고 상술한 방법과 동일하다.
플라스틱 바이알에 50㎍/ml FN 또는 1％ BSA 0.3ml를 도포하였다.
튜브를 진탕하면서 4℃에서 밤새 보온시켰다.
이어 튜브를 5ml PBS로 3회 세척하였다.
이어 PBS에 녹인 1％ BSA 0.31ml를 첨가하고, 튜브를(유리된 부위를 차단하기 위하여) 20℃에서 2∼3시간동안 진탕하에 보온하였다.
간접-결합 실험에서는, 세균을 억제제와함께 4℃에서 24시간동안 예비 보온하였다.
세균(4×106pfu/ml, 3pfu/cpm)을 도면의 설명 부분에 지시되어 있는 농도로 비이알에 첨가하였다.
분석 혼합물의 최종 부피는 0.3ml PBS 이었다.
혼합물을 4℃에서 90∼120분간 천천히 진탕하였다.
이어 튜브를 경사분리하고 5ml PBS로 3회 세척하였다.수있는 부기적인(표품이 아닌) C-말단 아미노산(제2도 참조)대문일 수 있다.
후술하는 난은 에스, 이우레우스에의 직접 결합 및 에스.아우레우스가 상피세포에 결합하는 것의 억제의 측면에서 31KD FBD 폴리펩티드와 기타 다른 FBD 폴리펩티드 단편을 비교하기 위한 것이다.
[재료 및 방법]
A. 표지화 FN 또는 FFBD의 세균에의 결합
1. 용액에서의 직접 결합
부가적으로 0.1％ 트윈 및 1％ BSA를 함유하는 PBS 용액에 들어있는 5×108에스.
아우레우스 세균에 각종 농도의125I-r31 KD FBD 또는125I-FN을 첨가하였다.
최종 부피는 1ml 이었다.
세균의 첨가후 즉시 취한 20㎕ 부분표본을 이용하여 반응의 총 방사능을 분석하였다.
혼합물을 계속 흔들어주면서 20℃에서 2시간동안 보온하였다.
100㎕의 보온 혼합물을 취하여 5ml 실리콘 처리된 튜브에 들어있는 10％ 퍼콜(Percoll)-0.15M NaCl 3ml 위에 층을 이룬 0.5ml PBS의 꼭대기에 놓았다.
이것을 20℃에서 15분간 1,350×g(SW 버켓 로터내에서 4,000 rpm)에서 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 펠릿의 방사능을 분석하였다.
2. 표지화하지 않은 FN, FBD 및 관련 분자들과의 경쟁
후술하는 방법은, 소정량의 경쟁분자(FN 또는 FBD)를 초기 결합 혼합물에 첨가하고 3㎍/ml125I-P31KD를 사용한 것을 제외하고 상술한 방법과 동일하다.
3. 방사능 표지화 세균의 고정화 FN에의 결합
플라스틱 바이알에 50㎍/ml FN 또는 1％ 0.3ml를 도포하였다.
튜브를 진탕하면서 4℃에서 밤새 보온시켰다.
이어 튜브를 5ml PBS로 3회 세척하였다.
이어 PBS에 녹인 1％ BSA 0.31ml를 첨가하고, 튜브를(유리된 부위를 차단하기 위하여) 20℃에서 2∼3시간동안 진탕하에 보온하였다.
간접-결합 실험에서는, 세균을 억제제와함께 4℃에서 24시간동안 예비 보온하였다.
세균(4×106pfu/ml, 3pfu/cpm)을 도면의 설명 부분에 지시되어 있는 농도로 비이알에 첨가하였다.
분석 혼합물의 최종 부피는 0.3ml PBS 이었다.
혼합물을 4℃에서 90∼120분간 천천히 진탕하였다.
이어 튜브를 경사분리하고 5ml PBS로 3회 세척하였다.
3H-표지화 세균의 결합을 분석할때 신틸레이션액 5ml를 첨가하였다.
B. 에스.아우레우스가 상피세포에 결합되는 것에 있어서 FBD 단편에 의한 억제
I. 에스. 아우레우스의 요오드화
에스. 아우레우스 SA 113(ATCC 수탁번호 35556)을 11 발효기를 이용하여 37℃에서 트립틴 소이 브로쓰(Tryptic Soy Broth ; Difco Laboratories, U. S. A.)에서 생육시켰다.
대수기의 중간에서 광학 밀도가(660nm)에서 2.30 OD에 도달하였을때 세균을 수확하였다.
세균 세포 펠릿을 5mM PMSF-함유 PBS 500ml에 재현탁시키고 3회 세척하였다.
세포를 다시 1mM PMSF 및 5mM NEM(N-에틸 말레이미드, Sigma E-3876)과 함께 100ml PBS에 현탁시키고, 88℃에서 20분간 열불활성화하여 고정시키고, 빙수에서 냉각한 후 -20℃에서 소량의 부분표본으로 나누어 저장하였다.
사용전에, 세균의 농도를 5×109PFU/ml로 조정하였다.
단백질 요오드화 시약인 볼톤-헌터(Bolton-Munter)시약(Amersham)의 100μCi 부분 표본을 얼음위에서 유리관에서 증발시켰다.
세균 현탁액(1ml)을 증발시킨 시약에 첨가하고 10분간 얼음위에서 부드럽게 혼합하였다.
50mM 인산칼륨 완충액 pH 8.5에 용해시킨 0.2M 글리신 1ml를 첨가하여 반응을 종결시켰다.
이어 반응 혼합물을 1mM PMSF-함유 PBS 20ml에 현탁시켰다.
3000rpm 5℃에서 10분간 원심분리한후, 세척단계를 2회 반복하였다.
최종 펠릿을 5mM PMSF-함유 PBS 2.2ml에 현탁시키고 -20℃에서 보관하였다.
비활성은 일반적으로 20∼100 PFU/cpm 이었다.
II. 상피세포의 생육
공지되어 있는 대로(Ogawa S. K. et al. 1985, Infect. Immunol. 50 : 218∼224), 소 동맥 상피세포 A5P7(예루살렘에 있는 하닷사 병원의 A. Eldor로 부터 입수)을 조직 배양으로 유지하였다.
배양 배지는 L-글루타민과 젠타마이신(각각 7mM과 5mg/ml, 모두 Sigma Chemicals에서 입수)이 보강되어 있고, DMEM/+1％ 글루코스 및 10％ FCS(둘다 모두 이스라엘 키부츠 베트-하멕에 소재하는 Biological Industries에서 입수)를 함유한다.
세포를 150ml 조직 배양용 플라스크(Falcon)내에서 37℃ 및 5.5％ CO2내에서 유지하였다.
24웰 조직 배양 플레이트나 35mm 조직 배양 플레이트(Corning Glassware, Corning N.Y.)를 이용하여 결합 실험을 위한 교합 단층을 준비하였다.
웰과 플레이트를, 세포 현탁액을 첨가하기 전에 미리, 0.5ml 또는 1ml의 완전 배지와 함께 30분간 보온하였다.
전형적인 실험에서는 웰과 플레이트에 각각 5×104와 5×105세포를 접종하고, 배양물이 교합되기 시작하는 3∼4일후에 사용한다.
III. 상피세포에의125I-에스, 아우레우스의 결합
이 방법은 기본적으로 상술한 문헌(Ogawa et al., 1985)에 기술된 방법과 동일하다.
상술한 대로 제조한 표지화된 에스.아우레우스 부분 표본을 PBS로 108/ml로 희석하였다.
200UL DMEM+10％ FCS, 33 uL 150mM NaCl(20mM NaHCO3함유), 17μl의 PBS 또는 시험하고자 하는 경쟁자를 함유하는 혼합물에 표지화 세균 3.5μl를 첨가한후 부드럽게 혼합하면서 2시간동안 보온하였다.
이어 세균을 상술한 대로 미리 생육시킨 상피세포의 교합 단층에 첨가하였다.
상피세포를 분석진전에 식염수로 세척하였다.
혼합물을 4℃에서 1시간동안 온화한 진탕하에, 또는 37℃에서 5％ CO2하에 진탕하지 않고 보온하였다.
결합되지 않은 표지화 세균은 2mM PMSF와 2mM EDTA를 함유하는 냉 PBS로 3회 세척하여 제거하였다.
