KR20230174238A - 방사성 항종양제 - Google Patents

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KR20230174238A
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antibody
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seq
muc5ac
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쇼타 고모토
나오아키 야마다
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니혼 메디피직스 가부시키가이샤
스미토모 파마 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 뮤신 서브타입 5AC(MUC5AC)에 대한 특이성과 종양에 대한 집적성이 우수하고, 또한 신장 독성이 저감된, 악티늄-225로 표지된 항MUC5AC 인간화 항체의 제공을 과제로 한다. 본 발명은, 악티늄-225가 킬레이트한 킬레이트제와, 항체와의 복합체로서, 상기 항체가, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체이며, 또한 서열번호 1 내지 4의 어느 것으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 5 내지 8의 어느 것으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화 항체인, 복합체에 관한 것이다.

Description

방사성 항종양제
본 발명은 방사성 항종양제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 방사성 핵종인 225Ac(악티늄-225)가 킬레이트한 킬레이트제와 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체의 복합체를 유효 성분으로서 포함하는, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는, 방사성 항종양제 등에 관한 것이다.
뮤신은 동물의 상피 세포 등으로부터 분비되는 점액의 주성분이며 분자량 100만 내지 1000만의 당을 다량으로 포함하는 당단백질이다. 뮤신에는 상피 세포 등이 산생하는 분비형 뮤신과, 소수성의 막 관통 부위를 갖고 세포막에 결합한 상태로 존재하는 막 결합형 뮤신이 있다. 뮤신의 코어 단백은 총칭해서 MUC로 불리고 있고, 코어 단백을 코드하는 유전자는 적어도 20종류 있는 것을 알고 있다. 그 중 1종인 뮤신 서브타입 5AC(MUC5AC)는 분비형 뮤신에 속한다.
MUC5AC는 정상 조직에서는 위나 기관에 있어서 발현하고 있지만, 췌장암에서의 과잉 발현이 보고되고 있고, 그 외에도 갑상선암, 간장암, 대장암, 위암, 요로 상피암, 유방암, 자궁경암, 난소암, 자궁 내막암, 담관암에서도 과잉 발현이 보고되고 있다. MUC5AC에 대한 항체에 대해서는, 인간 췌장암 세포주 SW1990의 이종이식으로부터 정제한 췌장암 뮤신 분획을 항원으로서 제작한 마우스 항체(비특허문헌 1)나, 그것을 바탕으로 제작된 키메라 항체(특허문헌 1, 2, 비특허문헌 2, 3), 인간화 항체(특허문헌 3, 4)의 보고가 있다.
항체는 항체가 갖는 표적 분자에 대한 특이성을 이용하여, 표적 분자의 검출을 위한 시약, 진단약, 또는, 질환의 치료를 위한 의약품으로서 사용되고 있다. 검출 성능 및 치료 효과의 한층 더한 향상을 목적으로 하여, 방사성 핵종이나 약제가 결합한 항체에 관한 검토가 진행되고 있다. 비특허문헌 1에서는, β선 방출 핵종(β 핵종)인 131I로 표지된 마우스 항체를 사용한 췌장암 모델 마우스의 방사 면역 치료가 보고되고 있다. 비특허문헌 3에서는, γ선 방출 핵종(γ 핵종)인 111In으로 표지된 키메라 항체를 사용한 췌장암 환자의 SPECT 이미징에 대해서 보고되고 있다. 특허문헌 3 및 4에서는, 특정한 MUC5AC 특이적 인간화 항체에 관한 기재가 있고, 90Y나 111In 등으로 표지한 것을 포함할 수 있다고도 기재되어 있지만, 실시예에는 당해 MUC5AC 특이적 인간화 항체의 ADCC(항체 의존성 세포 장애) 활성이 나타날 뿐이다.
특허문헌 5 및 비특허문헌 4에는, α선 방출 핵종(α 핵종)인 225Ac로 표지된 항체(225Ac 표지 항체)에 관한 기재가 있고, 해당 항체에는 투여 후 지발적인 신장 독성이 보고되고 있다. 신장 독성을 저감하기 위해서 다양한 약제가 병용되어 있다(비특허문헌 4).
특허문헌 6에는, 특정한 구조를 갖는 레닌 저해제와, 스테로이드계 알도스테론 안타고니스트인 스피로노락톤, 에플레레논과 조합해서 신장 보호에 사용하는 의약 조성물이 개시되어 있다.
일본특허공개 평7-203974호 공보 일본특허공개 평11-5749호 공보 국제공개 2013/157102호 팸플릿 국제공개 2013/157105호 팸플릿 국제공개 2005/028021호 팸플릿 일본특허공표 2007-529459호 공보
Japanese Journal of Cancer Research, 87, 977-984, 1996 일본 임상 64권, 증간호 1, 2006, 274-278 Japanese Journal of Cancer Research, 90, 1179-1186, 1999 Cancer Res. 2005 Jun 1;65(11): 4888-95.
방사성 핵종인 225Ac(악티늄-225)로 표지된, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(이하, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체라고도 칭한다)의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성을 저감한 약제를 제공할 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 감안하여 예의 검토를 행한 결과, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용함으로써 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제 또는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 독성을 저감시키는 약제의 양쪽을 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제의 신장 독성을 저감할 수 있는 것을 알아내고, 그 효과를 확인해서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양태는, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 양태는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 양태는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와 조합해서 사용되는, 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 양태는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와, 신장 독성을 저감하기 위한 약제
를 갖는 조합 의약을 제공하는 것이다.
도 1은 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 후 26주일의 마우스의 평균 체중의 추이를 나타낸 그래프이다. 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(Zn-DTPA)과의 병용 투여군(실시예 1), 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 단독 투여군(비교예 1) 및 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(Zn-DTPA) 단독 투여군(비교예 2)의 결과를 나타낸다.
도 2는 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 후 26주일의 마우스의 평균 체중의 추이를 나타낸 그래프이다. 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(푸로세미드)과의 병용 투여군(실시예 2, 실시예 5), 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 단독 투여군(비교예 1) 및 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(푸로세미드) 단독 투여군(비교예 3)의 결과를 나타낸다.
도 3은 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 후 26주일의 마우스의 평균 체중의 추이를 나타낸 그래프이다. 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(스피로노락톤)과의 병용 투여군(실시예 3, 실시예 6), 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 단독 투여군(비교예 1) 및 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(스피로노락톤) 단독 투여군(비교예 4)의 결과를 나타낸다.
도 4는 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 후 26주일의 마우스의 평균 체중의 추이를 나타낸 그래프이다. 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(에플레레논)과의 병용 투여군(실시예 4, 실시예 7), 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 단독 투여군(비교예 1) 및 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(에플레레논) 단독 투여군(비교예 5)의 결과를 나타낸다.
도 5는 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 후 16주째의 각 투여군의 마우스에 있어서의 요 중 N/C비를 나타내는 그래프이다(각 군 n=4 내지 5). 「*」은 던네트 검정에 있어서의 유의 차가 확인된 투여군을 나타낸다(p＜0.05).
도 6은 각 투여군의 신장의 병리학적 평가의 결과를 도시하는 도면이다. 각 군 2 내지 5마리이고, 소견란 기재된 소견이 확인된 각 그레이드의 개체수를 나타낸다. 각 소견에 공통되게 그레이드 「-」은 소견이 확인되지 않는 것을 나타낸다. 수질 외층에 있어서의 요세관 상피의 변성/재생에 있어서, 그레이드 「+」는 요세관 상피 세포의 변성이 산발적으로 확인되는 것을 나타내고, 그레이드 「2+」는 동 변화가 미만성으로 확인되는 것을 나타내고, 그레이드 「3+」는 더욱 변성 및 재생 요세관이 명확하고 활동적인 상태인 것을 나타낸다. 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관에 있어서, 그레이드 「+」는 소견이 자연 발생과 동일 정도의 빈도로 확인되는 것을 나타내고, 그레이드 「2+」는 소견이 자연 발생보다 많이 확인되어 다소성으로 확인되는 것을 나타내고, 그레이드 「3+」는 명확한 변화가 신장 전체에 확인되는 것을 나타낸다.
도 7은 각 실시예 및 비교예에 있어서의 수질 외층에 있어서의 요세관 상피 세포의 변성/재생의 대표적인 병리학적 소견을 도시하는 도면이다(스케일 바는 70㎛). 화살표는 병리학적 소견이 확인되는 부위를 나타낸다.
도 8은 각 실시예 및 비교예에 있어서의 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관의 대표적인 병리학적 소견을 도시하는 도면이다(스케일 바는 300㎛). 화살표는 병리학적 소견이 확인되는 부위를 나타낸다.
도 9는 111In 표지한 각 항체를 사용해서 SPECT-CT 이미징을 실시한 결과를 도시하는 도면이다. 111In 표지한 각 항체의 SPECT 화상을 나타낸다.
도 10은 111In 표지한 각 항체의 SPECT 화상으로부터 각 시간점의 종양(상) 및 간장(하)을 VOI(volume of interest, 삼차원 ROI) 해석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 111In 표지한 각 항체를 투여해서 168 시간 후의 체내 분포(상) 및 배설 경로(하)를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 111In 표지한 각 항체의 시험관 내 ARG에 의한 결합능을 비교한 결과를 나타내는 화상이다.
도 13은 111In 표지한 각 항체의 시험관 내 ARG에 의한 결합능을 정량화하고, 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 명세서에서 사용하는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 의미로 사용할 수 있다.
(1) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체
본 발명에서 사용하는 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체는, 방사성 핵종으로서 악티늄-225를 사용하여, 해당 방사성 핵종으로 착 형성된 킬레이트제와 MUC5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체와의 복합체(이하, 본 발명의 복합체라 칭하는 경우가 있다)이다.
(1-1) 악티늄-225에 의한 표지(225Ac 표지)
본 발명의 복합체에 포함되는 방사성 핵종인 225Ac는 α선을 방출하는 핵종으로서 알려져 있다. 225Ac는 사이클로트론이나 선형 가속기 등의 가속기를 사용해서 공지된 방법에 의해 제조할 수 있고, 예를 들어 사이클로트론을 사용해서 226Ra 타깃에 양자를 조사함으로써, (p,2n)의 핵반응에 의해 생성할 수 있다. 생성한 225Ac는, 타깃으로부터 분리 정제함으로써 정제할 수 있고, 예를 들어 225Ac를 포함하는 타깃을 산 등으로 용해하고, 용해액에 알칼리를 첨가함으로써 225Ac를 포함하는 염을 석출시키고, 당해 염을 분리 정제함으로써, 정제한 225Ac를 얻을 수 있다. 이와 같이 해서 정제한 225Ac에 필요에 따라서 화학 처리를 첨가해서 RI 표지에 적합한 화학 형태로 함으로써, RI 표지에 사용할 수 있다.
(1-2) 항체
본 발명의 복합체에 포함되는 항체는, MUC5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(이하, 본 발명으로 사용되는 인간화 항체라고도 칭한다)이다. 해당 항체는 그 항원 결합 단편으로서 사용되어도 되고, 이러한 양태도 본원 발명에 포함된다. 구체적으로는 후술하는 특정한 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 소망에 따라 적절한 중쇄 정상 영역과 경쇄 정상 영역을 갖는다. 본 명세서가 있어서 「항원 결합 단편」이란 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 일부로 이루어지는 항체 단편이며, 또한 MUC5AC와의 결합능을 갖는 것을 의미한다. MUC5AC와의 결합능을 갖는 한, 항원 결합 단편을 구성하는 폴리펩티드에 포함되는 아미노산의 수는 특별히 한정되는 것은 아니다.
하기에 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역으로서 바람직한 아미노산 서열을 나타낸다. 중쇄 가변 영역 1(H01), 중쇄 가변 영역 2(H02), 중쇄 가변 영역 3(H03) 및 중쇄 가변 영역 4(H04)는, 본 명세서에 첨부한 서열표의 서열번호 1 내지 4에, 각각 상당한다. 밑줄을 그은 부위는 CDR 부위이다.
Figure pct00001
하기에 본 발명에 있어서 인간화 항체의 경쇄 가변 영역으로서 바람직한 아미노산 서열을 나타낸다. 경쇄 가변 영역 1(L01), 경쇄 가변 영역 2(L02), 경쇄 가변 영역 3(L03) 및 경쇄 가변 영역 4(L04)는, 본 명세서에 첨부한 서열표의 서열번호 5 내지 8에, 각각 상당한다. 밑줄을 그은 부위는 CDR 부위이다.
Figure pct00002
바꿔 말하면, 본 발명에 있어서 바람직한 인간화 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 5 내지 서열번호 8의 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열로 이루어진다. 즉 본 발명에서 사용되는 인간화 항체는, 상기에서 설명한 4개의 중쇄 가변 영역(H01 내지 H04)의 어느 하나와 4개의 경쇄 가변 영역(L01 내지 L04)의 어느 하나의 조합으로 이루어진다.
본 발명에 있어서 적합한 인간화 항체는 중쇄 가변 영역이 H01, H03 또는 H04이고, 또한 경쇄 가변 영역이 L01 내지 L04의 어느 하나인 인간화 항체이다.
본 발명에 있어서 가장 적합한 인간화 항체는 중쇄 가변 영역이 H01이고 경쇄 가변 영역이 L03인 항체이다.
본 발명에 있어서 인간화 항체의 중쇄 가변 영역은, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열에 의해 규정되는 것에 한정되지 않고, 기능을 유지하고 있는 변이체도 포함한다. 즉 서열번호 1 내지 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상 혹은 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 변이한 중쇄 가변 영역도, 본 발명의 경쇄 가변 영역과 조합되었을 때 MUC5AC와의 결합능을 갖는 한 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역으로서 사용할 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 갖는 항MUC5AC 인간화 항체는, MUC5AC에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 인간화 항체이며, 안정된 물성을 갖고 또한 종양 집적성이 우수하다.
본 명세서에 있어서 아미노산 서열의 동일성이란, 대상으로 하는 2개의 단백질간의 아미노산 서열의 동일성을 말하며, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 수학적 알고리즘을 사용해서 작성된 아미노산 서열의 최적의 얼라인먼트에 있어서 일치하는 아미노산 잔기의 비율(%)에 의해 표현된다. 아미노산 서열의 동일성은, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있고, 당업자에게 주지의 호몰로지 검색 프로그램(예를 들어, BLAST, FASTA)이나 서열 정렬 프로그램(예를 들어, ClustalW)), 혹은 유전 정보 처리 소프트웨어(예를 들어, GENETYX [등록상표]) 등을 사용해서 산출할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 아미노산 서열의 동일성은, 구체적으로는 DDBJ(DNA DataBank of Japan)의 웹 사이트에서 공개되고 있는 계통 해석 프로그램 ClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja)를 사용하여, 초기 설정의 조건(Version2.1, Alignment type:slow, DNA Weight Matrix:Gonnet, GAP OPEN:10, GAP EXTENSION:0.1)으로 구할 수 있다.
