JP2024506070A

JP2024506070A - 新規ｈｅｒ２結合ポリペプチド

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Publication number: JP2024506070A
Application number: JP2023548247A
Authority: JP
Inventors: フレイドフレードリク; トルマケブブラディミル
Original assignee: アフィボディアクティエボラーグ
Priority date: 2021-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2024-02-08
Also published as: WO2022171892A1; EP4291251A1; US20240124533A1

Abstract

配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドが提供される。また、ＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートからなる放射性標識ポリペプチドも提供される。例えばＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌に関連する、治療、診断及び予後用途においてポリペプチドを利用する方法及び使用も提供される。

Description

本開示は、ヒト上皮成長因子受容体２（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2、以下、ＨＥＲ２と呼ぶ）に結合する新規ポリペプチドに関する。本開示はまた、診断薬、予後薬及び／又は医薬としての、そのようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用、より詳細には、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の形態の診断、予後及び／又は治療における該ポリペプチドの使用に関する。

ＨＥＲ２は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーに属する膜貫通型受容体である。ＨＥＲ２は、乳癌、胃食道癌及び卵巣癌のかなりの割合において過剰発現され、ＨＥＲ２発現の上昇は予後不良に関連する。ＨＥＲ２が高発現している腫瘍は特異的標的治療薬に反応するため、患者のＨＥＲ２発現レベルに関する情報は疾患管理にとって重要である。ＨＥＲ２発現状態を求めるために現在実施されている方法としては、生検材料の分析が挙げられるが、これは侵襲的かつ複雑であり、複数回の採取を必要とし、ＨＥＲ２の不均一な発現又は治療に反応したＨＥＲ２発現の変化を解明することが困難である。

一方、放射性核種分子イメージングは、標本誤差に由来する偽陰性結果を生じることなく、原発腫瘍及び転移の両方におけるＨＥＲ２を非侵襲的に検出することが期待できる。このアプローチを証明する最初の臨床試験は、単光子放射体インジウム－１１１で標識されたモノクローナル抗体トラスツズマブを用いて行われた。長寿命の陽電子放射体であるジルコニウム－８９の使用、及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）の利用によって、抗体ベースのプローブの使用における更なる進歩が達成され、感度及び分解能が向上した。それでも、治療用抗体をベースとするイメージングプローブは、血液からの消失速度が遅い。このため、（注射後４～５日後でも）画像コントラストが低く、線量負担が大きい。より小さいイメージングプローブ、例えば、設計足場タンパク質をベースとするプローブを使用することにより、最適なイメージング時間を注射後数時間に短縮することが可能になり、画像コントラストが増大し、ひいては感度が向上する。

例えば放射性核種イメージングの目的で、ＨＥＲ２結合分子を生成するのに有用な足場タンパク質の１つに、ブドウ球菌タンパク質ＡのドメインＢのタンパク質Ｚ誘導体がある。Ｚバリアントは、５８アミノ酸のシステインを含まない足場をベースとし、化学的に合成されてもよく、又は組換えＤＮＡ技術によって細菌中で産生されてもよい。Ｚバリアントは、サイズが小さく熱安定性が高いこと、部位特異的な放射性標識が可能であること、標的親和性が非常に高い可能性があることを更に特徴とする。異なる世代のＨＥＲ２結合Ｚバリアントが、国際公開第２００５／００３１５６号、国際公開第２００９／０８０８１０号及び国際公開第２０１５／０２８５５０号に開示されている。

第一世代のＨＥＲ２結合Ｚバリアント（国際公開第２００５／００３１５６号参照）は、前臨床試験（Ｏｒｌｏｖａｅｔａｌ（２００６），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６６：４３３９－４３４８；Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２００９）ＪＮｕｃｌＭｅｄ５０：７８１－７８９）及び臨床試験（Ｂａｕｍｅｔａｌ（２０１０），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５１（６）：８９２－８９７）において、ＨＥＲ２発現腫瘍をイメージングする優れた能力を示した。第二世代では、Ｚバリアント足場は広範囲に再設計され、非結合部分における４５種のアミノ酸のうち１１種が置換された（国際公開第２００９／０８０８１０号、Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈｅｔａｌ（２０１０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ３９８：２３２－２４７）。これらの置換により、Ｚバリアント分子のペプチド合成収率及び保存安定性が向上した。ＩｇＧ及びＩｇＭへの残余の結合（Residual binding）は、血液クリアランスを促進するために本質的に排除され、アラニンのセリンによる置換によって、水にさらされる表面の親水性が高められた。

この第二世代のＨＥＲ２結合Ｚバリアントは、ＤＯＴＡコンジュゲート^６８Ｇａ標識放射性トレーサー分子の形態でＰＥＴイメージングに使用されている。該トレーサーは、乳癌患者におけるＨＥＲ２発現転移の検出において優れた感度及び特異性を示している（Ｓｏｒｅｎｓｅｎｅｔａｌ（２０１６），Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ６（２）：２６２－２７１）。このトレーサーを使用する典型的な臨床試験では、実効線量は５～６ｍＳｖの範囲であり、これは抗体試薬を用いたＰＥＴイメージングに典型的な線量（１４～２２ｍＳｖ）と比較してかなり低い。ＰＥＴイメージングは、北アメリカ及び西欧では比較的利用しやすいが、南アメリカ、アジア、アフリカ、及び一部のヨーロッパ諸国では利用しにくい。ここでは、ＳＰＥＣＴの使用がより一般的である。^１１１Ｉｎを標識として使用し、同じイメージング分子がＳＰＥＣＴについても試験されている（Ｓｏｒｅｎｓｅｎｅｔａｌ（２０１４），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５５（５）：７３０－７３５）が、この核種は高価であり、中程度のエネルギーのコリメータを必要とするため、分解能と感度が低下する。

臨床的観点からは、^９９ｍＴｃ（Ｔ１／２＝６時間）の使用がはるかに魅力的である。該核種はジェネレーターで製造されるため、安価で入手が容易である。^９９ｍＴｃの壊変図式は、半減期が最適であること、線量が穏やかであること、低エネルギーの高分解能コリメータを使用することができ、イメージング感度が向上することから、放射性医薬品の標識にほぼ理想的である。^９９ｍＴｃによる第一世代Ｚバリアントの標識は、特にペプチドベースのキレーターを使用して十分に調査された。そのようなキレーターの組成及びＺバリアント分子におけるキレーターの位置により、^９９ｍＴｃ標識分子の生体内分布及びその排泄経路が大幅に変更される可能性があることが示された（Ｈｏｆｓｔｒｏｍｅｔａｌ（２０１３），ＪＭｅｄＣｈｅｍ５６：４９６６－４９７４）。更に、Ｚバリアント配列のＣ末端にシステイン残基を配置すること（したがって、Ｃ末端配列－ＫＶＤＣ、配列番号４を生成すること）により、^９９ｍＴｃの安定したカップリングに有用なＮ_３Ｓキレーターが形成されることが示された（Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２００９），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５０：７８１－７８９）。Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２００９，ｓｕｐｒａ）の^９９ｍＴｃ標識ＨＥＲ２結合分子Ｚ_{ＨＥＲ２：２３９５}は、マウスモデルにおけるＨＥＲ２発現のイメージングにおいて、標的特異性の向上と高いコントラストを示した（腫瘍対血液比１２１±２４、注射４時間後）。しかしながら、Ｚ_{ＨＥＲ２：２３９５}は、腎取り込みが高く（１４０～１９０％ＩＤ／ｇ、注射４時間後）、イメージングには望ましくない。

^１８８Ｒｅもこれに関連して試験されている。^１８８Ｒｅは、高エネルギーの、ベータ線を放出する放射性同位元素で、半減期が短く（１６．９８時間）、悪性腫瘍の診断や治療のための放射性医薬品の生成が可能である。半減期が短いため、患者、スタッフ及び環境にとってより安全である。^１８８Ｒｅからの放射線にはベータ線とガンマ線の両方が含まれる。高いベータ線放出（７８４ｋｅＶ）は高い治療効果を保証し、低いガンマ線放出（１５５ｋｅＶ）により、オペレータが従来のガンマカメラで視覚情報を得ることが可能になる。更に、レニウムジェネレーターを臨床現場に容易に提供することができる。

ペプチドベースのキレーターにおけるアミノ酸組成とアミノ酸残基の順序の両方が、生体内分布及び標的化特性に影響を与えることが判明している（Ｗａｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１１），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５２：４６１－４６９；Ａｌｔａｉｅｔａｌ（２０１２），ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ５：１９７５－１９８５）。Ｃ末端－ＧＧＧＣキレート配列（配列番号５）を含有する第一世代のＨＥＲ２結合Ｚバリアント^９９ｍＴｃ－Ｚ_{ＨＥＲ２：Ｖ２}によって、最も良好な画像コントラストが示された。［^９９ｍＴｃ］（Ｔｃ＝Ｏ）－ＧＧＧＣ錯体が非残留化標識として作用することが示されている。腎臓で再吸収され速やかに内在化した放射能量（ａｃｔｉｖｉｔｙ）は速やかに排泄された。Ｚバリアント分子の内在化が遅い腫瘍では、細胞膜上のＨＥＲ２に対するＺバリアントの親和性が高いため、放射能量は長時間保持された（Ｗａｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１１），ｓｕｐｒａ）。これにより、良好な画像作成（construct）と、^９９ｍＴｃ－Ｚ_{ＨＥＲ２：Ｖ２}の低い腎取り込みとの組み合わせが得られた。

これらの結果に基づいて、－ＧＧＧＣキレーターは、第二世代のＨＥＲ２結合Ｚバリアントにおいても標識の候補と考えられる。しかし、足場配列中のアミノ酸を再配置することは、電子供与性側鎖を有するアミノ酸がクラスター化することによって追加のキレートポケット（chelating pocket）が生成するリスクがある。このような側鎖がテクネチウムの錯化に関与する可能性が示唆されている（Ｃｙｒｅｔａｌ（２００７），ＪＬａｂｅｌｌｅｄＣｏｍｐＲａｄｉｏｐｈａｒｍ５０（ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ９）。錯化により標識部位特異性が失われ、コンジュゲートの安定性や薬物動態が変化する。例えば、Ｚ_{ＨＥＲ２：Ｖ２}のＮ末端へＨＥＨＥＨＥタグ（配列番号６）を導入すると、得られた構築物の生体内分布が顕著に変化し、特に腎の取り込みが非常に高くなった（Ｌｉｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１２），ＴｕｍｏｕｒＢｉｏｌ３３（３）：６４１－６５１）。また、^９９ｍＴｃ－Ｚ_{ＨＥＲ２：Ｖ２}Ｎ末端精製タグを導入するわずかな変更を加えるだけでも、この場合は医療現場において、標識に有害な影響を及ぼすことが示されている（Ｃａｉｅｔａｌ（２０２０），ＩｒａｎＪＲａｄｉｏｌｅ９６４１９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅｏｎ２０Ｊａｎｕａｒｙ２０２０）。更に、別のＺバリアントであるＥＧＦＲ結合分子Ｚ_{ＥＧＦＲ：２３７７}の結合部位組成は、－ＧＧＧＣキレーターと競合してその使用を不可能にするキレートポケットを含有する（Ｏｒｏｕｊｅｎｉｅｔａｌ（２０１８），ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ５０：９８１－９９４）。

結論として、再設計されたＨＥＲ２特異的Ｚバリアントが、足場に－ＧＧＧＣキレート配列を使用する^９９ｍＴｃによる安定な標識に適合するとは到底言えない。
本発明の開示

本開示の目的は、ＨＥＲ２への特異的結合を特徴とするポリペプチドの提供を通じて、ＨＥＲ２に対する親和性を有する薬剤の継続的な提供という要件を満たすことである。

本開示の関連する目的は、非特異的結合をほとんど又は全く示さないＨＥＲ２結合ポリペプチドである。

本開示の別の目的は、融合ポリペプチド中の部分として容易に使用することができるＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

別の目的は、既存の抗体試薬で経験されている公知の問題の１つ以上を解決する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの提供である。

本開示の更なる目的は、治療用途に使用可能なＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

本開示の更なる目的は、診断用途に使用可能なＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

本開示の更なる目的は、予後用途に使用可能なＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

関連する目的は、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を特徴とする癌疾患の、医療現場における治療、阻害及び／又は標的化のための新しい形態を見出すことである。

本開示の別の目的は、組換えタンパク質発現を使用して産生され得るか、又は化学的ペプチド合成によって合成され得るＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

関連する目的は、ポリペプチドにキレート基をコンジュゲートさせる任意の工程を追加することなく、生成されたままの放射性核種で標識することができるＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

別の目的は、公知のＨＥＲ２結合剤と比較して改善された安定性を示し、任意選択で保存時の貯蔵寿命の延長ももたらすＨＥＲ２結合ポリペプチドを見出すことである。

本開示の更に別の目的は、哺乳動物においてインビボで使用された場合に低い抗原性及び／又は免疫原性を示すＨＥＲ２結合ポリペプチドを得ることである。

本開示の別の目的は、哺乳動物への投与時に有益な生体内分布をするＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。

これらの目的及び他の目的は、本開示の様々な態様によって達成される。したがって、第１の態様において、本開示は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＧＧＧＣ（配列番号１）を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。