결합된 표지화 세균은, 1％ 데옥시콜레이트, 20mM 트리스 HCl pH 8.3, 2mM PMSF, 2mM EDTA, 2mM NEM 및 2mM 요오드아세트산을 함유하는 PBS를 이용하여 실온에서 1시간동안 진탕하여 추출하였다.
추출을 1회 더 반복하고, 합한 추출물을 감마 계수기내에서 계수하였다.
결과
A. 용액내에서125I-FN 또는 FBD에의 세균의 결합
1. 직접 결합
현탁액내에서 에스.아우레우스 세균에125I-FN 또는125I-rFBD가 결합되는 것을 측정하기 위해 실험을 수행하였다.
다양한 양의 방사능 FN 또는 r31 KD를 5×108세균에 가하고, 2시간동안 보온한후, 10％ 퍼콜-식염수 용액을 이용하여 원심분리하였다.
펠릿중의 방사능을 모니터하였다.
결과는,125I-FN가 비교할때125I-rFBD(r31 KD)가 현탁액내에서 더 잘 세균에 결합되는 것을 보여준다.
이렇듯 에스. 아우레우스에 대한125I-FN 결합에 비교하여125I-rFBD가 에스.아우레우스에 더 잘 결합하는 것은, 온전한 혈장에서 유래된 FN의 이가 다중도메인에 비교하여 보다 높은 일가 도메인의 친화력 때문일 수 있다.
12 KD와 18.5 KD FBD 단편을 갖고 행한 비슷한 실험들은 전혀 결합을 보여주지 않았다.
2. 순수한 무표지화 FN, FBD 및 관련 분자들의 경쟁
경쟁자인 각종 FBD 분자의 양을 증가시키면서 고정된 양의125I-P31KD(3㎍/ml)를 5×108세균과 함께 보온하였다.
결과는 순수한FN 뿐만아니라 올바르게 폴딩된 P31KD 또는 r31 KD FBD가 비슷한 방식으로125I-P31KD가 에스.아우레우스에 결합되는 것을 억제함을 입증하는데, 이것은 재조합 31 KD가 천연의 혈장-유래 분자만큼 활성을 갖는다는 것을 시사한다.
그러나, 환원된(헝크러진)형태의 재조합 또는 혈장 유래 FBD는125I-FBD가 세균에 결합하는 것을 최소한으로 억제하는데, 이는 결합을 위해서는 적절한 폴딩이 이루어져야 한다는 것을 시사한다.
나아가, CBD 폴리펩티드(FN의 33KD 세포 결합 도메인)뿐만아니라 r 18.5KD 및 r12 KD FBD 폴리펩티드는125I-pFBD가 에스. 아우레우스에 결합하는 것과 경쟁을 하지 않는데, 이는 결론적으로 완전한 31 KD FBD 도메인은 세균 결합 활성을 갖는 반면에 보다 짧은 FBD 단편은 세균에 결합되지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
B. 고정화 FN에의 표지화 에스. 아우레우스의 결합
세균이 상처중의 세포외 메틱스에 흡착하는 것을 방해하는 rFBD(r31 KD)의 능력을 평가하기 위하여, 경쟁 분석법을 개발하였다.
이 분석에서는 FN이 피복된 플라스틱 표면에 에스.아우레스가 부착되는 것 및 FBD가 이 결합을 방해하는 것을 측정하였다.
결과는 FN-피복 플라스틱 바이알에 에스.아우레우스가 부착되는 것은 에스.아우레우스와 FN, pFBD(31 KD)또는 rFBD(31 KD)와의 예비 보온에 따라 억제되는 것을 입증한다.
이들 분자에 의한 억제의 정도는 유사하다.
에스.아우레우스 결합 부위를 갖지 않는 관련되지 않은 단백질인 BSA는 FN-피복된 플라스틱 바이알에 방사능 표지화된 에스.아우레우스가 부착되는 것을 전혀 억제하지 않는다.
12 KD FBD를 갖고 실시한 비슷한 실험에서, 고정화 FN에 에스.아우레우스가 부착되는 것의 억제는 전혀 검출되지 않았다.
C. 에스.아우레우스가 상피 세포에 결합되는 것의 억제
제29도는 상술한 대로 에스.아우레우스가 상피세포에 결합하는 것을 FBD 단편이 역제하는 것을 보여준다.
31 KD는 에스.아우레우스가 상피 세포에 결합하는 것을 현저하게 그리고 용량 의존적으로 억제한다.
그러나, 18.5 KD와 12 KD는 전혀 억제효과를 나타내지 않는데, 이는 에스.아우레우스 수용체에 대한 FBD상의 결합 부위가 12 KD와 18.5 KD 단편에서는 발견되지 않는 것을 드러낸다.
이러한 것은, 피브로넥틴의 FBD의 세균성 결합 도메인이 에스.아우레우스 결합 도메인과 분리될 수 있다는 것을 입증하는 첫번째 자료이기 때문에 놀라운 결과이다.
요약과 결론
표 C는 상술한 각종 FBD 폴리펩티드 단편들의 활성을 요약 및 비교하고 있다.
각종 FBD 폴리펩티드 단편의 활성 및 결합 특이성의 비교
따라서, 18.5 KD와 12 KD FBD 폴리펠티드 단편은 피브린에 대해 높은 공유결합 특이성을 갖는 한편, 나아가 31KD에 비하여 활성의 스펙트럼이 좁고, 혈관 성분같은 다른 리간드에 대한 특이성이 낮다는 것을 알 수 있다.
이러한 것은 혈전 영상화제로서의 유리한 특성이며, 이들이 진단용시약으로서 피브린-함유 혈전에 대해 높은 친화력을 갖고, 배경수준을 낮게 유지할수 있게끔 한다.
이와 동일한 생체내 실험에는 실시예 13에 나타나 있다.
[실시예 10]
짧은 FBD 폴리펩티드 단편을 재폴딩/산화 및 정제하는 개량방법
재조합 FBD 단백질들, 즉 r31 KD(5 핑거), 18.5 KD(전술한 바 있는 20KD보다 표품에 가까운 3 핑거) 및 r12 KD(2 핑거)를 이.콜리내에서 발현시키고, 균질하게(98％ 순도) 정제하기전에 재폴딩/재산화시켰다.
완전한 31KD FBD 폴리펩티드(5-핑거)와 보다 짧은 12 KD와 18.5 KD FBD 폴리펩티드 단편들(각각 2-핑거 및 3-핑거)에 대해 사용된 재폴딩/재산화 방법은 서로 상이하며 상기 실시예 2와 5에 기술한 바 있다.
실시예 5의 방법은 재폴딩된 2-와 3-핑거 FBD 단백질 모두에 적용할 수 있는 반면, 5-핑거 단백질에는, 정제된 혈장-유래 31 KD을 환원 및 이어서 재산화시킨 경우에도, 즉 단백질을 개방하고 재폴딩시 키는 경우에도 적용할 수가 없었다.
이 방법은 최근에 재폴딩 과정의 원리에 변화를 주지 않으면서 개량되었으며, 이 개량된 방법은 12 KD, 18.5 KD 및 20 KD 폴리펩티드, 그리고 45 KD FBD-CBD 융합폴리펩티드(12 KD-33 KD)에는 적용 가능한 것으로 밝혀졌지만 31 KD 폴리펩티드에는 적용할 수 없다.
이 방법은 그 원리는 실시예 1에 기재된 대로이다.
후술하는 설명은 12 KD 폴리펩티드에 관한 것이며, 18.5 KD FBD 폴리펩티드와 45 KD BFD-CBD 융합 펠리펩티드에 대해서도 비슷한 결과가 얻어졌다.
이들 폴리펩티드는 각각 플라스미드 pFN 203-2(제27도), pFN 208-13(제23도) 및 플라스미드 pFN 202-5(제12도)에 의해 발현되었다.
세균 균체는(제27도에 기술한) 플라스미드 pFN 203-2를 보유하는 이.콜리 주 A4255를 배양하여 실시예 2에 기재된 대로 생산하였다.