이에 더하여, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역으로서, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열이 있어서, 10개 이하, 바람직하게는 8개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하(3개, 2개 혹은 1개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지는 변이한 중쇄 가변 영역도, 본 발명의 경쇄 가변 영역과 조합되었을 때 MUC5AC와의 결합능을 갖는 한, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역으로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역은, 서열번호 5 내지 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 한정되지 않고, 기능을 유지하고 있는 변이체도 포함한다. 즉 서열번호 5 내지 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상 혹은 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 변이한 경쇄 가변 영역도, 본 발명의 중쇄 가변 영역과 조합되었을 때 MUC5AC와의 결합능을 갖는 한 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역으로서 사용된다.
이에 더하여, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역으로서, 서열번호 5 내지 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열이 있어서 10개 이하, 바람직하게는 8개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하(3개, 2개 혹은 1개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지는 변이한 경쇄 가변 영역도, 본 발명의 중쇄 가변 영역과 조합되었을 때 MUC5AC와의 결합능을 갖는 한, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 경쇄 가변 영역으로서 사용된다.
본 발명에서 사용되는 인간화 항체는 본 기술 분야에서 일반적으로 실시되고 있는 방법 또는 그에 준한 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 이하의 수순으로 행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 8에 개시되어 있으므로, 그들의 아미노산 서열 정보에 기초하여 얻어진 해당 항체를 코드하는 핵산을 구축하고, 적당한 발현 벡터에 삽입한다. 발현 벡터는, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체를 코드하는 핵산에 더하여, 임의로, 번역 효율을 높이기 위한 코작 서열, 숙주에 도입되었을 때 본 발명에서 사용되는 인간화 항체가 배지 중에 분비하는 것을 촉진하는 시그널 서열 및 프로모터 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 벡터는, 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것으로 선택할 수 있지만, 플라스미드 벡터인 pcDNA3.4가 바람직하다. 발현 벡터의 숙주 세포로의 도입도 특별히 한정되지 않고, 세포내에 유전자를 도입하는 방법으로서는 본 기술 분야에서 종래부터 사용되고 있는 방법, 예를 들어 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, DEAE-덱스트란법의 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 하기의 실시예에서 행하고 있는 바와 같이, 리포펙션법을 사용한 도입 방법은 특히 적합하다. 또한 이 목적으로 사용되는 숙주 세포도, 본 기술 분야에서 종래부터 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 그러한 숙주 세포의 예로서, CHO 세포, 293 세포, 대장균, 피키아 효모, Sf9 세포 등을 들 수 있다. 또한 현재는 목적으로 하는 단백질을 발현시키기 위한 발현 시스템의 키트도 시판되고 있고, 하기의 실시예에서 사용하고 있는 ExpiCHO System(서모 피셔 사이언티픽사제)은, 신속 또한 확실한 목적 단백질의 발현을 위해, 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 인간화 항체를 코드하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하고, 그 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 숙주 세포에 그 핵산을 도입하고, 핵산이 도입된 숙주 세포를 배양하고, 그 배양 상청으로부터, 크로마토그래피 등의 정제 수단에 의해, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체를 얻을 수 있다. 본 방법에 있어서는 숙주 세포를 배양함으로써 배양 상청에 본 발명에서 사용되는 인간화 항체를 분비시킨다. 배양 상청으로부터, 크로마토그래피 등의 정제 수단을 사용하여, 본 발명에서 사용되는 인간화 항체 또는 그 항원 결합 단편을 얻을 수 있다. 크로마토그래피의 수단으로서, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피 등 본 기술 분야에서 알려진 다양한 수단을 사용할 수 있다. 하기의 실시예에서 사용하고 있는 프로테인 A 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피는, 특히 바람직하다.
또한 상기의 인간화 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체여도 된다.
(1-3) 킬레이트제
본 발명에 있어서 킬레이트제는, 악티늄-225가 배위하는 부위를 구조 중에 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 악티늄-225가 배위하는 부위인 킬레이트부와 항체와의 복합화를 가능하게 하기 위한 치환기를 갖는다. 킬레이트부로서, 예를 들어 CB-TE2A(1,4,8,11-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디아세트산), CDTA(시클로헥산-트랜스-1,2-디아민테트라-아세트산), CDTPA(4-시아노-4-[[(도데실티오)티옥소메틸]티오]-펜탄산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α'"-테트라메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTAM(1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), DOTA-GA(α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTA-GA-NHS, DOTP(((1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)테트라키스(메틸렌))테트라포스폰산), DOTPA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라프로피온산), 1,4,7,10-테트라키스(피리딘-2-일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Lpy), p-SCN-Bn-DOTA(S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸테트라아세트산), MeO-DOTA-NCS(1-[(2-메톡시-5-이소티오시아나토페닐)-카르복시메틸]-4,7,10-트리스카르복시5메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), EuK-106, DOTMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(메틸렌포스폰산)), DOTA-4AMP(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(아세트아미도메틸렌포스폰산), D02P(테트라아자시클로도데칸디메탄포스폰산), 데페록사민(DFO), DTPA(글리신, N,N-bis[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]-), DTPA-BMA(5,8-비스(카르복시메틸)-11-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸]-3-옥소-2,5,8,11-테트라아자트리데칸-13-오익산), EDTA(2,2',2",2'"-(에탄-1,2-디일비스(아잔트리일))테트라아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산), NOTP(1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리일트리스(메틸렌포스폰산), TETPA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라프로피온산), TETA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산), TTHA(3,6,9,12-테트라키스(카르복시메틸)-3,6,9,12-테트라아자테트라데칸디오익산), HEHA(1,2,7,10,13-헥사아자시클로옥타데칸-1,4,7,10,13,16-헥사아세트산), 1,2-HOPO(N,N',N",N'"-테트라(1,2-디히드로-1-히드록시-2-옥소피리딘-6-카르보닐)-1,5,10,14-테트라아자테트라데칸), PEPA(1,4,7,10,13-펜타아자시클로펜타데칸-N,N',N",N'",N""-펜타-아세트산), H4옥타파(N,N'-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-에틸렌디아민-N,N'-디아세트산), H2비스파2(6,6'-({9-히드록시-1,5-비스(메톡시카르보닐)-2,4-di(피리딘-2-일)-3,7-디아자비시클로[3.3.1]노난-3,7-디일}비스(-메틸렌))디피콜린산), H2데드파(1,2-[{6-(카르복시)-피리딘-2-일}-메틸아미노]에탄), H2마크로파(6-(1,4,10,13-테트라옥사-7,16-디아자시클로옥타데칸-N,N'-메틸)피콜린산), H5데카파(N,N"-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-디에틸렌트리아민-N,N',N"-트리아세트산), H6포스파(N,N'-(메틸렌포스포네이트)-N,N'-[6-(메톡시카르보닐)피리딘-2-일]-메틸-1,2-디아미노에탄), HP-D03A(히드록시프로필테트라아자시클로도데칸트리아세트산), 포르피린, DO3A(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세트산트리소듐염), DO3A-NHS(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산모노-N-히드록시숙신이미드에스테르)와 같은 것을 들 수 있지만, 하기 식 (A)로 표시되는 화합물에서 유래하는 구조를 갖는 것이 바람직하다.
Figure pct00003
(식 (A) 중, R11, R13 및 R14는, 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이고, R12 또는 R15의 한쪽이 수소 원자, 카르복실기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이고, 다른 쪽이 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기이고, p가 0 이상 3 이하의 정수이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기일 때 R15는 수소 원자이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기이다.)
식 (A)로 표시되는 구체적인 구조로서는, 이하의 식 (A-1) 내지 (A-12)로 표현되는 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
킬레이트부와, 항체와 복합화를 가능하게 하기 위한 치환기와의 연결 부위는 아미드 결합이거나, 티오우레아 결합인 것이 바람직하지만, 안정성의 관점에서는 아미드 결합이 보다 바람직하다.
아미드 결합은, 예를 들어 상기 식 (A-10)이나 (A-11)의 N-히드록시숙신이미드에스테르(NHS)기, 또는 상기 (A-12)의 2,6-디옥소테트라히드로-2H-피라닐기와, 제1급 아민과의 반응에 의해 형성된다. 또한, 티오우레아 결합은, 상기 식 (A-2), (A-3)으로 나타내는 화합물의 이소티오시아네이트기와, 제1급 아민 또는 말레이미드기와의 반응에 의해 형성된다.
본 발명의 복합체에 있어서, 킬레이트제는, 항체 1분자에 대하여, 적어도 1분자 이상 구비하고 있으면 되지만, 1분자 이상 8분자 이하 구비하는 것이 바람직하다. 단, 항체 그 자체의 활성(항원 인식 작용, 중화 작용, 보체 활성화 작용 및/또는 옵소닌 작용)을 유지하는 관점에서, 항체의 Fc 영역(정상 영역)에 부위 특이적으로 킬레이트제가 도입되는 것이 바람직하고, 본 발명에 있어서, 킬레이트제는, 항체 1분자에 대하여 1분자 또는 2분자 구비하고 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 복합체에 있어서, 킬레이트제는, 링커를 통하여 항체와 접속되어 있어도 된다. 링커로서는, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬기, 폴리에틸렌글리콜(PEG)기, 펩티드, 당쇄, 디술피드기 및 이들 조합 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 킬레이트제는, 링커를 통하여, 항체를 부위 특이적으로, 보다 바람직하게는 Fc 영역에 수식하고 있다. 이 경우, 링커는 하기 식 (i)로 표시되는, 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드(이하, 「항체 수식 펩티드」 이라고도 한다.)를 포함하고, 또한 가교제로 수식된 항체 수식 펩티드와 항체와의 가교 반응에 의해 형성되어 있는 것을 사용할 수 있다. 또한, 식 (i)에 있어서, 아미노산 서열의 지면 좌측이 N 말단측을 나타내고, 아미노산 서열의 지면 우측이 C 말단측을 나타내는 것으로서 설명한다. 킬레이트제가 링커로서 항체 수식 펩티드를 통하여 항체와 접속되는 경우, 킬레이트제와 항체 수식 펩티드가 연결하는 위치는 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 항체 수식 펩티드의 N 말단 또는 C 말단, 바람직하게는 N 말단에 직접 또는 간접적으로 연결할 수 있다. 또한, 항체 수식 펩티드의 C 말단은 그 안정성의 향상 등을 위해서 아미드화 등의 수식을 받고 있어도 된다.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) … (i)
식 (i) 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각, 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 모두 가지지 않는 아미노산 잔기이고, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로
측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 또는,
한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결하고 있고,
Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이고, 가교제로 수식되어 있다.
상기 식 (i)에 있어서의 X에 포함될 수 있는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌 등의 아미노산에서 유래하는 것을 들 수 있고, X는 동일한 종류의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기여도 되고, 각각 다른 종류의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기여도 된다.
식 (i) 중의 a, b, c 및 d는, 상술한 범위의 수이면 특별히 제한은 없지만, 펩티드와 항체의 결합 안정성의 관점에서, a+b+c+d≤14를 조건으로 하고, a는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, b는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, c는 바람직하게는 3 이상 5 이하의 정수 및d는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수이다.
Xaa1 및 Xaa3은, 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이고, 해당 아미노산은 각각 동일해도 되고, 상이해도 된다. 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모 시스테인을 들 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는, 디술피드 결합에 의해 결합하고 있거나, 또는 이하의 식 (4)에 나타내는 링커를 통하여, 술피드기가 결합되어 있는 것이 바람직하다. 식 (4) 중, 파선 부분은 술피드기와의 결합 부분을 나타낸다.
Figure pct00007
Xaa1 및 Xaa3은, 상술한 조합 대신에, Xaa1 및 Xaa3 중 한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기이고, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기여도 된다. 이들은, 티오에테르 결합을 통하여 결합하고 있다. 할로아세틸기는, 그 말단이 요오드 등의 할로겐으로 치환되고 있어, 다른 쪽의 측쇄에 있어서의 티올기와의 반응에 의해 할로겐이 탈리하고, 티오에테르 결합이 형성된다.
식 (i)로 표시되는 항체 수식 펩티드의 구체적인 아미노산 서열은, 예를 들어 국제공개 2016/186206호 팸플릿, 국제공개 2017/217347호 팸플릿 및 국제공개 2018/230257호 팸플릿에 기재된 펩티드를 들 수 있어, 이들을 사용할 수도 있다.
이들 중, 항체 수식 펩티드의 아미노산 서열로서, 이하의 서열 (1) 내지 (14)의 어느 하나를 갖고 있는 것이 바람직하고, 이하의 서열 (1), (2), (13) 또는 (14)를 갖고 있는 것이 더욱 바람직하다. 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14)에 있어서, (Xaa2)는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산을 나타내고, (Xaa1) 및 (Xaa3)은 모두 호모시스테인 잔기를 나타낸다. 또한, 이하의 아미노산 서열 (1) 내지 (14) 중, (Xaa1), (Xaa2) 및 (Xaa3) 이외의 아미노산은 1문자 약호로 표기한다.
(1) DCAYH(Xaa2)GELVWCT(서열번호 9)
(2) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열번호 10)
(3) RCAYH(Xaa2)GELVWCS(서열번호 11)
(4) GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열번호 12)
(5) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열번호 13)
(6) GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열번호 14)
(7) GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열번호 15)
(8) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열번호 16)
(9) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(서열번호 17)
(10) GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열번호 18)
(11) SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열번호 19)
(12) SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열번호 20)
(13) RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(서열번호 21)
(14) G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(서열번호 22)
(1-4) 복합체의 제조 방법
본 발명의 복합체 제조 방법은, 킬레이트제와 항체를 콘주게이션하는 콘주게이션 공정과, 악티늄-225와 킬레이트제와의 착체를 형성하는 착체 형성 공정의 2개의 공정으로부터 제조할 수 있다. 콘주게이션 공정은, 착체 형성 공정 앞이여도 되고 착체 형성 공정의 후에도 된다.
콘주게이션 공정에 있어서는, 다양한 항체의 화학 수식법이 사용된다. 구체적으로는, (a) 내지 (f)의 방법을 들 수 있다.