これに従って、本発明者らは、配列番号１を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドが、例えば、以下にＨ２ＢＰＰ２と示される、配列番号２を有する、Ｗａｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１１，ｓｕｐｒａ）において以前に開示されたＨＥＲ２結合ポリペプチドＺ_{ＨＥＲ２：Ｖ２}、及び以下にＨ２ＢＰＰ３と示される、配列番号３を有する、Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２００９，ｓｕｐｒａ）のＺ_{ＨＥＲ２：２３９５}と比較して、驚くべき利点を示すことを見出した。本開示の本態様によるポリペプチドの１つ以上の実施形態によってそれぞれ個々に示され得るそのような利点の非限定的な例は、以下の通りである。
・開示されるポリペプチドに含まれる、アスパラギン及びアスパラギン酸などの、ポリペプチド配列の化学合成において低い収率及び成功率などの問題を引き起こし得るアミノ酸残基が少ない。
・開示されるポリペプチドは、表面疎水性を付与するアミノ酸残基が少なく、したがって、以前に記載された関連するＨＥＲ２結合ポリペプチドよりも親水性のプロファイルを有する。これは、低溶解性及び凝集の問題がより少ないことを意味する。理論に束縛されることを望むものではないが、より親水性の特性は、宿主に投与された際のポリペプチドの生体内分布を、肝胆道経路（肝臓を介した排泄）から、より望ましい腎経路（腎臓を介した排泄）へとシフトさせる作用があるとも現在考えられている。
・開示されるポリペプチドに含まれる、アスパラギン、アスパラギン酸、ジペプチドのアスパラギン－プロリンなどの、ポリペプチドの安定性の問題に関連するアミノ酸残基が少ない。アスパラギンは脱アミド化されやすく、アスパラギン酸は異性化されやすく、アスパラギン－プロリン結合は切断されやすいため、最終生成物の非均一性の一因となる。
・開示されるポリペプチドには、類似の配列状況において、ＶＨ３由来の重鎖可変ドメインを含有する免疫グロブリンとの相互作用を増加させることが見出されているアミノ酸残基（ＳｉｌｖｅｒｍａｎＧ．Ｊ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；９（１）：５７－７８）がない。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明によるポリペプチドにおけるこのようなアミノ酸残基の置き換えは、宿主へのポリペプチドの投与時にポリペプチドの抗原性を低下させると現在考えられている。
・開示されるポリペプチドは、以下の実施例４に示されるように、先に知られているＨＥＲ２結合Ｚバリアントよりも少ない潜在的Ｔ細胞エピトープを含み、したがって、免疫原性が低いと考えられる。

本開示の本態様によるポリペプチドは、多様な用途において、ＨＥＲ２結合抗体及び公知のＨＥＲ２結合Ｚバリアントの代替物として使用することができる。非限定的な例として、該ポリペプチドは、ＨＥＲ２過剰発現を特徴とする癌の治療において、細胞表面上のＨＥＲ２に結合することによる細胞シグナル伝達の阻害において、ＨＥＲ２過剰発現を特徴とする癌のインビボ及びインビトロの両方での診断及び／又は予後において、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞への他の治療薬、診断薬又は予後薬の標的化において、ＨＥＲ２の検出のための組織化学的方法において、分離の方法及び他の用途において有用である。本態様によるポリペプチドは、試薬のＨＥＲ２に対する親和性に依存する任意の方法において有用であると証明することができる。したがって、該ポリペプチドは、このような方法における検出試薬、捕捉試薬若しくは分離試薬として、インビボ若しくはインビトロにおける診断及び／若しくは予後のための診断薬及び／若しくは予後薬として、又はそれ自体で治療薬として、又は他の治療薬若しくは診断薬をＨＥＲ２タンパク質に標的化するための手段として使用することができる。本開示の本態様によるポリペプチドをインビトロで利用する方法は、マイクロタイタープレート、タンパク質アレイ、バイオセンサー表面、組織切片上などの様々な形式で行うことができる。

本教示の範囲から逸脱することなく、意図される特定の用途にポリペプチドを適合させるために、本開示の本態様によるポリペプチドの様々な修飾、及び／又はポリペプチドへの付加を行うことができる。そのような修飾及び付加は、以下においてより詳細に記載され、同じポリペプチド鎖に含まれる更なるアミノ酸、又は本開示の本態様によるポリペプチドに化学的にコンジュゲートされるか、若しくは他の方法で結合される標識及び／若しくは治療薬を含んでもよい。

本明細書で使用される「ＨＥＲ２結合」及び「ＨＥＲ２に対する結合親和性」という用語は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用によって試験され得るポリペプチドの特性を指す。

例えば、以下の実施例に記載されているように、ＨＥＲ２結合親和性は、ＨＥＲ２又はそのフラグメントを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置のセンサーチップ上に固定化し、試験するポリペプチドを含有する試料にチップ上を通過させる実験で試験することができる。あるいは、試験するポリペプチドを装置のセンサーチップ上に固定化し、ＨＥＲ２又はそのフラグメントを含有する試料にチップ上を通過させる。次いで当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して、ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合親和性の少なくとも定性的な測定を確立することができる。例えば、相互作用のＫ_Ｄ値を求めるために定量的測定が所望される場合も、表面プラズモン共鳴法を使用することができる。結合値は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ）又はＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）装置を使用して定義することができる。ＨＥＲ２は、好適には、装置のセンサーチップ上に固定化され、親和性を求めるポリペプチドの試料は連続希釈によって調製され、ランダムな順序で注入される。次いで、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、又は装置製造業者によって提供される他の好適なソフトウェアを使用して、結果からＫ_Ｄ値を計算することができる。

本開示の本態様はまた、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、いずれかの末端、特にＮ末端に更なるアミノ酸残基が付加されたＨＥＲ２結合ドメインとして存在するポリペプチドを包含する。これらの更なるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＨＥＲ２に対する結合において役割を果たし得るが、例えば、ポリペプチドの産生、精製、安定化、カップリング又は検出のうちの１つ以上に関連する他の目的にも役立つことがある。このような更なるアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的で付加された１つ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。このような更なるアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えば、ヘキサヒスチジル（Ｈ_６）タグ、又は「ｍｙｃ」タグ若しくは「ＦＬＡＧ」タグを含んでもよい。このようなタグにより、例えば、タグに特異的な抗体との相互作用、又は場合によっては固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）が可能になる。当業者は、他の代替案を認識している。

上記の「更なるアミノ酸残基」はまた、任意の所望の機能、例えば、第１のＨＥＲ２結合ドメインと同じ結合機能、又は別の結合機能、又は酵素機能、又は蛍光機能、又はそれらの組み合わせを備える１つ以上のポリペプチドドメインを構成し得る。

したがって、本開示は、配列番号１を含むポリペプチドの多量体を包含する。例えば、癌の診断若しくは治療に、又はＨＥＲ２の精製方法において本発明によるポリペプチドを使用する場合、本発明による１つのポリペプチドを用いて可能であるよりも更に強力なＨＥＲ２の結合を得ることが重要であり得る。この場合、ポリペプチドの多量体、例えば、二量体、三量体又は四量体の提供により、必要なアビディティー効果（avidity effect）がもたらされ得る。多量体は、好適な数の本発明によるポリペプチドからなってもよい。本発明による多量体中の連結されたポリペプチド「単位」は、公知の有機化学的方法を使用して共有結合によって結合されてもよく、ポリペプチドの組換え発現のための系において１つ以上の融合ポリペプチドとして発現されてもよく、直接又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して、他の任意の様式で結合されてもよい。

更に、配列番号１を含むポリペプチドが第１のドメイン、又は第１の部分を構成し、第２の及び更なる部分がＨＥＲ２に結合する以外の機能を有する「異種」融合ポリペプチドもまた企図され、本開示の範囲内にある。このような融合ポリペプチドの第２の及び更なる部分（複数可）は、ＨＥＲ２とは別の標的に対する親和性を有する結合ドメインを含んでもよい。このような第２の及び更なる部分（複数可）の標的の非限定的な例は、ＣＤ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦ、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１及びｃＭｅｔからなる群から選択されてもよい。その結果、少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメインと、前記他の標的分子に親和性のある少なくとも１つのドメインを有する融合ポリペプチドが得られる。これにより、治療薬及び／又は診断薬及び／又は予後薬として、あるいは捕捉、検出又は分離のための試薬として使用されるなど、いくつかの用途に使用され得る多重特異性試薬の作製が可能になる。少なくとも１つのポリペプチドドメインが配列番号１を含む、ポリペプチドのこのような多重特異性多量体の調製は、いくつかのＨＥＲ２結合「単位」の多量体について上記の通りに行うことができる。

第２の又は更なる部分（複数可）は、黄色ブドウ球菌のタンパク質Ａに由来するドメインのバリアント、例えばＺバリアントであってもよく、又は標的に対する結合親和性を有する無関係の天然若しくは組換えタンパク質（又は天然若しくは組換えタンパク質の結合能力を保持するそのフラグメント）を含んでもよい。

ヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、本発明によるポリペプチドとの融合パートナーとして使用することができる、このような結合タンパク質の別の例は、レンサ球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇ（ＮｙｇｒｅｎＰ－Å ｅｔａｌ（１９８８）ＭｏｌＲｅｃｏｇｎ１：６９－７４）のアルブミン結合ドメインの１つ、例えば、ＧＡ１、ＧＡ２又はＧＡ３ドメインである。タンパク質ＧのＧＡ３ドメインはＡＢＤ、すなわちアルブミン結合ドメイン（albumin binding domain）とも呼ばれる。タンパク質Ｇの野生型ＧＡ３ドメインと比較して改善された特性を有するＡＢＤの誘導体は、例えば、国際公開第２００９／０１６０４３号、国際公開第２０１２／００４３８４号及び国際公開第２０１４／０４８９７７号に開示されている。したがって、配列番号１を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドとレンサ球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインとの融合ポリペプチドもまた、本開示の範囲内にある。開示されるポリペプチドが診断薬、予後薬、治療薬として、又は標的化薬としてヒト対象に投与される場合、該ポリペプチドの、血清アルブミンと結合する部分との融合は、そのような融合タンパク質のインビボでの半減期が、ＨＥＲ２結合部分単独の半減期と比較して長くなる可能性が高いという点で、有益であると証明することができる（この原理は、例えば国際公開第９１／０１７４３号に記載されている）。

融合ポリペプチドの作製のための他の可能性も企図される。したがって、本開示の第１の態様によるポリペプチドは、標的結合に加えて、又は標的結合の代わりに他の機能を示す、第２の又は更なる部分（複数可）と共有結合してもよい。１つの例は、配列番号１を含む１つ以上のポリペプチドと、レポーター又はエフェクター部分として機能する酵素的に活性なポリペプチドとの融合である。融合タンパク質を形成するために配列番号１を含むポリペプチドに結合され得るレポーター酵素の例は、当業者に公知であり、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどの酵素が含まれる。本発明による融合ポリペプチドの第２の及び更なる部分（複数可）の他の選択肢としては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びそれらのバリアントが挙げられる。

本発明による融合ポリペプチドの第２の及び更なる部分（複数可）についての他の選択肢には、治療用途のための部分（複数可）が含まれる。治療用途において、他の分子もまた、他の手段によって本発明のポリペプチドに共有結合又は非共有結合されてもよい。非限定的な例としては、エフェクター酵素の指向性のために本発明によるポリペプチドを使用するＡＤＥＰＴ（antibody-directed enzyme prodrug therapy、抗体指向性酵素プロドラッグ療法）用途のための酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ）；エフェクター細胞及び免疫系の他の成分を動員するためのタンパク質；サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＰ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ；凝固促進因子、例えば組織因子、フォン・ヴィレブランド因子；毒素、例えば、リシンＡ、シュードモナス外毒素、カリケアマイシン、メイタンシノイド；毒性小分子、例えばアウリスタチン類似体、ドキソルビシンが挙げられる。

本発明によるＨＥＲ２結合ポリペプチドを組み込んだ融合タンパク質の上記の説明に関して、第１の、第２の及び更なる部分という呼称は、一方のＨＥＲ２結合部分（複数可）と、他方の他の機能を示す部分とを区別するために、明確性の理由からなされたことに留意されたい。これらの呼称は、融合タンパク質のポリペプチド鎖における異なるドメインの実際の順序を指すことを意図していない。したがって、例えば、前記第１の部分は、制限なく、融合タンパク質のＮ末端、中央、又はＣ末端に出現し得る。

本開示における第１の態様の一実施形態において、ＨＥＲ２結合ポリペプチドは配列番号１からなる。

本開示は更に、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、例えばポリペプチドの検出を目的として、少なくとも１つのフルオロフォア、ビオチン又は放射性同位元素などの標識基を備えるポリペプチドを包含する。

特に、本開示の第２の態様は、第１の態様によるＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートからなる放射性標識ポリペプチドに関する。

放射性核種の大部分は金属的性質を有する。金属は、典型的には、タンパク質及びペプチドに含まれる元素と安定な共有結合を形成することができないため、放射性金属による標的タンパク質の標識は、キレーター、すなわち金属とキレートと呼ばれる非共有結合化合物を形成する多座配位子を使用して行われることが多い。本発明によるポリペプチドにおいて、放射性核種の組み込みは、キレート化環境（chelating environment）を提供することによって可能になり、該キレート化環境を介して放射性核種はポリペプチドに配位、キレート化又は錯化され得る。