A. 세균 균체의 조가공 : 2- 및 3-핑거 FBD 단백질의 경우와 유사한 방식으로 펠릿의 세척 및 추출을 행하였다(실시예 5 참조).
세균 균체를 20부피의 50mM 트리스 HCl, 50mM EDTA, pH 7.4에 현탁시켰다.
15분간 교반한후, 현탁액을 다이노밀(Dynomill) KD 5 비드 멀에 51/시간의 속도로 2회 통과시켜 파쇄하였다.
파쇄 현탁액을 세파(Cepa) 101 원심분리에서 매시간당 801의 공급 속도로 원심분리하였다(1400×g).
펠릿을 상기 완충액에 최종 부피가 최초 세균 균체의 건조 중량의 10배에 해당하는 양으로 현탁시켰다.
현탁액을 37℃로 되게하고 리소자임(2500U/ml)을 첨가하였다.
37℃에서 2시간동안 교반한후, 트리톤 X-100(1％)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하에 보온하였다.
현탁액을 동일한 부피의 탈 이온수로 희석하고, W 370 초음파기를 이용하여 초음파 처리하고, 상기와 동일한 조건하에서 1400×g로 원심분리하였다.
펠릿을 세균 균체의 건조 중량의 부피의 16배 되는 최종 부피로 탈이온수에 현탁시킴으로써 2회 세척하고, pH 7.4에서 실온에서 15분간 교반하였다.
교반후에, 현탁액을 W 370 초음파기로 초음파처리하고 상기와 동일한 조건하에서 1400×g로 원심분리하였다.
FBD 폴리펩티드의 봉입체를 함유하는 세척 및 추출된 펠릿은 추후 처리하기 까지-20℃에서 동결 보존하였다.
B. 재폴딩/재산화 : 얻어진 세척된 봉입체(100g, 이는 건조중량 19.2g을 의미한다)를 5부피의 10mM 트리스 HCl pH 8.0, 5mM EDTA, 1mM 페논메탄설포닐플루오라이드(PMSF), 10mM-아미노카프로인산, 및 부가적으로 6M 구아니딘 HCl을 함유하는 완충액(최종 부피 600ml)에 용해시켰다.
2.27ml의-메칸토에탄올(최종 농도 : 50mM)을 첨가하여 시료를 환원시키고 공기의 부재하에, 밀봉 용기내에서 실온에서 90분간 교반하였다.
환원된 단백질을 다음과 같이 0.54M 구아니딘 HCl중에서 단백질 농도 0.81mg/ml로 재산화시켰다.
부가적 0.3mM 산화형 글루타치온(GSSG)을 함유하는 산화 완충액(10mM 트리스 HCl, pH 8.0, 5mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM-아미노카프로인산) 61를 150ml/분의 속도로 교반하면서 환원 단백질 용액에 첨가하였다.
계속해서 부드럽게 교반하면서, 폐쇄 용기내에서 실온에서 65시간동안 산화방법을 계속하였다.
재산화된 단백질 용액을 화트만(Whatman) No. 3여과지로 여과하여 침전물을 제거하고, 분자량 분획 3KD의 막이 구비된 펠리콘(Pellicon) 접점 유출 한외여과 장치상에서 10배로 농축하고, 구아니딘 HCl,-메칸토에탄올 및 GSSG를 제거하기 위해 동일한 막위에서 투석 여과하였다.
4℃에서 밤새 방치하여 전개시킨 그외의 침전물은 22,500×g에서 45분간 원심분리하여 제거하였다.(18.5 KD와 45 KD 폴리펩티드의 경우에는, 분자량 분획이 10 KD인막을 이용하여 한외여과와 투석여과를 실시하였다).
C. 정제 : 농축 및 청정화한 용액(700ml)를 10mM 트리스 HCl, 5mM EDTA, 1mM PMSF, 10mM-아미노카프로인산 pH 8.0으로 평형화한 Q-세파로스 컬럼(2.5×28.5cm)에 로딩하였다.
45 KD 단백질을 함유하는 초기 용출 분획을 170∼350mg씩 10mM 트리스 HCl, pH 8.0 5mM EDTA로 평형화한 헤파린-세파로스 컬럼(2×6.5cm)에 로딩하였다.
결합되지 않은 단백질은 상기 완충액으로 세척한후, 결합된 단백질을 500mM NaCl을 더 함유하는 동일한 완충액으로 용출시켰다.
용출액을 모아 -20℃에서 동결 보존하였다.
상술한 대로, 이 방법은 약간의 수정을 가하여 18.5 KD 폴리펩티드와 45 KD FBD-CBD 융합 단백질에도 적용하였다.
이들 2 폴리펩티드에서 얻어진 결과는 12 KD 폴리펩티드에서 얻어진 결과와 매우 유사하다.
폴리펩티드의 안정성을 확보하기 위해서는 헤파린-세파로스 컬럼에서의 용출 및 저장을 위해 적어도 0.5 NaCl을 함유하는 완충액을 사용하는 것이 필요하다는 것이 밝혀졌는데, 그렇지 않으면 빠르게 그의 활성을 상실하는 경향이 있다.
이러한 것은 특히 31 KD 폴리펩티드의 경우에 그렇다.
[실시예 11]
FBD 폴리펩티드 단편의 특성지적
I. 방법
본 발명의 방법에 의해 제조한 FBD 단편을 당업계에 공지된 후술하는 방법에 의한 일련의 특성지적 시험에 의해 평가 및 비교하였다.
1. SDS-PAGE+ME(ME=-머캅토에탄올) : 1％ SDS를 함유하는 시료 완충액중에서 5분간 끓여 에비 처리한 단백질을 환원 조건하에(+1％ ME) 12.5％ 아크릴아미드 슬랩 겔에 로딩하였다.
레인당 20㎍을 이용하기 전기 영동을 행하고, 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)를 이용하여 겔을 염색하였다.
측정된 변수는 a) 이동성[이 이동성은 분자량 마커(94, 67, 43, 30, 20.1 및 14.4 KD)와 비교했을때 연구하고자 하는 단백질의 겉보기 분자량으로 나타낼 수 있다]; b) 균질성 또는 순도[이것은 주요 밴드 및 소량성분 밴드의 상대적 강도로 부터 평가할 수 있다]이다.
b)의 경우, 특히 이러한 조건하에서는, 디설파이드-연결된 다이머의 양을 평가할 수 있다.
3. 수퍼로스 12상에서의 겔 여과 : 액체 크로마토그래피 컨트롤러 LCC-500 및 레코더가 장착된 FPLC 장치(Pharmacia Fine Chemicals), 또는 2개의 펌프(모델 501), 주입기(모델 U6K) 및 가변 파장 검출기[스펙트로-모니터 3000(LDCMilton Roy)]와 크로마토-인테그레이터(Merck-Hitachi, 모델 2000)가 장착된 자동화 구배 콘트롤러(모델 580)로 이루어진 HPLC 시스템(Waters Associates)에 부착되어 있는 수퍼로스 12컬럼(HR 10/30, Pharmacia Fine Chemicals)상에서 얻어진 용출 프로필로부터 단백질 제제의 겉보기 분자량과 균질도를 평가하였다.
컬럼은 머무름 시간이 측정되어 있는 다음의 분자량 표준물질로 보정하였다.
소 혈청 알부빈(67KD), 난 알부민(43 KD), 키모트립시노겐(25 KD) 및 리보누클레아제(13.7 KD).
표준 용액 완충액, 즉 150,mM NaCl-20mM 트리스 HCl, pH 7.8∼8.0을 이용한 용출 속도는 0.8ml/분이었다.
두가지의 변수, 즉 머무름 시간과 반분자량 밴드넓이를 모니터하였다.
4. UV 분광법
프린터/플로터가 구비된 필립스(Philips) UV/비스 스캐닝 분광 측정기 모델 PU 8720(밴드넓이 2nm)상에서, 0.2∼1mg/ml의 농도로 함유하는 BBS 또는 PBS에서 실온에서 스펙트럼을 얻었다.
투과경로 길이가 10mm인 파이우니캄(Pye Unicam) UV 실리카 셀을 이용하여 스펙트럼을 측정하였다.
두개의 흡수 계수, 즉 스펙트럼의max 상에서의1％ 및 흡광도max와min 사이의 비를 모니터하였다.