(a) 아민 커플링법(N-히드록시숙시미딜(NHS)기로 활성화된 카르복실기를 갖는 킬레이트제 또는 킬레이트를 사용해서 항체의 리신 잔기의 아미노기를 수식하는 방법)
(b) 항체의 힌지 부위에 있는 폴리펩티드쇄간의 디술피드 결합(SS 결합)을 부분적으로 환원함으로써 발생하는 술프히드릴(SH)기에 대하여, SH기에 반응성을 갖는 말레이미드기를 갖는 킬레이트제 또는 링커로 수식하는 방법
(c) 유전자 공학에 의한 아미노산 변이에 의해, 항체에 새롭게 도입된 시스테인에 대하여 말레이미드기를 갖는 킬레이트제 또는 링커를 수식하는 방법
(d) 유전자 공학에 의한 아미노산 변이에 의해, 항체에 새롭게 도입된 아지드화 리신의 아지드기에, 클릭 반응을 이용하여, 알킨(예를 들어 디벤질시클로옥틴: DBCO)을 갖는 킬레이트제 또는 링커를 수식하는 방법
(e) 트랜스글루타미나아제를 이용하여, 항체가 특정한 위치에 도입된 글루타민에, 리신의 측쇄를 갖는 킬레이트제 또는 링커를 수식하는 방법
(f) 전술한 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드를 갖는 킬레이트제 또는 링커를, 항체의 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하는 방법
착체 형성 공정에서는, 킬레이트제에 악티늄-225를 킬레이트(착체 형성)시킨다. 여기서 사용하는 악티늄-225는, 착체 형성 효율을 높이는 관점에서, 전리 가능한 양태에서 사용하는 것이 바람직하고, 이온의 양태에서 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 착체 형성 공정은, 방사성 핵종과의 착체 형성이 가능하면, 킬레이트제에의 방사성 핵종의 첨가 순서는 묻지 않는다. 예를 들어, 물을 주체로 하는 용매에, 방사성 금속 이온이 용해한 용액을 방사성 핵종으로서 사용할 수 있다.
착체 형성 후, 여과 필터, 멤브레인 필터, 다양한 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여, 얻어진 착체를 정제해도 된다.
본 발명의 복합체 제조 방법은, 착체 형성 공정 후에 콘주게이션 공정이 실행되는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 양태에 있어서, 착체 형성 공정 (A)에서는, 악티늄-225와 클릭 반응 가능한 제1 원자단을 항체와 복합화를 가능하게 하기 위한 치환기로서 갖는 킬레이트제 사이에서 착체를 형성한다. 이어서, 콘주게이션 공정 (B)에서는, 전술한 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드와, 클릭 반응 가능한 제2 원자단을 갖는 항체 수식 링커를 사용하여, Fc 영역을 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체와, 공정 (A)에서 얻어진 착체 형성된 킬레이트제 사이에서 클릭 반응을 실행하고, 본 발명의 복합체를 얻는다.
이하 공정 (A) 및 (B)에 대해서, 상세하게 설명한다.
클릭 반응 가능한 제1 원자단과 제2 원자단의 조합으로서는, 클릭 반응의 종류에 따라 적절한 것이 선택되고, 예를 들어 알킨과 아지드의 조합, 1,2,4,5-테트라진과 알켄의 조합 등을 들 수 있다. 이들의 원자단은, 제1 원자단이 상기 원자단의 조합 중 하나를 갖고, 제2 원자단이 상기 원자단의 조합 중 제1 원자단과 다른 하나가 되는 원자단을 갖고 있으면 된다. 킬레이트제 및 항체의 안정성과, 이들의 결합 효율의 향상을 양립시키는 관점에서, 킬레이트 링커가 알킨이며 또한 항체 수식 링커가 아지드이거나, 또는 킬레이트 링커가 1,2,4,5-테트라진이고 또한 항체 수식 링커가 알켄인 것이 바람직하다. 이러한 원자단의 조합에 의한 클릭 반응의 구체예로서, 휘스겐 환화 부가 반응, 혹은 역전자 요청형 딜스알더 반응 등을 들 수 있다.
클릭 반응 가능한 원자단의 조합 구체예로서는, 이하의 식에 나타내는 바와 같이, 제1 원자단의 알킨으로서 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단(식 (1a))과, 제2 원자단의 아지드로서 아지드기를 포함하는 원자단(식 (2a))과의 조합, 혹은 제1 원자단이 1,2,4,5-테트라진을 포함하는 원자단(식 (1b))과, 제2 원자단의 알켄으로서 트랜스-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단(식 (2b))과의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 식 (1a)과 식 (2a)의 조합이다.
Figure pct00008
(식 중, R1은 킬레이트제와의 연결 부위를 나타내고, R2는 항체에 있어서의 항체 수식 펩티드와의 연결 부위를 나타낸다.)
Figure pct00009
(식 중, R3 및 R4 중 한쪽이 킬레이트제 또는 항체에 있어서의 항체 수식 펩티드의 어느 한쪽과의 연결 부위를 나타내고, 다른 쪽이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, R5는 R3 또는 R4에 따라서 킬레이트제 또는 항체에 있어서의 항체 수식 펩티드의 어느 한쪽과의 연결 부위를 나타낸다.)
제1 원자단의 알킨으로서, 상기 식 (1a)로 표시되는 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단을 사용하는 경우에는, 시판되고 있는 다양한 DBCO 시약을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 DBCO-C6-산, 디벤질시클로옥틴-아민, 디벤질시클로옥틴 말레이미드, DBCO-PEG산, DBCO-PEG-NHS 에스테르, DBCO-PEG-알코올, DBCO-PEG-아민, DBCO-PEG-NH-Boc, 카르복시로다민-PEG-DBCO, 술포로다민-PEG-DBCO, TAMRA-PEG-DBCO, DBCO-PEG-비오틴, DBCO-PEG-DBCO, DBCO-PEG-말레이미드, TCO-PEG-DBCO, DBCO-mPEG 등을 선택할 수 있지만, 바람직하게는 디벤질시클로옥틴말레이미드를 사용한다.
공정 (A)에서는, 보다 바람직하게는, 이하의 식 (ii)로 표시되는 구조를 갖는 킬레이트제를 사용한다.
A-B-C … (ii)
식 (ii) 중, A는 이하의 식 (iia)로 표시되는 킬레이트부이다.
Figure pct00010
식 (iia) 중, Ra, Rb 및 Rc는, 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이고, p는 0 이상 3 이하의 정수이고, Rd 또는 Re의 어느 한쪽이 B와의 결합 부위(*)이고, 다른 쪽이 수소 원자이거나, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이고, p는 0 이상 3 이하의 정수이다.
식 (ii) 중, B는 이하의 식 (iib)로 표시된다.
Figure pct00011
식 (iib) 중, La 및 Lb는, 독립적으로 적어도 아미드 결합 또는 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, t는 0 이상 30 이하의 정수이고, s는 0 또는 1이고, *은 A와의 결합 부위이고, **은 C와의 결합 부위이다.
식 (ii) 중, C는 이하의 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체 또는 식 (iid)로 표시되는 테트라진 유도체의 어느 것이다.
식 (iic) 중, X는 CHRk-** 또는 N-**이고, Y는 CHRk 또는 C=O이고, Rk는 독립적으로 수소 원자이거나, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, X가 CHRk-**이고, Y가 CHRk인 경우에는, Rk 부분이 하나가 되어 시클로알킬기를 형성해도 되고, Rf, Rg, Rh 및 Ri는, 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, Rf와 Rg가 하나가 되거나, 혹은 Rh와 Ri가 하나가 되어 탄화수소환을 형성해도 되고, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, 식 (iid) 중, **은 B와의 결합 부위를 나타내고, Rj는 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타낸다.
공정 (A)에서 사용되는 킬레이트제로서, 상기 식 (iia) 중, Ra 내지 Rd가, -(CH2)pCOOH이고, p가 1이고, Re가 B와의 결합 부위인 DOTA 유도체; 또는 Ra 내지 Rc가, -(CH2)pCOOH이고, p가 1이고, Rd가 B와의 결합 부위이고, Re가 수소 원자인 DO3A 유도체 혹은 DOTAGA 유도체의 어느 것이 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DOTA 유도체인 경우, B는 La가 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, s가 0 또는 1이고, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이고, Lb가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, C는 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이고, Y가 CHRk이고, Rk가 수소 원자이고, Rf와 Rg가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DOTA-PEGt-DBCO 유도체; 또는 B는, La가 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, s가 0 또는 1이고, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이고, Lb가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, C는 식 (iid)에서 표현되는 테트라진 유도체인, DOTA-PEGt-Tz 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DO3A 유도체인 경우, B는, La가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, s가 0 또는 1이고, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이고, Lb가 아미드 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, C는 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N-**이고, Y가 CHRk이고, Rk가 수소 원자이고, Rf와 Rg가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DO3A-PEGt-DBCO 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
식 (ii) 중, A가 상기 DOTAGA 유도체인 경우, B는, La가 아미드 결합 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, s가 0 또는 1이고, s가 1인 경우에는, t가 0 이상 30 이하의 정수이고, Lb가 아미드 결합을 포함하는 혹은 티오우레아 결합을 포함하는 탄소수 1 이상 50 이하의 결합 링커이고, C는 식 (iic)로 표시되는 알킨 유도체이며, 식 (iic) 중, X가 N―**이고, Y가 CHRk이고, Rk가 수소 원자이고, Rf와 Rg가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, Rh와 Ri가 하나가 되어 벤젠환을 형성하고 있고, **은 B와의 결합 부위인, DOTAGA-PEGt-DBCO 유도체가 더욱 보다 바람직하다.
킬레이트제와 악티늄-225의 몰 비율은, 킬레이트부/악티늄-225로서, 하한이, 10/1 이상이 바람직하고, 100/1 이상이 보다 바람직하고, 500/1 이상이 더욱 바람직하고, 상한이, 10000/1 이하가 바람직하고, 8000/1 이하가 보다 바람직하고, 7000/1 이하가 더욱 바람직하고, 예를 들어 100/1 이상 7000/1 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 500/1 이상 7000/1 이하의 범위이다.
착체 형성 반응은, 용매 하에 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들어 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 트리스히드록시메틸아미노메탄 완충액(트리스 완충액), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산 완충액(HEPES 완충액), 혹은 테트라메틸암모늄 아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다.
용매의 액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 공정 (A)의 개시 시에 있어서, 하한은, 0.01mL 이상, 바람직하게는 0.1mL 이상, 보다 바람직하게는 1.0mL 이상, 더욱 바람직하게는 10mL 이상, 보다 더욱 바람직하게는 100mL 이상이며, 상한은, 바람직하게는 1000mL 이하, 보다 바람직하게는 100mL 이하, 더욱 바람직하게는 10mL 이하, 보다 더욱 바람직하게는 1.0mL이하이며, 예를 들어 0.01mL 이상 100mL 이하의 범위이다.
착체 형성 반응의 반응액 중의 킬레이트제의 농도는, 목적으로 하는 킬레이트제의 수율 관점에서, 각각 독립적으로 공정 (A)의 개시 시에 있어서, 하한은, 바람직하게는 0.001μmol/L 이상, 보다 바람직하게는 0.01μmol/L 이상, 더욱 바람직하게는 0.1μmol/L 이상, 보다 바람직하게는 1μmol/L 이상이며, 상한은, 바람직하게는 1000μmol/L 이하, 보다 바람직하게는 100μmol/L 이하, 더욱 바람직하게는 10μmol/L이하이며, 예를 들어 1μmol/L 이상 100μmol/L 이하의 범위를 들 수 있다.
착체 형성 반응의 온도로서는, 예를 들어 실온(25℃)이어도 되고, 가열 조건 하여도 되지만, 킬레이트제의 분해 억제와 착체의 형성 효율 향상을 양립시키는 관점에서, 하한은, 바람직하게는 20℃ 이상, 보다 바람직하게는 30℃ 이상, 더욱 바람직하게는 35℃ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 37℃ 이상, 특히 바람직하게는 45℃ 이상이고, 상한은, 바람직하게는 150℃ 이하, 보다 바람직하게는 120℃ 이하, 더욱 바람직하게는 100℃ 이하, 보다 더욱 바람직하게는 90℃ 이하이고, 예를 들어 30℃ 이상 100℃ 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 35℃ 이상 90℃ 이하의 범위이다.
반응 시간은, 상술한 반응 온도인 것을 조건으로 하여, 하한은, 바람직하게는 5분 이상, 보다 바람직하게는 10분 이상, 더욱 바람직하게는 20분 이상, 보다 더욱 바람직하게는 30분 이상, 특히 바람직하게는 45분 이상이고, 상한은, 바람직하게는 180분 이하, 보다 바람직하게는 150분 이하, 더욱 바람직하게는 120분 이하, 보다 더욱 바람직하게는 90분 이하, 특히 바람직하게는 60분 이하이며, 예를 들어 10분 이상 150분 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분 이상 60분 이하의 범위이다.
공정 (B)에서 사용되는 항체는, 전술한 (i)로 나타내는 항체 수식 펩티드와, 클릭 반응 가능한 제2 원자단을 갖는 항체 수식 링커를 사용하여, 상기 「(1-2) 항체」의 항에서 상세하게 설명한 인간화 항체의 Fc 영역(정상 영역)이 부위 특이적으로 수식된 펩티드 수식 항체이다.
항체 수식 펩티드는, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 묻지 않는 아미노산을 조합해서 사용하여, 예를 들어 액상 합성법, 고상 합성법, 자동 펩티드 합성법, 유전자 재조합법 및 파지 디스플레이법 등의 펩티드 합성법에 제공하는 것에 의해 제조할 수 있다. 펩티드의 합성에 있어서, 필요에 따라, 사용되는 아미노산의 관능기 보호를 행해도 된다. 이들은, 예를 들어 국제공개 2017/217347호 팸플릿 및 국제공개 2018/230257호 팸플릿에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다.
항체 수식 링커는, 항체 수식 펩티드와, 이하의 식 (S1)로 표현되는 링커가 결합한 것이어도 된다.
*-((L1)m-Z)k-L2-AG2 … (S1)
(식 중, *은 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과의 결합 부위를 나타내고,
L1은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커부이고,
m은 1 이상 50 이하의 정수이고,
Z는 (L1)m과 L2를 결합하는 제2 링커부이고,
k는 0 또는 1이고,
L2는 제2 PEG 링커부이고,
AG2는 제2 원자단이다.)
상기 식 (S1)에 있어서, Z의 구조는 (L1)m과 L2를 서로 결합하는 링커 구조이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1 이상 5 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, Z에 포함되는 아미노산 서열은, 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하고, 시스테인 잔기의 티올기와 말레이미드기와의 결합에 의해 형성된 티오에테르 기를 통하여 L2와 결합하고 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, L2를 구성하는 PEG 링커부는, 이하의 식 (P2)에 나타내는 구조를 갖고 있는 것이 바람직하다. 식 (P2) 중, n은 정수이고, 바람직하게는 1 이상 50 이하, 보다 바람직하게는 1 이상 20 이하, 더욱 바람직하게는 2 이상 10 이하, 한층 바람직하게는 2 이상 6 이하이다.
Figure pct00013
PEG 링커부의 구조의 일단부는, 시판되고 있는 PEG화 시약에서 유래하는 구조 또는 PEG화할 때 통상 사용되는 시약에서 유래하는 구조에 의해 수식되어 있어도 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 디글리콜산 또는 그의 유도체, 말레이미드 또는 그의 유도체에서 유래하는 구조가 예시된다.