第１の態様のポリペプチドは、Ｎ_３Ｓキレーターとして特徴付けられる四座キレート環境を含む。Ｎ_３Ｓという用語が示すように、このようなキレーターの４つの結合基は、３個の窒素原子及び１個の硫黄原子から形成される。Ｎ_３Ｓキレーターにおいて、Ｎ及びＳ原子は、放射性金属の錯化又は結合のための好適な「ポケット」を提供するように空間的に配置される。本開示によるポリペプチドにおいて、Ｎ_３Ｓキレーターは、配列番号１のＣ末端アミノ酸残基として－ＧＧＧＣを選択することによってもたらされる。

したがって、３つの連続するペプチド結合の窒素原子及びポリペプチドのＣ末端のシステイン残基によってもたらされる、Ｎ_３Ｓキレーターとして特徴付けられる四座キレート環境を含む第１の態様によるポリペプチドは、ＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートからなる、第２の態様による放射性標識ポリペプチドを提供するために使用することができる。

一実施形態において、前記放射性核種は医用イメージングに適している。より詳細な実施形態において、放射性核種は、^９９ｍＴｃ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５２Ｍｎ、^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態において、医用イメージングに適した放射性核種は^９９ｍＴｃである。

別の実施形態において、前記放射性核種は治療に適している。より詳細な実施形態において、放射性核種は、^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態において、治療に適した放射性核種は^１８８Ｒｅである。

第２の態様による放射性標識ポリペプチドのこれらの実施形態において、放射性核種は、Ｃ末端－ＧＧＧＣ配列によってもたらされるキレート化環境を介してＨＥＲ２結合ポリペプチドと錯化される。

本開示はまた、第１の態様によるポリペプチド又は第２の態様による放射性標識ポリペプチドを含む組成物を包含する。

本開示の第３の態様は、第１の態様のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む組成物を提供する。前記組成物は、好適には、保存、輸送、凍結乾燥、濃縮、又はそれらの任意の組み合わせから選択される目的のために製剤化されてもよい。特定の実施形態において、本態様による組成物は、更なる操作なしで、医薬、インビボでの診断薬又はインビボでの予後薬として使用するのに適している。別の実施形態において、前記組成物は凍結乾燥に適している。この実施形態による組成物の凍結乾燥により、前記ポリペプチドの凍結乾燥粉末が得られる。ポリペプチドの前記凍結乾燥粉末は、本開示の更なる第４の態様を構成し、ポリペプチドが医薬として、又はインビボでの診断薬若しくは予後薬として使用されることが意図される場合、ポリペプチドの輸送、保存、取り扱い、及び放射性標識の点で利点をもたらし得る。

本開示の第５の態様は、第３の態様の放射性標識ポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む組成物を提供する。好適には、前記少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は担体は、治療又はイメージングされる対象への放射性標識ポリペプチドの投与が可能になるか又は増強されるように選択される。

医薬組成物及び製剤の技術分野の当業者であれば、ＨＥＲ２結合ポリペプチド又は放射性標識ポリペプチドにおける所与の用途のために適切な賦形剤又は担体を選択し、過度の実験を行うことなく、第３又は第５の態様による組成物を作製することができる。

本開示はまた、放射性標識されているか否かにかかわらず、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチド及び組成物を使用する様々な態様を包含する。本開示はまた、本ポリペプチドがその結合特性により有用である、治療、診断及び予後のための種々の方法も包含する。これらの使用及び方法に関する以下の説明において「ＨＥＲ２結合ポリペプチド」に言及する場合、この用語は、ＨＥＲ２結合ポリペプチド単独だけでなく、例えば融合タンパク質中の部分としてＨＥＲ２結合ポリペプチドを組み込んだ、並びに／又は標識、キレーター、治療薬及び／若しくは診断薬にコンジュゲートした、並びに／又はタグとして若しくは他の目的のために更なるアミノ酸残基を備える、上記のポリペプチドをベースとする全ての分子も包含することが意図される。上記で説明したように、このような融合タンパク質、誘導体などは、本開示の一部を形成する。「ＨＥＲ２結合ポリペプチド」はまた、上記の第３、第４及び第５の態様によるポリペプチド又は放射性標識ポリペプチドの組成物及び粉末を包含することが意図される。

したがって、第６の態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有するか又は有することが疑われる、ヒトを含む哺乳動物対象の体におけるインビボイメージングの方法であって、該方法が、
－医用イメージングに適した放射性核種を含む、第２の態様による放射性標識ポリペプチドを、哺乳動物対象の体内に投与すること、及び
－医用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の画像を得ること、の工程を含み、前記画像が、前記体内における放射性核種の存在を示す、方法を提供する。一実施形態において、画像は、放射性標識ポリペプチドを体内に投与してから１～７２時間以内、例えば１～２４時間以内に得られる。投与から画像取得までの時間は、使用する放射性核種の半減期に依存する。画像を得る工程を２回、３回又はそれ以上繰り返すことが可能であり、それによって一連の画像が得られる。これは、標的化薬の生体内分布を経時的に追跡しようとする場合に有用であり、薬物動態試験が可能になる。当業者は、そのような試験において必要な程度の時間分解能を達成するために、任意の数の画像を得ることができることを理解する。

本態様によるイメージング方法の一実施形態において、前記投与は静脈内投与である。

本態様によるイメージング方法の一実施形態において、本方法は、投与工程の前に、第２の態様による放射性標識ポリペプチドを調製する調製工程を含み、該工程は、第１の態様によるポリペプチドを医用イメージングに適した放射性核種と混合することを含む。

本態様によるイメージング方法のより詳細な実施形態において、本方法は、投与工程の前に、ｉ）アミノ酸配列が配列番号１を含むか、又は配列番号１からなるポリペプチドと、ｉｉ）^９９ｍＴｃとの放射性標識ポリペプチドを調製する調製工程を含み、該工程は、適切な緩衝液中、適切な還元剤、例えば塩化第一スズ、アスコルビン酸又はゲンチシン酸の存在下で、ポリペプチドを^９９ｍＴｃ－過テクネチウム酸と混合することを含む。調製工程はまた、中間体の弱いキレーター（例えば、酒石酸塩、又はクエン酸塩若しくはグルコン酸塩）の存在下で行ってもよい。

ポリペプチドが第４の態様による凍結乾燥粉末状で存在する場合、調製工程は、好適には、放射性標識及び投与のために好適な緩衝液中で粉末を溶解（reconstitute）する第１の工程も含む。

関連する第７の態様において、本開示は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を診断する方法であって、
－第６の態様によるインビボイメージングの方法を実施すること、
－得られた画像に基づいて前記診断を確立することを含む、方法を提供する。

別の関連する第８の態様において、本開示は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の予後を確立する方法であって、
－第６の態様によるインビボイメージングの方法を実施すること、
－得られた画像に基づいて前記予後を確立することを含む、方法を提供する。

更に、本開示は、第９の態様において、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有するヒトを含む哺乳動物対象を治療する方法であって、治療に適した放射性核種を含む、治療における有効量の、第２の態様による放射性標識ポリペプチドを前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。

本態様による治療方法の一実施形態において、前記投与は静脈内投与である。

本態様による治療方法の一実施形態において、本方法は、投与工程の前に、第２の態様による放射性標識ポリペプチドを調製する調製工程を含み、該工程は、第１の態様によるポリペプチドを治療に適した放射性核種と混合することを含む。

本態様による治療方法のより詳細な実施形態において、前記調製工程は、
－適切な還元剤の存在下、適切な緩衝液中で、第１の態様によるポリペプチドを過レニウム酸塩と混合すること（この混合は、中間体の弱いキレーター、例えば酒石酸塩、又はクエン酸塩若しくはグルコン酸塩の存在下で行ってもよい）、
又は
－第１の態様によるポリペプチドを、レニウムの反応性中間体、例えばトリカルボニル錯体と混合することを含む。

本態様による治療方法の更に詳細な実施形態において、前記調製工程本方法は、前記投与工程の前に、ｉ）アミノ酸配列が配列番号１を含むか、又は配列番号１からなるポリペプチドと、ｉｉ）^１８８Ｒｅとの放射性標識ポリペプチドを調製する調製工程を含み、該工程は、適切な緩衝液中、適切な還元剤、例えば塩化第一スズ、アスコルビン酸又はゲンチシン酸の存在下でポリペプチドを過レニウム酸^１８８Ｒｅと混合することを含む。調製工程はまた、中間体の弱いキレーター（例えば、酒石酸塩、又はクエン酸塩若しくはグルコン酸塩）の存在下で行ってもよい。

ポリペプチドが第４の態様による凍結乾燥粉末状で存在する場合、調製工程は、好適には、放射性標識及び投与のために好適な緩衝液中で粉末を溶解する第１の工程も含む。

本発明のこれらの診断、予後及び治療態様のいくつかの実施形態において、前記癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌（特に非小細胞肺癌）及び食道の癌（特に胃及び胃食道接合部癌）から選択される。特定の実施形態において、前記癌は乳癌である。

本開示は、これらの癌種に由来するが、対象の体の他の部分に局在するＨＥＲ２陽性転移巣に対する結合及び標的化も包含する。これに関して特に企図されるのは、脳におけるＨＥＲ２陽性転移巣である。

本開示は更に、第６、第７、第８及び第９の態様による方法のいずれかにおいて、インビボでの診断薬として、又はインビボでの予後薬として、又は医薬として使用するための、第１の態様によるポリペプチド、第２の態様による放射性標識ポリペプチド、第３の態様による組成物、第４の態様による凍結乾燥粉末、又は第５の態様による組成物を提供する。

本開示の更なる、プロセスに関連する態様は、これまで実用的又は効率的であると考えられていた温度よりも低い温度で、本明細書に開示されるポリペプチドの放射性標識を行うことが可能であるという驚くべき発見に基づく。これに関連して、このような低温での放射性標識は、反応の望ましくない副生成物の生成がより少ないことが観察されている。本開示は、第１の態様によるポリペプチドを放射性標識する方法であって、６０～８５℃、例えば６５～８０℃、例えば６５～７５℃、特に約７０℃、例えば７０℃の温度で放射性標識する工程を含む、方法を包含する。当業者は、本態様による放射性標識の方法が、上記のイメージング及び治療方法のいくつかの実施形態に含まれる放射性標識の調製工程に組み込まれてもよいことを理解する。

本開示の別の態様は、第１の態様によるポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子に関する。

本開示の更なる態様は、前記態様の核酸分子、及び核酸分子の発現によるポリペプチドの産生を可能にする他の核酸要素を含む発現ベクターに関する。

本開示の更に別の態様は、前記態様の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明の後者３つの態様は、本発明によるポリペプチドを産生するためのツールであり、当業者は、発現されるべきポリペプチドに関する本明細書中の情報及びタンパク質の組換え発現の技術分野における現在の技術レベルを考慮すれば、過度の負担なく、該ツールを得て、実用化することができるであろう。

本開示によるポリペプチドはまた、化学合成、又は植物及びトランスジェニック動物を含む様々な原核生物宿主若しくは真核生物宿主における発現を含む、他の公知の手段によって産生されてもよい。

ここで、本開示の様々な態様を、各態様に従って行われた実験の説明を通して詳細に説明する。以下の実施例は限定的に解釈されるものではない。実施例においては、添付の図を参照されたい。

Ｃ末端ＧＧＧＣキレーターを含有する新規ＨＥＲ２結合ポリペプチド（Ｈ２ＢＰＰ１、配列番号１）、Ｃ末端ＧＧＧＣキレーターを含有するＨＥＲ２結合参照ポリペプチド（Ｈ２ＢＰＰ２、配列番号２）、及びＣ末端ＫＶＤＣキレーターを含有するＨＥＲ２結合参照ポリペプチド（Ｈ２ＢＰＰ３、配列番号３）のアミノ酸配列のリストである。

可変温度測定（ＶＴＭ）の前（実線）及び後（破線）に２０℃で収集された（Ａ）Ｈ２ＢＰＰ１及び（Ｂ）Ｈ２ＢＰＰ２の円二色性スペクトルを示す図である。

９０℃で６０分間の熱処理後のＨ２ＢＰＰ１のＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す（黒線）図である。未処理の参照試料（灰色線）のクロマトグラムが比較のために含まれている。図３Ａの拡大クロマトグラムである。未処理の参照試料（灰色線）のクロマトグラムが比較のために含まれている。９０℃で６０分間の熱処理後のＨ２ＢＰＰ２のＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す（黒線）図である。未処理の参照試料（灰色線）のクロマトグラムが比較のために含まれている。図３Ｃの拡大クロマトグラムである。未処理の参照試料（灰色線）のクロマトグラムが比較のために含まれている。

灰色の垂直線によって示される時点において、０．３及び３ｎＭの濃度で連続的に注入された（Ａ）ヒトＨＥＲ２及び（Ｂ）カニクイザルＨＥＲ２に対するＨ２ＢＰＰ１の結合を示すシングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）ＳＰＲセンサーグラム（黒線）を示す図である。

灰色の垂直線によって示される時点において連続的に注入され、指定濃度で分析されたヒト（Ａ）ＨＥＲ１、（Ｂ）ＨＥＲ３及び（Ｃ）ＨＥＲ４に対するＨ２ＢＰＰ１の結合がないことを示すＳＣＫＳＰＲセンサーグラム（黒線）を示す図である。