5. 고유 형광 : 25℃±0.1℃에서 자스코(Jasco)분광형광 측정기를 이용하여 데이터를 얻었다.
여기 파장은 280nm이었고, 여기 슬릿과 방출 슬릿은 모두 5nm로 고정시켰다.
분석에서의 단백질 농도는 PBS 또는 신선한 BBS, pH 7.5에 용해시켜서 8∼25㎍/ml이었다.
측정된 두개의 변수, 즉max(초대 스펙트럼의 파장) 및 비강도(단백질 농도(mg/ml)로 정상화한 최대 스펙트럼에서의 형광 강도)모두 현저하게 pH의존성을 보였다.
6. 아미노산 조성 : 이 시험은 아미노산 분석을 위한 스타인과 무어(teinMoore)의 방법학에 따라 수행하였다.
스피드 백(Speed Vac) 원심분리기(Savant)내에서 다음의 처리를 행하여 건조 단백질에 대한 단백질 분석을 실시하였다.
6. ON HCl을 단백질 1mg 마다 1ml씩 첨가하고, 연속적인 탈기 및 질소 주입시에 의해 공기를 질소로 치환하였다.
시험관을 밀봉하고 110±0.1℃에서 22시간 동안 가열하였다.
현재 사용되는 방법은 본질적으로 문헌[Biotechnology-Derived Products, 1989 USP의회. Inc.954PP 96-88]에 기재된 USP 입안에 일치한다.
사용된 분석기는 바이오트로닉(Biotronic) LC 5000, 일련번호 515-01이다.
이 방법에 의해 평가된 변수는 Cys과 Trp을 제외한 각 아미노산 잔기의 수이다.
7. 헤파린-세파로스 크로마토그래피 : 2개의 펌프(모델 501), 주입기(모델 U6K) 및 가변 파장 검출기[스펙트럼-모니터 300(LDC/Militon Roy)와 크로마토-인터그레이터(Merck-Hitachi, 모델 2000)가 장착된 자동화 구배 콘트롤러(모델 580)로 이루어진 HPLC 시스템(Waters Associates)에 부착되어 있는 분석용 헤파린 세파로스 컬럼(5.5×0.5cm)에 200μl 미만의 시료를 주입하였다.
컬럼은 10mM Na-인산염 pH 6.5, 75mM NaCl로 0.5ml/분의 유출 속도로 예비평형화하고 동일한 완충액으로 5분간 세척하였다.
단백질은 완충액에 용해시킨 NaCl 75∼500mM의 직선상 농도구배에서(37.5분 송)용출되었다.
단백질이 용출되는 염농도에 비례하는 머무름 시간(ret. time)과 피크의 균질성을 나타내는 반높이 밴드 넓이(half-ht. b.w.)의 두가지 변수를 측정하였다.
8. 역상 HPLC 크로마토 그래피 : 시료를 1.7항에서와 같은 HPLC 시스템에 부착된 분석용 워터스 C18본다팍(Waters C18Bondapak) 역상 칼럼(30×0.39cm)에 주입하였다.
컬럼은 1ml/분의 유출 속도로 80％ H2O, 0.1％ TFA/20％, 아세토니트릴, 0.08％ TFA로 예비 평형화하고 동일 용매로 5분간 세척하였다.
단백질은 40％ H2O-0.1％ TFA : 60％ 아세토니트릴-0.08％ TFA의 직선상 구배에서 40분에 걸쳐 용출되었다.
머무름 시간(ret. time)과 피크의 균질성을 나타내는 반높이 밴드 넓이(half-ht. b.w.)를 평가하였다.
9. 트립신분해지도 : 각종 배치의 시료 200㎍을 각종 트립신 W/W 비율, 즉 0.25％, 0.5％, 1.0％, 2.5％, 5.0％ 및 10.0％에서 37℃에서 10분간 소화시켰다.
5mM PMSF를 이용하여 반응을 종결시키고, 얼음위에서 30분간 방치한후 시료 완충액±ME(1.1 및 1.2항 참조)로 처리하고 상술한 대로 20％ 아크릴아미드 슬랩 겔에서 전개시켰다.
쿠마씨 브릴리언트 블루염색후에 밴드 패턴들간의 균등정도를 평가하였다.
10. 단백질내의 티올 측정을 위한 엘만(Ellman)의 방법 : 티올기가 완전히 노출되도록 하기 위하여, 변성 단백질에 대해 측정하였다.
원액 : 1. 10mM 트리스 HCl pH 8에 용해시킨 구아니딘-HCl(가능한한 최고의 순도의 것) 7.2M(GyClO ; 2. 10mM K-인산염 완충액 pH 7에 용해시킨 DTNB(엘만의 시약) 5×10방법 : 10∼100μM의 티올기를 함유하는 단백질 시료를 0.15ml를 만들고, (단백질이 포함되어 있지 않은)DTNB 블랭크, 0.75ml의 GuCl 7.2M을 최종 농도 6M로 첨가하였다.
실온에서 15∼30분간 보온한후, 단백질 용액의 블랭크를 412nm에서 흡광도를 측정하였다.
이어서, 100μl DTNB를 최종 농도 5×10-4M로 첨가하였다.
실온에서 30분간 보온한후, 시료의 흡광도를 DTNB 블랭크에 대해 412nm에서 측정하였다.
=13,600M-1cm-1, 즉 100μM의 티올기가 1.36의 흡광도를 나타낸다는 식을 이용하여 농도를 계산한다.
11. 침전/흡착
동결125I-FBD를 함유하는 에펜도르프 튜브를 실온에서 해동시킨후 볼텍싱에 의해 혼합하였다.
방사능 측정을 위해 두개의 5μl부분 표본을 취하였다.
높은 비활성의125I-FBD가 사용되는 경우에는, 계수하기 전에 실리콘처리 튜브내에서 고염 완충액(0.6M NaCl-20mM NaHCO3, pH 8-9)으로 희석해야만 한다.
이 원액을 에펜도르프 원심분리기내에서 최고 속도로 원심분린한 후 상층액을 다른 실리콘처리 튜브로 옮겼다.
두개의 5μl 부분 표본은 다시 계수하였다.
원심분리 전후에 얻어진 방사능간의 차이는 침전율을 표시한다.
125I-FBD를 실리콘 처리된 튜브내에서 고염(0.6M NaCl)완충액내에서 -70℃로 동결 보존한 경우에는, 단백질은 매우 안정하다.
본 발명자들은 2주 이내에는125I-FBD의 0.7％만이 침전되는 것을 관찰하였다.
그러나, 실리콘 처리되지 않은 튜브를 이용하여 저염(150mM NaCl)완충액에서 보존하면,125I-FBD 침전은 2-3일내에 60-80％로 감소된다.
이러한 조건하에서 침전과 튜브에의 흡착 모두가 실제로 일어난다.
12. FBD와14C-푸르레신과의 반응
이 반응에서는 인자 XIIIa의 트랜스글루타미나제 반응에 FBD의 Gln ＃3이 접근할 수 있는 가능성을 측정한다.
방법 : 실리콘 처리된 에펜도르프 튜브내의 반응 혼합물(100μl)은 10mM CaCl2, 50mM 트래스 HCl(pH 7.5), 5mM DTT, 120μM14C-푸트레신(Sigma), 6μM FBD 및 0.05U/ml 기니아 키그 간 트랜스글루타미나제(Sigma)를 함유한다.
실온에서 0, 15, 30 및 60분간 보온한후, 200μl의 종결 시약(0.4mg/ml BSA, 50mM EDTA, 150mM NaCl, 20mM NaHCO3, pH 8.0)을 함유하는 튜브에 0℃에서 (얼음위에서) 부분 표본 10μl를 첨가하였다.
냉 20％ TCA(250μl)를 첨가하고 얼음위에서 10분간 보온한후, 냉 20％ TCA 3ml를 더 첨가한후, 유리 섬유 필터(Whatman GF＼C)상에 튜브의내용물을 여과하였다.
필터를 냉 20％ TCA로 3회, 그리고 70％ 에탄올로 1회 세척하였다.
베타 계수기를 이용하여 TCA에 의해 침전되는 방사성 물질을 모니터하였다.
