CN117377690A - 抗egfr抗体的放射性复合物和放射性药物 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明的课题在于，提供与以往相比稳定性得以提高而不损害药效的复合物。本发明的复合物是位点特异性地用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的复合物，放射性金属同位素螯合于螯合剂，肽与螯合剂经由接头(L)连接，接头(L)不含硫脲键。
Description
技术领域
本发明涉及抗EGFR抗体的放射性复合物和放射性药物。
背景技术
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor：表皮生长因子受体)是识别对细胞的增殖、生长加以控制的生长因子并进行信号传导的酪氨酸激酶型受体，其是分子量约为170kDa的跨膜蛋白质。也被称为HER1、ErbB1。
作为抗EGFR抗体，已知有西妥昔单抗(Cetuximab)。西妥昔单抗是阻碍EGFR发挥作用的单克隆抗体，其被用作抗癌剂，且是狙击与癌症的增殖等有关的特定分子的分子靶向治疗药之一。
已知西妥昔单抗是在已经上市的ADC(Antibody Drug Conjugate(抗体药物复合物))中使用的抗体。作为使用西妥昔单抗的ADC，有经由接头在抗体上共价键合有化疗药、作为光敏性物质的有效载荷(药物)的药剂。
抗体药物的靶向选择性高且副作用较少，另一方面，药效有时不充分。作为有效载荷之一的化疗药具有强力的药效，但靶向选择性低，因此，杀灭癌细胞所需的最小有效量高，另一方面，从毒性的观点出发不太能提高用量，因此，最大耐受量低、治疗用量范围狭窄被视作课题。
根据ADC，能够将化疗药选择性地大量送达至癌细胞，其结果，以更少的量显示出效果，到达正常细胞的化疗药减少，因此，最大耐受量也变高，因而，可期待治疗用量范围变宽。
作为ADC的一种形式，有放射性免疫复合物(Radioimmunoconjugate)。在放射性免疫复合物中，使用放射性同位素来代替有效载荷。
另外，专利文献1中记载了一种放射性的药物组合物，其使用3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]-十五碳-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)等二官能性螯合剂，并用放射性铜修饰西妥昔单抗。
另外，将发射γ射线、正电子的放射性同位素用作放射性同位素的放射性免疫复合物可用于核医学检查。专利文献2中记载了：可以向对抗体的Fc区域进行位点特异性修饰的肽中导入DTPA来修饰西妥昔单抗，并用放射性金属同位素进行标记。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-214308号公报
专利文献2：国际公开第2017/217347号
发明内容
然而，根据本发明人等的见解而明确：以往的抗EGFR抗体的放射性复合物存在稳定性低等课题。
专利文献1中，没有针对基于肽的抗EGFR抗体的位点特异性修饰进行记载。另外，也没有形成有硫脲键的抗EGFR抗体的课题的相关公开/或启示。
本发明的一个方式是复合物，其是位点特异性地用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的复合物，放射性金属同位素螯合于螯合剂，肽与螯合剂经由接头(L)连接，接头(L)不含硫脲键。
本发明的其它方式是放射性药物，其含有上述复合物作为有效成分。
另外，本发明的其它方式是放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，在室温下保管7天时的复合物的放射化学纯度为90％以上。
需要说明的是，在没有特别说明的情况下，本发明中提及的“连接”是指直接连接或间接连接这两者。
根据本发明，提供与以往相比稳定性得以提高而不损害药效的抗EGFR抗体的放射性复合物。
附图说明
图1是表示按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物的抗原结合性的评价结果的图。纵轴表示：用标准射线源的计数值除以标准射线源的面积而得到值，利用该得到的值对在所使用的肿瘤切片上设定的关注区域(ROI)内的计数值除以ROI的面积而得到的值进行校正而得到的值，横轴表示在评价中使用的肿瘤切片的细胞种类。图表示各样品(n＝10)的平均值±标准偏差。
图2是表示按照实施例2而制造的放射性复合物的荷瘤小鼠的PET图像(MIP图像)的代表例的图。箭头表示来自荷瘤A431细胞的肿瘤。
图3是表示按照比较例2而制造的放射性复合物的荷瘤小鼠的PET图像(MIP图像)的代表例的图。箭头表示来自荷瘤A431细胞的肿瘤。
图4是表示放射性复合物(实施例1)给药组、放射性复合物(比较例1)给药组、抗体对照组和溶剂对照(vehicle)组的荷瘤小鼠的经时性肿瘤体积变化的图。纵轴表示将给药各药剂时的肿瘤体积设为1时的相对值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差，“**”表示相对于抗体对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.05)的时间点，/>表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点。
图5是表示放射性复合物(实施例1)给药组、放射性复合物(比较例1)给药组、抗体对照组和溶剂对照组的荷瘤小鼠的经时性体重变化的图。纵轴表示将给药各药剂时的体重设为1时的相对值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的体重的平均值±标准偏差。
图6是表示按照实施例6的记载而制造的放射性复合物相对于EGFR而言的特异性的评价结果的图。纵轴表示：用标准射线源的计数值除以标准射线源的面积而得到值，利用该得到的值对在所使用的肿瘤切片上设定的ROI内的计数值除以ROI的面积而得到的值进行校正而得到的值，横轴表示在评价中使用的肿瘤切片的细胞种类。图表示各样品(n＝10)的平均值±标准偏差。
图7A是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于COLO205细胞(上段)、HCT-116细胞(下段)的细胞杀伤效果的图。作为比较对象，添加有未标记的帕尼单抗。纵轴表示将未添加抗体条件下的活细胞数设为1时的相对值，横轴表示所添加的抗体浓度。图表示各组的平均值±标准偏差。
图7B是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于SW48细胞(上段)、MIAPaCa-2细胞(下段)的细胞杀伤效果的图。作为比较对象，添加有未标记的帕尼单抗。纵轴表示将未添加抗体条件下的活细胞数设为1时的相对值，横轴表示所添加的抗体浓度。图表示各组的平均值±标准偏差。
图7C是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于NCI-H358细胞的细胞杀伤效果的图。作为比较对象，添加有未标记的帕尼单抗。纵轴表示将未添加抗体条件下的活细胞数设为1时的相对值，横轴表示所添加的抗体浓度。图表示各组的平均值±标准偏差。
图8是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于COLO205细胞、SW48细胞的细胞凋亡诱导能力的图。作为比较对象，添加有未标记的帕尼单抗。纵轴表示将未添加抗体条件下的Caspase-3/7活性设为1时的相对值，横轴表示所添加的抗体浓度。图表示各组的平均值±标准偏差。
图9A是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于SW48细胞的DNA双链断裂效果的图。利用DAPI对细胞核进行染色并检测(上段图像)，对γH2AX进行染色并检测(下段图像)。
图9B是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于MIAPaCa-2细胞的DNA双链断裂效果的图。利用DAPI对细胞核进行染色并检测(上段图像)，对γH2AX进行染色并检测(下段图像)。
图9C是表示225Ac络合物标记帕尼单抗对于NCI-H358细胞的DNA双链断裂效果的图。利用DAPI对细胞核进行染色并检测(上段图像)，对γH2AX进行染色并检测(下段图像)。
图10是表示放射性复合物(实施例6)高放射能给药组、放射性复合物(实施例6)低放射能给药组、抗体腹腔给药组、抗体对照组和溶剂对照组的荷瘤小鼠(COLO205细胞)的经时性肿瘤体积变化的图。纵轴表示各组的肿瘤体积的平均值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差，“*”表示相对于抗体对照组确认到显著差异(p<0.05)的时间点，“**”表示相对于抗体对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.05)的时间点，“§”表示相对于抗体腹腔给药组确认到显著差异(p<0.01)的时间点。
图11是表示放射性复合物(实施例6)高放射能给药组、放射性复合物(实施例6)低放射能给药组、抗体腹腔给药组、抗体对照组和溶剂对照组的荷瘤小鼠(HCT-116细胞)的经时性肿瘤体积变化的图。纵轴表示各组的肿瘤体积的平均值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差，“**”表示相对于抗体对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，“§”表示相对于抗体腹腔给药组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，“||”表示相对于放射性复合物(实施例6)高放射能给药组确认到显著差异(p<0.05)的时间点。
图12是表示放射性复合物(实施例6)高放射能给药组、放射性复合物(实施例6)低放射能给药组、抗体腹腔给药组、抗体对照组和溶剂对照组的荷瘤小鼠(SW48细胞)的经时性肿瘤体积变化的图。纵轴表示各组的肿瘤体积的平均值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差，“**”表示相对于抗体对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点，表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点。