^９９ｍＴｃ標識ポリペプチドである（１）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１、（２）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２、及び（３）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析をそれぞれ示す図である。シグナル（４）は、^９９ｍＴｃＯ_４ ^－に対応する。シグナルはデジタルライト単位（ＤＬＵ）として測定され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中のレーンの所定点における放射能に比例する。

ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３（Ａ、Ｂ、Ｃ）及びＢＴ－４７４（Ｄ、Ｅ、Ｆ）細胞株に対する、（Ａ、Ｄ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１、（Ｂ、Ｅ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２及び（Ｃ、Ｆ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３のインビトロ結合特異性を示す図である。ＨＥＲ２の事前飽和のために、５００倍モル過剰の非放射性標識ポリペプチドを添加した。データは平均値（ｎ＝３）±ＳＤとして示される。

ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３（Ａ、Ｂ、Ｃ）及びＢＴ－４７４（Ｄ、Ｅ、Ｆ）細胞株に対する（Ａ、Ｄ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１、（Ｂ、Ｅ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２及び（Ｃ、Ｆ）^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の正規化された細胞保持率を示す図である。データは平均値（ｎ＝３）±ＳＤとして示される。エラーバーが見られない場合、エラーバーは各点記号よりも小さい。

注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの血液における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの肺における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの肝臓における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの脾臓における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの胃における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの腎臓における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの筋肉における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスの骨における^９９ｍＴｃ標識新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１、並びに参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３のそれぞれの取り込みを示す図である。標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈に注射した。

注射後４時間後のＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片及びＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片における^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１のインビボ特異性を示す図である。データは平均値（ｎ＝４）±ＳＤとして示される。

ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおける注射の４時間後の、示されている^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２の（Ａ）生体内分布及び（Ｂ）腫瘍対臓器比を示す図である。データは平均値（ｎ＝４）±ＳＤとして表される。

^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１を使用した、ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片（右マウス）及びＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片（左マウス）のイメージングを示す図である。

７０℃で標識した後の^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１のＲＰ－ＨＰＬＣ分析によるクロマトグラムを示す図である。

ＨＥＲ２発現（Ａ）ＳＫＯＶ－３及び（Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞株に対する^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１のインビトロ結合特異性を示す図である。ＨＥＲ２の事前飽和のために、４００倍モル過剰の非放射性標識ポリペプチドを対照ディッシュに添加した（「遮断」）。データは平均値（ｎ＝３）±ＳＤとして示される。

非担癌マウスにおけるイメージングリガンドの生体内分布を示す図である。（Ａ）ＮＭＲＩマウスの唾液腺におけるＮａ／Ｉ共輸送体の飽和の結果。１群のマウス（「遮断」）への飲料水にＮａＩを添加したことにより、唾液腺における放射能量取り込みが有意に（ｐ＜０．００１３）減少した。データは平均値（ｎ＝４）±ＳＤとして示される。アスタリスクは有意差（対応のないｔ検定でｐ＜０．０５）を示す。非担癌マウスにおけるイメージングリガンドの生体内分布を示す図である。（Ｂ）注射４時間後のＮＭＲＩマウスにおける^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布の比較。データは平均値（ｎ＝４）±ＳＤとして示される。アスタリスクは有意差（対応のないｔ検定でｐ＜０．０５）を示す。

^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の注射１時間後及び４時間後のＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片のイメージングを示す図である。矢印は腫瘍（Ｔ）及び腎臓（Ｋ）を指す。

（Ａ）ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３及びＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおける^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の比較（データは平均値（ｎ＝４）±ＳＤとして示される）を示す図である。（Ｂ）^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を注射されたＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片（左マウス）及びＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片（右マウス）のイメージング（矢印は腫瘍（Ｔ）を指す）を示す図である。

（Ａ）^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇ、１６ＭＢｑで３回）で処置したマウスにおける個々の腫瘍の増殖を示す図である。（Ｂ）ビヒクル（１０％エタノール水溶液で３回）で処置したマウスにおける個々の腫瘍の増殖を示す図である。（Ｃ）非標識Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇで３回）で処置したマウスにおける個々の腫瘍の増殖を示す図である。

^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇ、１６ＭＢｑで３回）、ビヒクル（１０％エタノール水溶液で３回）、又は非標識Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇで３回）で処置したマウスの（Ａ）生存率を示す図である。 ^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇ、１６ＭＢｑで３回）、ビヒクル（１０％エタノール水溶液で３回）、又は非標識Ｈ２ＢＰＰ１（１０％エタノール水溶液に溶解、５μｇで３回）で処置したマウスの（Ｂ）平均体重を示す図である。

以下の実施例は、Ｃ末端にシステイン含有ペプチドベースのキレーター（ＧＧＧＣ、配列番号５）を有するよう設計された新規ＨＥＲ２標的ポリペプチドであるＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）の生成及び特性評価を開示する。Ｈ２ＢＰＰ１のインビトロ及びインビボ特性を、以前に試験された２種のＨＥＲ２結合ポリペプチド：同様にＣ末端ＧＧＧＣキレーターを含有するＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）、及びＣ末端ＫＶＤＣキレーター（配列番号４）を含有するＨ２ＢＰＰ３（配列番号３）（Ｗａｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１１），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５２：４６１－４６９；Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２０１０），ＪＮｕｃｌＭｅｄ５０：７８１－７８９）の特性と比較した。ＨＥＲ２と相互作用するアミノ酸残基に関しては、３種全てのポリペプチドにおいて同一であるが、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１は、Ｈ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３と比較して足場残基が異なる。ここで、後者の２つは、Ｃ末端のキレート残基を除いて同一である（図１）。足場の変化は、特性の望ましくない変化、例えば放射性標識の部位特異性の喪失並びに生体内分布及びイメージング特性の変化を伴う可能性があるため、新規放射性トレーサーの臨床応用には、新たな前臨床評価が必要である。このような評価を目的として、ここではＴｃ－９９ｍを用いて放射性標識を行った。以下の実施例に記載される試験は、驚くべきことに、Ｈ２ＢＰＰ２及びＨ２ＢＰＰ３と比較して、Ｈ２ＢＰＰ１の足場におけるいくつかのアミノ酸の変化にもかかわらず、標識効率及び腎取り込みの有益な低減が保持されたことを示した。結論として、この新規ポリペプチドを診断及び治療用途における使用に適したものとする好ましいインビトロ及びインビボ特性、例えばＨＥＲ２結合、免疫原性プロファイル、生体内分布及び腫瘍標的化が、Ｈ２ＢＰＰ１について実証された。

実施例１
ＨＥＲ２結合ポリペプチドの作製及び純度分析
方法
ポリペプチドの化学合成：両方ともＣ末端にＧＧＧＣキレート配列を含む新規ＨＥＲ２結合ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）及び参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）を、Ａｌｍａｃ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ）で特注した。ポリペプチドは化学合成によって作製され、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製され、酢酸含有緩衝液に交換され、凍結乾燥製品として届られた。特性評価及び放射性標識の前に、凍結乾燥したポリペプチドを－２０℃で保存した。

組換え産生：参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ３（配列番号３）を、前述の通り産生した（Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２００８），ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ１９：２３５－２４３）。

ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳ分析：Ｈ２ＢＰＰ１及びＨ２ＢＰＰ２の純度を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び逆相超高速クロマトグラフィ質量分析（ＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって分析した。凍結乾燥したポリペプチドを、ＰＢＳ（ＫＣｌ２．６８ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．４７ｍＭ、ＮａＣｌ１３６．９ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４８．１ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶解し、ＥＤＴＡ２ｍＭを添加し、時々かき混ぜながら２時間インキュベートした。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドＧＬ１０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）において、流量０．３ｍＬ／ｍｉｎで、ランニング緩衝液としてＰＢＳを使用して行った。ＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳ分析は、ＡＰＩ－ＥＳ及び６１３０シングル四重極ＭＳＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２９０ＵＰＬＣシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＣＳＨ－Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。溶出は、流量０．２ｍＬ／ｍｉｎで２４分間、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル１０～６０％のリニアグラジエントによって行った。

結果
ペプチド合成、精製及び凍結乾燥は、Ｈ２ＢＰＰ１及びＨ２ＢＰＰ２の両方において良好に行われた。両ポリペプチドの純度は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって９９％超、ＲＰ－ＵＰＬＣによって９２％超であると求められた。ＲＰ－ＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、２２０ｎｍシグナルの積分に基づき、表１に示したフラクションで、それぞれ単量体ポリペプチド及びＣｙｓ－Ｃｙｓ媒介二量体ポリペプチドに対応する予想質量を特定した。結論として、２種のポリペプチドそれぞれの純度は同等であり、更なるインビトロ及びインビボ分析のために十分であるとみなされた。

実施例２
非標識ＨＥＲ２結合ポリペプチドの安定性試験
方法
円二色性分光法：新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）及び参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）について、熱安定性及び熱変性後のリフォールディングを、円偏光二色性分光法を用いて測定した。凍結乾燥したポリペプチドをＰＢＳに溶解し、２時間のインキュベーション後、０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＧＶシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で滅菌濾過し、最終濃度が２ｍＭになるまでＥＤＴＡを添加した。ポリペプチド試料をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。１ｍｍの光路長を有するセルを用いて、ＪａｓｃｏＪ－８１０分光偏光計（ＪａｓｃｏＳｃａｎｄｉｎａｖｉａＡＢ）で測定を行った。各ポリペプチドについて、２５０～１９５ｎｍの楕円率を測定する第１のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。熱安定性は、可変温度測定（ＶＴＭ、２０℃から９０℃まで５℃／ｍｉｎ）の間、２２１ｎｍの楕円率を記録することによって求めた。２０℃まで冷却後、２５０ｎｍ～１９５ｎｍの第２のＣＤスペクトルを記録した。

長期安定性評価：それぞれ凍結乾燥され、－２０℃で保存された、又はＰＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡに溶解され、－８０℃及び５℃で保存された、Ｈ２ＢＰＰ１（配列番号１）及びＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）のそれぞれの安定性を、６ヶ月後までモニターした。実施例１に記載される通りに実施したＲＰ－ＵＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣ分析を評価に使用した。

高温安定性評価：Ｈ２ＢＰＰ１（配列番号１）及びＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）をそれぞれＰＢＳに溶解した。ポリペプチド各１００μｇに、ＳｎＣｌ_２５６μｇ、Ｎａ_４ＥＤＴＡ７５μｇ及びグルコン酸Ｎａ２．８ｍｇを添加した。９０℃で６０分間の放射性標識条件で処理した後のポリペプチドの安定性を、質量分析計（Ｖｉｏｎ－Ｑ－Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ）と直列接続したＲＰ－ＵＰＬＣを用いて評価した。分析は、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＣＳＨ－Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、流量０．２ｍＬ／ｍｉｎで、０．１％ギ酸中アセトニトリル１０～５０％のリニアグラジエントによる溶出で２４分間行った。

結果
円二色性分光法：円二色性分光法を使用した可変温度測定から求めた融解温度Ｔｍは、Ｈ２ＢＰＰ１で６２℃、Ｈ２ＢＰＰ２で６８℃であった。これは、Ｚバリアントポリペプチドにしては高いと考えられた。更に、熱誘導変性の前及び後に測定したＣＤスペクトルは、両方のポリペプチドにおいて完全なリフォールディング及び典型的なαヘリックス構造を示した（図２）。

長期安定性評価：－２０℃で凍結乾燥して保存した場合、又はＰＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡに溶解して－８０℃又は５℃で６ヶ月後まで保存した場合、Ｈ２ＢＰＰ１とＨ２ＢＰＰ２との間で安定性の差は見られなかった。表２は、ＲＰ－ＵＰＬＣの結果の概要を示す。

高温安定性評価：ＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）は、Ｈ２ＢＰＰ２についてより多くのポストピークバリアントが生じたという事実から結論付けられるように（図３Ｂと図３Ｄとを比較）、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１は、好ましい標識条件（９０℃、６０分間）での熱処理後、参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２よりも安定であることを示している。これらのバリアントは、脱アミド化ポリペプチドバリアントである可能性が最も高い。

^＊ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋２ｍＭＥＤＴＡに溶解

実施例３
非標識ＨＥＲ２結合ポリペプチドの結合分析
本実施例では、ＨＥＲ２に対する結合親和性及び特異性を評価するために、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）を用いて行われたＳＰＲ結合試験を示す。ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスＨＥＲ２に対する結合をそれぞれ分析することによって、異種間相互作用を調べた。Ｈ２ＢＰＰ１のＨＥＲ２結合特異性を確認するために、近縁の受容体チロシンキナーゼＨＥＲ１（上皮成長因子受容体、ＥＧＦＲとしても知られる）、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対する結合を評価した。