FBD중의 Gln ＃3이 트랜스글루타미나제 반응에 접근할 수 있는 가능성은,14C-푸트레신의 비활성 및 반응 혼합물중의 FBD의 농도를 토대로 하여 계산하였다.
총계수의 5％가 혼입되었으면 이는 100％ 접근 가능성에 해당한다.
13. 자가 결합
0.1×타이로드 완충액, 0.6％ BSA, 5mM CaCl2, 0.15μM125I-FBD 및 6μl 트랜스글루타니미제(0.02U/ml)를 함유하는 150mM NaCl-20mM NaHCo3300μl 중에서 반응을 행하였다(제12항 참조).
반응혼합물을 37℃에서 18시간 동안 보온하고, 반응 용액을 진공 증발시키고, 세척 완충액 1ml로 3회 세척하고 감마 계수기내에서 방사능을 측정하였다.
II. 결과
모든 FBD 단백질은 아미노 말단에 여분의 메티오닌을 포함하고 있고, 코딩된 Gln이 번역후 변형되어 생긴 p31KD의 차단된 N-말단인 피로글루타메이트 잔기 대신에 N-말단 Met에 이어서 Gln 잔기가 있다.
겔의 웨스턴 블럿 분석 및 항-20 KD로 발현시키는 것에 의해 FBD 단백질이 존재하는 것을 확인하였다.
45 KD는 항-20KD 및 항-세포 결합 도메인 33KD 모두를 이용하여 블럿을 발현시켜 존재를 확인하였다.
FBD 단편과 45 KD FBD-CBD 융합 폴리펩티드는 (a) 31 KD와의 비교란에서 상술한 바 있는 물리화학적 시험법(표 C 및 D 참조).
(b) 생체외에서의 생화학적 및 생물학적 시험 : 트랜스글루타미나제-촉매 트랜스아미드화 반응에 Gln ＃3이 접근할 수 있는 가능성(표 C 및 D 참조); 및 자가결합(기형성된 피브린 응괴에의 결합은 실시예 9에 기술되어 있음).
(c) 생체내에서의 생물학적 시험 : 실시예 13에 기재되어 있는 쥐에서의 정맥 혈전에의 결합과 같은 각종 방법에 의해 특성 지적하였다.
표 D는 FBD 폴리펩티드 및 FBD-CBD 융합 폴리펩티드의 화학적 및 물리화학적 특성 지적에서 분석한 변수들을 나타내고 있다.
12 KD, 18.5 KD 및 45 KD는 각각 플라스미드 pFN 203-2, pFN 208-13 및 pFN 202-5에 의해 생산되었다.
표 E는 분석된 FBD 폴리펩티드에 대해 실제로 측정된 값을 보여준다.
[실시예 12]
FBD-SM 복합체를 이용한 특이적 혈전용해
I. 도입
간단하고 효율적인 피브린-특이적 혈전용해는 제약산업에서 중요한 과제의 하나이다.
이러한 약제를 개발하고자 하는 본발명자들의 접근 방법은 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인(FBD)이 인자 XIIIa에 의한 피브린 응괴에 특이적으로 교차 결합한다는 관찰을 토대로 하고있다.
새로이 형성되는 혈전은 활성화 인자 XIII가 풍분한 환경에 불과하므로, FBD는 오래된 혈전보다는 새로운 혈전에 더 잘 결합할 것이며 궁극적으로 타게팅 부형제가 될 수 있다.
따라서 본발명자들은 화학적 교차 결합에 의해, 키메라 FBD-스트렙토키나제 접합체를 생산하고, 혈괴 용해에 있어서의 그들의 활성을 분석하였다.
조직 플라스미노겐 활성화제(TPA)와 스트렙토키나제(SK)는 심혈관 치로에 사용되는 최선의 피브린 용해제로 알려져 있다.
TPA와 SK는 모두 피브린을 분해하지만, 이들은 작용기작에 있어서 상이한다.
TPA는 피브린-선택성 플라스미노겐·활성화능을 나타낸다.
TPA의 선택성은 이 분자의 아미노말단 영역에 피브린 결합 부위가 존재하는 것에 기인한다.
TPA는 0.16μM의 Kd값으로 피브린에 결합한다.
피브린에 결합하면, 플라스미노겐 활성화 반응 공정의 Km은 83μM에서 0.18μM로 감소되며, 이에 의해 플라스미노겐이 효소에 의해 효율적으로 플라스민으로 전환된다.
SK는 플라스미노겐과 반응하여 플라스민의 형성을 촉매할 수 있는 활성화 복합체를 형성한다.
이 상호작용은 피브린 결합에 의해 좌우되지 않는다.
혈류중에 있는 활성화 SK-플라스미노겐 복합체는 전신에서 순환하는 플라스미노겐이 플라스민으로 전환되는 것을 촉매할 수 있다.
활성화된 플라스민은 2-안티플라스민에 의해 우선적으로 억제된다.
일단 억제제로서의 용량이 고갈되면, 자유 피브리노겐, 피브린 및 기타 몇몇 플라스마 단백질이 플라스민에 의해 분해된다.
이때 일어나는 피브리노겐 분해 반응은 정상적인 응혈 기작을 파괘하여 출형의 위험을 증가시킨다.
피브린에 대한 TPA의 친화력 때문에, TPA는 피브린에 결합하지 않는 SK에 비해 피브린용해제로서 유리할 것으로 추측된다.
TPA와 SK는 최근 큰 규모의 여러 인체 임상실험에서 그들의 치료학적 효능이 비교되고 있다.
축적된 데이타에 따르면, SK는 대부분의 환자에 대해 선택되고 있는 시약이다(스크립 번호 1597, 22-23면, 1991년 3월 8일).
그러나 아직도 피브린 선택성이 증가된 개선된 피브린 용해제를 개발하고자 하는 요구가 있다.
목적하는 분자를 설계하는 데에는 화학적 교차 결합법과 재조합 DNA 분자가 사용되고 있다.
여러 혈장 유래 단백질의 각종 고 친화력 피브린 결합 도메인, 또는 TPA의 촉매 부위에 결합된 항-피브린 단클론성 항체를 함유하는 여러 키메라 플라스미노겐 활성화제 분자가 제작되어 오고 있다.
이들 분자들의 치료학적 효능이 여러 제약회사에 의해 분석되고 있다.
활성화된 인자 XIII(트랜스글루타미나제)는 혈액 응고의 첫번째 단계에서 피브린 분자의 교차 결합을 촉매함으로써 혈괴의 기계적 안정성을 증가시킨다.
실시예 6B에 기술한 대로, 온전한 혈장 피브로넥티(FN)도 또한 인자 XIIIa에 의해 피브린에 교차 결합된다.
실시예 2 및 4에 기술된 대로, 본 출원인은 FN의 FBD 폴리펩티드 단편(12 KD, 18.5 KD, 20 KD 및 31 KD)을 클로닝 및 발현하였다.
이들 폴리펩티드는 인자 XIIIa의 존재하에 피브린 응괴와 혈전에 공유적으로 결합될 수 있는 활성에 관하여 시험관내 및 생체내에서 연구되었다(실시예 6, 9, 13).
본 발명자들은 피브린에 공유 결합되는 것과 관련하여 FBD 분자의 고유한 활성을 발견하고, SK를 혈전에 타게팅하여 출혈의 위험을 감소시키기 위하여 화학적 교차결합(또는 재조합 DNA법)에 의해 키메라 FBD-SK 분자를 제조하기로 결정하였다.
II. 화학적 유도체화 반응 및 FBD와 SK의 교차 결합
N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)(헤테로이기 교차 결합제)를 이용하여 FN의 아미노 말단 영역에 걸쳐 있는 FBD 폴리펩티드와 단편들을 유도체화하였다.
SPDP는 알칼리성 pH에서 일차 아민과 반응하여 2-피리딘-디설파이드기를 단백질에 도입시킨다.
상기 pH 범위에서 변형된 FBD의 환원후에 방출되는 티오-피리딘기에 대해 특이적인 343nm에서의 흡광도를 측정하므로써, FBD 분자당 교차 결합기의 수를 계산하였다.
혈장 31 KD FBD 분자의 경우에는, 화학적 변형 반응 조건하에서 침전되는 경향이 있지만 반응 수율이 매우 낮다.