图13是表示放射性复合物(实施例6)给药组、奥沙利铂给药组和溶剂对照组的COLO205荷瘤小鼠的经时性肿瘤体积变化的图。
图14是表示放射性复合物(实施例6)给药组、奥沙利铂给药组和溶剂对照组的COLO205荷瘤小鼠的最终观察日的肝毒性(上图和中图)和肾毒性(下图)标记物的测定结果的图。
图15是表示给药了按照实施例2的记载而制造的放射性复合物的COLO205细胞荷瘤小鼠的PET图像(MIP图像)的代表例的图。
具体实施方式
(1)放射性复合物
本发明为复合物，其是位点特异性地用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的复合物，放射性金属同位素螯合于螯合剂，肽与螯合剂经由接头(L)连接，接头(L)不含硫脲键(以下也称为本发明的放射性复合物)。
(1-1)放射性金属同位素
本发明的放射性复合物中包含的放射性金属同位素为发射α射线的放射性同位素、发射β射线的放射性同位素、发射正电子的放射性同位素或发射γ射线的放射性同位素。将本发明的放射性复合物用于癌症治疗的情况下，优选使用发射α射线的放射性同位素或发射β射线的放射性同位素。另外，将本发明的放射性复合物用于癌症的诊断或检测的情况下，优选使用发射正电子的放射性同位素或发射γ射线的放射性同位素。作为发射α射线的放射性同位素，可例示出Bi-212、Bi-213、Ac-225、Th-227。另外，作为发射β射线的放射性同位素，可例示出Cu-64、Y-90或Lu-177。另外，作为发射正电子的放射性同位素，可例示出Cu-64、Ga-68、Y-86、Zr-89。另外，作为发射γ射线的放射性同位素，可例示出Tc-99m或In-111。本发明的放射性复合物中包含的放射性金属同位素更优选为Ga-68、Zr-89、Y-90、In-111、Lu-177或Ac-225，进一步优选为Zr-89、Y-90、Lu-177或Ac-225。
(1-2)抗体
本发明的放射性复合物中包含的抗体是与EGFR特异性结合的免疫球蛋白(以下也称为本发明中使用的抗体)。本发明中使用的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，优选为单克隆抗体。抗体的来源没有特别限定，可列举出例如非人动物的抗体、非人哺乳动物的抗体和人抗体，可优选例示出人、大鼠、小鼠和兔的抗体。在抗体来自除人之外的物种的情况下，优选使用公知技术来进行嵌合化或人源化，本发明中使用的抗体可以为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。另外，本发明中使用的抗体可以为双特异性抗体。本发明中使用的抗体例如为IgG，可以是例如IgG1、IgG2(例如IgG2a和IgG2b)、IgG3或IgG4。
本发明的放射性复合物中使用的抗体更优选为西妥昔单抗或帕尼单抗。
西妥昔单抗(Cetuximab)是特异性地识别EGFR的IgG1亚类的人/小鼠嵌合化单克隆抗体，已知其通过抑制EGFR的活化/二聚化而对结肠直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胃癌等发挥出抑制肿瘤生长的效果。
西妥昔单抗的化学名(命名法)是通过导入对由小鼠抗人上皮细胞生长因子受体单克隆抗体的可变区和人IgG1恒定区构成的人/小鼠嵌合型单克隆抗体进行编码的cDNA而在小鼠杂交瘤SP2/0-Ag14细胞株中产生的由2分子轻链和2分子重链构成的糖蛋白，所述轻链由214个氨基酸残基(C1025H1595N281O338S5；分子量：23422.64)构成，所述重链由449个氨基酸残基(C2208H3400N582O674S15；分子量：49363.09)构成。
本说明书中，西妥昔单抗为日本特开2005-047934号公报中记载的抗体，具体而言，是包含下述氨基酸序列的人源化抗体。
轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
[化1]
和、重链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
[化2]
西妥昔单抗作为以RAS基因野生型的无法治愈切除的进行/复发性结肠/直肠癌、头颈癌为适应症的抗肿瘤剂而在临床中加以应用，可以以アービタックス(Erbitux；注册商标)的形式进行获取。
帕尼单抗(Panitumumab)是特异性地识别EGFR的人型IgG2单克隆抗体。其化学名(命名法)是在导入有对作为人抗人EGFR单克隆抗体的IgG2进行编码的基因组DNA的中国仓鼠卵巢细胞中产生的由2分子轻链和2分子重链构成的糖蛋白(分子量：约147,000)，重链亚单位的主成分欠缺C末端的赖氨酸，所述轻链由214个氨基酸残基(C1028H1588N274O336S6；分子量：23353.63)构成，所述重链由445个氨基酸残基(C2171H3355N573O672S18；分子量：48811.47)构成。
帕尼单抗的氨基酸序列在针对Vectibix点滴静注100mg“TAKEDA BIO”的基于独立行政法人药品医疗设备综合机构的审查报告书中如下那样地显示。
轻链(SEQ ID NO:3)：
[化3]
重链(SEQ ID NO:4)：
[化4]
此处，分子内的二硫醚键用实线表示。分子间的二硫醚键利用重链的Cys222残基与轻链的Cys214残基、重链的Cys225残基彼此、重链的Cys228残基彼此来形成。
标有下划线的Asn(Asn)为糖链键合位置，标有星号的Gln(Gln*)是一部分环化成焦谷氨酸。标有两个星号的Lys(Lys**)基本完全缺失。
糖链结构如下所示。
[化5]
此处，Fuc为L-岩藻糖，(Gal)0-2为0分子、1分子或2分子的D-半乳糖，GlucNac为D-N-乙酰基葡糖胺，Man为D-甘露糖。
帕尼单抗作为以KRAS基因野生型的无法治愈切除的进行/复发性结肠/直肠癌为适应症的抗肿瘤剂而在临床中加以应用，可以以ベクティビックス(Vectibix；注册商标)的形式进行获取。
(1-3)螯合剂
本发明中，螯合剂只要在结构中具有放射性金属同位素进行配位的部位即可，没有特别限定。作为螯合剂，可列举出例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(环己烷-反式-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫代甲酰基]硫基]戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸),1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy),DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰胺基亚甲基膦酸)、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)、去铁胺(DFO)、DTPA(甘氨酸,N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-)、CHX-A”-DTPA(2,2'-((2-(((1S,2R)-2-(双(羧甲基)氨基)环己基)(羧甲基)氨基)乙基)氮烷二基)二乙酸)、DTPA-BMA(5,8-双(羧甲基)-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸)、EDTA(2,2',2”,2’”-(乙烷-1,2-二基双(氮烷三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基三(亚甲基膦酸))、TETPA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N’”-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮杂环十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-四(1,2-二氢-1-羟基-2-氧代吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮杂十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮杂环十五碳-N,N’,N”,N’”,N””-五乙酸)、H4octapa(N,N’-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N’-二乙酸)、H2bispa2(6,6’-({9-羟基-1,5-双(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基}双(亚甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基氨基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-N,N’-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N”-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)-二亚乙基三胺-N,N’,N”-三乙酸)、H6phospa(N,N’-(亚甲基膦酸酯)-N,N’-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二氨基乙烷)、HP-D03A(羟基丙基四氮杂环十二烷三乙酸)、卟啉之类的物质，优选为下述式(A)所示的化合物。
[化6]
(式(A)中，R11、R12、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R15为氢原子，p为0以上且3以下的整数)。
作为式(A)所示的化合物，优选为包含来自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物的结构的化合物，具体而言，可以在结构中包含来自选自DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸),1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy),DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰胺基亚甲基膦酸)、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)中的一种螯合剂的结构，可更优选列举出下式(A-1)～(A-6)所示的化合物。本发明的放射性复合物中使用的螯合剂更优选为DOTA-GA(式(A-6)所示的化合物)。在所使用的螯合剂为DOTA-GA的情况下，前述螯合剂可以为立体异构体(S体、R体)，也可以为消旋体。S体与R体的立体异构体可以以任意比例进行混合。