方法
ＳＰＲ異種間結合分析：第１の実験では、ヒト、カニクイザル、ラット及びマウスＨＥＲ２を有するＦｃキメラタンパク質に対するＨ２ＢＰＰ１の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ装置（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して測定した。組換えヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０００４－Ｈ０２Ｈ）、カニクイザルＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０２９５－Ｃ０２Ｈ）、ラットＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号８００７９－Ｒ０２Ｈ）及びマウスＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５０７１４－Ｍ０２Ｈ）をそれぞれ、固定化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリングキットタイプ２（Ｃｙｔｉｖａ）を使用するＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学により、製造業者の指示に従ってＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）上に固定化した。センサーチップ固定化の結果はそれぞれ、ヒトＨＥＲ２Ｆｃキメラタンパク質は２３４２ＲＵ、カニクイザルＨＥＲ２Ｆｃキメラタンパク質は２０６６ＲＵ、ラットＨＥＲ２Ｆｃキメラタンパク質は２３８５ＲＵ、マウスＨＥＲ２Ｆｃキメラタンパク質は１６７４ＲＵであった。チップ表面上へのＨ２ＢＰＰ１の注入には、間に再生を伴わずに１サイクルで一連の分析物注入が可能であるシングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）法を使用した。背景差分のため、各分析物サイクルの前に、ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ３ｍＭ、界面活性剤Ｐ－２００．０５％、ｐＨ７．４）を用いたブランクサイクルを行った。Ｈ２ＢＰＰ１を０．３及び３ｎＭの濃度で２４０秒間連続的に注入した後、解離時間を９００秒間とした。流量は５０μｌ／ｍｉｎであり、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニング緩衝液として使用した。再生緩衝液（２５ｍＭＨＣｌ）を３０秒間、１回注入することにより、表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ８ＫＩｎｓｉｇｈｔＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの１：１結合モデルを使用して、結合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）及び解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を計算した。

ＳＰＲ特異性分析：第２の実験では、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの他のメンバーに対する結合を分析することにより、Ｈ２ＢＰＰ１の特異性を調査した。組換えヒトＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１－Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４４－ＥＲ）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１２９－ＥＲ）、ＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３－Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８－ＲＢ）及びＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４－Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１３１－ＥＲ）の固定化及び試料分析を、１）Ｈ２ＢＰＰ１をそれぞれ０．１９、０．３８及び０．７５ｎＭの濃度で連続的に注入したこと、及び２）解離時間が１２００秒であったことを除いて、異種間結合分析について記載した通りに行った。ヒトＨＥＲＦｃキメラタンパク質のセンサーチップ固定化の結果、ＨＥＲ１は１５９２ＲＵ、ＨＥＲ２は１７０４ＲＵ、ＨＥＲ３は２９４２ＲＵ、ＨＥＲ４は２０５６ＲＵであった。

結果
ＨＥＲ２に対する新規Ｈ２ＢＰＰ１の結合親和性及び特異性を、表面プラズモン共鳴測定によって評価した。

ＳＰＲ異種結合分析：第１の分析において、Ｈ２ＢＰＰ１を、固定化ヒト、カニクイザル、ラット及びマウスＨＥＲ２Ｆｃキメラタンパク質をそれぞれ含有する４つのＢｉａｃｏｒｅセンサーチップチャネル上に、ＳＣＫ濃度系列（０．３及び３ｎＭ）で注入した。Ｈ２ＢＰＰ１は、ヒト及びカニクイザルＨＥＲ２に対する結合を示したが（図４）、ラット又はマウスＨＥＲ２に対する結合は示さなかった（図示せず）。ヒト及びカニクイザルＨＥＲ２－Ｆｃに対するＨ２ＢＰＰ１の結合についての結合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）及び解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）をそれぞれ表３にまとめた。

ＳＰＲ特異性分析：第２のＳＰＲ分析では、Ｈ２ＢＰＰ１のＨＥＲ２結合特異性を、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの他のメンバーであるＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対する結合をそれぞれ分析することによって調査した。ヒトＨＥＲ２についての結合動態は、表３に示されるデータと一致し、Ｋ_Ｄは１００ｐＭと求められたが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４に対する結合は検出されなかった（図５）。

実施例４
インシリコ免疫原性評価
本実施例では、ＨＬＡ結合予測のためのウェブベースのツールを使用した、新規ＨＥＲ２結合ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１及び参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２の、それぞれのアミノ酸配列のインシリコ免疫原性評価を記載する。ヒト試験における使用のためには、最も免疫原性の低いポリペプチドが非常に好ましい。

方法
ＩｍｍｕｎｅＥｐｉｔｏｐｅＤａｔａＢａｓｅ（ＩＥＤＢ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ，ＮＩＨによる：ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／）からのウェブベースのＭＨＣＩＩ結合予測ツールを使用して、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）及び参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）のインシリコ予測分析を行った。このツールは、選択されたＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチド（デフォルトでは１５量体）の結合親和性を予測し、親和性はペプチドの参照セットとの関係でランク付けされる。パーセンタイルランクを使用して、免疫原性である可能性が高い、高親和性結合エピトープを同定することができる。ＩＥＤＢツールの背景及び更なる詳細については、Ｖｉｔａｅｔａｌ（２０１９），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ４７：３３９－３４３を参照されたい。使用したクエリパラメータは、ＩＥＤＢデフォルトパラメータ（方法：「ＩＥＤＢ推奨２．２２」、ＨＬＡセット：完全ＨＬＡ参照セット（２７対立遺伝子）、ペプチド長：１５量体）であった。データをパーセンタイルランク（≦１％、１～２％、２～３％、及び３～１０％）に基づいてグループ分けし、閾値群及びクエリ配列当たりのユニークコアエピトープ（９アミノ酸）及び対立遺伝子の数を集計した。１０％を超えるスコアのペプチドは重要でないと分類された。

結果
２種のペプチドにおける免疫原性エピトープの潜在的な存在を、ＩＥＤＢウェブベースのＭＨＣＩＩ結合予測ツールを使用してインシリコで評価した。新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１と参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２において、それぞれ予測された別個のコアエピトープの数を表４に示す。異なる対立遺伝子に対する親和性が異なる閾値内に入る任意の単一のエピトープは、複数回（各閾値につき１回）数えた。更に、各配列及び閾値について、別個のＨＬＡ対立遺伝子の数を数え、集計した（表５）。評価に使用した対立遺伝子の数は２７であり、したがって最大スコアは２７となった。

Ｈ２ＢＰＰ１内の予測エピトープをＨ２ＢＰＰ２内の予測エピトープと比較すると、主な差異は、参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２のアミノ酸残基４０～４８位に存在するが、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１には存在しないと予測される１つの１～２％閾値エピトープであることが明らかになる。更に、３～１０％閾値エピトープとの差異は、参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２において予測されているが、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１においては予測されていない、５～１３位における１つの更なるエピトープ及び３０～５２位における１つの更なるエピトープ（足場残基は、これら２種のポリペプチド間において最も異なっている）である。結論として、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１では、参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２と比較して、潜在的に免疫原性のエピトープの数が少なく、このことから、Ｈ２ＢＰＰ１は、ヒトにおける使用のための開発において好ましい。

実施例５
ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性標識
本実施例では、新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（配列番号１）並びに２つの参照ポリペプチドＨ２ＢＰＰ２（配列番号２）及びＨ２ＢＰＰ３（配列番号３）の、テクネチウム－９９（^９９ｍＴｃ）の準安定核異性体による放射性標識を記載する。放射化学的収率、純度及び安定性を評価するために実施した分析も示す。

方法
ジスルフィド結合の還元：標識の前に、各ポリペプチドをジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｍｅｒｃｋ）で処理し、システイン残基間に形成されたジスルフィド結合を還元した。この目的のために、ＤＴＴ溶液（１５μｌ、脱気Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中１Ｍ）をポリペプチド（５００μｌ、脱気ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。還元されたポリペプチドを、ＰＢＳで平衡化し、溶出するＮＡＰ－５カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して精製した。溶出した各ポリペプチドを分注（ａｌｉｑｕｏｔ）し（５０μｌ中５０μｇ）、その後使用するまで－８０℃で保存した。

^９９ｍＴｃによる標識：塩化スズ（ＩＩ）二水和物７５μｇ（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｋａ）、グルコン酸ナトリウム塩５ｍｇ（ＣｅｌｓｕｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡＮａ_４）１００μｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する凍結乾燥標識キットを、前述の通り調製した（Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２０１０），ＮｕｃｌＭｅｄＢｉｏｌ３７：５３９－５４６）。ＵｌｔｒａＴｅｃｈｎｅＫｏｗジェネレーター（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）を滅菌０．９％塩化ナトリウム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）で溶出することによって、^９９ｍＴｃを過テクネチウム酸塩として得た。脱気ＰＢＳ１００μｌに溶解した凍結乾燥キットの内容物をポリペプチド５０μｇに添加することによって、各ポリペプチドの放射性標識を行った。反応混合物に、ジェネレーター溶出^９９ｍＴｃ－過テクネチウム酸塩１００μｌ（１５０～２５０ＭＢｑ）を添加し、バイアルを脱気して混合物を酸化から保護した。反応バイアルを十分にボルテックスで混合し、９０℃で１時間インキュベートした。

放射性標識の評価：各ポリペプチドの放射化学的収率を、ＩＴＬＣ－ＳＧストリップ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＰＢＳで展開するインスタント薄層クロマトグラフィにより分析した（ポリペプチド：保持因子（Ｒｆ）＝０．０、^９９ｍＴｃの他の形態：Ｒｆ＝１．０）。生成物中の還元加水分解テクネチウムコロイド（ＲＨＴ）レベルを、移動相としてピリジン：酢酸：水（５：３：１．５）を用いて測定した（^９９ｍＴｃコロイド：Ｒｆ＝０．０、^９９ｍＴｃの他の形態及び放射性標識ポリペプチド：Ｒｆ＝１．０）。放射化学的収率は全てのコンジュゲートにおいて９５％超であったため、更なる精製は行わなかった。ＩＴＬＣ測定の結果を、ＭＥＳ緩衝液中のＮｕＰＡＧＥ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証した。ＩＴＬＣストリップ及び電気泳動ゲルの両方における放射能分布の定量的測定には、ＣｙｃｌｏｎｅＳｔｏｒａｇｅＰｈｏｓｐｈｏｒシステム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用した。

放射性ＩＴＬＣデータを更に交差検証するために、ＲＰ－ＨＰＬＣを、直列に連結されたＬ－２１３０ポンプ、ＵＶ検出器（Ｌ－２４００）及び放射線（radiation flow）検出器（Ｂｉｏｓｃａｎ）を備えたＬａＣｈｒｏｍＥｌｉｔｅ（登録商標）システム（ＶＷＲ－Ｈｉｔａｃｈｉ）で行った。^９９ｍＴｃ標識化合物の純度分析は、分析カラム（Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍＣ１８、１００Å、１５０×４．６ｍｍカラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて行った。ＲＰ－ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった。溶媒Ａ：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中１０ｍＭＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中１０ｍＭＴＦＡ、２２０ｎｍでのＵＶ検出、グラジエント溶出：Ｂ５～７０％で０～１５分、Ｂ７０～９５％で１５～１８分、Ｂ５％で１９～２０分、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎ。

放射性標識コンジュゲートのインビトロ安定性を評価するために、新たに標識されたポリペプチドの各フラクション（１０μｌ、０．４μｇ）を過剰量のＰＢＳ（４０μｌ）と共に３７℃で１時間及び４時間インキュベートした。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。^９９ｍＴｃの放出を、上記の通りＩＴＬＣによってモニターした。

結果
３つ全てのポリペプチドバリアントは、^９９ｍＴｃで首尾よく標識され、放射性標識収率及び放射化学的純度の両方が９５％を超えた。全てのコンジュゲートは、過剰のＰＢＳ存在下、３７℃で４時間のインキュベーション中において安定であった。^９９ｍＴｃの３％未満の放出が観察された。放射性標識及びインビトロ安定性試験の結果を表６にまとめた。

ＩＴＬＣデータの交差検証のため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ及び分析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図６）では、高分子量又は低分子量の放射能バンドが観察されなかったため、凝集、分解、放射性核種の放出の兆候は認められなかった。放射性ＲＰ－ＨＰＬＣ分析では、全てのポリペプチドの保持時間は約８．６～９．２分であり、標識ポリペプチドの保持時間（放射能検出器により測定）は、非標識ポリペプチドの保持時間（ＵＶ検出器により測定）と同じであった。このことから、標識ペプチドの真正性が確認された。

実施例６
放射性標識ＨＥＲ２結合ポリペプチドのインビトロ特性評価
本実施例では、実施例５に記載される通りに調製された３つの^９９ｍＴｃ標識ポリペプチドの、インビトロ細胞ベースのアッセイを使用した特性評価について記載する。

材料
細胞培養：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手したＨＥＲ２発現卵巣癌ＳＫＯＶ－３及び乳癌ＢＴ－４７４細胞株を使用した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ－グルタミン、並びに１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンで構成されるＰＥＳＴを添加したＲＰＭＩ培地（ＦｌｏｗＩｒｖｉｎｅ）（以下、「完全培地」と呼ぶ）中で細胞を培養した。細胞を、１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で細胞培養ディッシュに播種した。結合特異性、細胞保持率及び細胞プロセシングのインビトロ試験における各データポイントに、３つのディッシュのセットを使用した。

インビトロ結合特異性：対照ディッシュでは、ＳＫＯＶ－３及びＢＴ－４７４細胞を５００倍過剰の非標識Ｈ２ＢＰＰ３で１５分間予め飽和させた。０．５ｎＭの各標識ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１（新規）、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２（参照）及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３（参照）をそれぞれ試験ディッシュ及び対照ディッシュに添加し、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）中で１時間インキュベートした。培地を捨て、細胞を冷たい無血清培地で洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ディッシュ当たり０．５ｍＬ）を添加し、細胞を更に１０分間インキュベートした。剥離した細胞を完全培地０．５ｍＬで希釈し、再懸濁し、フラクションチューブに移した。細胞の放射能を、ＮａＩ（ＴＩ）検出器を備えた自動ガンマカウンター（１４８０Ｗｉｚａｒｄ、Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定し、細胞結合放射能を計算した。