항체 수식 링커로의 상기 제2 원자단에 대한 도입 방법은, 상술한 방법에 의해 원하는 아미노산 서열을 갖는 항체 수식 펩티드를 얻은 후, 해당 펩티드를, 용해 보조제 및 환원제, 그리고 필요에 따라 산을 첨가한 용액에 용해하고, 해당 용액에 제2 원자단으로서, 아지드기 또는 트랜스-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단의 유기 용매 용액을 첨가하고, 실온에서 교반함으로써 도입하는 방법을 들 수 있다.
제2 원자단으로서 아지드기를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, 시판되고 있는 아지드기 도입 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 아지드기를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통하여 아지드기를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다. 사용되는 아지드기 도입 시약으로서는 예를 들어, 실릴 아지드, 인산 아지드, 알킬암모늄 아지드, 무기 아지드, 술포닐아지드, 또는 PEG 아지드 등을 들 수 있다.
또한, 제2 원자단으로서 TCO를 포함하는 원자단을 도입하는 경우에는, TCO를 포함하는 시판되고 있는 클릭 케미스트리용 시약을 사용하여, 통상의 방법에 따라, 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 직접 TCO를 도입하거나, 또는 상술한 링커 구조를 통하여 TCO를 포함하는 원자단을 도입할 수 있다.
항체 수식 펩티드와 항체를 결합시켜서, 펩티드 수식 항체를 얻는 방법은, 예를 들어 가교제를 사용해서 행할 수 있다. 가교제란, 항체 수식 펩티드와, 항체를 공유 결합에 의해 연결시키기 위한 화학 물질이며, 그 예로서, 디숙신이미딜글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜수베레이트(DSS) 등의 숙신이미딜기를 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, 아디프이미드산디메틸 등의 이미드산 부분을 바람직하게는 2 이상 포함하는 화합물 또는 그의 염으로 이루어지는 가교제, 그리고 3,3'-디티오비스프로피온이미드산디메틸, 디티오비스숙신이미딜프로피온산 등의 디술피드 결합을 갖는 화합물 또는 그의 염으로 이루어지는 것 등을 들 수 있다. 이러한 가교제를 사용함으로써, 항체 수식 펩티드에 있어서의 Xaa2의 아미노산 잔기와, 항체 사이에서 가교 반응을 일으킬 수 있다. 항체에 있어서의 가교 반응은, 예를 들어 항체로서 본 발명의 인간화 항체를 사용한 경우, Xaa2의 아미노산 잔기와, 본 발명의 인간화 항체에 있어서의 Eu 넘버링을 따르는 Lys252 잔기와의 사이에 부위 특이적으로 발생한다. 이들 Lys 잔기는, 본 발명의 인간화 항체에 있어서의 Fc 영역에 존재한다.
항체 수식 펩티드와 항체의 결합 방법은, 예를 들어 상술한 항체 수식 펩티드와, 항체와, 가교제와, 필요에 따라 촉매를, 적절한 완충액 중에 10℃ 이상 30℃ 이하 환경 하에서 분산시켜서 행할 수 있다. 반응 시간은 10분 이상 2시간 정도 로 할 수 있다. 펩티드와 항체와의 반응 시에 있어서의 몰 비율은, 항체/펩티드로서, 하한은, 바람직하게는 1/5 이상, 보다 바람직하게는 1/3 이상, 더욱 바람직하게는 1/1.5 이상이고, 상한은, 바람직하게는 20/1 이하, 보다 바람직하게는 10/1 이하, 더욱 바람직하게는 5/1 이하, 보다 더욱 바람직하게는 1/1 이하, 특히 바람직하게는 1/1.7 이하며, 예를 들어 1/5 이상 20/1 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1/1.5 이상 1/1.7 이하이다.
이상의 공정을 거쳐서 얻어지는 펩티드 수식 항체는, 항체 1분자에 대하여 항체 수식 펩티드 1분자가 결합한 항체(이하, 「1가 항체」라고 한다)와, 항체 1분자에 대하여 항체 수식 펩티드 2분자가 결합한 항체(이하, 「2가 항체」라고 한다)를 임의의 비율로 함유하는 혼합물이지만, 이것을 그대로 이후의 공정에 제공해도 되고, 여과 필터, 멤브레인 필터, 다양한 충전제를 충전한 칼럼, 각종 크로마토그래피 등의 방법에서, 미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제한 뒤로 어느 것의 가수의 항체만을 이후의 공정에 제공해도 된다. 정제의 결과, 미수식 항체와 다른 가수의 항체와의 분리를 할 수 없는 경우에는, 이들을 함유하는 혼합물로서 이후의 공정에 제공해도 된다.
미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 분리 정제하는 경우에는, 상기의 어느 정제 방법으로 분리 정제해도 되지만, 다양한 충전제를 충전한 칼럼을 사용하는 것이 바람직하고, 항체 등의 단백질의 분리 정제에 적합한 충전제를 충전한 칼럼을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
항체 등의 단백질의 분리 정제에 적합한 충전제로서는, 항체와 특이적으로 결합하는, 이뮤노글로불린 결합성 단백질이 수불용성의 기재를 포함하는 담체가 고정화된 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이뮤노글로불린 결합성 단백질로서는, 예를 들어 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L 등을 들 수 있다. 이들의 이뮤노글로불린 결합성 단백질은, 유전자 조작한 재조합형이어도 되고, 재조합형의 이뮤노글로불린 결합성 단백질로서는, 유전자 개변형 프로테인 A, 유전자 개변형 프로테인 G, 또는 프로테인 A의 도메인과 프로테인 G의 도메인과의 융합형을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 적어도 1가 항체와 2가 항체와의 분리 정제에 적합한 충전제로서는 프로테인 A가 보다 바람직하고, 유전자 개변형 프로테인 A가 더욱 바람직하다. 여기서, 프로테인 A 및 프로테인 G는, 항체 분자인 IgG와 특이적으로 결합을 할 수 있는 단백질 분자이고, 분리된 미생물 유래의 차이에 의해, 프로테인 A(황색 포도 구균: Staphylococcus aureus) 혹은 프로테인 G(연쇄 구균: Streptococcus속)로 분류되는 것이다. 유전자 개변형 프로테인 A는, 프로테인 A의 IgG 결합 도메인(E, D, A, B 및 C 도메인) 중 어느 것의 도메인 아미노산 잔기에 대하여 적어도 하나의 아미노산 변이를 도입한 프로테인 A이고, 본 발명에 있어서는, 적어도 하나의 아미노산 변이를 도입한 도메인을 다량체화시킨 유전자 개변형 프로테인 A가 바람직하고, 프로테인 A의 적어도 하나의 아미노산 변이를 도입한 A, B 또는 C 도메인의 다량체화시킨 것이 보다 바람직하고, 이량체 이상 오량체 이하로 다량체화시킨 것이 더욱 보다 바람직하다. 아미노산 변이는, 유전자의 전사 번역 공정에서의 아미노산 서열 또는 아미노산을 코드하는 염기 서열의 치환, 결실, 삽입 등의 어느 변이에서 유래하는 것이어도 된다. 특별히 한정되지 않는 일례로서 국제공개 2003/080655호 팸플릿, 국제공개 2011/118699호 팸플릿에 기재되는 유전자 개변형 프로테인 A 등을 들 수 있다.
이뮤노글로불린 결합성 단백질이 고정화되는 수불용성의 기재로서는, 글래스 비즈, 실리카겔 등의 무기 담체, 가교 폴리비닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나, 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류를 포함하는 유기 담체, 나아가 이들의 조합에 의해 얻어지는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있다.
상술한 유전자 개변형 프로테인 A를 충전제로서 충전한 칼럼으로서는, 예를 들어 가부시키가이샤 가네카의 KanCap(등록상표) 시리즈(KANEKA KanCapA prepacked column), GE 헬스케어사의 HiTrap(등록상표) 시리즈(HiTrap Mabselect, HiTrap Mabselect SuRe, HiTrap Mabselect Xtra), GE 헬스케어사의 HiScreen 시리즈(HiScreen Mabselect SuRe), 또는 도소 가부시키가이샤의 TOYOPEARL(등록상표) 시리즈(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F) 등으로서, 시판되고 있다.
공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 사용하는 펩티드 수식 항체를 분리 정제하는 경우를 예로, 이하 설명한다.
펩티드 수식 항체는, 항체 수식 펩티드를 구비하는 링커(항체 수식 링커)에 의해 항체의 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식해서 수식 항체를 얻는 항체 수식 공정과, 상술한 이뮤노글로불린 결합성 단백질이 고정화된 담체를 사용해서 수식 항체를 정제하는 항체 정제 공정을 거치고, 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 제공된다. 또한, 항체 정제 공정은, 담체에 유지되는 수식 항체를 담체에 유지시키는 유지 공정과, 담체에 유지되지 않는 수식 항체를 세정하는 세정 공정, 유지 공정에서 담체에 유지된 수식 항체를 용출하는 용출 공정을 더 포함한다.
보다 구체적으로는, 항체 수식 공정에 있어서, 항체 수식 링커가 수식되지 않는 미수식 항체와, 1가 항체와, 2가 항체를 포함하는 혼합물로서 수식 항체를 취득하고, 항체 정제 공정에 있어서, 미수식 항체, 1가 항체 및 2가 항체의 이뮤노글로불린 결합성 단백질에 대한 각각의 상호 작용의 차이를 이용하여, 미수식 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제1 항체 조성물과, 2가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제2 항체 조성물을 각각 용출한다. 즉, 항체 정제 공정 중, 유지 공정 및 세정 공정에서는, 이뮤노글로불린 결합성 단백질과의 상호 작용의 정도가 낮은 펩티드 수식 항체(2가 항체)를 상대적으로 많이 포함하는 제2 항체 조성물이 용출되어, 항체 정제 공정 중 용출 공정에서는, 이뮤노글로불린 결합성 단백질과의 상호 작용의 정도가 높은 펩티드 수식 항체(미수식 항체 및 1가 항체)를 상대적으로 많이 포함하는 제1 항체 조성물이 용출된다. 여기서, 「미수식 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함한다」란, 제1 항체 조성물에 포함되는 미수식 항체 및 1가 항체의 합계량이, 해당 항체 조성물에 포함되는 2가 항체보다 많은 것을 의미하고, 바람직하게는 해당 항체 조성물에 포함되는 미수식 항체 및 수식 항체의 전량(100%)에 대하여, 미수식 항체 및 1가 항체의 합계량이 55% 이상, 63% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상인 것을 의미하고, 「2가 항체를 상대적으로 많이 포함한다」란, 제2 항체 조성물에 포함되는 2가 항체의 양이 해당 항체 조성물에 포함되는 1가 항체보다 많은 것을 의미하고, 바람직하게는 해당 항체 조성물에 포함되는 미수식 항체 및 수식 항체의 전량(100%)에 대하여, 2가 항체의 양이 55% 이상, 63% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상인 것을 의미한다.
유지 공정에서는, 항체 수식 공정에서 얻어진 미수식 항체, 1가 항체 및 2가 항체의 혼합물을 함유하는 용액을 칼럼에 첨가하고, 담체에 유지되는 미수식 항체 및 1가 항체를 칼럼에 유지시켜서, 담체에 유지되지 않는 2가 항체를 통과시킨다. 여기서, 유지 공정에서 통과한 용액은 제2 항체 조성물의 일부를 구성한다. 미수식 항체 및 1가 항체를 칼럼에 유지하기 쉽게 하기 위해서, 또한 이들 응집 혹은 변성을 방지하기 위해서, 펩티드 수식 항체의 혼합 용액을 적절한 희석 용매로 희석해서 칼럼에 첨가하는 것이 바람직하다. 희석 용매로서는, 펩티드 수식 항체가 용해하고, 용매 중에서 응집 또는 변성하기 어려운 용매이면 특별히 한정되지 않고, 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 2-아미노-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(Tris) 완충액, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-에탄술폰산(HEPES) 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있고, 상술한 어느 것의 완충액을 사용하는 것이 바람직하고, 아세트산나트륨 완충액을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 희석 용매에 완충액을 사용하는 경우에는, 완충제의 농도는, 하한으로서 10mmol/L 이상, 바람직하게는 15mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 20mmol/L 이상, 상한으로서 1000mmol/L 이하, 바람직하게는 500mmol/L 이하, 보다 바람직하게는 100mmol/L 이하이다. 또한, 2가 항체나 항체 수식 펩티드의 칼럼 담체로의 비특이적 결합의 저감 관점에서, 용출 용매는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 첨가제를 함유 해도 된다. 용출 용매가 함유하는 첨가제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.15mol/L를 사용할 수 있다.
세정 공정에서는, 세정 용매를 사용해서 칼럼 내에 잔존하고 있는 수식 항체를 칼럼으로부터 용출한다. 상술한 유지 공정에서 칼럼을 통과한 용액과, 세정 공정에서 칼럼으로부터 용출한 용액은, 2가 항체를 상대적으로 많이 포함하므로, 이들을 맞추어 제2 항체 조성물로서 사용할 수 있다.
세정 용매로서는, 펩티드 수식 항체가 용해하여, 용매 중에서 응집 또는 변성하기 어렵고, 적절한 pH 완충 능을 갖는 완충액이면 특별히 한정되지 않고, 아세트산나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, 2-아미노-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(Tris) 완충액, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-에탄술폰산(HEPES) 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있고, 상술한 어느 것의 완충액을 사용하는 것이 바람직하고, 아세트산나트륨 완충액을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 세정 용매에 사용하는 완충제의 농도는, 하한으로서, 20mmol/L 이상, 바람직하게는 30mmol/L 이상, 상한으로서는 200mmol/L 이하, 바람직하게는 70mmol/L 이하이다. 또한, 세정 용매의 pH는, 하한으로서 4.0 이상, 바람직하게는 4.5 이상, 보다 바람직하게는 4.8 이상, 상한으로서 7.4 이하, 바람직하게는 6.0 이하, 보다 바람직하게는 5.2 이하이다. 또한, 2가 항체나 항체 수식 펩티드의 칼럼 담체로의 비특이적 결합의 저감 관점에서, 용출 용매는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 첨가제를 함유 해도 된다. 용출 용매가 함유하는 첨가제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.15mol/L를 사용할 수 있다.
용출 공정에서는, 담체에 유지된 수식 항체를 용출 용매를 사용해서 칼럼으로부터 용출한다. 즉 미수식 항체 및 1가 항체를 상대적으로 많이 포함하는 제1 항체 조성물을 용출 용매를 사용해서 칼럼으로부터 용출한다.
용출 용매로서는, 아세트산나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액, 시트르산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 또한, 항체 수식 링커, 미수식 항체 및 수식 항체 칼럼 담체로의 비특이적 결합의 저감 관점에서, 용출 용매는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 첨가제를 함유 해도 된다. 용출 용매가 함유하는 첨가제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.15mol/L를 사용할 수 있다.