[化7]
本发明中使用的螯合剂经由接头(L)与肽连接。在本发明的放射性复合物中，螯合剂与接头(L)优选通过共价键连接。因此，在本发明的放射性复合物中，前述螯合剂的化合物内的一部分基团任选被取代成与接头(L)形成共价键的基团。例如，在本发明中使用的螯合剂为式(A)所示化合物的情况下，R12或R15任选被替换成与接头(L)形成共价键的基团。优选的是：R12被替换成与接头(L)形成共价键的基团时，R15为氢原子，R12为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团时，R15被替换成与接头(L)形成共价键的基团。
螯合剂与接头(L)的共价键只要不含硫脲键即可，可列举出碳-碳键、酰胺键、醚键、酯键等。
螯合剂与接头(L)的连接通过例如下述式(A-7)、(A-8)的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基或下述式(A-9)的2,6-二氧代四氢-2H-吡喃基与接头(L)的伯胺的反应来形成。
[化8]
(1-4)抗体修饰肽
本发明中，肽只要是位点特异性地修饰抗体、优选位点特异性地修饰Fc区域、更优选位点特异性地修饰抗体的Fc区域中的赖氨酸残基即可，没有特别限定。由此，能够维持抗体自身的活性(抗原识别作用、中和作用、补体活化作用和/或调理素作用)。
本发明中使用的肽可以为链状肽，也可以为环状肽，优选为环状肽。更优选包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的氨基酸序列(以下也称为“抗体修饰肽”)，且用交联剂修饰。需要说明的是，在式(i)中，以氨基酸序列的纸面左侧表示N末端侧、氨基酸序列的纸面右侧表示C末端侧的形式进行说明。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14，
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基或者来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，其中，Xaa1和Xaa3中的任一者为来自具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1和Xaa3优选通过连接而形成环结构，
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，优选为赖氨酸残基，并且，Xaa2用交联剂修饰。
作为上述式(i)中的X可包含的氨基酸残基，可列举出例如来自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等氨基酸的氨基酸残基，X可以为由同一种类的氨基酸构成的氨基酸残基，也可以为由彼此不同种类的氨基酸构成的氨基酸残基。
式(i)中的a、b、c和d只要是上述范围的数即可，没有特别限定，从肽与抗EGFR抗体的结合稳定性的观点出发，以a+b+c+d≤14为条件，a优选为1以上且3以下的整数，b优选为1以上且3以下的整数，c优选为3以上且5以下的整数，并且，d优选为1以上且3以下的整数。
Xaa1和Xaa3中的至少一者为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，该氨基酸彼此可以相同也可以不同。作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸，可列举出例如半胱氨酸、同半胱胺酸。这种氨基酸残基优选通过二硫醚键进行键合、或者经由下述式(4)所示的结构而键合有硫醚基。式(4)中，波浪线部分表示与硫醚基的键合部分。
[化9]
(4)
关于Xaa1和Xaa3，代替上述组合，可以是Xaa1和Xaa3之中的一者为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者为来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基。它们借助硫醚键而进行键合。卤代乙酰基的末端被碘等卤素取代，通过与另一个侧链中的硫醇基的反应而使卤素脱离，形成硫醚键。
式(i)所示的抗体修饰肽的具体氨基酸序列可列举出例如国际公开第2016/186206号、国际公开第2017/217347号和国际公开第2018/230257号中记载的肽，也可以使用它们。
本发明中使用的抗体修饰肽优选为下述式(i)'所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列。
(X1-3)-C-(Xaa3')-(Xaa4')-H-(Xaa1')-G-(Xaa2')-L-V-W-C-(X1-3)(i)'
式(i)'中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意的氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1'为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2'为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa3'为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且
Xaa4'为酪氨酸残基或色氨酸残基。
上述式(i)'中，N末端或C末端的X1-3这一表述是指：除半胱氨酸(C或Cys)之外的独立且任意的1～3个氨基酸残基X是连续的，构成其的氨基酸残基是相同或不同的残基，优选由3个均不相同的残基的序列构成。
这些之中，作为抗体修饰肽的氨基酸序列，优选具有下述序列(1)～(14)中的任一者，进一步优选具有下述序列(1)、(2)、(13)或(14)。在下述氨基酸序列(1)～(14)中，(Xaa2)表示赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，优选表示赖氨酸残基，(Xaa2)优选用交联剂修饰，(Xaa1)和(Xaa3)均表示同半胱胺酸残基。另外，在以下的氨基酸序列(1)～(14)中，除(Xaa1)、(Xaa2)和(Xaa3)之外的氨基酸用单文字简写来表述。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:5)
(2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)
(3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(SEQ ID NO:7)
(4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)
(5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:9)
(6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:10)
(7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:11)
(8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:12)
(9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(SEQ ID NO:13)
(10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:14)
(11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:15)
(12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:16)
(13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:17)
(14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(SEQ ID NO:18)
上述式(i)或(i)’所示的肽或者具有序列(1)～(14)的肽优选向N末端导入有接头(L)，且C末端被酰胺化。另外，这些肽的Xaa2(或者与Xaa2相当的部分)用交联剂修饰，由此，能够借助交联剂使肽与抗EGFR抗体的Fc区域进行共价键合。在式(i)’中，与Xaa2相当的部分为Xaa1’。
只要是本领域技术人员，就可以适当选择交联剂，可以制成具有至少2处能够与期望的氨基酸(例如赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸、以及精氨酸等)键合的部位的化合物。作为其例子，没有限定，可列举出DSG(disuccinimidylglutarate、双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、双琥珀酰亚胺辛二酸酯)等优选包含2个以上琥珀酰亚胺基的交联剂；DMA(dimethyl adipimidate·2HCl、己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DMS(dimethyl suberimidate·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等优选包含2个以上亚氨酸部分的交联剂；以及DTBP(dimethyl 3,3’-dithio bispropionimidate·2HCl、3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯))等具有SS键的交联剂；SBAP(3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚胺酯)。DSS或DSG等包含琥珀酰亚胺基的交联剂与存在于N末端的伯胺发生反应，因此，在封闭N末端后再与DSS或DSG发生反应，由此，能够用DSS或DSG特异性地仅修Xaa2的氨基。例如，可以在向抗体修饰肽的N末端预先导入接头(L)后，再与DSS或DSG发生反应。DSS或DSG的琥珀酰亚胺基通过与作为抗EGFR抗体的例如西妥昔单抗中的依据Eu编号的Lys248残基或Lys250残基发生反应，优选与Lys250残基发生反应，与例如帕尼单抗中的依据Eu编号的Lys244残基或Lys246残基发生反应，优选与Lys246残基发生反应，从而位点特异性地用肽修饰抗EGFR抗体。这些Lys残基存在于人IgG中的Fc区域，即便是除西妥昔单抗之外的抗EGFR抗体，只要是本领域技术人员，就可以比对抗体的氨基酸序列并确定相应的Lys残基。