インビトロ結合親和性：^９９ｍＴｃ標識ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（新規）、Ｈ２ＢＰＰ２（参照）及びＨ２ＢＰＰ３（参照）のＨＥＲ２受容体に対する結合動態を、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒＹｅｌｌｏｗ装置（ＲｉｄｇｅｖｉｅｗＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。ＳＫＯＶ－３細胞を、細胞培養ディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、サイズ１００６２０、ＮＵＮＣＡ／Ｓ）の局所領域に播種した。測定は、内在化を防ぐために室温（ＲＴ）で行った。^９９ｍＴｃ標識ポリペプチド０．３３、１及び３ｎＭで取り込み曲線を記録し、その後、放射性培地を取り除き、新しい非放射性培地を添加して、解離曲線を記録した。データを、ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＭａｐソフトウェア（ＲｉｄｇｅｖｉｅｗＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して分析して、結合速度、解離速度及び平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算した。分析はｄｕｐｌｉｃａｔｅで行った。

細胞プロセシング試験：以前に記載され、検証された方法を使用して、細胞プロセシングを調べた（ＷａｌｌｂｅｒｇａｎｄＯｒｌｏｖａ（２００８），ＣａｎｃｅｒＢｉｏｔｈｅｒＲａｄｉｏｐｈａｒｍ２３：４３５－４４２）。簡単に説明すると、ＳＫＯＶ－３及びＢＴ－４７４細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）を標識Ｈ２ＢＰＰ１（新規）、Ｈ２ＢＰＰ２（参照）及びＨ２ＢＰＰ３（参照）各０．５ｎＭと共に室温で１時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を３７℃の加湿インキュベーターに入れた。インキュベーションの０、１、２、４及び６時間後に、内在化されたフラクションを酸洗浄法によって求めた。氷上で５分間、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）中４Ｍ尿素溶液で処理することによって、膜結合ポリペプチドを細胞から除去した。内在化されたコンジュゲートを含有する細胞残屑を、１ＭＮａＯＨで処理することによって剥離した。細胞の放射能を、ＮａＩ（ＴＩ）検出器を備えた自動ガンマカウンター（１４８０Ｗｉｚａｒｄ、Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定し、膜結合放射能及び内在化放射能の割合を計算した。

結果
インビトロ結合特異性：Ｈ２ＢＰＰ１（新規）、Ｈ２ＢＰＰ２（参照）及びＨ２ＢＰＰ３（参照）ポリペプチドのＨＥＲ２結合特異性を、飽和実験を使用して評価した。細胞を非標識Ｈ２ＢＰＰ３で予め飽和させた場合、結合は有意に減少し（ｐ＜５×１０^－６）（図７）、新規及び参照ポリペプチドの両方の結合がＨＥＲ２媒介性であることが確認された。

インビトロ結合親和性：ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒを使用して測定した、^９９ｍＴｃ標識ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１（新規）、Ｈ２ＢＰＰ２（参照）及びＨ２ＢＰＰ３（参照）のそれぞれの、ＳＫＯＶ－３細胞のＨＥＲ２受容体に対する結合動態を表７にまとめた。全てのコンジュゲートの、ＳＫＯＶ－３細胞株に対する結合の最良適合は、１：１モデルを使用して達成された。相互作用マップ計算では、全てのコンジュゲートについて、急速な結合とそれに続く非常に遅い解離が示され、その結果、ピコモルの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が得られた。

細胞プロセシング試験：細胞保持率及び内在化実験の結果では、全てのポリペプチドの内在化が遅いことが示された（図８）。参照ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３は、６時間のインキュベーション後に、ＧＧＧＣキレーターを含有するポリペプチド、すなわち新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１（ＳＫＯＶ－３及びＢＴ－４７４についてそれぞれ６５．８±２．１及び８１．５±２．３％）及び参照ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２（ＳＫＯＶ－３及びＢＴ－４７４についてそれぞれ７６．８±４．０及び８６．９±１．２％）よりも高い保持率（ＳＫＯＶ－３及びＢＴ－４７４細胞についてそれぞれ８７．６±３．５及び８７．３±３．５％）を示す傾向がわずかに見られた。

結論：新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１は、５８±２ｐＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でＨＥＲ２発現細胞に特異的に結合することが示された。これは、遅い内在化速度にもかかわらず、腫瘍における放射能量の保持に好ましい。

実施例７
インビボ生体内分布試験
方法
動物の取り扱い：動物実験は、実験動物を用いた作業に関する国内法に従って行った。ＵｐｐｓａｌａのＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈによって承認が与えられた。これらの実験では、１データポイント当たり４匹のマウス群を使用した。

非担癌マウスにおける生体内分布：新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の足場再設計が該ポリペプチドのインビボ挙動に対して強い有害作用を及ぼさないことを確認するため、注射４時間後の雌ＮＭＲＩマウスにおける生体内分布を、参照ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の生体内分布と比較した。非担癌マウス（体重：２５．５±２．４ｇ）に、各^９９ｍＴｃ標識ポリペプチド１μｇ（６０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈注射した。４時間後、麻酔（Ｒｏｍｐｕｎ／Ｋｅｔａｌａｒ）の過剰投与によってマウスを安楽死させ、続いて心臓穿刺を行い、血液試料を採取した。臓器及び組織試料を採取し、秤量した。臓器の放射能を、ＮａＩ（ＴＩ）検出器を備えたガンマスペクトロメータ（１４８０Ｗｉｚａｒｄ、Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定し、臓器の取り込み値を、組織１グラム当たりの投与量（injected dose）に対する割合（％ＩＤ／ｇ）として計算した。

担癌マウスにおける生体内分布：ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおいて、生体内分布及び標的化特性を評価した。異種移植片を構築するために、１０^７個のＳＫＯＶ－３細胞を雌ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に皮下注射した。特異性対照として、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を使用した。５×１０^６個のＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ）を、５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの左後肢に皮下移植した。実験は、細胞移植の２週間後に行った。動物の平均体重は１８．２±０．７ｇであった。平均腫瘍重量は、ＳＫＯＶ－３及びＲａｍｏｓ異種移植片について、それぞれ０．０６±０．０２及び０．０３±０．０１ｇであった。ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するマウスにおける注射の１、４、８及び２４時間後に^、９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布を測定した。３群の担癌マウスに、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１４μｇ（８０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈注射した。注射２４時間後の生体内分布を測定するために、１群のマウスに６４０ｋＢｑを注射したが、注射されたタンパク質質量は同じ４μｇであった。腫瘍における^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１蓄積のＨＥＲ２特異性を評価するために、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を有する１群の動物（マウスの平均体重は１７．６±１．２ｇであった）に^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１４μｇ（８０ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を注射し、注射４時間後に生体内分布を測定した。比較のため、１群のマウスに参照ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２（^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１と同じ放射能量及び投与量）を注射し、注射４時間後に生体内分布を測定した。担癌マウスにおける生体内分布の測定は、ＮＭＲＩマウスについて上述した通りに行った。

インビボイメージング：生体内分布結果を確認するために、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを実施した。ＳＫＯＶ－３異種移植マウス１匹及びＲａｍｏｓ異種移植マウス１匹に、２０ＭＢｑ／４μｇの^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１を静脈内注射した。注射４時間後に、ｎａｎｏＳｃａｎＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナ（ＭｅｄｉｓｏＭｅｄｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）を使用してマウスをイメージングした。マウスを、カメラに入れる直前にＣＯ_２窒息によって安楽死させた。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）取得を以下のパラメータで行った：エネルギーピーク５０ｋＶ、６７０μＡ、投影４８０回、取得時間２．２９分。ＳＰＥＣＴ取得を以下のパラメータで行った：^９９ｍＴｃエネルギーピーク１４０ｋｅＶ、ウィンドウ幅２０％、マトリックス２５６×２５６、取得時間１時間。Ｎｕｃｌｉｎｅ２．０３ソフトウェア（ＭｅｄｉｓｏＭｅｄｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）を使用してＣＴ画像をリアルタイムで再構成した。Ｔｅｒａ－Ｔｏｍｏ（商標）３ＤＳＰＥＣＴ再構成技術を使用して、ＳＰＥＣＴの生データを再構成した。

結果
非担癌マウスにおける生体内分布：注射４時間後のＮＭＲＩマウスにおける、新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１並びに２つの参照ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の生体内分布の比較を図９に示す。^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の生体内分布データは、これらの参照ポリペプチドについて以前に得られたデータと非常によく一致していた（Ｗａｌｌｂｅｒｇｅｔａｌ（２０１１），ｓｕｐｒａ；Ａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ（２０１０），ｓｕｐｒａ）。ＧＧＧＣ含有ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１（５．９±２．１％ＩＤ／ｇ）及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２（７．９±２．１％ＩＤ／ｇ）の腎取り込みは、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３（１８３．８±２７．３％ＩＤ／ｇ）よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００５）。言い換えれば、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２の腎取り込みは、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の腎取り込みと比較して１／２５～１／３０であった。更に、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２は、肺、肝臓、脾臓、胃、筋肉及び骨での取り込みが、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３よりも有意に（ｐ＜０．０５）低かった。肝臓における^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２の取り込みは、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３の取り込みと比較して、ほぼ１／４であった。このように取り込みが低いことは、乳癌において多く見られる肝転移のイメージングにおける背景放射能量の低下をもたらすため、好ましい特徴である。新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１はまた、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ３よりも有意に低い血中濃度も示した。

担癌マウスマウスにおける生体内分布：ヒト癌異種移植片を有するヌードマウスで行われた実験は、注射４時間後に、ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３異種移植片における^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の取り込みが、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片よりも１７５倍高いことを実証した（ｐ＜０．０００５）（図１０）。これにより、腫瘍蓄積がＨＥＲ２特異的であることが確認された。注射の１、４、８及び２４時間後の新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布データを表８に示す。^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１は、腫瘍取り込みが注射１時間後において既に２４±７％ＩＤ／ｇであったことから、効率的な標的化を示した。［^９９ｍＴｃ］（Ｔｃ＝Ｏ）－ＧＧＧＣ錯体が非残留性（ｎｏｎ－ｒｅｓｉｄｕａｌｉｚｉｎｇ）標識として作用することが示されているという事実にもかかわらず、腫瘍における経時的な放射能量の保持は良好であった。理論に束縛されることを望むものではないが、ＨＥＲ２に対する結合ポリペプチドの親和性が非常に高いことが、このような有益な特性の根拠となっている。注射１時間後及び８時間後における腫瘍取り込みに有意差はなく、腫瘍取り込みは注射２４時間後までに１／２しか減少しなかった。対照的に、正常組織からのクリアランスは急速であった。腎臓に関する放射能量は、経時的に非常に急速に低下した（注射２４時間後の５．３±０．３％ＩＤ／ｇと比較して、注射１時間後では４０±１％ＩＤ／ｇ）。このような生体内分布パターンにより、注射４時間後において既に、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の腫瘍対臓器比は有利に高くなっている（表９）。

注射４時間後のヒトＳＫＯＶ－３異種移植片を有するヌードマウスの同じバッチにおける^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２の生体内分布の直接比較（図１１）は、これらのポリペプチドの生体内分布が非常に類似していること、すなわち、新規ポリペプチドにおける足場の変化が生体内分布に対していかなる負の影響も及ぼさないことを実証した。更に、腫瘍対骨比を除いて、２つのコンジュゲートの腫瘍対臓器比に有意差はなかった。腫瘍対腎臓比は、両コンジュゲートともほぼ同じレベルであった（^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ２について、それぞれ２．２±０．５及び１．９±０．２）。

インビボイメージング：ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングの結果（図１２）は、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１を使用したＨＥＲ２陽性腫瘍におけるＨＥＲ２発現の高コントラスト可視化が可能であることを実証した。右後肢のＳＫＯＶ－３腫瘍は、注射４時間後に明確かつ高コントラストで可視化された。生体内分布データと一致して、腫瘍における放射能取り込みは腎臓よりもかなり高かった。予想通り、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片における放射能取り込みは、ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片よりもはるかに低かった。

結論
新規ポリペプチドＨ２ＢＰＰ１の足場を広範囲に再設計しても、該ポリペプチドのＣ末端内に設計されたＧＧＧＣキレーターを使用して^９９ｍＴｃで標識した該ポリペプチドのイメージング特性は損なわれなかった。この新規プローブ、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１は、これまでの文献に記載されている単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）用のＨＥＲ２イメージングプローブと比較しても、優れた腫瘍対血液比をもたらした。本発明者らは、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１が、高い腫瘍対臓器比及び低い腎取り込みを提供することから、更なる臨床応用試験のための有望な候補であると結論付ける。