용출 용매가 완충제를 포함하는 경우에는, 완충제의 농도는, 하한으로서, 20mmol/L 이상, 바람직하게는 30mmol/L 이상, 상한으로서는 200mmol/L 이하, 바람직하게는 70mmol/L 이하이다. 또한, 용출 용매의 pH는, 미수식 항체 및 1가 항체와, 이뮤노글로불린 결합성 단백질과의 상호 작용을 약화시키기 위해서, 또한 항체의 변성 및 응집을 방지하는 관점에서, 하한으로서 pH3.0 이상, 상한으로서 pH4.2 이하가 바람직하다.
항체 정제 공정에서 취득한 제1 항체 조성물 또는 제2 항체 조성물은, 그대로 이후의 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 사용해도 되고, 함유하는 펩티드 수식 항체의 단백질 농도를 조절하고 나서 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응에 사용해도 된다.
공정 (B)에 있어서의 클릭 반응은, 킬레이트제가 갖는 클릭 반응 가능한 제1 원자단과, 펩티드 수식 항체가 갖는 클릭 반응 가능한 제2 원자단 사이에서 실행되는 것이다. 이러한 클릭 반응에 의해 킬레이트제와 항체를 연결하는 결합기(항체와의 복합화를 가능하게 하는 치환기)가 형성된다.
펩티드 수식 항체와 공정 (A)에서 얻어진 착체가 클릭 반응 가능하면, 이들의 첨가 순서는 막론하고, 예를 들어 용매를 수용한 반응 용기에, 해당 착체 및 해당 펩티드 수식 항체의 한쪽을 첨가하고, 이어서 다른 쪽을 첨가해서 반응시켜도 되고, 해당킬레이트제 및 해당 항체의 한쪽을 용매에 분산한 분산액에 다른 쪽을 첨가해서 반응시켜도 된다. 혹은, 용매를 수용한 반응 용기에, 이들을 동시에 첨가해서 반응시켜도 된다.
공정 (B)의 클릭 반응에 사용되는 용매로서는, 물을 포함하는 용매를 사용할 수 있고, 예를 들어 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충액, HEPES 완충액, 혹은 테트라메틸암모늄 아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 완충액을 사용하는 경우, 착체 및 항체의 안정성과, 이들 결합 효율을 양립시키는 관점에서, 25℃에 있어서의 pH를 바람직하게는 4.0 이상 10.0 이하, 더욱 바람직하게는 5.5 이상 8.5 이하로 한다.
반응액량은, 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 공정 (B)의 개시 시에 있어서, 하한은, 0.001mL 이상이 바람직하고, 0.01mL 이상이 보다 바람직하고, 0.1mL 이상이 더욱 바람직하고, 1mL 이상이 보다 더욱 바람직하고, 상한은, 1000mL 이하가 바람직하고, 100mL이하가 보다 바람직하고, 10mL이하가 더욱 바람직하고, 1mL이하가 보다 더욱 바람직하고, 예를 들어 0.001mL 이상 1000mL 이하의 범위가 바람직하고, 0.1mL 이상 10mL 이하의 범위가 보다 바람직하다.
또한, 킬레이트제 및 항체의 반응액 중의 농도는, 각각 독립적으로 공정 (B)의 개시 시에 있어서, 하한으로서, 0.001μmol/L 이상이 바람직하고, 0.01μmol/L 이상이 보다 바람직하고, 0.1μmol/L 이상이 더욱 바람직하고, 1.0μmol/L 이상이 보다 더욱 바람직하고, 상한으로서, 1000μmol/L 이하가 바람직하고, 100μmol/L이하가 보다 바람직하고, 예를 들어 0.1μmol/L 이상 1000μmol/L 이하의 범위가 바람직하고, 1μmol/L 이상 100μmol/L 이하의 범위인 것이, 목적으로 하는 복합체의 수량 관점에서 보다 바람직하다.
항체의 의도하지 않는 변성을 방지하면서, 반응 효율을 높이는 관점에서, 공정 (B)에 있어서의 클릭 반응은, 반응 온도의 상한은, 50℃ 이하가 바람직하고, 40℃ 이하가 보다 바람직하다. 또한, 반응 온도의 하한은, 반응이 진행하는 온도이면 특별히 제한은 없지만, 15℃ 이상이 바람직하다. 클릭 반응의 반응 시간은, 상술한 반응 온도인 것을 조건으로 하고, 바람직하게는 5분 이상, 보다 바람직하게는 10분 이상이고, 24시간 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20시간 이하이며, 예를 들어 5분 이상 24시간 이하의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분 이상 20시간 이하의 범위이다.
얻어진 복합체는, 이것을 그대로 사용해도 되고, 혹은 여과 필터, 멤브레인 필터, 다양한 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용해서 정제해도 된다.
공정 (A) 및 (B)에 의해 제조되는 복합체는, MUC5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체가 특정한 부위(예를 들어 항체의 Fc 영역의 리신 잔기)가 킬레이트제에 의해 특이적으로 수식된 것이다. 이 복합체는, 해당 항체 1분자에 대하여, 상기 킬레이트제를 1분자 또는 2분자 구비한다. 킬레이트제는, 링커를 통하여, 본 발명의 항체 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하고 있다. 해당 링커는, 킬레이트제에 접속하는 킬레이트 링커, 해당 링커에 접속하는 제1 원자단, 제1 원자단과 클릭 반응할 수 있는 제2 원자단, 제2 원자단에 접속하는 항체 수식 링커(상기 식 (i)로 표시되는 항체 수식 펩티드를 포함한다)로 구성된다. 따라서, 해당 링커는, 제1 원자단과 제2 원자단에서 유래하는 화학 구조를 갖는다. 이러한 화학 구조로서는, 하기 식 (10a) 또는 (10b)로 표현되는 트리아졸 골격 함유 구조 또는 하기 식 (10c)로 표현되는 피리다진 골격 함유 구조가 생각된다. 식 (10a)와 식 (10b)는 이성체의 관계에 있기 때문에 임의의 비율로 포함되어 있어도 된다.
Figure pct00014
식 (10a) 및 식 (10b) 중, R1A는 킬레이트 링커와의 결합 부위를 나타내고, R2A는 항체 수식 링커와의 결합 부위를 나타낸다. 식 (10c) 중, R3A 및 R4A 중 한쪽은 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 다른 쪽은 킬레이트 링커와의 결합 부위를 나타내고, R5A는 항체 수식 링커와의 결합 부위를 나타낸다.
(1-5) 신장 독성을 저감하기 위한 약제
본 발명에서는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 독성을 저감하기 위한 약제(이하, 신장 보호제라고도 칭한다)를 병용하는 것을 특징으로 한다.
225Ac의 딸핵종 중, 221Fr 및 217At는 반감기가 짧기 때문에(각각 4.9min, 32.3msec), 225Ac의 분포 개소와 동일한 개소로 붕괴된다고 생각된다. 한편, 213Bi는 다른 딸핵종과 비교하면 반감기가 길기 때문에(46min), 괴변 후 생체 내에서 재분포하고, 비스무트의 생리 집적 장기인 신장으로 축적할 가능성이 보고되어 있다. 따라서, 225Ac 표지 항체의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성을 방지하기 위한 하나의 방책으로서 생체 내에서 생성한 213Bi의 신장으로의 집적을 저감시키는 것이 중요하다고 생각된다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 신장 보호제는, 방사성 핵종 및/또는 그 딸핵종, 바람직하게는 213Bi의 신장으로의 집적을 저감시키는 것이 가능한 약제이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 강압제, 항응고제(헤파린, 와파린 등), 항혈소판제(디피리다몰, 염산 디라세브 등), 경구 흡착제(구형 흡착탄 등), 스테로이드제(덱사메타손, 프레드니솔론 등), 면역 제어제(미조리빈, 시클로스포린 등) 등을 들 수 있다. 강압제로서는, 예를 들어 안지오텐신 II 수용체 길항제(예, 로사르탄, 칸데사르탄, 이르베사르탄, 발사르탄, 에프로사르탄, 텔미사르탄), 안지오텐신 변환 효소 저해제(예, 에날라프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 이미다프릴, 캡토프릴, 에날라프릴라트, 알라세프릴, 페린도프릴 에르부민, 델라프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 실라자프릴, 포시노프릴, 트란돌라프릴, 테모카프릴, 모엑시프릴, 스피라프릴, 조페노프릴), Ca 길항제(예, 암로디핀, 니페디핀, 니카지핀, 딜티아젬, 마니디핀, 베니디핀, 닐바디핀, 니트렌디핀, 니솔디핀, 바르니디핀), 금속 제거제(예, DTPA, Ca-DTPA 또는 Zn-DTPA), 이뇨제(예, 스피로노락톤, 히드로클로로디아지드, 푸로세미드, 트리암테렌, 에플레레논), α 차단제(예, 독사조신, 프라조신, 부나조신, 테라조신, 우라피딜) 및 β 차단제(예, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤롤, 아로티놀롤, 셀리프롤롤, 베탁솔)를 들 수 있다.
신장 보호제는 상기 화합물의 약학상 허용되는 프로드러그, 및 그들의 약학상 허용되는 염이어도 된다.
바람직하게는, 이뇨제 또는 금속 제거제이고, 보다 바람직하게는 DTPA, Ca-DTPA 및 Zn-DTPA에서 선택되는 금속 제거제, 혹은 푸로세미드, 스피로노락톤 및 에플레레논에서 선택되는 이뇨제이다. 더욱 보다 바람직하게는, Zn-DTPA, 혹은 푸로세미드이다.
(1-6) 방사성 의약(방사성 항종양제)
상술한 (1-4)에 나타내는 방법으로 제조한 복합체(225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체)는, 상술한 (1-5)에 기재된 신장 독성을 저감하기 위한 약제(신장 보호제)와 조합되어, 방사성 항종양제(이하, 본 명세서에 있어서 방사성 항종양제 1이라고도 칭한다)로서 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시 형태로서는, 상술한 (1-4)에 나타내는 방법으로 제조한 복합체(225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체)와, 상술한 (1-5)에 기재된 신장 독성을 저감하기 위한 약제(신장 보호제)를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제(이하, 본 명세서에 있어서 방사성 항종양제 2라고도 칭한다)로서 사용할 수 있다.
본 발명의 방사성 항종양제 1 또는 방사성 항종양제 2에 있어서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 양은, 해당 방사성 항종양제의 투여 형태(후술), 질병의 중증도, 투여 대상으로 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르다. 통상적으로, 성인, 1회당 250kBq/kg 이하로 투여될 수 있다. 1회당 80kBq/kg 이하의 용량이어도 효과를 발휘할 수 있다. 이 경우, 통상, 조합해서 사용되는 신장 보호제의 용량은 임상상 사용되는 용량이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 신장 보호제가 금속 제거제인 경우에는, 성인, 1일당, 500 내지 2000㎎, 바람직하게는 700 내지 1500㎎, 보다 바람직하게는 800 내지 1200㎎의 용량으로 사용되고, 보다 구체적인 예로서 금속 제거제로서 Ca-DTPA 또는 Zn-DTPA를 조합하는 경우에는, 성인, 1일당 900 내지 1100㎎가 특히 바람직하다. 또한, 신장 보호제가 이뇨제인 경우에는, 성인, 1일당 10 내지 200㎎, 바람직하게는 20 내지 150㎎, 보다 바람직하게는 40 내지 100㎎의 용량으로 사용되고, 보다 구체적인 예로서, 이뇨제로서 푸로세미드를 조합하는 경우에는, 성인, 1일당 40 내지 80㎎의 용량이 특히 바람직하고, 이뇨제로서 스피로노락톤 또는 에플레레논을 조합하는 경우에는, 성인, 1일당 50 내지 100㎎의 용량이 특히 바람직하다.
본 발명의 방사성 항종양제 1에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 그것에 조합되어 투여되는 신장 보호제의 투여 형태는, 특별히 한정되지 않고, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성이 저감되어 있으면 된다. 본 발명의 방사성 항종양제 1에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 형태로서는, 경구 투여 또는 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하고, 정맥내 투여가 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 방사성 항종양제 1에 있어서의 유효 성분으로서의 신장 보호제의 투여 형태로서는, 경구 투여 또는 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 이들의 신장 보호제가 임상상 사용되는 투여 형태인 것이 바람직하고, 상술한 신장 보호제의 종류에 따라 선택되는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어, 신장 보호제가 안지오텐신 II 수용체 길항제, 안지오텐신 변환 효소 저해제, Ca 길항제, 이뇨제, α 차단제 또는 β 차단제이면, 경구 투여가 바람직하고, 금속 제거제이면, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하고, 정맥내 투여, 피하 투여 또는 복강내 투여가 보다 바람직하다. 마찬가지로, 본 발명의 방사성 항종양제 2에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 보호제의 투여 형태는, 특별히 한정되지 않고, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성이 저감되어 있으면 된다. 본 발명의 방사성 항종양제 2에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 보호제의 투여 형태로서는, 경구 투여 또는 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여 혹은 근육내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하고, 정맥내 투여가 보다 바람직하다.
본 발명의 방사성 항종양제 1 또는 본 발명의 방사성 항종양제 2의 투여 형태로 해서는, 예를 들어
(1) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 동시에 제제화해서 얻어지는 단일의 제제로서의 투여,
(2) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 별도로 제제화해서 얻어지는 2종의 제제의 동일 투여 경로로의 동시 투여,
(3) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 별도로 제제화해서 얻어지는 2종의 제제의 동일 투여 경로로의 시간차를 둔 투여,
(4) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 별도로 제제화해서 얻어지는 2종의 제제의 다른 투여 경로로의 동시 투여,
(5) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 별도로 제제화해서 얻어지는 2종의 제제의 다른 투여 경로로의 시간차를 둔 투여
등을 들 수 있다.
간편성의 관점에서, 단일 제제로서의 투여, 또는 2종의 제제의 동인 경로로의 동시 투여가 바람직하다. 신장 보호제의 신장 독성 저감 효과를 최대화시키는 관점에서, 2종의 제제의 동일 투여 경로로의 시간차를 둔 투여, 또는 2종의 제제의 다른 투여 경로로의 시간차를 둔 투여도 또한 바람직한 양태이다.
상기 시간차를 둔 투여를 하는 경우에는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체가 신장 보호제의 투여 전에 투여되는 경우, 및 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체가 신장 보호제의 투여 후에 투여되는 경우의 양쪽 경우를 포함한다.
제제화는, 예를 들어 본 발명의 복합체 및/또는 신장 보호제를, 각각 물을 주체로 하고, 또한 생체와 대략 등장의 용매에 용해시킴으로써 실시할 수 있다. 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 다른 성분을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 단순히 「방사성 항종양제」라고 칭하는 경우에는, 본 발명의 방사성 항종양제 1 및 2를 포함하는 의도이며, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 보호제를 동시에 제제화해서 얻어지는 단일의 제제 및 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 별도로 제제화해서 얻어지는 2종의 제제의 각각, 어느 것도 포함한다.