(1-5)接头(L)
接头(L)只要是在本发明的放射性复合物中能够将螯合剂与肽连接的接头即可，没有特别限定。本发明中使用的接头(L)只要不包含硫脲键即可，没有特别限定，可列举出取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖链、二硫醚基、酰胺基、以及它们的组合等。
本说明书中，接头(L)是指在用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的连接中使用的接头的统称，是包括抗体修饰接头(L1)和螯合接头(L2)在内的术语。抗体修饰接头(L1)详见后述，其是向(1-4)中说明的肽的N末端侧导入的接头，螯合接头(L2)也详见后述，其是向(1-3)中说明的螯合剂的官能团中导入的接头。
本发明中使用的接头(L)可以包含通过点击反应而形成的结合部位，抗体修饰接头(L1)与螯合接头(L2)优选通过点击反应而结合。本发明中，优选在通过点击反应而形成的结合部位与螯合剂之间不含硫脲键。换言之，螯合接头(L2)优选不含硫脲键。此处，可以认为通过点击反应而形成的结合部位优选为下述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或下述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
[化10]
式(10a)和式(10b)中，R1A表示与螯合剂的连接部位，R2A表示与抗体修饰肽的连接部位。式(10c)中，R3A和R4A中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与螯合剂的连接部位，R5A表示与抗体修饰肽的连接部位。在式(10a)、式(10b)和式(10c)中，与抗体修饰肽的连接部位经由抗体修饰接头(L1)而与肽连接，与螯合剂的连接部位经由螯合接头(L2)而与螯合剂连接。
本发明的放射性复合物位点特异性地用肽修饰抗体，肽与螯合剂经由接头(L)连接，因此，使1分子或2分子的螯合剂与1分子的抗EGFR抗体复合化。
(1-6)复合物的制造方法
本发明的放射性复合物的制造方法中，可以由下述的两个工序进行制造：偶联工序，将螯合剂与抗EGFR抗体进行偶联；以及络合物形成工序，形成放射性金属同位素与螯合剂的络合物。偶联工序可以在络合物形成工序之前，也可以在络合物形成工序之后。
在偶联工序中，具有前述式(i)所示的抗体修饰肽的螯合剂或接头(L)位点特异性地修饰抗体的Fc区域。
在络合物形成工序中，使放射性金属同位素螯合于螯合剂(形成络合物)。从提高络合物形成效率的观点出发，此处使用的放射性金属同位素优选以能够电离的方式来使用，进一步优选以离子方式来使用。络合物形成工序只要能够与放射性金属同位素形成络合物即可，向螯合剂中添加放射性金属同位素的顺序没有限定。例如，可以将在以水为主体的溶剂中溶解有放射性金属离子的溶液用作放射性同位素。
在形成络合物后，可以使用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等对所得络合物进行纯化。
本发明的放射性复合物的制造方法中，优选在络合物形成工序之后实施偶联工序。
在更优选的方式中，在络合物形成工序(A)中，在放射性金属同位素与螯合剂之间形成络合物，所述螯合剂具有能够发生点击反应的第一原子团作为用于能够与抗体复合化的取代基。接着，在偶联工序(B)中，在肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物形成的螯合剂之间实施点击反应，得到本发明的放射性复合物，所述肽修饰抗体是使用具有前述式(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头(L1)位点特异性地修饰Fc区域而得到的。
以下，针对工序(A)和(B)进行详述。
作为能够发生点击反应的第一原子团与第二原子团的组合，根据点击反应的种类来选择适当的组合，可列举出例如炔烃与叠氮的组合、1,2,4,5-四嗪与烯烃的组合等。这些原子团只要第一原子团具有上述原子团的组合之中的一者且第二原子团具有上述原子团的组合之中的与第一原子团不同的一种原子团即可。从兼顾螯合剂和抗体的稳定性和它们的结合效率的提高的观点出发，优选的是：螯合接头(L2)为炔烃且抗体修饰接头(L1)为叠氮，或者，螯合接头(L2)为1,2,4,5-四嗪且抗体修饰接头(L1)为烯烃。作为基于这种原子团的组合的点击反应的具体例，可列举出Huisgen环化加成反应或反电子需求型Diels-Alder反应等。
能够能够发生点击反应的原子团的组合的具体例，如下式所示那样，可列举出：包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团(式(1a))与包含叠氮基作为第二原子团的叠氮的原子团(式(2a))的组合、或者、作为第一原子团的包含1,2,4,5-四嗪的原子团(式(1b))与包含反式环辛烯(TCO)作为第二原子团的烯烃的原子团(式(2b))的组合。优选为式(1a)与式(2a)的组合。
[化11]
(1a)(2a)/>
式(1a)中，R1表示与螯合剂的连接部位，式(2a)中，R2表示与抗体修饰肽的连接部位。
[化12]
(1b)(2b)/>
式(1b)中，R3和R4之中的一者表示与螯合剂的连接部位或者与抗体修饰肽的连接部位，另一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基。式(2b)的原子团与螯合剂连接时，R5表示与抗体修饰肽的连接部位，式(2b)的原子团与抗体修饰肽连接时，R5表示与螯合剂的连接部位。
使用上述式(1a)所示的包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团时，可列举出市售的各种DBCO试剂。具体而言，可以选择例如DBCO-C6-酸、二苄基环辛炔-胺、二苄基环辛炔马来酰亚胺、DBCO-PEG-酸、DBCO-PEG-醇、DBCO-PEG-胺、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基罗丹明-PEG-DBCO、磺基罗丹明-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-马来酰亚胺、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，优选使用二苄基环辛炔马来酰亚胺。
在络合物形成工序(A)中，更优选使用具有下述式(ii)所示结构的化合物。
A-B-C…(ii)
式(ii)中，A为前述螯合剂，B与C的统称为螯合接头(L2)。
式(ii)中，B用下述式(iib)表示。
[化13]
(iib)
式(iib)中，La和Lb独立地是至少包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，t为0以上且30以下的整数，s为0或1，*为与A的结合部位，**为与C的结合部位。
式(ii)中，C为下述式(iic)所示的炔烃衍生物或式(iid)所示的四嗪衍生物中的任一者。
[化14]
(iic)
式(iic)中，X为CHRk-**或N-**，Y为CHRk或C＝O，Rk独立地为氢原子或者碳原子数1以上且5以下的烷基，在X为CHRk-**且Y为CHRk的情况下，Rk部分任选一同形成环烷基，Rf、Rg、Rh和Ri独立地为氢原子、卤素原子、碳原子数1以上且5以下的烷基，Rf与Rg任选一同形成烃环，或者，Rh与Ri任选一同形成烃环，**表示与B的结合部位，式(iid)中，**表示与B的结合部位，Rj表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基。
作为工序(A)中使用的螯合剂，更优选为上述式(A)中的R11～R14为-(CH2)pCOOH、p为1、R15为与B的结合部位的DOTA衍生物；或者，R11～R14为-(CH2)pCOOH、p为1、R12为与B的结合部位(*)、R15为氢原子的DO3A衍生物；或者DOTAGA衍生物中的任一者。
式(ii)中，在A为上述DO3A的情况下，B优选为下述DO3A-PEGt-DBCO，其中，La为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
式(ii)中，在A为上述DOTAGA衍生物的情况下，B优选为下述DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。更优选为下述的DOTAGA-DBCO。
[化15]
螯合剂与放射性金属同位素的摩尔比率以螯合物部/放射性金属同位素计，下限优选为10/1以上，更优选为100/1以上，进一步优选为500/1以上，上限优选为10000/1以下，更优选为8000/1以下，进一步优选为7000/1以下，例如，优选为100/1以上且7000/1以下的范围，更优选为500/1以上且7000/1以下的范围。
络合物形成反应优选在溶剂中进行。作为溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES缓冲液)或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。
溶剂的液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点出发，在工序(A)开始时，下限为0.01mL以上、优选为0.1mL以上、更优选为1.0mL以上、进一步优选为10mL以上、更进一步优选为100mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1.0mL以下，例如为0.01mL以上且100mL以下的范围。
关于络合物形成反应的反应液中的螯合剂的浓度，从作为目标的螯合剂的收率的观点出发，在工序(A)开始时，下限各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更优选为1μmol/L以上，上限各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下、进一步优选为10μmol/L以下，可列举出例如1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