実施例８
ヒトにおける使用のための線量評価
方法
新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１のヒトにおける線量評価を行うために、マウスにおける取り込み値を、確立された「パーセントｋｇ／ｇ法（percent kg/g method）」（Ｓｔａｂｉｎ（２００８），ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＤｏｓｉｍｅｔｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；ｐ８３－８６）を使用し、以下：
（％ＩＡ／ｏｒｇａｎ）_{ｈｕｍａｎ}＝［（％ＩＡ／ｇ）_{ａｎｉｍａｌ}×（ｋｇ_{ＴＢｗｅｉｇｈｔ}）_{ａｎｉｍａｌ}×（ｇ_{ｏｒｇａｎ}／（ｋｇ_{ＴＢｗｅｉｇｈｔ}）_{ｈｕｍａｎ}］
（ここで、「％ＩＡ」は投与放射能％を表し、「ＴＢｗｅｉｇｈｔ」は総体重を表す）に従って計算した。

ヒトの臓器取り込みは、標準の成人女性の臓器重量（ＲｅｐｏｒｔｏｆｔｈｅＴａｓｋＧｒｏｕｐｏｎＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｎ，ＩＣＲＰＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ２３（１９７５）．ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）を使用して計算した。滞留時間は、ヒトの時間－放射能曲線に対する指数関数フィットの曲線下面積として計算した。残りの体内滞留時間は、屠体中の放射能に基づいている。ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ１．０ソフトウェアを使用して吸収線量を推定した。

結果
ヒトにおける新規ポリペプチド^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の推定吸収線量を表１０に示す。ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ１．０を使用した計算によれば、実効線量は０．０００６６ｍＳｖ／ＭＢｑ（実効線量当量：０．００１１６ｍＳｖ／ＭＢｑ）となるはずである。

実施例９
^１８８ＲｅによるＨ２ＢＰＰ１の放射性標識
方法
^１８８Ｒｅによるポリペプチドの標識：^１８８Ｒｅは、滅菌０．９％塩化ナトリウム４ｍＬによる^１８８Ｗ／^１８８Ｒｅジェネレーターの溶出（いずれもＯｎｃｏＢｅｔａＧｍｂＨ製、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、過レニウム酸塩として得られた。放射性標識は、１）低溶出液量（１５００μｌ以下）又は２）高溶出液量（４０００μｌ）の２通りの方法で行った。

低溶出液量での標識：１．２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２に溶解した、塩化スズ（ＩＩ）二水和物１ｍｇ、グルコン酸ナトリウム塩５ｍｇ及びＥＤＴＡＮａ_４１００μｇを含有する１つの凍結乾燥キットの内容物を、Ｈ２ＢＰＰ１２００μｇに添加して総体積１００μｌとした。反応液に^１８８Ｒｅ含有ジェネレーター溶出液を最大で１５００μｌ（最大で３００ＭＢｑ）添加した。混合物を７０℃で６０分間インキュベートし、次いで室温で５分間冷却した。実施例５に記載される通りに、サイズ排除ＮＡＰ－５カラムを使用して標識^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の精製を行った。

高溶出液量での標識：１．２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２に溶解した、塩化スズ（ＩＩ）二水和物２ｍｇ、グルコン酸ナトリウム塩５０ｍｇ及びＥＤＴＡＮａ_４２００μｇを含有する１つの凍結乾燥キットの内容物を、Ｈ２ＢＰＰ１２００μｇに添加して総体積１００μｌとした。反応液に^１８８Ｒｅ含有ジェネレーター溶出液４０００μｌを添加した。アスコルビン酸４４０μｇ（１．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中２ｍｇ／ｍＬ）を反応バイアルに添加し、混合物を７０℃で６０分間インキュベートし、次いで室温で５分間冷却した。その後、５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ＰＢＳ溶液を使用して、反応バイアル中のアスコルビン酸の総量を１ｍｇに調整した。精製はＯａｓｉｓＨＬＢ６ｃｃＶａｃＣａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して行った。５０％エタノール水溶液５ｍＬを通すことによってカートリッジを活性化し、水５ｍＬを通すことによって不活性化した。反応混合物をカートリッジに通し、続いて水２０ｍｌを通した。カートリッジを２５％エタノール水溶液５００μｌで更に洗浄し、５０％エタノール水溶液１ｍＬで精製された^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を溶出した。その後の使用のために、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を水で希釈して、最終エタノール濃度を５～１０％とした。精製したサンプルを、実施例５に記載される通りにＩＴＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。

結果
低溶出液量による標識により、９８．６±０．５％の放射化学的収率が得られた。生成物の放射化学的純度は９８％超であった。この^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を、実施例１０～１１に記載される特性評価、生体内分布及びイメージング試験において使用した。

高溶出液量による標識により、８５±１０％の放射化学的収率が得られた。生成物の放射化学的純度は９７％超であった。この^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を、実施例１２に記載される実験的治療試験において使用した。

実施例１０
^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１ＨＥＲ２結合ポリペプチドのインビトロ特性評価
本実施例では、実施例９に記載される通りに調製された^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の、インビトロでの細胞ベースのアッセイを使用した特性評価を記載する。

方法
細胞培養：ＨＥＲ２発現卵巣癌ＳＫＯＶ－３及び乳癌ＳＫ－ＢＲ－３細胞株（ＡＴＣＣ）を使用した。細胞は完全培地（実施例６参照）で培養し、細胞培養ディッシュに１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で播種した。インビトロ結合特異性試験の各データポイントに、３つのディッシュのセットを使用した。

インビトロ結合特異性：対照ディッシュでは、ＳＫＯＶ－３及びＳＫ－ＢＲ－３細胞を、４００倍モル過剰の非標識Ｈ２ＢＰＰ１（２００ｎＭ）と共に１５分間インキュベートすることによって予め飽和させた。その後、０．５ｎＭの標識ポリペプチド^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を試験ディッシュ及び対照ディッシュの両方に添加し、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）中で１時間インキュベートした。培地を捨て、細胞を冷たい無血清培地で洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ディッシュ当たり０．５ｍＬ）を添加し、細胞を更に１０分間インキュベートした。剥離した細胞を完全培地０．５ｍＬで希釈し、再懸濁し、フラクションチューブに移した。細胞の放射能を、ＮａＩ（ＴＩ）検出器を備えた自動ガンマカウンター（１４８０Ｗｉｚａｒｄ、Ｗａｌｌａｃ）を使用して測定し、細胞結合放射能を計算した。

インビトロ結合親和性：^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１のＨＥＲ２受容体に対する結合動態を、実施例６に記載される通りにＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒＹｅｌｌｏｗ装置（ＲｉｄｇｅｖｉｅｗＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。

結果
インビトロ結合特異性：飽和実験を使用して、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１のＨＥＲ２結合特異性を評価した。細胞を非標識Ｈ２ＢＰＰ１で予め飽和させた場合、結合は有意に減少し（ｐ＜５×１０^－５）（図１４）、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の結合がＨＥＲ２媒介性であることが確認された。

インビトロ結合親和性：ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒを使用して測定した^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の、ＳＫＯＶ－３細胞のＨＥＲ２受容体に対する結合動態を表１１にまとめた。全てのコンジュゲートについて、ＳＫＯＶ－３細胞に対する結合の最良適合は、１：２モデルを使用して達成された。相互作用マップ計算では、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の優勢な相互作用について、急速な結合とそれに続く非常に遅い解離が示され、その結果、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の低い値、すなわち非常に高い親和性が得られた。

結論
新規ポリペプチド^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１は、５±３ｐＭの優勢な親和性（Ｋ_Ｄ）でＨＥＲ２発現細胞に特異的に結合することが示された。これは、腫瘍における放射能量の保持に好ましい。

実施例１１
インビボ生体内分布及びイメージング試験
方法
動物の取り扱い：動物実験は、実験動物を用いた作業に関する国内法に従って行った。ＵｐｐｓａｌａのＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈによって承認が与えられた。

非担癌マウスにおける生体内分布：^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の腎異化の間に放射性過レニウム酸塩が放出されるかどうかを求め、ヒトにおける線量推定のためのデータを得るために、生体内分布試験を実施した（実施例１３）。ＮＭＲＩマウスを無作為に４匹ずつの群に分けた。実験時の動物の平均体重は２９．６±３．４ｇであった。各マウスに、０．９％滅菌生理食塩水１００μｌ中^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１５μｇ（２１０ｋＢｑ）を静脈内注射した。第１の実験において、マウスの１群には、唾液腺のＮａ／Ｉ共輸送体を飽和させるために、実験の２４時間前に飲料水中５％ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を投与し、別の１群には無添加の飲料水を投与した。注射４時間後に生体内分布を測定した。更なる実験では、全ての群に、実験の２４時間前に飲料水中ＮａＩを投与した。注射の０．５、１、４、２４及び４８時間後の時点で、実施例７に記載される通りに^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布を測定した。注射４時間後に得られた結果を、^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１について実施例７で得られた同じ時点での結果と比較し、生体内分布に対する標識の任意の効果を評価した。

担癌マウスにおける生体内分布：ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおいて、生体内分布及び標的化特性を評価した。異種移植片を構築するために、１０^７個のＳＫＯＶ－３細胞を雌ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に皮下注射した。特異性対照として、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を使用した。５×１０^６個のＲａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ）を、５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの左後肢に皮下移植した。実験は、細胞移植の２週間後に行った。動物の平均体重は１８．０±１．０ｇであった。平均腫瘍重量は、ＳＫＯＶ－３及びＲａｍｏｓ異種移植片について、それぞれ０．１６０±０．１２０及び０．７±０．３ｇであった。ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するマウスにおける注射の１、４、８及び２４時間後に^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布を測定した。３群の担癌マウスに、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１１０μｇ（２６３ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を尾静脈注射した。注射の２４時間後及び４８時間後の生体内分布を測定するために、２群のマウスに４７０ｋＢｑを注射したが、注射されたタンパク質質量は同じ１０μｇであった。腫瘍における^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１蓄積のＨＥＲ２特異性を評価するために、ＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓ異種移植片を有する１群の動物（マウスの平均体重は１９．８±０．６ｇであった）に^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１１０μｇ（２６５ｋＢｑ、ＰＢＳ中１００μｌ）を注射し、注射４時間後に生体内分布を測定した。担癌マウスにおける生体内分布の測定は、ＮＭＲＩマウスについて上述した通りに行った。

インビボイメージング：生体内分布結果を確認するために、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングを実施した。ＳＫＯＶ－３異種移植マウス１匹及びＲａｍｏｓ異種移植マウス１匹に、２．４ＭＢｑ／１０μｇの^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を静脈内注射した。ｎａｎｏＳｃａｎＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナ（ＭｅｄｉｓｏＭｅｄｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、セボフルラン麻酔下で注射の１時間後及び４時間後に、ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するマウスをイメージングした。その後、それぞれＳＫＯＶ－３及びＲａｍｏｓ異種移植片を有するマウスを、カメラに入れる直前にＣＯ_２窒息によって安楽死させ、同時に並べてイメージングした。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）取得を以下のパラメータで行った：エネルギーピーク５０ｋＶ、６７０μＡ、投影４８０回、取得時間２．２９分。ＳＰＥＣＴ取得を以下のパラメータで行った：^１８８Ｒｅエネルギーピーク１５０ｋｅＶ、ウィンドウ幅２０％、マトリックス２５６×２５６、取得時間２０分。Ｎｕｃｌｉｎｅ２．０３ソフトウェア（ＭｅｄｉｓｏＭｅｄｉｃａｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）を使用してＣＴ画像をリアルタイムで再構成した。Ｔｅｒａ－Ｔｏｍｏ（商標）３ＤＳＰＥＣＴ再構成技術を使用して、ＳＰＥＣＴの生データを再構成した。

結果
非担癌マウスにおける生体内分布：ＮＭＲＩマウスにおけるＮａ／Ｉ共輸送体の遮断を評価する第１の実験の結果を図１５Ａに示す。遮断の結果、唾液腺における放射能量取り込みが有意に減少した（ｐ＜０．００１３）。遊離放射性過レニウム酸塩（^１８８ＲｅＯ_４ ^－）は、Ｎａ／Ｉ共輸送体によって唾液腺に取り込まれるため、冷ヨウ化物による共輸送体の遮断は、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の異化中に放射性過レニウム酸塩の放出があることを示す。遊離放射性過レニウム酸塩は、正常組織で吸収される線量を増加させることがある。これを回避するために、臨床では、放射性核種治療中にヨウ化ナトリウム、牛乳中ヨウ素又はルゴールヨウ素の形態のヨウ素を患者に投与することによって、Ｎａ／Ｉ共輸送体を遮断する。このアプローチは、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１による治療にも使用することができる。そこで、飲料水にＮａＩを添加した後のマウスで更なる実験を行った。

テクネチウム及びレニウムは化学類似体であるが、その化学特性には差異があり、その結果、^９９ｍＴｃ及び^１８８Ｒｅで標識された放射性医薬品は異なる生物学的挙動を示す。そのような差異が^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１及び^９９ｍＴｃ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布に望ましくない影響を引き起こさないことを確認するために、注射４時間後にＮＭＲＩマウスにおいて得られた結果を比較した（図１５Ｂ）。^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の取り込みは、血液、肺、肝臓及び骨で高いことがわかった。予想外なことに、腎臓における^１８８Ｒｅの保持率は^９９ｍＴｃの保持率よりも低く、これは腎臓における吸収線量の低さに結びつくはずである。腎臓は放射性核種治療において重要な臓器であるため、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１のこの特徴は、Ｈ２ＢＰＰ１の治療への応用に好ましい。正常マウスにおける^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布試験のデータを表１２に示す。生体内分布の特徴は、血液並びに他の器官及び組織からの^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の速やかなクリアランスであった。腸内容物への蓄積量が少ないことから、肝胆道系排泄経路が、体からの^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の排出においていかなる実質的な役割も果たさなかったことが示唆される。非常に重要なことは、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の腎取り込みが急速に減少したことである。