본 발명의 방사성 항종양제는, 유효 성분인 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 보호제 이외에, 임의의 첨가물, 예를 들어 의약상 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 의약상 허용될 수 있는 담체로서는, 예를 들어 자당, 전분, 만니트, 소르비트, 유당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필 피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 자당, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 나트륨-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 활제, 시트르산, 멘톨, 글리실 리신·암모늄염, 글리신, 오렌지분 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산알루미늄 등의 현탁제, 계면 활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오 버터, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되지 않는다.
하나의 실시 양태에 있어서, 본 발명의 방사성 항종양제는 경구 투여에 적합한 제제로서 처방될 수 있다. 경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리 식염수와 같은 희석액에 유효량의 물질을 용해시킨 액제, 유효량의 물질을 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 과립제, 산제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 물질을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 물질을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.
본 발명의 방사성 항종양제 1에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 그것에 조합되어 투여되는 신장 보호제의 투여 경로는, 특별히 한정되지 않고, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성이 저감되어 있으면 된다. 마찬가지로, 본 발명의 방사성 항종양제 2에 있어서의 유효 성분으로서의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 보호제의 투여 경로는, 특별히 한정되지 않고, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 시에, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하거나, 또는 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성이 저감되어 있으면 된다. 이러한 투여 경로로서는, 예를 들어 (1) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 정맥내 주사하고, 신장 보호제를 경구 투여, (2) 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제의 양쪽 모두를 정맥내 주사 등을 들 수 있다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명의 방사성 항종양제는 비경구적인 투여에 적합한 제제로서 처방될 수 있다. 비경구적인 투여(예, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입 등)에 적합한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장무균의 주사액제가 있고, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 된다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있고, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 된다. 당해 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 혹은 복수회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용될 수 있는 담체를 동결 건조하고, 사용 직전에 적당한 무균의 비히클에 용해 또는 현탁하면 되는 상태에서 보존할 수도 있다.
유효 성분으로서 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호제를 사용하는 본 발명의 방사성 항종양제는, 포유 동물(예, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 모르모트, 침팬치, 양, 염소, 개, 고양이, 돼지, 소, 말), 바람직하게는 인간에 대하여 항종양 효과를 갖고, 따라서 다양한 암의 치료용으로서 유용하다.
바람직한 대상 질환으로서는, 췌장암, 갑상선암, 간장암, 대장암, 위암, 요로 상피암, 유방암, 자궁경암, 난소암 또는 자궁 내막암을 들 수 있고, 특히 췌장암으로의 적용이 바람직하다.
본 발명에서 치료되는 암의 예로서는, 담관암도 들 수 있다.
또한, MUC5AC는 CA19-9의 항원 캐리어인 것이 복수 보고되고 있다(PLoS ONE(December2011, Volume6, Issue12, e29180, p1-10)). 따라서, 본 발명에서 치료되는 암으로서는, CA19-9를 과잉 발현하는, 담관암, 자궁체암, 폐암 또는 식도암도 들 수 있고, 효율적으로 치료할 수 있다.
이상 설명한 본 발명의 실시 형태에 따르면, MUC5AC에 대한 특이성과 종양에의 집적성이 우수하고, 또한 신장 독성이 저감된 방사성 항종양제가 제공된다.
본 발명의 상기의 실시 형태는, 이하의 기술 사상을 포함하는 것이다.
[1] 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체(악티늄-225로 표지된, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체)를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제.
[2] 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체(악티늄-225로 표지된, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체)와 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제.
[3] 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하는 신장 독성을 저감하기 위한 약제인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방사성 항종양제.
[4] 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성을 저감하기 위한 약제인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방사성 항종양제.
[5] 상기 신장 독성이, 상기 방사성 항종양제의 투여 후 10주 이상 경과하고 나서 발생하는 지발성의 신장 독성인, 상기 [1] 내지 [4]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[6] 상기 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 이뇨제 또는 금속 제거제인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[7] 상기 금속 제거제가, DTPA, Ca-DTPA 또는 Zn-DTPA를 포함하는, 상기 [6] 기재의 방사성 항종양제.
[8] 상기 금속 제거제가, Zn-DTPA를 포함하는, 상기 [7] 기재의 방사성 항종양제.
[9] 상기 이뇨제가, 푸로세미드, 스피로노락톤 또는 에플레레논을 포함하는, 상기 [6] 기재의 방사성 항종양제.
[10] 상기 이뇨제가, 푸로세미드를 포함하는, 상기 [9] 기재의 방사성 항종양제.
[11] 상기 항MUC5AC 인간화 항체가,
(1) 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열 (H01), 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열,
(2) 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열 (H02), 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열,
(3) 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 (H03), 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열, 또는
(4) 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열 (H04), 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열
로 이루어지는 중쇄 가변 영역과,
(5) 서열번호 5로 나타나는 아미노산 서열 (L01), 서열번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열,
(6) 서열번호 6으로 나타나는 아미노산 서열 (L02), 서열번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열,
(7) 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열 (L03), 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열, 또는
(8) 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열 (L04), 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 90% 이상 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 3개, 2개 혹은 1개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가한 아미노산 서열
로 이루어지는 경쇄 가변 영역
을 갖는 상기 [1] 내지 [10]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[12] 상기 항MUC5AC 인간화 항체가,
(1) 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열 (H01) 혹은 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과,
(7) 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열 (L03) 혹은 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역
을 갖는 인간화 항체인 상기 [1] 내지 [11]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[13] 상기 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체는, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제와 상기 항MUC5AC 인간화 항체의 복합체이며, 상기 항MUC5AC 인간화 항체의 Fc 영역이, 링커를 통하여, 상기 킬레이트제로 부위 특이적으로 수식되어 있는, 상기 [1] 내지 [12]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[14] 상기 링커가, 하기 식 (i)로 표시되는, 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 포함하고, 가교제로 수식된 상기 펩티드와 상기 항체의 가교 반응에 의해 형성되어 있는, 상기 [11] 기재의 방사성 항종양제.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) … (i)
(식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 모두 가지지 않는 아미노산 잔기이고,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고,
또는,
한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결되어 있고, Xaa2는, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이고, 상기 가교제로 수식되어 있다.)
[15] 상기 킬레이트제가, 하기 식 (A)로 표시되는 화합물 또는 그의 염에서 유래하는 구조를 갖는 상기 [13] 또는 [14]에 기재된 방사성 항종양제.
Figure pct00015
(식 (A) 중, R11, R13 및 R14는, 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이고, R12 또는 R15의 한쪽이 수소 원자, 카르복실기, 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이고, 다른 쪽이 상기 항체와 복합체화하기 위한 치환기이고, p가 0 이상 3 이하의 정수이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기일 때 R15는 수소 원자이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기이다.)
[16] 췌장암, 갑상선암, 간장암, 대장암, 위암, 요로 상피암, 유방암, 자궁경암, 난소암, 자궁 내막암 또는 담관암을 치료하기 위해서 사용되는, 상기 [1] 내지 [15]의 어느 것에 기재된 방사성 항종양제.
[17] 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와 조합해서 사용되고, 신장 독성을 저감하기 위한 약제.
[18] 당해 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 이뇨제 또는 금속 제거제인, 상기 [17] 기재의 약제.
[19] 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와, 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 갖는 조합 의약.
[20] 포유 동물에, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 유효량과, 신장 독성을 저감하기 위한 약제 유효량을 조합해서 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
[21] 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는 방사성 항종양제를 제조하기 위한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 사용.
[22] 방사성 항종양제를 제조하기 위한, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 독성을 저감하기 위한 약제 사용.
[23] 종양을 치료하기 위한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체이며, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용하는 것을 특징으로 하는 항체.
[24] 종양을 치료하기 위한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 독성을 저감하기 위한 약제와의 조합.
[25] 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는 방사성 항종양제를 제조하기 위한 키트이며, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제와, 항MUC5AC 인간화 항체를 포함하고, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가 상기 [11] 또는 [12]에 기재되는 항체인, 키트.
[26] 방사성 항종양제를 제조하기 위한 키트이며, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제, 항MUC5AC 인간화 항체 및 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 포함하고, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가 상기 [11] 또는 [12]에 기재되는 항체인, 키트.
[27] 암을 치료하기 위한 키트이며, 신장 독성을 저감하기 위한 약제, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제 및 항MUC5AC 인간화 항체를 포함하고, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가 상기 [11] 또는 [12]에 기재되는 항체인, 키트.
[28] 암의 RI 내용 요법에 사용하기 위한 키트이며, 신장 독성을 저감하기 위한 약제, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제 및 항MUC5AC 인간화 항체를 포함하고, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가 상기 [11] 또는 [12]에 기재되는 항체인, 키트.
본 발명의 방사성 항종양제에 의하면, MUC5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체와, α선을 방출하는 악티늄-225를 구비한 복합체를 유효 성분으로서 함유하므로, 암의 RI 내용 요법에 사용함으로써 MUC5AC를 발현하는 종양에 대하여 특이적으로 집적하고, 정상 세포에는 영향을 주지 않고 종양 세포 특이적으로 α선을 조사 할 수 있고, 더 높은 안전성과 치료 효과가 얻어진다. 또한, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 병용되므로, 암 치료에 염려되는 부작용이 저감된다.
이하, 실시예 등에 의해, 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
제조예 1. 항MUC5AC 인간화 항체의 제조
시그널 서열을 부가한 각종 가변 영역의 아미노산 서열 및 각종 정상 영역의 아미노산 서열을, CHO 세포에 있어서의 발현에 적합한 코돈 유시지가 되도록 고려하면서 염기 서열로 변환했다. 시그널 서열의 개시 코돈 부위에 코작 서열을 부가하고, 정상 영역의 C 말단측에는 정지 코돈을 부가했다. 또한 코작 서열의 상류와 정지 코돈의 하류에 제한 효소 사이트를 부가하고, 포유류 세포 발현용 플라스미드(pcDNA3.4)의 발현용 유전자 도입 사이트에 도입할 수 있도록 했다. 이와 같이 설계한 각 DNA 단편은, 화학 합성에 의해 제작했다. 목적의 H쇄와 목적의 L쇄가 되는 가변 영역을 포함하는 DNA 단편과, 정상 영역을 포함하는 DNA 단편을 융합 PCR을 사용해 연결했다.
제작한 각종 항체 유전자를 제한 처리한 뒤 정제했다. 마찬가지로 포유류 세포 일과성 발현용 플라스미드(pcDNA3.4)도 동일한 제한 효소로 처리한 뒤 정제했다. 양 단편을 적절한 혼합비로 혼합하고 라이게이션을 행하였다. 라이게이션 반응액을 대장균 DH5α 적격 세포와 혼합하고 트랜스포메이션을 행하였다. 발생한 트랜스포먼트로부터, 콜로니 PCR, 싱글 콜로니 아이솔레이션, 소스케일 배양액으로부터의 플라스미드 추출, 인서트 부분의 염기 서열 결정을 행하고, 설계한 항체 유전자 전체 길이가 설계한 바와 같은 서열로 의도한 방향으로 올바르게 삽입되어 있는 플라스미드(대장균 클론)를 선발했다. 선발한 대장균 클론에 대해서 대스케일 배양을 실시하고, 엔도톡신 제거 공정을 포함하는 플라스미드 추출·정제를 행하였다. 정제한 플라스미드는 260㎚의 흡광도를 측정하고 농도를 산출했다.
ExpiCHO System(서모 피셔 사이언티픽사제)을 사용하고, CHO 세포에 의한 일과성 발현을 실시했다. 제작한 각 H쇄 발현용 플라스미드와 각 L쇄 발현용 플라스미드로부터, H쇄 1종, L쇄 1종을 목적의 조합이 되도록 선택하고, 리포펙션법으로 형질 감염을 행하고, 배양, 피드를 행하였다. 형질 감염으로부터 7일 내지 13일후, 배양액을 회수했다. 원심 분리 및 필터 여과한 배양 상청을 Protein A 칼럼에 첨가해서 통상의 어피니티 칼럼 크로마토그래피(흡착 후 세정, 산성 완충액에 의한 용출, 용출액의 중화)에 의해 항체를 정제했다. 정제한 항체는 280㎚의 흡광도를 측정하고 농도를 산출했다.
상기에서 설명한 방법을 사용해서 하기의 항MUC5AC 인간화 항체를 제작했다. 이하에 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합에 대하여 첨부한 항체의 번호를 나타낸다.
항체 1: H01L03
항체 2: H01L04
항체 3: H02L04
항체 4: H04L04
여기서 H01, H02 및 H04는 각각, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타내는 중쇄 가변 영역이며, L03 및 L04는 각각, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타내는 경쇄 가변 영역이다. 이하의 실시예에서 사용된 항체는, 중쇄 정상 영역 1(서열번호 25)과 경쇄 정상 영역 1(서열번호 26), 및 상기의 항체 1 내지 항체 4의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함한다.
제조예 2. 펩티드 링커에 의한 부위 특이적 항체 수식
(1) 항체 수식 공정
항체 수식 펩티드를 국제공개 2017/217347호 팸플릿에 기재된 방법으로 제조하고, 하기 식 (P3)로 표현되는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다. 이 펩티드의 아미노산 서열은, 서열번호 10의 Xaa2가 리신 잔기인 서열과 동일해서, 리신 잔기의 측쇄 말단 아미노기가 R1로 나타나는 구조로 수식되어 있었다. 또한, 2개의 시스테인 잔기로 서로 디술피드 결합을 형성하고 있어, 펩티드의 N 말단은 디글리콜산 및 8개의 PEG를 갖는 링커 구조를 통하여, 제2 원자단인 아지드기를 포함하는 원자단으로서, 에틸아지드가 결합하고 있는 것이었다.
Figure pct00016
(식 (P3) 중, Gly는 글리신을, Pro는 프롤린을, Asp는 아스파르트산을, Cys는 시스테인을, Ala는 알라닌을, Tyr은 티로신을, His는 히스티딘을, Lys는 리신을, Glu는 글루탐산을, Leu는 류신을, Val은 발린을, Trp는 트립토판을, Thr은 트레오닌을, Phe는 페닐알라닌을 각각 나타낸다.)
이 펩티드와, 제조예 1에서 제작한 항MUC5AC 인간화 항체(항체 1)를 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)에 혼합한 혼합액을, 실온에서 30분간 반응시켜서, 펩티드 수식 항체를 포함하는 용액을 얻었다. 이 펩티드 수식 항체는, 상기의 펩티드에 의해 항체의 Fc 영역이 부위 특이적으로 수식된 것이다.
(2) 펩티드 수식 항체 분리 공정
이 펩티드 수식 항체를, 1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)로 희석하여, Protein A 칼럼(GE 헬스케어사 제조, HiTrap MabSelect SuRe)에 첨가하고, 0.15mol/L염화나트륨 함유 0.05mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH5.7)을 흘리고, 펩티드 2분자가 수식된 펩티드 수식 항체(이하, 「2가 항체」 이라고도 한다.)를 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 2가 항체의 농도가 15㎎/mL이 되도록 농도를 조정했다. 그 후, Protein A 칼럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.05mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH3.5)을 흘리고, 펩티드 1분자가 수식된 펩티드 수식 항체(이하, 「1가 항체」라고도 한다.)를 회수하고, 회수한 분획에 포함되는 1가 항체의 농도가 15㎎/mL가 되도록 농도를 조정했다.