作为络合物形成反应的温度，例如可以为室温(25℃)，也可以为在加热条件下，从兼顾螯合剂的分解抑制和络合物的形成效率提高的观点出发，下限优选为20℃以上、更优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上、更进一步优选为37℃以上、特别优选为45℃以上，上限优选为150℃以下、更优选为120℃以下、进一步优选为100℃以下、更进一步优选为90℃以下，例如优选为30℃以上且100℃以下的范围，更优选为35℃以上且90℃以下的范围。
工序(B)中使用的抗体是使用具有前述式(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头(L2)，位点特异性地修饰在上述“(1-2)抗体”一项中详述的抗EGFR抗体的Fc区域(恒定区)而得到的肽修饰抗体。
抗体修饰肽可通过组合使用氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸均可)，并供于例如液相合成法、固相合成法、自动肽合成法、基因重组法和噬菌体展示法等肽合成法来制造。在肽的合成中，根据需要可以进行所使用的氨基酸的官能团的保护。它们可按照例如国际公开第2017/217347号和国际公开第2018/230257号中记载的方法来进行。
抗体修饰接头(L2)可以为抗体修饰肽与下述式(S1)所示的接头(L2)结合而成的接头。
*-((Li)m-Z)k-Lii-AG2…(S1)
(式中，*表示与肽的N末端或C末端的结合部位，
Li为聚乙二醇(PEG)接头部，
m为1以上且50以下的整数，
Z为将(Li)m与Lii键合的第二接头部，
k为0或1，
Lii为第二PEG接头部，
AG2为第二原子团)。
在前述式(S1)中，Z的结构只要是将(Li)m与Lii彼此键合的接头结构即可，没有特别限定，可以包含例如由1个以上且5个以下的氨基酸残基构成的氨基酸序列。在该情况下，Z中包含的氨基酸序列优选包含半胱氨酸残基，更优选为借助通过半胱氨酸残基的硫醇基与马来酰亚胺基的键合而形成的硫醚基，与L2进行键合。
本发明中，构成Lii的聚乙二醇(PEG)接头部优选具有下述式(P2)所示的结构。在式(P2)中，n为整数，优选为1以上且50以下，更优选为1以上且20以下，进一步优选为2以上且10以下，更进一步优选为2以上且6以下。
[化16]
(P2)
PEG接头部的结构的一端可以用来自市售的PEG化试剂的结构或者来自在PEG化时通常使用的试剂的结构进行修饰，没有特别限定，可例示出例如来自二甘醇酸或其衍生物、马来酰亚胺或其衍生物的结构。
向抗体修饰接头(L2)中导入前述第二原子团的方法可列举出下述方法：通过上述方法而得到具有期望的氨基酸序列的抗体修饰肽后，将该肽溶解于添加有溶解辅助剂和还原剂、以及根据需要的酸的溶液中，向该溶液中添加作为第二原子团的包含叠氮基或反式-环辛烯(TCO)的原子团的有机溶剂溶液，并在室温下进行搅拌来导入。
在导入包含叠氮基的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用市售的叠氮基导入试剂，并按照常规方法向肽的N末端或C末端直接导入叠氮基；或者，借助上述接头结构来导入包含叠氮基的原子团。作为所使用的叠氮基导入试剂，可列举出例如甲硅烷基叠氮化物、磷酸叠氮化物、烷基铵叠氮化物、无机叠氮化物、磺酰基叠氮化物或PEG叠氮化物等。
另外，在导入包含TCO的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用包含TCO的市售的点击化学用试剂，并按照常规方法，向肽的N末端或C末端直接导入TCO；或者，经由上述接头结构来导入包含TCO的原子团。
使抗体修饰肽与抗EGFR抗体进行结合而得到肽修饰抗体的方法可按照国际公开第2017/217347号的记载，使例如上述抗体修饰肽、抗EGFR抗体、交联剂和根据需要的催化剂分散至适当的缓冲液中来进行。此处，交联剂可以使用上述交联剂。另外，在使抗体修饰肽与抗EGFR抗体进行结合时，根据需要可以在实施1次或2次以上的将包含抗EGFR抗体的溶液用超滤过滤器等进行处理并使其分散至缓冲液中的缓冲液置换后，再与抗体修饰肽结合。
在一个方式中，本申请涉及生产抗体修饰肽与抗EGFR抗体的复合物的方法，其包括将用交联剂修饰的抗体修饰肽与抗EGFR抗体混合的工序。通过该工序，能够在用交联剂修饰的抗体修饰肽与抗EGFR抗体之间发生交联反应。例如，关于西妥昔单抗，交联反应能够在抗体修饰肽的上述Xaa2的氨基酸残基与人IgG Fc中的依据Eu编号的Lys248残基或Lys250残基、优选与Lys250残基之间位点特异性地发生，例如，关于帕尼单抗，交联反应能够在抗体修饰肽的上述Xaa2的氨基酸残基与人IgG Fc中的依据Eu编号的Lys244残基或Lys246残基、优选与Lys246残基之间位点特异性地发生。
关于该混合工序的条件，只要在抗体修饰肽与抗EGFR抗体之间发生交联反应的条件下进行即可，没有特别限定。例如，通过将抗体修饰肽与抗EGFR抗体在适当的缓冲液中在室温(例如约15℃～30℃)下混合，从而能够进行反应。该混合工序根据需要可以添加适量促进交联反应的催化剂来进行。
作为一例，至少添加包含水的溶剂而将抗EGFR抗体溶解。该溶剂除水之外，可列举出例如二甲基亚砜、乙腈、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、四甲基乙酸铵缓冲液或组氨酸缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从抗体稳定性的观点出发，25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、更优选设为5.5以上且8.5以下。关于抗体的浓度，在交联反应开始时，优选将下限设为1.0μmol/L以上且将上限设为1000μmol/L以下，关于上限，更优选设为500μmol/L以下。
接着，可以添加用交联剂修饰的抗体修饰肽和根据需要的催化剂，使其在10℃以上且30℃以下发生分散来进行。
该混合工序中的抗体修饰肽与抗EGFR抗体的混合比率没有特别限定。抗体修饰肽与抗EGFR抗体的摩尔比率例如可以设为1:1～20:1、优选设为2:1～20:1或5:1～10:1。
在某个优选方式中，在上述混合工序中，可以以抗体修饰肽相对于抗EGFR抗体(摩尔比)为0.5～2.2、优选为0.8～1.8来进行混合。通过这样操作，从而能够高效地获得相对于1分子抗EGFR抗体键合有1分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“一价抗体”)。
该混合工序中的混合时间(反应时间)只要在抗体修饰肽与抗EGFR抗体之间发生交联反应即可，没有限定，例如可以设为1分钟～5小时，优选设为10分钟～2小时。
历经上述工序而得到的肽修饰抗体是以任意比例含有相对于1分子抗EGFR抗体键合有1分子抗体修饰肽的抗体(即，一价抗体)以及相对于1分子抗EGFR抗体键合有2分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“二价抗体”)的混合物，可以将其直接供于后续工序，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、各种色谱等方法对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化后，仅将任意价数的抗体供于后续工序。经纯化的结果，在未修饰抗体与其它价数的抗体无法分离的情况下，可以以含有它们的混合物的形式供于之后的工序。
在对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化的情况下，可以利用上述的任意纯化方法进行分离纯化，可以使用填充有各种填充剂的柱，可以使用例如填充有蛋白质A、蛋白质G或上述抗体修饰肽等蛋白质键合于载体而得到的填充剂的柱。作为向这种柱中填充的填充剂的载体的形状，可列举出凝胶(例如柱用凝胶)、颗粒、珠、纳米颗粒、微粒和大珠等形状，作为载体的材质，可列举出磁性物质、胶乳、琼脂糖、玻璃、纤维素、Sepharose、硝基纤维素、聚苯乙烯、其它高分子材料。具体而言，可例示出使上述抗体修饰肽结合于柱用凝胶而得到的IgG-BP柱(国际公开第2021/080008号)。
IgG-BP柱是将IgG结合肽固相化而得到的柱。由于二价抗体的结合部位已被IgG结合肽占有，因此无法与该柱结合，仅一价抗体对该柱显示亲和性。使用该IgG-BP柱，利用各自对抗体修饰肽的相互作用的不同，可分别分离纯化包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物和包含相对较多的二价抗体的第二抗体组合物。在某个优选方案中，在第一抗体组合物中，未修饰抗体与一价抗体的摩尔比为4～47:53～96、优选为4～30:70～96、更优选为4～20:80～96、进一步优选为4～10:90～96。
如此操作，经分离纯化的第一抗体组合物或第二抗体组合物可以直接用于随后的工序(B)中的点击反应，也可以在调节所含有的肽修饰抗体的蛋白质浓度后，再用于工序(B)中的点击反应。
工序(B)中的点击反应是在螯合剂所具有的能够进行点击反应的第一原子团与肽修饰抗体所具有的能够进行点击反应的第二原子团之间实施的。通过该点击反应，形成将螯合剂与抗体连接的键合基团(能够与抗体复合化的取代基)。
只要肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物能够进行点击反应即可，对它们的添加顺序没有限定，例如，可以向收纳有溶剂的反应容器内添加该络合物和该肽修饰抗体中的一者，接着添加另一者并使其反应，也可以在将该螯合剂和该抗体中的一者分散于溶剂而得到的分散液中添加另一者并使其反应。或者，可以向收纳有溶剂的反应容器内同时添加它们并使其反应。
作为在工序(B)的点击反应中使用的溶剂，可以使用包括水在内的溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从兼顾络合物和抗体的稳定性以及它们的结合效率的观点来看，将25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、进一步优选设为5.5以上且8.5以下。