^＊データは、内容物を有する試料全体の％ＩＤとして示される。
^＊＊データは、試料全体について示される。

担癌マウスにおける生体内分布：ＨＥＲ２発現ＳＫＯＶ－３異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕマウスにおける^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の生体内分布試験のデータを、図１６～１７及び表１３に示す。正常なＮＭＲＩマウスにおける生体内分布データと一致して、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１は、血液及び腎臓を含む正常組織から速やかに消失した。腫瘍への取り込みは高く、注射１時間後において既に３１±４％ＩＤ／ｇであった（表１３）。この時点までに、腫瘍取り込みは、大部分の臓器における取り込みよりも高く、腎取り込みと同程度であった。しかし、腫瘍取り込みは経時的に高いままであったが、腎臓における放射能量は急速に低下した。注射４時間後において既に、腫瘍取り込みは腎取り込みの８倍超であった。このことは、放射性核種治療のための好ましい前提条件を作り出した。ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴを用いた実験的イメージングにより、生体内分布データが確認された（図１６）。

^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１を使用した腫瘍標的化のＨＥＲ２特異性を確認するために、注射４時間後にＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ－３及びＨＥＲ２陰性Ｒａｍｏｓリンパ腫異種移植片における取り込みを比較した（図１７）。ＨＥＲ２陽性異種移植片における取り込みは、ＨＥＲ２陰性異種移植片の２４５倍であった。このことは、^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の腫瘍取り込みがＨＥＲ２媒介性であることを明確に実証している。

実施例１２
ＨＥＲ２陽性異種移植片の放射線治療
方法
動物の取り扱い：動物実験は、実験動物を用いた作業に関する国内法に従って行った。ＵｐｐｓａｌａのＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈによって承認が与えられた。

異種移植片の実験的放射性核種治療：ＳＫＯＶ－３細胞を使用して、高レベルのＨＥＲ２発現を有する異種移植片に対するＨ２ＢＰＰ１の効果を調べた。ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの腹部に、１０^７個のＳＫＯＶ－３細胞を皮下移植した。７日後、３群のマウス（群当たりｎ＝１０）を以下のように処置した。Ａ群：^１８８Ｒｅ標識Ｈ２ＢＰＰ１（５μｇ、１６ＭＢｑ、１０％エタノール水溶液１５０μｌ中に溶解）、Ｂ群：ビヒクル（１０％エタノール水溶液１５０μｌ、対照群）、Ｃ群：非標識Ｈ２ＢＰＰ１（５μｇ、１０％エタノール水溶液１５０μｌに溶解。タンパク質自体での処置が腫瘍増殖に対して任意の効果を及ぼすかどうかを評価するための対照群）。各群について、４８時間間隔で３回の投与を行った。倫理的許可に従い、試験は最初の薬剤投与から９０日間行った。腫瘍の存在及びサイズを、スライドキャリパーを用いて週に２回評価した。体重減少が１週間の間に１０％若しくは処置開始後１５％を超えた場合、又は腫瘍が１ｍＬより大きくなった場合若しくは潰瘍化した場合、マウスを安楽死させた。処置開始時、腫瘍体積は以下の通りであった：Ａ群：１０１±２８ｍｍ^３、Ｂ群：８５±４３ｍｍ^３、Ｃ群：８６±２５ｍｍ^３。群間の腫瘍サイズの差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５、多重比較のためのボンフェローニ補正を伴う一元配置分散分析）。

結果
異種移植片の実験的放射性核種治療の結果を図１８～１９に示す。図１８は、各群における個々の腫瘍の増殖を示す。対照群における腫瘍の増殖は急速であった。腫瘍体積倍加時間は、Ｂ群（ビヒクルで処置）で１２±７日、Ｃ群（非標識Ｈ２ＢＰＰ１で処置）で９±２日であった。これらの２群間で腫瘍倍加時間に有意差はなく（ｐ＞０．０５、対応のないｔ検定）、このことは、非標識Ｈ２ＢＰＰ１による処置には抗腫瘍効果がないことを示唆する。腫瘍体積限界に達したため、又は腫瘍潰瘍形成のために、Ｂ群の全ての動物が５１日目までに屠殺された。Ｃ群では、最後の動物が３７日目までに屠殺された。Ａ群における腫瘍増殖のパターンは異なっていた。治療開始後１９日目から腫瘍体積の減少が観察された（図１８Ａ）。この時点で、平均腫瘍体積は、２つの対照群における腫瘍体積よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５、多重比較のためのボンフェローニ補正を伴う一元配置分散分析）。若干遅れて、いくつかの腫瘍は増殖を再開した。しかし、試験終了時（９０日目）には３匹の動物が生存していた。

投与群（Ａ）の生存期間中央値は６８日であり、これは対照群よりも有意に長かった（ｌｏｇ－ｒａｎｋＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定において＜０．０００１）（Ｂ群：２９日、Ｃ群：２７．５日、図１９Ａ）。ビヒクル（Ｂ群）及び非標識Ｈ２ＢＰＰ１（Ｃ群）でそれぞれ処置したマウスの生存期間に差はなかった（ｌｏｇ－ｒａｎｋＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定においてｐ＞０．０５）。

治療の忍容性は良好であった。投与群におけるマウスの挙動及び外観は、対照群における動物の挙動及び外観と変わらなかった。治療群と対照群の間で動物の平均体重に有意差はなかった（図１９Ｂ）。

結論
実験的前臨床治療は、^１８８Re－H2BPP1による処置が、HER2発現腫瘍異種移植片の増殖を遅延させ、そのような異種移植片を有するマウスの生存期間を有意に延長し、動物に対する有害作用を伴わないことを実証した。

実施例１３
ヒトにおける使用のための線量評価
方法
非担癌マウスにおける生体内分布データ（実施例１１）に基づいて、ヒト患者に対する^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の線量評価のアップスケーリングを、実施例８に記載される通りに行った。

結果
ヒトにおける新規ポリペプチド^１８８Ｒｅ－Ｈ２ＢＰＰ１の推定吸収線量を表１４に示す。ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ１．０を使用した計算によれば、実効線量は０．０６８３ｍＳｖ／ＭＢｑ（実効線量当量：０．０６８３ｍＳｖ／ＭＢｑ）となるはずである。

実施形態の項目別リスト
１．アミノ酸配列がＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＧＧＧＣ（配列番号１）を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２．アミノ酸配列が配列番号１からなる、項目１に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。

３．項目１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートからなる放射性標識ポリペプチド。

４．前記放射性核種が医用イメージングに適している、項目３に記載の放射性標識ポリペプチド。

５．前記放射性核種が、^９９ｍＴｃ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５２Ｍｎ、^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択される、項目４に記載の放射性標識ポリペプチド。

６．前記放射性核種が^９９ｍＴｃである、項目５に記載の放射性標識ポリペプチド。

７．前記放射性核種が治療に適している、項目３に記載の放射性標識ポリペプチド。

８．前記放射性核種が^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択される、項目７に記載の放射性標識ポリペプチド。

９．前記放射性核種が^１８８Ｒｅである、項目８に記載の放射性標識ポリペプチド。

１０．項目１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド又は項目３～９のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む組成物。

１１．ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有するか又は有することが疑われる、ヒトを含む哺乳動物対象の体におけるインビボイメージングの方法であって、前記方法が、
－項目１０に記載の組成物に任意選択で含まれる、項目４～６のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドを、哺乳動物対象の体内に投与すること、及び
－医用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の画像を１枚以上得ること、の工程を含み、前記画像が、前記体内における放射性核種の存在を示す、方法。

１２．項目１１に記載の方法であって、前記投与工程の前に、項目４～６のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドを調製する工程を含み、該工程が、項目１又は２に記載のポリペプチドを医用イメージングに適した放射性核種と混合することを含む、方法。

１３．ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を診断する方法であって、
－項目１１又は１２に記載のインビボイメージングの方法を実施すること、
－得られた画像に基づいて前記診断を確立することを含む、方法。

１４．ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の予後を確立する方法であって、
－項目１１又は１２に記載のインビボイメージングの方法を実施すること、
－得られた画像に基づいて前記予後を確立することを含む、方法。

１５．前記癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌及び食道癌から選択される、項目１１～１４のいずれか一項に記載の方法。

１６．前記癌が乳癌である、項目１５に記載の方法。

１７．ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有する、ヒトを含む哺乳動物対象を治療する方法であって、項目１０に記載の組成物中に任意選択で含まれる、治療における有効量の、項目７～９のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドを前記対象に投与する工程を含む、方法。

１８．項目１７に記載の方法であって、前記投与工程の前に、項目７～９のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドを調製する工程を含み、該工程が、項目１又は２に記載のポリペプチドを治療に適した放射性核種と混合することを含む、方法。

１９．前記癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌及び食道癌から選択される、項目１７又は１８に記載の方法。

２０．前記癌が乳癌である、項目１９に記載の方法。

２１．医薬として使用するための、項目１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２２．前記使用が、項目１７～２０のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目２１に記載の使用のためのＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２３．インビボでの診断薬として使用するための、項目１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２４．前記使用が、項目１３及び１５～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目２３に記載の使用のためのＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２５．インビボでの予後薬として使用するための、項目１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２６．前記使用が、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目２３に記載の使用のためのＨＥＲ２結合ポリペプチド。

２７．インビボでの診断薬として使用するための、項目３～６のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチド。

２８．前記使用が、項目１３及び１５～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目２５に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。

２９．インビボでの予後薬として使用するための、項目３～６のいずれか１つに記載の放射性標識ポリペプチド。

３０．前記使用が、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目２９に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。

３１．医薬として使用するための、項目３及び７～９のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチド。

３２．前記使用が、項目１７～２０のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目３１に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。

３３．インビボでの診断薬として使用するための、項目１０に記載の組成物。

３４．前記使用が、項目１３及び１５～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目３３に記載の使用のための組成物。

３５．インビボでの予後薬として使用するための、項目１０に記載の組成物。

３６．前記使用が、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目３５に記載の使用のための組成物。

３７．医薬として使用するための、項目１０に記載の組成物。

３８．前記使用が、項目１７～２０のいずれか一項に記載の方法における使用である、項目３７に記載の使用のための組成物。

３９．項目１又は２に記載のポリペプチドをコードする、核酸。

４０．項目３９に記載の核酸を含む、発現ベクター。

４１．項目４０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

Claims

アミノ酸配列がＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＧＧＧＣ（配列番号１）を含む、ＨＥＲ２結合ポリペプチド。
アミノ酸配列が配列番号１からなる、請求項１に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
請求項１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートからなる放射性標識ポリペプチド。
前記放射性核種が医用イメージングに適しており、例えば^９９ｍＴｃ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５２Ｍｎ、^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択され、例えば^９９ｍＴｃである、請求項３に記載の放射性標識ポリペプチド。
前記放射性核種が治療に適しており、例えば^１８６Ｒｅ及び^１８８Ｒｅからなる群から選択され、例えば^１８８Ｒｅである、請求項３に記載の放射性標識ポリペプチド。
請求項１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド又は請求項３～５のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む組成物。
医薬として、インビボでの診断薬として、又はインビボでの予後薬として使用するための、請求項１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
インビボでの診断薬として使用するための、請求項３又は４に記載の放射性標識ポリペプチド。
前記使用が、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を診断する方法であって、
ｉ）ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有するか又は有することが疑われる、ヒトを含む哺乳動物対象の体におけるインビボイメージングの方法であり、
－請求項６に記載の組成物に任意選択で含まれる、請求項３又は４に記載の放射性標識ポリペプチドを、哺乳動物対象の体内に投与すること、及び
－医用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の画像を１枚以上得ること、の工程を含み、前記画像が、前記体内における放射性核種の存在を示す、方法を行うこと、並びに
ｉｉ）得られた前記画像に基づいて前記診断を確立することを含む、方法における使用である、請求項８に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。
インビボでの予後薬として使用するための、請求項３又は４に記載の放射性標識ポリペプチド。
前記使用が、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌の予後を確立する方法であって、
ｉ）ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有するか又は有することが疑われる、ヒトを含む哺乳動物対象の体におけるインビボイメージングの方法であり、
－請求項６に記載の組成物に任意選択で含まれる、請求項３又は４に記載の放射性標識ポリペプチドを、哺乳動物対象の体内に投与すること、及び
－医用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の画像を１枚以上得ること、の工程を含み、前記画像が、前記体内における放射性核種の存在を示す、方法を行うこと、並びに
ｉｉ）得られた前記画像に基づいて前記予後を確立することを含む、方法における使用である、請求項１０に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。
医薬として使用するための、請求項３～５のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチド。
前記使用が、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌を有する、ヒトを含む哺乳動物対象を治療する方法であって、請求項６に記載の組成物中に任意選択で含まれる、治療における有効量の、請求項３～５のいずれか一項に記載の放射性標識ポリペプチドを前記対象に投与する工程を含む、方法における使用である、請求項１２に記載の使用のための放射性標識ポリペプチド。
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする、核酸。