제조예 3. 225 Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 제조
(1) 킬레이트제 합성 공정
본 실시예에 사용되는 킬레이트부(DOTAGA-DBCO)의 구조를, 이하의 식 (L1-5)에 나타낸다. 식 (L1-5)에 나타나는 DOTAGA-DBCO는, Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841에 기재된 방법에 준해서 제조했다. 이 킬레이트부를, 용매로서 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0)에 분산시키고, 킬레이트부를 1.7mmol/L 포함하는 분산액으로 하였다. 이 분산액 0.004mL와, 방사성 금속원으로서 225Ac이온 함유 용액(0.2mol/L염산수 용액, 방사능 농도 1225MBq/mL, Oak Ridge NationalLaboratory제로부터 조제, 액량 0.004mL) 4.9MBq(검정 일시 방사능으로부터 감쇠 계산한 계산값)과 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.0) 0.06mL를 혼합한 반응액을, 가열 조건 하에서 반응시켜서, 225Ac 착체 용액을 얻었다. 킬레이트부와 방사성 금속 이온과의 몰 비율은, 킬레이트부:225Ac이온=약 670:1이고, 반응액의 가열 온도는 70℃, 가열 시간은 30분간으로 하였다.
얻어진 225Ac 착체의 방사 화학적 순도를, 다음 방법으로 측정했다. 즉, 225Ac 착체 용액의 일부를 박층 크로마토그래피(Agilent사 제조, 형식 번호:SGI0001, 전개 용매:아세토니트릴/물 혼합액(체적비1:1))로 전개하고, 그 후 라디오 γ-TLC 애널라이저(raytest제, MODEL GITA Star)에서 측정했다. 검출된 전체 방사능(카운트)에 대한, 원점 부근에 검출된 피크의 방사능(카운트)의 백분율을 225Ac 착체의 방사 화학적 순도(%)로 하였다. 그 결과, 225Ac 착체의 방사 화학적 순도는 85%였다. 얻어진 225Ac 착체 용액은, 그대로 표지 공정에 사용했다.
(2) 표지 공정
제조예 2에서 얻어진 1가 항체의 용출액, 및 상술한 (1)의 공정에서 얻어진 225Ac 착체의 용액을 각각 0.02mol/L(20mM) 아스코르브산 함유 0.09mol/L 아세트산나트륨 완충액에 첨가하고, 37℃에서 120분간 클릭 반응시켜서, 225Ac 표지 1가 항체를 얻었다. 225Ac 착체량 및 펩티드 수식 항체량은 각각 44μmol 및 46μmol이고, 제1 원자단(DBCO)과 제2 원자단(아지드)의 몰비는 각각 약 1:1이었다.
또한, 37℃에서 2시간 반응시켜서 얻어진 225Ac 표지 1가 항체의 용액을 한외 여과 필터(Merck사 제조, 형식 번호: UFC505096)를 사용해서 정제하고, 이후의 실험에 제공했다. 정제 후의 225Ac 표지 1가 항체(검정 일시 방사능량으로부터 감쇠 계산한 방사능량 0.303MBq)의 방사 화학적 순도는, 93%이고, 방사 화학적 수율은, 39%였다. 여기서, 방사 화학적 순도는, 박층 크로마토그래피로 분석한 경우의 박층판의 전체 방사능 카운트에 대한 225Ac 표지 1가 항체에 상당하는 피크의 방사능 카운트의 비율(%)이며, 방사 화학적 수율은 γ선 스펙트로미터(Ge 반도체 검출기:GMX10P4-70(ORTEC사제), 멀티 채널 애널라이저:M7-000(세이코 EG and G사제), 데이터 처리: Spectrum Navigator:DS-P300(세이코 EG and G사제) 및 Gamma Studio:DS-P600(세이코 EG and G사제))로 측정한 표지 공정 개시 시의 방사능 카운트로부터 계산한 방사능량에 대한 225Ac 표지 1가 항체의 방사능 카운트로부터 계산한 방사능량의 비율(%)이다.
실시예 1 내지 7, 비교예 1 내지 5: 신장 보호 작용이 기대되는 화합물의 병용 투여에 의한 지발성의 신장 독성의 저감
225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 사용해서 제작한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 신장 보호 작용이 기대되는 화합물(신장 보호제)을 병용 투여함으로써, 225Ac 또는 225Ac의 딸핵종으로부터 방출되는 방사선에서 유래하는 지발성의 신장 독성의 저감이 확인될지 평가를 실시했다.
CD-1 마우스(5주령, 웅성, 니혼 찰스 리버사제)에 각 군 n=5로, 제조예 3으로 제조한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 15kBq/마리의 용량으로 투여하고, 신장 보호제로서 Zn-DTPA, 푸로세미드, 스피로노락톤 또는 에플레레논의 어느 것을 표 1에 나타내는 투여량, 투여 방법, 투여 횟수 및 첫회 투여 타이밍에 병용 투여했다. 즉, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체만을 투여하는 군(비교예 1), 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 및 각 신장 보호제를 병용 투여하는 군(실시예 1 내지 실시예 7) 및 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 투여하지 않고, 신장 보호제만을 투여하는 군(비교예 2 내지 5)을 마련했다. 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여량, 각 신장 보호제 및 급이 조건을 표 1에 나타낸다. 각 신장 보호제의 경피 투여군에 사용한 서방정제는 Innovative Research of America사제를 사용하여, 각 신장 보호제를 0.004% 함유하는 혼합 사료는 오리엔탈 고우보 고교 가부시키가이샤제를 사용했다.
각 개체는 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여일로부터 26주일(184일간) 관찰했다. 관찰 기간 중은 체중 측정, 혈구 측정, 요 중의 신장 독성 마커 측정을 경시적으로 행하고, 독성 징후의 평가를 행하였다.
Figure pct00018
[평가 1] 체중 변화
225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여일로부터 관찰 기간 중의 각 군 평균 체중 추이를 도 1 내지 도 4에 도시한다. 어느 군에 있어서도 평균 체중의 감소 경향은 확인되지 않았다.
[평가 2] 요 중 신장 독성 마커
225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여일로부터 16주인 경과한 각 개체로부터 오줌을 회수하고, 얻어진 오줌 샘플 중의 호중구 젤라티나아제 결합성 리포카린(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin; NGAL) 및 크레아티닌 농도를 ELISA법에 의해 측정했다. NGAL값은 정상적인 신장에서는 거의 검출되지 않지만, 신장 장애가 발생하면 원위 요세관으로부터 빠르게 유도됨과 함께 근위 요세관으로부터의 재흡수가 저해되고, 요 중으로의 배설 비율이 증가한다고 되어 있고, 요세관 장애 마커로서 이용되고 있다. 얻어진 NGAL값을 크레아티닌값으로 제산하는 것으로 오줌 농도가 보정된 NGAL값(요 중 NGAL/크레아티닌비, 이하, 요 중 N/C비)을 산출했다. 산출한 요 중 N/C비는 Stat PreClinica(타쿠미 인포메이션 테크놀로지사제)를 사용하여, 측정값의 등 분산성을 확인하고, 모든 항목에 대해서 등 분산성이 확인된 것부터, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여군을 대조 군으로 한 파라메트릭 검정의 던네트 법에 의한 유의차 검정을 행하였다. 유의 수준은 5%로 하였다.
225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여 16주째에 있어서의 요 중 N/C비의 산출 결과를 표 2에 나타낸다. 복강내 투여군(실시예 1) 및 경구 투여 군(실시예 2)의 요 중 N/C비의 그래프를 도 5에 도시한다. 16주째에 있어서, Zn-DTPA 병용 투여군(실시예 1)에 있어서, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여군(비교예 1)과 비교해서 유의미한 N/C비의 저하가 확인되었다. 그 외 군 중, 경구에 의한 모든 화합물의 병용 투여군(실시예 2 내지 4) 및 경피에 의한 푸로세미드의 병용 투여군(실시예 5)에서는 통계학적으로 유의미한 차는 확인되지 않았지만, 비교예 1에서 확인된 N/C비의 평균값과 비교해서 절반 이하의 값을 나타냈다. 이들 결과로부터, Zn-DTPA, 푸로세미드, 스피로노락톤, 에플레레논을 경구 투여 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여에 기인하는 요세관 장애를 저감시킬 가능성이 시사되었다.
Figure pct00019
[평가 3] 부검 및 신장 중량의 측정
관찰 기간 마지막 날(225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여일로부터 184일점)에 이소플루란 마취 하에서의 방혈에 의한 안락사 및 부검을 행하였다. 부검후, 신장을 채취하고 중량을 측정했다. 얻어진 장기 중량 측정 결과(단, 실시예 7을 제외한다)에 대해서 측정값의 등 분산성을 확인하고, 모든 항목에 대해서 등 분산성이 확인된 점에서, 파라메트릭 검정의 터키법에 의한 유의차 검정을 행하였다. 유의 수준은 5%로 하였다.
부검의 결과, 어느 것의 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여군에 있어서도, 외견적인 독성 소견은 확인되지 않았다. 또한, 모든 군에 있어서 부검 후의 신장 중량에 유의차는 확인되지 않았다(표 3).
Figure pct00020
[평가 4] 병리학적 평가
장기 중량 측정 후의 신장은 10% 중성 완충 포르말린액에 의해 1주일 이상 고정 조작을 행하였다. 고정한 조직에 대해서, 파라핀 포매, 얇게 썰기(절편 두께: 3㎛)를 행하고, 얻어진 조직 절편을 헤마톡실린·에오신 염색하고, 병리학적 평가에 제공했다. 또한, 평가는 독성 병리학 전문 자격을 갖는 사람이 행하였다.
각 투여군의 신장 병리학적 평가의 결과를 도 6에 도시한다. 신장의 수질 외층의 요세관 상피 세포의 변성/재생 및 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관의 대표적인 병리학적 소견을 도 7 및 도 8에 각각 나타낸다. 비교예 1에 있어서, 수질 외층에 있어서의 요세관 상피의 변성/재생이 5예 전예에서 확인되었다. 비교예 1에서는, 어느 예도 미만성의 변화였다(이하, 본 단락에 있어서 「그레이드 2」이라고 한다.). 한편, 실시예 1 내지 7에서는, 모두 그레이드 2 이상의 변화는 5예 중 0 내지 2예였다. 즉, 실시예 1 내지 6에 있어서, 수질 외층에 있어서의 요세관 상피의 변성/재생의 그레이드 2 이상의 변화는, 비교예 1과 비교해서 발현 빈도가 저하되었다.
염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관이, 비교예 1에서는, 5예 중 3예에서 자연 발생으로도 보이는 정도로 확인되고(이하, 본 단락에 있어서 「그레이드 1」이라고 한다.), 5예 중 2예에서 다소성으로 확인되었다(이하, 본 단락에 있어서 「그레이드 2」라고 한다.). 한편, 실시예 1에서는, 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관이 확인되지 않은 예가 1예, 그레이드 1의 변화가 3예, 그레이드 2의 변화가 1예 확인되었다. 또한, 실시예 2, 5 및 7에서는, 그레이드 2 이상의 동일 변화는 확인되지 않았다. 즉, 실시예 1, 2, 5 및 7에 있어서, 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관의 그레이드 2 이상의 변화는, 비교예 1과 비교해서 발현 빈도가 저하되었다.
이상의 결과로부터, 평가한 어느 화합물도, 요세관 상피에 대한 상해를 시사하는 변화인 수질 외층에 있어서의 요세관 상피의 변성/재생을 저감시키는 가능성이 나타나고, 또한 Zn-DTPA(실시예 1) 및 푸로세미드(실시예 2, 5)에 있어서는, 염증성 세포 침윤과 섬유화를 수반하는 호염기성 요세관도 저감시킬 가능성이 나타났다.
제조예 4. 225 Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 제조
DOTAGA-DBCO를 하기 구조식으로 표시되는 DOTA-Bn-DBCO로 바꾼 것 이외에는, 제조예 3에 준해서 조작하여, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 얻었다. 얻어진 정제후의 225Ac 표지 1가 항체(방사능량 1, 1MBq)의 방사 화학적 순도는 95%이고, 방사 화학적 수율은 23%였다.
Figure pct00021
실시예 8. 225 Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 안정성 평가
제조예 3 및 4에 준해서 제조한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를, 실온 및 냉장으로 2주일 보존하고, 각 시간점 (0일점, 1일점, 2일점, 7일점 및 14일점)에 있어서, 방사 화학적 순도를 평가했다. 또한, 제조 종료로부터 14일간은, 225Ac의 물리학적 반감기를 기준으로 해서 약 1.5 반감기에 상당한다.
[평가 5] 방사 화학적 순도
방사 화학적 순도를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석했다. TLC의 조건은, 제조예 3에서 방사 화학적 순도를 조사할 때 사용한 조건과 마찬가지로 하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00022
DOTAGA-DBCO에서 유래하는 구조를 갖는 제조예 3으로 제조한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체는, 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 99% 이상이 유지되고 있어, 냉장으로 7일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 99% 이상이 유지되고 있었다. 또한, 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 90% 이상이 유지되고 있어, 냉장으로 14일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 95% 이상이 유지되고 있었다.
DOTA-Bn-DBCO에서 유래하는 구조를 갖는 제조예 4에서 제조한 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체는, 제조 종료 후 실온에서 7일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 75% 이상이 유지되고 있고, 냉장으로 7일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 90% 이상이 유지되고 있었다. 또한, 제조 종료 후 실온에서 14일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 50% 이상이 유지되고 있고, 냉장으로 14일간 보존한 경우, 방사 화학적 순도로서 85% 이상이 유지되고 있었다.
이상으로부터, Zn-DTPA, 푸로세미드, 스피로노락톤 및 에플레레논은 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체와 병용 투여함으로써, 요세관 장애의 저감 및 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체의 투여 후 10주일 이상 경과하고 나서 지발적으로 발생할 수 있는 병리학적인 독성 소견의 개선에 기여하고, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체 투여에 수반하는 신장 독성을 저감시킨다고 하는 목적을 달성했다고 생각되었다.
참고예 1:In-111( 111 In)표지 항체를 사용한 인간화 항체의 스크리닝
참고예 1-1: 111 In 표지 항체의 조제
종양 집적능이 높고, 또한 최대 내용량이 높은 항MUC5AC 항체를 알아내기 위해서, 각종 항체를 111In 표지하고, 담암 마우스에 투여해서 SPECT-CT 촬상을 행하고, 얻어진 화상으로부터 종양 및 간장의 누적 방사능량 및 흡수선량을 산출하고, 비교를 행하였다.