反应液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点来看，在工序(B)开始时，下限优选为0.001mL以上、更优选为0.01mL以上、进一步优选为0.1mL以上、更进一步优选为1mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1mL以下，例如优选为0.001mL以上且1000mL以下的范围、更优选为0.1mL以上且10mL以下的范围。
另外，关于螯合剂和抗体在反应液中的浓度，在工序(B)开始时，作为下限，各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更进一步优选为1.0μmol/L以上，作为上限，各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下，例如优选为0.1μmol/L以上且1000μmol/L以下的范围，从作为目标的复合物的收量的观点出发，更优选为1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
从防止抗体的不希望的变性且提高反应效率的观点来看，关于工序(B)中的点击反应，反应温度的上限优选为50℃以下、更优选为40℃以下。另外，反应温度的下限只要是发生反应的温度即可，没有特别限定，优选为15℃以上。点击反应的反应时间以上述反应温度为条件，优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上，且优选为24小时以下、更优选为20小时以下，例如优选为5分钟以上且24小时以下的范围、更优选为10分钟以上且20小时以下的范围。
所得到的复合物可以直接使用，或者，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等进行纯化。
通过工序(A)和(B)而制造的复合物是抗EGFR抗体的Fc区的赖氨酸残基用螯合剂特异性修饰而得到的复合物。该复合物中，相对于1分子的该抗体，具备1分子或2分子的前述螯合剂。螯合剂经由接头(L)位点特异性地修饰本发明的抗体的Fc区。该接头(L)由与螯合剂连接的螯合接头(L2)、与该接头(L2)连接的第一原子团、能够与第一原子团进行点击反应的第二原子团、与第二原子团连接的抗体修饰接头(L1)(包含上述式(i)所示的抗体修饰肽)构成。因此，该接头(L)具有来自第一原子团和第二原子团的化学结构。作为这种化学结构，可以考虑前述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或前述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。由于式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
(1-7)放射性药物(放射性药物(1))
放射性药物是指包含本发明的放射性复合物且制成适合向对象生物体内给药的形态的组合物。放射性药物例如可以将按照上述(1-6)所示的方法而制造的放射性复合物直接溶解或者将其纯化后溶解于以水为主体且与生物体等渗的溶剂来制造。在该情况下，放射性药物优选为水溶液的形态，根据需要可以包含药学上可接受的其它成分。放射性药物以口服或静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内等非口服的方式对生物体给药有效量，其用于癌症的治疗、癌症的诊断或病灶的检测等。
这里，作为给药对象，有人或小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、绵羊、山羊、狗、猫、猪、牛或马等动物，没有特别限定。优选为人。
作为优选的对象疾病，可列举出EGFR过度表达的癌症。利用本发明进行治疗、诊断或检测的EGFR过度表达的癌症只要是EGFR过度表达即可，其种类没有特别限定，可列举出例如结肠/直肠癌(尤其是RAS基因野生型的无法治愈切除的进行/复发性的癌)、头颈癌。另外，EGFR过度表达的癌症可以是任何病期的癌症，可以为局限性或转移性、或者原发性或复发性中的任一者。此处，“过度表达”是指：在利用公知的检查方法进行测定的情况下，观察到肿瘤组织中的EGFR基因与非肿瘤组织相比明显扩增或者EGFR蛋白质的表达与非肿瘤组织相比明显亢进的状态。
此处的“有效量”是指在给药对象的诊断方面或治疗方面能够获得有效效果的量。应该对对象给药的有效量因对象的种类、对象的体重、给药的剂型(片剂、注射剂等)和途径(口服给药、非口服给药等)、以及疾病(例如癌症)的严重程度等而异。医生或兽医可考虑这些因素来确定适当的有效量。
本发明的放射性药物在室温下保管时，以构成其放射性药物的放射性金属同位素的半衰期为基准计，在经过半衰期的1倍以上且5倍以下的期间的时间点，具有规定比例以上的放射化学纯度。在上述放射性金属同位素为β射线核素(例如，Lu-177或Y-90)时，优选在室温下从制造结束起保管7天时的复合物的放射化学纯度为90％以上，更优选为93％以上。另外，在放射性金属同位素为α射线核素(例如，Ac-225)时，优选在室温下从制造结束起保管14天时的复合物的放射化学纯度为90％以上、更优选为94％以上。此处，本说明书中的“室温”优选是指日本药典中定义的“常温”，具体是指15～25℃。
此处，放射化学纯度是指：在利用市售的放射线检测器对试样进行分析的情况下，相当于复合物的峰的放射能(计数)相对于所检测到的总放射能(计数)的百分率。在放射化学纯度分析中可以采用高效液相色谱或薄层色谱，优选利用薄层色谱。更优选采取利用后述实施例中记载的条件进行的薄层色谱。
如上所述，本发明的放射性药物优选为水溶液的形态，如上那样从维持放射化学纯度的观点出发，更优选为缓冲液的形态。作为缓冲液，可以使用在含有抗EGFR抗体或抗EGFR抗体的ADC作为有效成分的抗体药物中使用的任意缓冲液，没有特别限定，作为一例，可以使用柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液。柠檬酸缓冲液由柠檬酸及其盐构成，例如，可以由柠檬酸及其钠盐构成。乙酸缓冲液由乙酸及其盐构成，例如，可以由乙酸及其钠盐构成。本发明的放射性药物中，可以包含甘氨酸等任意的氨基酸，也可以包含聚山梨酯80等增溶剂。
作为放射性金属同位素，通过选择具有治疗效果的核素、具体而言，选择发射α射线的放射性同位素或发射β射线的核素(优选为Ac-225、Y-90、Lu-177，更优选为Ac-225)，从而本发明的放射性药物可用于癌症的放射线内用疗法。在该放射线内用疗法中，可通过静注或口服给药本发明的放射性药物，从而能够使本发明的放射性复合物聚集于癌原发灶或转移灶那样的病灶部位，利用由放射性金属同位素发射的放射线破坏病灶部位的癌细胞。本发明的放射性药物的给药量、剂量根据有效成分的有效性、给药的方式/途径、癌症的进展阶段、患者的体型/体重/年龄、并用的其它疾病的治疗药的种类或量来适当选择。
另外，作为放射性金属同位素，通过选择发射正电子的放射性同位素、发射γ射线的放射性同位素(优选为Ga-68、Zr-89、In-111，更优选为Zr-89)，从而可用于癌症的诊断或病灶的检测。在使用发射正电子的放射性同位素的放射性药物的情况下，可适合地用于PET(Positron Emission Tomography：正电子发射断层成像术)检查，在使用发射γ射线的放射性同位素的放射性药物的情况下，可适合地用于SPECT(Single Photon EmissionComputed Tomography：单光子发射计算机断层成像术)检查。可以将其与上述癌症的放射线内用疗法中的癌症的诊断或病灶的检测加以并用。本发明的癌症诊断用放射性药物可用于癌症的进行放射线内用疗法之前的诊断，也可以用于癌症的进行放射线内用疗法之后的诊断。通过用于癌症的进行放射线内用疗法之前的诊断，从而可用于判断是否执行使用具备发射α射线的金属核素的本发明的放射性药物进行的癌症的放射线内用疗法的治疗选择。另外，通过用于癌症的进行了放射线内用疗法之后的诊断，从而可用于判定使用本发明的放射性药物进行的癌症的放射线内用疗法是否具有效果或者给药量的增减等治疗计划的适当化。
(2)放射性药物(放射性药物(2))
本发明的其它方式是：含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，以在室温下保管时构成该放射性药物的放射性金属同位素的半衰期为基准计，在经过半衰期的1倍以上且5倍以下的期间的时间点，具有规定比例以上的放射化学纯度。在上述放射性金属同位素为β射线核素(例如，Lu-177或Y-90)时，优选在室温下从制造结束起保管7天时的前述复合物的放射化学纯度为90％以上，更优选为93％以上。另外，当放射性金属同位素为α射线核素(例如，Ac-225)时，优选在室温下从制造结束起保管14天时的复合物的放射化学纯度为90％以上，更优选为94％以上。室温的定义与上述放射性药物(1)相同。
在放射性药物(2)中，在螯合剂与抗EGFR抗体的复合化中，除使用了肽的位点特异性修饰的方法以外，也可以采用下述(a)～(d)的方法，除此以外，与放射性药物(1)相同，因此省略说明。
方法(a)：利用具有对SH基具有反应性的马来酰亚胺基的螯合剂或接头(L)，对通过将位于抗体的关键部位的多肽链之间的二硫醚键(SS键)进行部分还原而产生的巯(SH)基进行修饰；
(b)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的半胱氨酸，修饰具有马来酰亚胺基的螯合剂或接头(L)的方法；
(c)对于通过基于基因工程学的氨基酸变异而向抗体中新导入的叠氮化赖氨酸的叠氮基，利用点击反应来修饰具有炔烃(例如二苯并环辛炔：DBCO)的螯合剂或接头(L)的方法
(d)对于利用转谷氨酰胺酶向抗体的特定位置导入的谷氨酰胺，修饰具有赖氨酸的侧链的螯合剂或接头(L)的方法。
本发明中，对抗EGFR抗体进行位点特异性修饰的肽与螯合剂不使用硫脲键地进行连接，因此，能够制成即便在室温下也稳定的放射性复合物和放射性药物。抗体的位点特异性修饰不同于随机修饰，可按任意的比例包含一价抗体或二价抗体或这两者，因此，形成品质稳定的放射性复合物和放射性药物。另外，本发明的放射性复合物维持与以往同等的药效。因此，根据本发明，可提供维持药效且品质更优异的抗EGFR抗体的复合物及其放射性药物。
本发明的技术思想中还包括以下方案。
[1]复合物，其是位点特异性地用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的复合物，
放射性金属同位素螯合于前述螯合剂，
前述肽与螯合剂经由接头(L)连接，前述接头(L)不含硫脲键。
[2]根据[1]所述的复合物，其中，前述螯合剂为DOTAGA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