플라스미드 pFN 196-2(제10도)에 의해 생산한 재조합 12 KD FBD 분자를 갖고 실험을 더 실시하였다.
각각의 12 KD FBD 분자당 대략 2잔기의 교차 결합제가 도입된 것으로 밝혀졌다.
시스테인 잔기를 갖지 않는 SK를 2-아미노티올란을 이용하여 유도체화하였다.
이 시약은 일차 아민과 반응하여, 티올기로 끝나는 하전된 스페이서를 도입시킨다.
SK 분자내에 도입된 티올기의 수는 엘만 시약을 이용하여 결정하였다.
변형반응의 조건하에서, SK 1 분자당 약 2개의 티올기가 도입된 것으로 밝혀졌다.
두개의 유도체화된 폴리펩티드를 혼합함으로써 유리 티올기가 2-피리딘-설파이드기와 교환되어 두 단백질 사이에 디설파이드 결합이 형성되고 피리딘-2-티올이 방출된다.
접합 반응은 유도체화된 FBD가 4-8배몰의 과량으로 있는 경우에 최적인 것으로 나타냈다.
이러한 조건하에서, 본질적으로 모든 SK 분자들은 FBD 분자와 결합하였다.
SDS-PAGE 및 수퍼로스 12에 부착된 FPLC상의 겔 여과에 의해 접합 반응을 분석하였다.
복합체 형성은 약 10분간에 완결되어 각종 함량의 FBD와 SK를 갖는 분자 혼합물이 얻어진다.
화학적 변형과 교차 결합 반응은 문헌[Runge et al., DNAS, USA, 84 : 7659-7662(1987)]에 기재된 방법에 따라 수행한다.
화학적 변형 반응에 대해 확립된 최적의 조건하에서, FBD와 SK 분자 각각에 있는 피리딘-디설파이드와 티올기의 계산치는 약 2이다.
이렇게 형성된 접합 혼합물은 대부분 바람직한 1 : 1 융합화합물을 포함하였다.
FBD-SK 복합체의 분리
접합된 분자와 유리 SK 및 FBD 분자간의 분리는 다음과 같이 2단계로 실시하였다.
먼저 수퍼로스 6상에서 겔 여과를 하여 과량의 12 KD FBD를 제거하였다.
두번째로 헤파린-세파로스 크로마토그래피하여 25mM NaCl, 10mM 트리스/HCl, pH 7.4에서 수지에 결합된 접합체로 부터 유리 스트렙토키나제를 분리하고, 동일 완충액에 녹인 0.5M NaCl을 이용하여 용출시켰다.
겔 전기영동에 의해 판단한 바에 따르면, 유리 SK에 의한 오염은 최종 제제의 5％미만을 차지한다.
FBD-SK 복합체의 기능적 특성지적
헤파린-세파로스 크로마토그래피에 의해 정제한, 교차결합된 FBD-SK 복합체를 다음과 같은 기준하에 순수한 SK와 비교하였다.
1. 플라스민의 색원체 기질 S-2251을 이용한 플라스미노겐 활성화의 역학(제33도).
2. 네빌 마쉬(Neville Marsh, Fibrinolysis, 1981)에 따라, 피브린-플레이트를 이용한 피브린 용해능.
3. 혈괴 형성에125I-피브리노겐을 이용한 인간 혈장 혈괴의 용해
결과는 복합체가 SK와 비견할 만한 수준의 플라스미노겐 활성화능을 보유함을 시사한다.
제33도에서 보면, 플라스미노겐 기질에 대한 겉보기 Km값인 Kplg는 SK 및 FBD-SK 복합체에 있어 각각 3.1×10-6M 및 1.8×10-6M인 반면, 복합체에 대한 촉매 속도상수인 Kplg는 SK보다 지수 2의 차이로 낮다는 것이 밝혀졌다.
또한, 제34도는 밤새 보온한 후에 형성된 용해 구역에 있어서, SK 또는 FBD-SK 복합체간에 중요한 차이가 없음을 입증한다.
덧붙여, 기니아 피그간 트랜스글루타미나제에 의해 복합체에 혼입된14C-푸트레신은 12 KD FBD에 혼입된 양의 약 40％ 이었으며(제35도), 실시예 11의 표 E와 비교하였다.
DTT는 복합체에의 도입을 140％까지 증가시켰다.
SK에의 도입은 관찰되지 않았다.
이러한 발견은 FBD-SK 접합체가, 활성화된 인자 XIII에 의한 혈전에 교차 결합될 수 있는 잠재성을 보유하고 있다는 것을 시사한다.
본 출원인은 또한 재조합 플라스미드에 의해 코딩하는 키메라 FBD-SK 폴리펩티드의 제작을 시도하였다.
[실시예 13]
쥐의 스테인레스 스틸 코일 모델에서111In-표지화 12 KD 및 18.5 KD-FBD에 의한 생체내 표지화
이용된 방법은 본질적으로 실시예 7에 기재되어 있는 것이다.
DTPA법(실시예 8)에 의해111In으로 재조합 12 KD-, 18.5 KD- 및 31 KD-FBD 폴리펩티드 단편을 표지화하였다.
표지화 물질(비활성 : 대략 5×106cpm/㎍)을 코일-함유 쥐(실시예 7)에게 코일을 삽입한지 5시간후에 정맥내 투입하였다.(5×106cpm/쥐).
표지를 투여하고 24시간후에 혈전을 보유하는 코일을 꺼내어 계수하였다.
제31도는 혈괴와 혈액에서의 비방사능의 결과를 보여주며, 제32도는 각각의 혈전대 혈액비를 제시한다.
도면에 나타낸 대로, 세개의 화합물에 대해 높은 혈전 비방사능값이 얻어졌다.
31 KD FBD 균의 혈전에서 12 KD- 및 18.5 KD-FBD 단편에서보다 높은 값이 얻어졌다.
그러나, 31 KD-FBD와 비교할때 보다 낮은 혈중 농도때문에, 혈전/혈액 비율은 12 KD와 18.5 KD-FBD 단편에서 더 높았다.
이것은 31 KD 폴리펩티드와 비교할때 보다 짧은 단편의 보다 좁은 특이성 및 활성 스펙트럼에서 기인하는 것일 수 있다(실시예 9, 표 C).
[실시예 14]
상처 치료에 있어서의 FBD 폴리펩티드의 이용
상처 치료의 초기 단계에서는, 라미닌과 IV형 콜라겐과 같은 영구적인 기저막 성분이 재형성되기 전에 피브린과 피브로넥틴의 겔층위로 상피가 이동한다.
피브린과 피브로넥틴을 모두 함유하는 초기 혈장-유래 겔은 섬유아세포에 의해 쉽게 공격을 받으며, 지혈과 흡착 작용을 나타내어 세포 이동을 위한 임시 매트릭스를제공하며, 주화성 인자 및 성장 인자(상처 호르몬류)의 저장고로서 역할을 한다.
빠르게 격자를 형성하는 피브린 혈관의 겔은 피브로넥틴내로 혼입된다.
생체내에서 섬유아세포가 피브로넥틴을 통하여 주로 피브린 격자에 부착된다는 것이 밝혀져 있다(Grinnell, F. et al.(1980) Cell 19 517-525 : Colvin, R. B. et al.(1979) Lab Invest. 41 464-473; Knox, P. et al.,(1986), J. Cell. Biol. 102, 2318-2323).
따라서, 상처 치료의 개신 단계에서 피브로넥틴의 피브린 결합 도메인과 세포 결합 도메인이 모두 요구되는 것으로 믿어진다.
피브린에 피브로넥틴이 부착되는 것은 트랜스글루타미나제를 통하여 일어나는 것으로 가정되기 때문에, 즉 피브로넥틴의 Gln-3가 촉매적으로 트랜스아미드화하여 피브린 리신 잔기로 되기 때문에, Gln-3 주변영역의 고유한 구조를 함유하는 모든 피브린 결합 도메인 폴리펩티드가 이 시스템에서 작용할 수 있어야만 한다.
즉, 본출원인의 FBD의 12 KD와 18.5 KD 폴리펩티드 단편은 또한 상처의 치료를 증강시키기 위해 CBD 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다.