항체는, 제조예 1로 제작한 항MUC5AC 인간화 항체 4종류와 특허문헌 1에서 개시된 항MUC5AC 키메라 항체 1종류를 사용하여, 111In 표지했다.
특허문헌 1에 개시되어 있는 키메라 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(각각 서열번호 23 및 24)은 이하와 같다.
111In 표지는, 하기 식에서 나타나는 구조를 갖는 표지 전구체와 각종 항체와의 복합체에 대해서 행하였다.
Figure pct00023
Figure pct00024
상기 표지 전구체는, 킬레이트부로서 DOTA가, 항체 수식 펩티드(서열번호 10의 Xaa2가 리신 잔기인 서열과 동일한 서열을 갖는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드)의 N 말단에 8개의 폴리에틸렌글리콜을 통하여 연결하고, 또한 당해 구조중의 N-히드록시숙신이미드에스테르기를 통하여, 각종 항체에 있어서의 EU 넘버링으로 252번째의 리신 잔기에 연결되어 있는 구조를 갖고 있는 것이었다.
이 표지 전구체를 450μg, 용매로서 100mmol/L의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산 완충액(pH5.5)에 용해시켰다. 이 용액과, 방사성 금속원으로서 111In 이온 함유 용액(염화인듐(111In) 주사액, 니혼 메디피직스사제)을 방사능량으로서 10MBq를 혼합하고, 45℃에서 120분간 표지 반응을 행하였다.
각종 111In 표지 항체의 방사 화학적 수율, 방사 화학적 순도, 동물에 투여한 방사능량을 표 5에 나타낸다. 여기에서 말하는 방사 화학적 수율이란, 사용한 111In의 방사능량에 대한 111In 표지 항체의 방사능량을 가리킨다. 방사능 측정은 라디오아이소토프·도즈·캘리브레이터(CAPINTEC사 제조, 형식 번호: CRC-15R)를 사용했다. 방사 화학적 순도는, 여과지 크로마토그래피로 분석한 경우의 여과지 전방사능 카운트에 대한 111In 표지 항체에 상당하는 피크의 방사능 카운트의 비율(%)을 가리킨다. 여과지 크로마토그래피는, 여과지:ADVANTEC사 제조, 형식 번호: No.590, 전개 용매: 0.01% EDTA, 50mM 시트르산-시트르산나트륨 수용액)로 전개하고, 방사능 카운트의 검출은, 라디오γ-TLC 애널라이저(raytest사 제조, MODEL GITA Star)를 사용했다.
Figure pct00025
참고예 1-2: 담암 마우스를 사용한 체내 분포
(담암 마우스의 제작 방법)
인간 췌장암 세포주 SW1990을 0.7×107개를, Balb/c누드마우스(웅성)의 옆구리부터 배면부에 걸쳐서 피하 투여했다.
SW1990을 이식 14일 후의, 종양의 크기가 약 150-300㎣이 된 시점에서, 참고예 1-1에서 조제한 각종 111In 표지 항체를 마우스 미정맥으로부터 투여했다. 또한, 종양의 체적은 이하의 계산 식으로부터 산출했다.
종양의 체적=(종양의 단경2×종양의 장경)/2
Figure pct00026
(평가 방법)
SPECT-CT 이미징(소동물용 SPECT-CT 장치: FX-3000, Trifoil사제)은 하기 표의 조건에서 실시했다. 촬상한 시간점은 투여 후 1, 6, 24, 48, 72, 168시간 후이다. 화상 재구성은 SPECT를 OSEM법, CT를 FBP법으로 실시했다. 각 시간점의 종양 및 간장의 VOI(volume of interest, 3차원 ROI) 해석을 실시했다. 장기 체적당 카운트수를 % ID/g로 보정하고, 물리적 반감기를 111In으로부터 225Ac로 환산하고, 물리학적 반감기의 차를 보정하고, 더욱 생물학적 반감기를 가미한 시간 방사능 곡선을 얻었다. 이 시간 방사능 곡선의 적분값으로부터 누적 방사능량을 산출하고, 구체 모델(OLINDA/EXM ver2.0)로 흡수선량을 산출하고, 이것을 각 항체로 비교 검토했다. 단, H01L03에 대해서는 투여 후 168시간에 시간 방사능 곡선의 감소가 확인되지 않기 때문에, 생물학적 반감기는 고려하지 않고, 물리적 반감기만을 가미했다.
Figure pct00027
Figure pct00028
(결과)
SPECT-CT 촬상을 실시한 결과를 도 9에 도시한다. 각 시간점의 종양 및 간장의 VOI 해석을 실시한 결과를 도 10에 도시한다. 투여 후 168 시간 후의 SPECT-CT 촬상 종료 후의 체내 분포·배설 경로를 확인한 결과를 나타내는 그래프를 도 11에 도시한다.
종양에의 집적은, 인간화 항체(H01L03)을 사용한 경우가 가장 높고, 반면에 키메라 항체를 사용한 경우가 가장 낮았다. 간장으로의 집적은, 키메라 항체를 사용한 경우가 가장 높고, 인간화 항체를 사용한 경우에는 모두 키메라 항체와 비교해서 낮았다. 인간화 항체(H01L03)을 사용한 경우의 배설이 가장 늦고, 혈액 체류성이 높았다. 어느 항체를 사용한 경우에도, 정상 장기 중에서는 간장 및 비장으로의 집적이 높고, 이어서 폐 및 신장으로의 집적이 높았다.
간장의 임계선량을 30Gy로 설정한 경우의 최대 내용량은, 인간화 항체(H01L03)를 사용한 경우에는 3.90MBq로 높은 값이었지만, 반면에 키메라 항체를 사용한 경우에는 0.43MBq로 낮은 값이었다. 최대 내용량 (MBq)은, 임계선량(Gy)/흡수선량(Gy/MBq)으로 산출했다.
참고예 1-3: 시험관 내 오토라디오그래피
참고예 1-1에서 조제한 각종 111In 표지 항체를 사용하여, 시험관 내 오토라디오그래피(ARG)에 의한 각종 항체의 MUC5AC에 대한 결합성 및 특이성을 평가한 화상 결과를 도 12에 도시한다. 또한, 절편 전체에 관심 영역(ROI)을 설정해서 산출한 ROI 중의 방사능 밀도(Bq/㎟)의 수치의 그래프를 도 13에 도시한다.
MUC5AC 고발현 종양(SW1990 이식 종양 조직) 또는 MUC5AC 저발현 종양(MIAPaCa2 이식 종양 조직)을 액체 질소 중에서 동결한 동결 블록으로부터, 크라이오스탯(Leica사제)을 사용하여, 두께 10㎛의 절편을 제작하고, 시험관 내 ARG에 사용했다.
사용 시까지 -80℃에서 보존한 절편을, 실온으로 되돌리고, 30분간 이상 건조시킨 후, 인산 완충 생리 식염수에 30분간 침지하고, 이어서, 1체적% 소 혈청 알부민 함유 인산 완충 생리 식염수에 30분 침지함으로써, 절편의 친수화를 행하였다.
친수화한 동결 절편을, 각종 111In 표지 항체를 5kBq/mL 함유 1체적% 소 혈청 알부민 함유 인산 완충 생리 식염수에 각각 30분간 침지했다. 이어서, 1체적% 소 혈청 알부민 함유 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수의 순으로 각 용액에 5분간씩 침지해서 절편의 세정을 행하였다. 세정 후의 절편을 풍건하고, 이메징플레이트(BAS-SR2040, 후지 필름 와코준야쿠사제)로 약 15시간 노광시켜서, 플루오로이미지 애널라이저(Typhoon FLA 7000 IP, GE 헬스케어사제)를 사용해서 오토라디오그램을 얻었다. 얻어진 오토라디오그램을, 플루오로이미지 애널라이저 부속의 해석 소프트웨어 「Image Quant TL」을 사용하여, 절편 전체에 관심 영역(ROI)을 설정하고, ROI 중의 방사능 밀도(Bq/㎟)를 산출했다.
111In 표지한 모든 인간화 항체에 있어서 MUC5AC에 대한 결합성 및 특이성을 유지하고 있는 것을 확인했다(도 13, MUC5AC 고발현 종양의 데이터 참조). 키메라 항체와 비교하여, 각종 인간화 항체는 비특이적인 결합이 적은 것을 확인했다(도 13, MUC5AC 저·미발현 종양의 데이터 참조).
참고예 1-2, 1-3의 결과로부터, 인간화 항체는, 키메라 항체와 비교해서 MUC5AC에 대한 특이성이 높고, 또한 종양에의 높은 집적성과 간장 등의 정상 장기에의 낮은 집적성을 갖는 것부터, RI 표지 항체에 관하는 것 보다 우수한 딜리버리 기술을 제공하는 것인 것이 명확해졌다.
본 참고예의 결과를 하기 표에 통합한다. 표 중, SPECT의 흡수선량에 있어서, 종양 체적은 150㎣를 상정해서 산출했다. 또한, 간장의 흡수선량은, 본 참고예에서 사용한 마우스 간장 중량의 평균값(1.15±0.14g, n=19)을 기초로 산출했다. 체내 분포의 수치는 n=4의 평균±표준 편차로 나타냈다(단, H02L04는 n=3).
Figure pct00029
이상, 실시 형태를 참조하여 본 발명을 설명했지만, 본 발명은, 상기 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구성이나 상세하게는, 본 발명의 스코프내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러 변경을 할 수 있다.
여기에서 설명된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용된 것에 의해, 그 모두가 명시된 것과 동일 정도로 본 명세서에 병합되는 것이다.
본 발명의 방사성 항종양제에 의하면, MUC5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체와, α선을 방출하는 악티늄-225를 구비한 복합체를 유효 성분으로서 함유하므로, 암의 RI 내용 요법에 사용함으로써 MUC5AC를 발현하는 종양에 대하여 특이적으로 집적하고, 정상 세포에는 영향을 주지 않고 종양 세포 특이적으로 α선을 조사 할 수 있고, 더 높은 안전성과 치료 효과가 얻어진다. 또한, 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 병용되므로, 암 치료에 염려되는 부작용이 저감된다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원2021-072206(출원일: 2021년 4월 21일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NIHON MEDI-PHYSICS CO., LTD. Sumitomo Pharma Co., Ltd. <120> Radioactive antitumor agent <130> 093254 <150> JP2021-072206 <151> 2021-04-21 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanaized antibody heavy chain variable region 1 (H01) <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanaized antibody heavy chain variable region 2 (H02) <400> 2 Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 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light chain variable region 1 (L01) <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanaized antibody light chain variable region 2 (L02) <400> 6 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser 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Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Tyr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu 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Claims (17)

  1. 신장 독성을 저감하기 위한 약제와 조합해서 사용되는, 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체(악티늄-225로 표지된, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체)를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제.
  2. 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체(악티늄-225로 표지된, 뮤신 서브타입 5AC에 특이적으로 결합하는 인간화 항체)와 신장 독성을 저감하기 위한 약제를 유효 성분으로서 포함하는, 방사성 항종양제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 악티늄-225를 포함하는 약제의 투여에서 유래하는 신장 독성을 저감하기 위한 약제인, 방사성 항종양제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 악티늄-225 또는 악티늄-225의 딸핵종에서 유래하는 신장 독성을 저감하기 위한 약제인, 방사성 항종양제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신장 독성이, 상기 방사성 항종양제의 투여 후 10주 이상 경과하고 나서 발생하는 지발성의 신장 독성인, 방사성 항종양제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 이뇨제 또는 금속 제거제인, 방사성 항종양제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 금속 제거제가, DTPA, Ca-DTPA 또는 Zn-DTPA를 포함하는, 방사성 항종양제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 이뇨제가, 푸로세미드, 스피로노락톤 또는 에플레레논을 포함하는, 방사성 항종양제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가,
    (1) 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열 (H01), 혹은 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    (2) 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열 (H02), 혹은 서열번호 2로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    (3) 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 (H03), 혹은 서열번호 3으로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    (4) 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열 (H04) 혹은 서열번호 4로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    로 이루어지는 중쇄 가변 영역과,
    (5) 서열번호 5로 나타나는 아미노산 서열 (L01), 혹은 서열번호 5로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    (6) 서열번호 6으로 나타나는 아미노산 서열 (L02), 혹은 서열번호 6으로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    (7) 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열 (L03), 혹은 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    (8) 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열 (L04) 혹은 서열번호 8로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    로 이루어지는 경쇄 가변 영역
    을 갖는, 방사성 항종양제.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항MUC5AC 인간화 항체가,
    (1) 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열 (H01) 혹은 서열번호 1로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과,
    (7) 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열 (L03) 혹은 서열번호 7로 나타나는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역
    을 갖는 인간화 항체인, 방사성 항종양제.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체는, 악티늄-225로 착 형성된 킬레이트제와 상기 항MUC5AC 인간화 항체의 복합체이며, 상기 항MUC5AC 인간화 항체의 Fc 영역이, 링커를 통하여, 상기 킬레이트제로 부위 특이적으로 수식되어 있는, 방사성 항종양제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 링커가, 하기 식 (i)로 표시되는, 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 포함하고, 가교제로 수식된 상기 펩티드와 상기 항체의 가교 반응에 의해 형성되어 있는, 방사성 항종양제.
    (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd) … (i)
    (식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 각각 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고,
    X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기 모두 가지지 않는 아미노산 잔기이고,
    a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이고, 또한 a+b+c+d≤14를 충족하고,
    Xaa1 및 Xaa3은, 각각 독립적으로 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고,
    또는,
    한쪽이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 다른 쪽이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산에서 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결되어 있고, Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산이고, 상기 가교제로 수식되어 있다.)
  13. 제11항에 있어서, 상기 킬레이트제가, 하기 식 (A)로 표시되는 화합물 또는 그의 염에서 유래하는 구조를 갖는, 방사성 항종양제.
    Figure pct00030

    (식 (A) 중, R11, R13 및 R14는, 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이고, R12 또는 R15의 한쪽이 수소 원자, 카르복실기, 또는, 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이고, 다른 쪽이 상기 항체와 복합체화하기 위한 치환기이고, p가 0 이상 3 이하의 정수이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기일 때 R15는 수소 원자이고, R12가 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체와 복합화하기 위한 치환기이다.)
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 췌장암, 갑상선암, 간장암, 대장암, 위암, 요로 상피암, 유방암, 자궁경암, 난소암, 자궁 내막암 또는 담관암을 치료하기 위해서 사용되는, 방사성 항종양제.
  15. 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와 조합해서 사용되고, 신장 독성을 저감하기 위한, 약제.
  16. 제15항에 있어서, 당해 신장 독성을 저감하기 위한 약제가, 이뇨제 또는 금속 제거제인, 약제.
  17. 225Ac 표지 항MUC5AC 인간화 항체를 유효 성분으로서 포함하는 방사성 항종양제와,
    신장 독성을 저감하기 위한 약제
    를 갖는, 조합 의약.
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