[3]根据[1]或[2]所述的复合物，其中，前述肽为下述式(i)所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
(式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，并且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基或者来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，其中，Xaa1和Xaa3中的任一者为来自具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基；
Xaa1和Xaa3通过连接而形成环结构；
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，并且，Xaa2用交联剂修饰)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的复合物，其中，前述放射性金属同位素为Ac-225、Y-90、Lu-177或Zr-89。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的复合物，其中，前述接头(L)包含式(10a)、式(10b)或式(10c)。
[化17]
(式(10a)和式(10b)中，R1A表示与前述螯合剂的连接部位；R2A表示与前述肽的连接部位，式(10c)中，R3A和R4A之中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与前述螯合剂的连接部位；R5A表示与前述肽的连接部位)。
[6]根据[5]所述的复合物，其中，在与前述肽的连接部位与前述肽之间包含聚乙二醇基。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的复合物，其中，通过使抗EGFR抗体与下述式所示的DOTAGA-DBCO的放射性金属络合物发生点击反应而复合化，所述抗EGFR抗体用在N末端上导入有叠氮基的前述肽进行位点特异性修饰。
[化18]
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的复合物，其中，前述抗EGFR抗体为西妥昔单抗。
[9]根据[1]～[7]中任一项所述的复合物，其中，前述抗EGFR抗体为帕尼单抗。
[10]放射性药物，其含有[1]～[9]中任一项所述的复合物作为有效成分。
[11]根据[10]所述的放射性药物，其用于癌症的放射线内用疗法。
[12]根据[10]所述的放射性药物，其用于癌症的诊断。
[13]根据[12]所述的放射性药物，其与使用了[11]所述的放射性药物的癌症的放射线内用疗法并用。
[14]放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，
在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，
所述放射性药物在室温下保管7天时的前述复合物的放射化学纯度为90％以上。
[15]根据[14]所述的放射性药物，其中，前述复合物为[1]～[9]中任一项所述的复合物。
[16]根据[15]所述的放射性药物，其用于癌症的放射线内用疗法。
[17]根据[15]所述的放射性药物，其用于癌症的诊断。
[18]根据[17]所述的放射性药物，其与使用了[16]所述的放射性药物的癌症的放射线内用疗法并用。
[19]放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，
在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，
所述放射性药物满足下述(1)或(2)的条件：
(1)前述放射性金属同位素为177Lu或90Y，在室温下保管7天时的前述复合物的放射化学纯度为90％以上。
(2)前述放射性金属同位素为225Ac，在室温下保管14天时的前述复合物的放射化学纯度为90％以上。
[20]放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，
在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，
以前述放射性金属同位素的半衰期为基准计，在经过前述半衰期的1倍以上且5倍以下的期间的时间点，前述复合物的放射化学纯度为90％以上。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明。然而，本发明的范围不限定于这些实施例。以下的表中，“-”栏表示未实施。
[实施例1]使用225Ac标记DOTAGA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
(1.抗体修饰工序)
按照国际公开第2017/217347号中记载的方法，得到下述式(P3)(SEQ ID NO:19)所示的包含17个氨基酸残基的肽。该肽的氨基酸序列与序列(2)的Xaa2为赖氨酸残基的序列相同，赖氨酸残基的侧链末端氨基用R1所示的结构修饰。另外，两个半胱氨酸残基彼此进行二硫醚键合，肽的N末端经由具有二甘醇酸和8个PEG的接头(L1)结构而键合有乙基叠氮来作为原子团，所述原子团包含作为第二原子团的叠氮基。
[化19]
(式(P3)中，Gly表示甘氨酸，Pro表示脯氨酸，Asp表示天冬氨酸，Cys表示半胱氨酸，Ala表示丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，His表示组氨酸，Lys表示赖氨酸，Glu表示谷氨酸，Leu表示亮氨酸，Val表示缬氨酸，Trp表示色氨酸，Thr表示苏氨酸，Phe表示苯丙氨酸)。
针对含有西妥昔单抗(默克公司制)的溶液，使用添加有0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0)的超滤过滤器(アミコンウルトラ-15)进行缓冲液置换。将该操作反复2次。
使将上述肽和缓冲液置换的西妥昔单抗混合至0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0)而得到的混合液在室温下反应30分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体位点特异性地用上述肽修饰抗体的Fc区域。
接着，对IgG-BP柱通液，得到包含相对于较多的未标记抗体和一价抗体的第一抗体组合物。以回收的级分中包含的一价抗体的浓度成为15mg/mL的方式，用含有0.1mol/L氯化钠和0.1mol/L甘氨酸的0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.5)调整浓度。将所得包含第一抗体组合物的溶液供于后述标记工序。
(2.络合物形成工序)
根据Bernhard等人的DOTAGA-Anhydride：A Valuable Building Block for thePreparation of DOTA-Like Chelating Agents.Chem.Eur.J.2012,18,7834-7841中记载的方法，制造下述式所示的DOTAGA-DBCO。使该螯合剂分散于作为溶剂的0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)，制成包含螯合剂1.7mmol/L的分散液。使将该分散液0.01mL、0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)0.15mL和作为放射性金属源的含有225Ac离子的溶液(0.2mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为358MBq/mL、由Oak Ridge National Laboratory制进行制备、液量为0.01mL)约3.6MBq(检验日时根据放射能量进行衰减计算而得到的计算值)混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到225Ac络合物溶液。螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:225Ac离子＝约2290:1，反应液的加热温度设为70℃，加热时间设为30分钟。
[化20]
利用下述方法测定所得225Ac络合物的放射化学纯度(RCP)。即，将一部分225Ac络合物溶液用薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂：乙腈/水混合液(体积比为1:1))展开，其后，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star)进行测定。将在原点附近检测到的峰的放射能(计数)相对于检测到的总放射能(计数)的百分率设为225Ac络合物的RCP(％)。其结果，225Ac络合物的RCP为91％。将所得225Ac络合物溶液直接用于标记工序。
(3.标记工序)
向历经上述工序(2)而得到的未纯化状态的225Ac络合物的溶液中添加上述工序(1)中得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液，在37℃下使其进行120分钟的点击反应，得到225Ac络合物标记抗体。225Ac络合物的量和肽修饰抗体(一价抗体)的量分别为17nmol和20nmol，DBCO基与叠氮基的摩尔比分别为约1:1.2。将未纯化时的225Ac络合物标记抗体的反应率(％)示于以下的表1。此处，反应率(％)是指相对于络合物形成工序中的标记率(％)而言的225Ac络合物标记抗体的RCP，标记率(％)是指225Ac络合物的放射能量相对于投料放射能量的比例(％)。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的225Ac络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。将纯化后的225Ac络合物标记抗体的RCP和放射化学的收率(RCY)示于以下的表1。