공동 계속중인 PCT 특허출원 제 WO/07577호에기술된 r33 KD 및 r 40 KD와 같은 재조합 CBD 폴리펩티드도 사용될 수 있다.
상처 치료의 촉진에 있어서 인간 피브로넥틴의 FBD의 잠재력을 평가하기 위하여, 세포 도말 분석법으로 시험하였다.
이 분석에서는, 섬유 아세포를 FBD 폴리펩티드의 부재 또는 존재하에 CBD 폴리펩티드를 부착시킨 유리 커버슬립에 도말하였다.
즉, FBD 도메인 폴리펩티드에 대해 피브로넥틴의 세포 결합 도메인과의 공동 기질로서 세포의 국소 흡착의 증강제로서 작용할수 있는 활성을 시험하였다.
소의 혈장 피브로넥틴에서 유래된 75 KD 세포-결합 도메인(CBD)과 조합하여 사용하면, 혈장-유래 FBD, p31KD 및 인간 유래의 재조합 FBD 및 r31 KD는 NRK 섬유아세포의 국소 흡착을 촉진하기 위한 활성에 있어서 구분이 불가능한 것으로 밝혀졌다.
인간의 단백질 도메인은 모두, 동일한 농도, 즉 FBD와 CBD 단백질의 1 : 혼합물 10㎍/ml의 100μl로 사용된 경우에 상응하는 소 유래의 단편들보다 훨씬 효과적이다(상세한 실험은 후술).
75 KD CBD를 단독으로 사용했을때와 FBD와 조합하여 사용했을때의 효과의 차이는 놀라운 것이다.
단독으로 사용된 75 KD CBD상에 도말된 세포의 간섭반사 현미경법(IRM)은 무정형 회색 패치와 스폿을 나타낼 뿐이지만(이들은 복부의 막 복제물의 전자현미경 사진에 의해 클라트린-기재의 구조와 관련된 것으로 알려져 있다), 공동 기질로서의 FBD(재조합 또는 혈장에서 유래된 것)의 도입에 의해서 IRM으로 가시화했을때 짙은 검은색 획선(색의 밀도는 복부막의 표면이 기질에 보다 밀접하게 접촉한 것을 의미한다)으로 나타나는 명확하게 구분된 국소 흡착 구조의 형성이 유도된다.
IRM/EM 상호 연관성은 이들 빽빽하고 잘 정돈된 흡착이 세포체질의 침습 섬유의 말단에 해당한다는 것을 보여준다.
상처 치료에 관한 FBD와 CBD의 조합 효과를 더 조사하기 위하여, 45 KD 폴리펩티드(12 KD FBD-33 KD CBD)와 64 KD 폴리펩티드(31 KD FBD-33 KD CBD)를 제작하였다(각각 제12도 및 제25도).
31 KD FBD대신에 12 KD 또는 18.5KD FBD를 이용하여, 그리고 33 KD CBD 폴리펩티드 대신에 40 KD CBD 폴리펩티드를 이용하여 비슷한 융합 폴리펩티드를 제작하였다.
실험의 세부적 사항
PBS에 용해시킨 10㎍/ml 농도의 총 부피 100μl의 p75 KD CBD(소 유래) 및 31 KD FBD(재조합 인간 유래)폴리펩티드를 실온에서 습기가 있는 대기하에, 밤새 진한 황산으로 처리하고 증류수로 철저히 헹구어낸 13mm 유리 커버슬립(Chance Propper Ltd. Warley, UK)에 흡착되도록 하였다.
PBS pH 7.1로 세척한후, 커버슬립을 실온에서 10분간 난알부민(PBS에 녹인 1mg/ml 농도, Sigma Chemical Co.)과 함께 보온하여 비특이적 흡착을 감소시켰다.
도말 분석법은 18시간동안 계대 배양하고, 0.1mg/ml TPCK-트립신(Sigma Chemical Co.)에 의해 탈착시키고, Ca++-함유 이글 최소 필수 배지(EMEM)에 37℃에서 20분간 재현탁시킨 NRK 세포를 이용하여 수행하였다.
이들 세포는 위생 바늘이 구비된 5ml 시린지를 이용하여 부드럽게 빨아들인후, 2％ W/V 난 알부민-함유 EMEM으로 3회 세척하므로써 단일 세포 현탁액으로 얻어졌다.
세척된 NRK 세포를 단백질 기질과 함께 1×104세포/㎠의 밀도로 커버슬립위에 재현탁함으로써 세포의 도말을 모니터하였다.
×50/1.0 및 ×100/1.32 PHACO RK 대물렌즈가 구비된 레이츠(Leitz)오로토룩스 II 현미경을 이용하는 간섭반사 현미경과 위상차 현미경을 이용하여 검사하고 사진을 찍었다(Kodak technical Pan2415 35mm 필름).
2시간후에, 살아있는 세포를 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액에 용해시킨 2.5％ V/V 글루타르알데히드(TAAB Labs, Reading, Berks, U. K.)를 이용하여 고정시키고, 고정된 세포는 EM으로 검사하였다.
실시예 15 ; 쥐의 모델에서 높은 혈전 대 혈액 비를 얻기위한 높은 방사화학적 순도를 갖는111In-DTPA 변형 FBD 단백질의 이용
1. DTPA-변형된 FBD 단백질의 변형 및 방사능표지화
실시예 8에 기재되어 있는 DTPA 변형과 DTPA-변형된 FBD 단백질의 방사능 표지화의 방법을 개량하였다.
이러한 개량에 의하여, 쥐의 코일 모델에 있어서 높은 혈전 대 혈액의 비를 얻을수 있었다.
1-1. DTPA-변형 : 0.1M HEPES 완충액 pH 7.0에 용해시킨 20배 과량의 DTPA를 이용하여 세개의 재조합 분자, r31 KD, r18.5 KD 및 r12 KD를 변형시키고, 겔 여과에 의하여 과량의 DTPA를 제거하였다.
1-2. 방사능표지화 : 개량을 위한 변경의 한가지는, 방사능콜로이드의 양을 최소한으로 감소시키기 위하여 낮은 pH(0.2M 구연산염 완충액, pH 5.7)에서111InCl3를 이용하여 방사능표지화를 수행하는 것이다.
방사능표지화된 FBD 용액의 완충액을 킬렉스(Cheley)-100-처리된 완충액으로 교환함으로써, 킬레이트화111In을 치환할 수 있는 오염 중금속 이온을 DTPA-변형된 단백질로서 제거하기위한 부가적인 예방책을 강구하였다.
2. FBD 단백질의 변형과 방사능 표지화의 프로토콜
FBD의 r31 KD, r18.5 KD 및 r12 KD 폴리펩티드 단편의 DTPA 변형및 방사능 표지화를 위한 상세한 개량방법을 후술하였다.
2-1. 탈염 : 단백질(모두 밀리몰 농도의 EDTA와 다른 프로테아제 억제제를 하유하는 0.5M NaCl에 용해시킴)을 탈염시키고 HEPES 완충액(0.1M pH 7)에 옮겼다.
31 KD FBD(27ml, 0.6mg/ml)는 투석에 의해 탈염시킨 반면, 18.5KD FBD(5ml, 8.7mg/ml) 및 및 12KD FBD (5ml, 5.6mg/ml)는 PD-10 겔 여과 컬럼상에서 탈염시켰다.
2-2. DTPA 변형 : 이 과정은 31 KD FBD의 경우에는 28ml, 그리고 12 KD와 18.5 KD FBD 단백질의 경우에는 7ml의 부피의 20배 과량의 DTPA 무수물을 이용하여 보온에서 1시간동안 실시하였다.
단백질에 혼입된 DTPA 잔기의 수를 결정하기 위해 변형 혼합물의 부분 표본(100μl) 비켜 두고, 예비 평형화하고 HEPES 완충액으로 전개시키는 2.6×60cm 세파덱스 G-25 컬럼상에서 겔 여과하여 나머지 물질을 제거하였다.
단백질-함유 분획(30ml)을 모았고, 얻어진 단백질 농도는 r31 KD, r18.5 KD 및 r12 KD FBD 단백질이 각각 0.35mg/ml, 0.8mg/ml 및 0.9mg/ml 이었다.
실리카 겔 TLC(85％ 메탄올로 전개)에 의해 결정한 변형의 정도는 상기 FBD 단백질이 각각 1.1, 0.8 및 1.6인 것으로 밝혀졌다.
DTPA-변형된 FBD 단배질은 -20℃에서 동결 보존하고,111In으로 방사능 표지화할 때에는 부분 표본을 해동시켜 사용한다.
2-3. 방사능표지화 : 표지화는 담체가 함유되지 않은111InCl3원액(111In : 3.2mCi/ml) 500μl에 125μl의 1M 구연산나트륨 pH 5.7을 가함으로써 0.2M 구연산나트륨 pH 5.7에 넣은111InCl3를 이용하여 실시하였다.
방사능 표지화를 위한 반응 혼합물은 최종 농도로서 FBD 단백질 0.2μl/μl, HEPES 60mM, HCl 10mM, 구연산나트륨 0.2M 및111In 0.8μCi/μl를 함유한다.
반응은 실온에서 1시간동안 진행시켰다.
방사화학적 순도는 실리카 겔 TLC(85％ 메탄올로 전개시킴)로 분석하였는데, FBD의 모든 폴리펩티드 단편에 있어 이 값는 91-95％의 범위내이다.
즉, 방사능표지화된 FBD 단백질의 비활성은 약 3.6μCi/㎍(8×106cpm/㎍)이다.
방사능 표지화중에 사용된 완충액에 미량 오염물질로 존재할 수 있는 중금속 이온이 DTPA-변형된 FBD 단백질에 결합된111In을 치환할 수 있기 때문에, 미리 킬렉스-100으로 예비 처리한(금속이온 오염물질을 제거하기 위하여) BSA-함유 BBS 완충액으로 예비 평형화하고 전개시키는 세파덱스 G-25 10ml 베드에 통과시켰다.
3. 생물학적 활성
생물학적 활성을 시험관내에서는 기형성된 혈괴에111In-표지화 DTPA-변형된 FBD를 결합시킴으로써, 그리고 생체내에서는 쥐에서의 스틸 코일-유도된 정맥 혈전 모델에서 시험하였다.
3-1. 기형성된 혈괴에의 결합
이 과정은 요오드화 FBD에 대해 실시예 6에서 설명한 바와 동일하게 실시하였다.
세개의111In-표지화 DTPA-변형된 FBD 단백질의 비활성은 6×106cpm/㎍ 단백질이었다.
실험결과는 표 F의 두번째 컬럼에 나타내었다.
3-2. 쥐에서의 정맥혈괴
사용된 모델(쥐에서의 코일-유도된 정맥혈전)은 실시예 7에 기술한 바 있다.
이 실시예의 실험에서는 각 군은111In 표지화 DTPA 변형된 FBD 단백질 5×106cpm(비활성 6×106cpm/㎍ 단백질)을 주입한 7마리의 쥐로 이루어져 있다.
실험결과는 표 F의 오른쪽 세컬럼에 나타내었다.
a 트랜스글루타미나제의 억제제인 요오드 아세테이트의 존재하에서는 이들 값의 대략 50％ 정도가 얻어진다.

Claims (18)

  1. 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인 중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하며, 도 2에 개시된 아미노산 1-109의 아미노산 서열을 이루어지며, 피브린 결합능이 있으며, 영상화 가능한 마커에 의해 표지화된 폴리펩티드를 함유함을 특징으로 하는 영상화제.
  2. 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인 중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하며, 도 2에 개시된 아미노산 1-154의 아미노산 서열로 이루어지며, 피브린 결합능이 있으며, 영상화 가능한 마커에 의해 표지화딘 폴리펩티드를 함유함을 특징으로 하는 영상화제.
  3. 제1항에 있어서, 마커는 방사성 동위원소, X-선을 투과시키지 않는 원소 또는 상자성 이온임을 특징으로하는 영상화제.
  4. 제2항에 있어서, 마커는 방사성 동위원소, X-선을 투과시키지 않는 원소또는 상자성 이온임을 특징으로 하는 영상화제.
  5. 제3항에 있어서, 방사성 동위원소는 인듐-111, 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 크립톤-81m, 크세논-133 또는 칼륨-67임을 특징으로 하는 영상화제.
  6. 제4항에 있어서, 방사성 동위원소는 인듐-111, 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 크립톤-81m, 크세논-133 또는 칼륨-67임을 특징으로 하는 영상화제.
  7. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 대하여 적절한 숙주세포내에서 폴리펩티드의 발현을 수행할 수 있도록 하는 위치에 놓여 있는 적절한 조절 요소들을 코딩하는 DNA를 함유함을 특징으로 하는, 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하고, 도 2에 개시된 아미노산 1-109의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 발현을 위한 플라스미드.
  8. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 대하여 적절한 숙주세포내에서 폴리펩티드의 발현을 수행할 수 있도록 하는 위치에 놓여 있는 적절한 조절 요소들을 코딩하는 DNA를 함유함을 특징으로 하는, 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인중에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하고, 도 2에 개시된 아미노산 1-154의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 발현을 위한 플라스미드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 플라스미드 pFN 196-2로 명명되고, 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 제68328호로 기탁된 것이거나; pFN 203-2로 명명되고, 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 주 A4255에 도입되어 ATCC에 수탁번호 제68606호로 기탁된 것임을 특징으로 하는 플라스미드.
  10. 제9항중 어느 한 항의 플라스미드를 함유함을 특징으로 하는 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 세포임을 특징으로 세포.
  12. 제11항에 있어서, 플라스미드는 pFN 196-2로 명명되고 세포는 ATCC에 수탁번호 제68328호로 기탁되어 있거나, 플라스미드는 pFN 203-2로 명명되고 세포는 ATCC에 수탁번호 제68606호로 기탁되어 있음을 특징으로 하는 에세리키아 콜리(Escherichia coli)세포.
  13. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항의 세포를 DNA가 폴리펩티드의 발현을 감독하고 세포가폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 처리하고, 이렇게 발현된 폴리펩티드를 세포로부터 회수함을 특징으로 하는 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 12KD 폴리펩티드의 제조방법.
  14. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항의 세포를 DNA가 폴리펩티드의 발현을 감독하고 세포가 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 처리하고, 이렇게 발현된 폴리렙티드를 세포로부터 회수함을 특징으로 하는 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인에 실질적으로 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 18.5KD 폴리펩티드의 제조방법.
  15. 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 도 2에 개시된 아미노산 1-109로 이루어짐을 특징으로 하는, 피브린 결합능이 있으며, 인간 유래의 다른 물질들이 실질적으로 함유되어 있지 않는 정제된 폴리펩티드.
  16. 천연의 인간 피브로넥틴의 N-말단 피브린 결합 도메인에 존재하는 아미노산 서열에 상응하는 도 2에 개시된 아미노산 1-154로 이루어짐을 특징으로 하는, 피브린 결합능이 있으며, 인간 유래의 다른 물질들이 실질적으로 함유되어 있지 않는 정제된 폴리펩티드.
  17. 폴리펩티드가 재폴딩 및 재산화될 수 있도록 폴리펩티드를 티올-함유 화합물 및 디설파이드와 접촉시킴을 특징으로 하는 제15항 또는 제16항의 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시키는 방법.
  18. (a) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 발현시켜 세균 세포내에 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖지만 디설파이드 결합이 결핍되어 있는 첫번째 폴리펩티드를 생산하고; (b) 세포를 파쇄하여 첫번째 폴리펩티드를 함유하는 분해액을 얻고; (c) 분해액을 원심 분리하여 첫번째 폴리펩티드를 농축하고; (d) 농축된 첫번째 폴리펩티드를 분리하고; (e) 분리 및 농축된 첫번째 폴리펩티드를 용해시키고; (f) 가용화한 첫번째 폴리펩티드를 재폴딩 및 재산화시켜 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 형성하고; (g) 재폴딩 및 재산화된 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리하고; (h) 정제, 재폴딩 및 재산화된 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하고; 및 (i) 이렇게 회수한 생물학적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 정제함을 특징으로 하는, 제15항 또는 제16항의 생물학적으로 활성을 갖는 정제된 폴리펩티드의 회수방법.
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