225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY的测定方法如下所示。即，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star)，对薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂为乙腈:0.1mmol/LEDTA溶液的混合液(体积比为1:1))进行测定，将在原点附近检测到的峰的放射能(计数)相对于相对于检测到的总放射能(计数)的百分率设为RCP(％)。另外，将超滤纯化后回收到的放射能(与上述同样地根据利用γ射线光谱仪而测得的计数进行计算而得到的放射能量)相对于在标记工序开始时施加的总放射能(根据利用γ射线光谱仪(Ge半导体检测器：GMX10P4-70(ORTEC公司制)、多通道分析仪：M7-000(Seiko EG&G公司制)、数据处理：Spectrum Navigator：DS-P300(Seiko EG&G公司制)和Gamma Studio：DS-P600(Seiko EG&G公司制))而测得的计数进行计算而得到的放射能量)的百分率设为RCY(％)。
[表1]
[比较例1]使用225Ac标记DOTA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
除了将DOTAGA-DBCO变更为下述DOTA-DBCO之外，按照实施例1来进行操作。将结果示于表2。
[化21]
[表2]
[实施例2]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
(1.络合物形成工序)
使DOTAGA-DBCO分散于作为溶剂的0.195mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.0375mL、作为放射性金属源的含有89Zr离子的溶液(0.1mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为5.2GBq/mL、由日本Medi-Physics公司制进行制备、液量为0.0375mL)195MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到89Zr络合物溶液。螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:89Zr离子＝约85:1，反应液的加热温度设为70℃、加热时间设为60分钟。
利用下述方法测定所得89Zr络合物的RCP。即，将一部分89Zr络合物溶液用薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂：乙腈/水混合液(体积比为1:1))展开，其后，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star PS)进行测定。将在原点附近检测到的峰的放射能(计数)相对于检测到的总放射能(计数)的百分率设为89Zr络合物的RCP(％)。其结果，89Zr络合物的RCP为96％。将所得89Zr络合物溶液直接用于标记工序。
(2.标记工序)
将历经上述工序(1)而得到的未纯化状态的89Zr络合物的溶液以及与实施例1同样操作而得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液在未纯化状态下添加至分别含有0.1mol/L氯化钠和0.1mol/L甘氨酸的0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，在37℃下使其进行90分钟的点击反应，得到实施例2的89Zr络合物标记抗体。89Zr络合物的量和肽修饰抗体(一价抗体)的量分别为11.3nmol和12nmol，DBCO与叠氮的摩尔比分别为约1:1.1。将未纯化时的实施例的89Zr络合物标记抗体的反应率(％)示于以下的表3。此处，反应率(％)是指相对于络合物形成工序中的标记率(％)而言的89Zr络合物标记抗体的RCP，标记率(％)是指相对于投料放射能量而言的89Zr络合物的放射能量(％)。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化。将纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY示于以下的表3。
89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY的测定方法与实施例1同样地进行。
[表3]
[比较例2]使用89Zr标记DOTA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
除了将DOTAGA-DBCO变更为DOTA-DBCO之外，按照实施例2来进行操作。将结果示于表4。
[表4]
[实施例3]使用177Lu标记DOTAGA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
(1.抗体修饰工序)
与实施例1中的抗体修饰工序所记载的方法同样地进行。
(2.络合物形成工序)
DOTAGA-DBCO的制造方法与实施例1同样地进行。使该螯合剂分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，制成包含螯合剂0.45mmol/L的分散液。使将该分散液0.015mL、溶解有0.225mmol/L龙胆酸的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)0.015mL和作为放射性金属源的含有177Lu离子的溶液(0.04mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为3.4GBq/mL，由POLATOM制进行制备、液量为0.0375mL)127MBq混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到177Lu络合物溶液。螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:177Lu离子＝约38:1，将反应液的加热温度设为70℃，将加热时间设为5分钟。
所得177Lu络合物的RCP与实施例1的放射性复合物的RCP测定同样地进行。其结果，177Lu络合物的RCP为100％。将所得177Lu络合物溶液直接用于标记工序。
(3.标记工序)
将历经上述工序(2)而得到的未纯化状态的177Lu络合物的溶液与上述工序(1)中得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液添加至分别含有0.1mol/L氯化钠和0.1mol/L甘氨酸的0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，在37℃下使其进行120分钟的点击反应，得到177Lu络合物标记抗体。177Lu络合物的量和肽修饰抗体(一价抗体)的量分别为6.75nmol和7.5nmol，DBCO基与叠氮基的摩尔比分别为约1:1.1。将未纯化时的177Lu络合物标记抗体的反应率(％)示于以下的表5。
另外，将与实施例1同样地使用超滤过滤器进行纯化后的177Lu络合物标记抗体的RCP和RCY示于以下的表5。
177Lu络合物标记抗体的RCP和RCY的测定方法与实施例1同样地实施。
[表5]
[比较例3]使用177Lu标记DOTA-DBCO来制造其与西妥昔单抗的复合物
除了将DOTAGA-DBCO变更为DOTA-DBCO之外，按照实施例3来进行操作。将结果示于表6。
[表6]
[实施例4]制剂化工序
分别选取一部分按照实施例1、实施例3、比较例1和比较例3的记载而制造的放射性复合物，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)中，用保存缓冲液(含有0.1mol/L氯化钠和0.1mol/L甘氨酸的0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.5)以及含有1.0重量/体积％聚山梨酯80、0.1mol/L氯化钠和0.1mol/L甘氨酸的0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.5)混合液)进行稀释。
[评价1]稳定性评价
将实施例4中得到的各放射性复合物在室温下保管2星期，在各时间点(0天、1天、7天和/或14天)评价RCP和抗原结合活性。需要说明的是，在从制造结束起的7天内，在放射性金属同位素为Lu-177的情况下，相当于约1半衰期，在从制造结束起的14天内，在放射性金属同位素为Ac-225的情况下，相当于约1.5个半衰期，在放射性金属同位素为Lu-177的情况下，相当于约2个半衰期。
[评价1-1]RCP(放射化学纯度)
利用薄层色谱(TLC)对RCP进行分析。TLC的条件设为与在实施例1中调查反应率时使用的条件相同。
将结果示于表7。
[表7]
不含硫脲键且按照实施例1的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了95％以上。另外，在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，也维持了90％以上。
包含硫脲键且按照比较例1的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了90％以上，但低于95％。另外，在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，低于75％。
不含硫脲键且按照实施例3的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了90％以上。另外，在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，也维持了85％以上。
包含硫脲键且按照比较例3的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了75％以上，但低于90％。另外，在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，低于65％。
[评价1-2]抗原结合活性
抗原结合活性利用体外自动射线照相术(ARG)进行确认(仅制造日(0)和保存最终日(14天))。对雌性SCID Beige小鼠(日本チャールス·リバー公司制)的侧腹皮下分别给药5×106cells和2×106cells的由ECACC(European Collection of Authenticated CellCultures)购入的EGFR高表达的人类上皮癌细胞株即A431细胞和自ATCC(American TypeCulture Collection)购入的EGFR低表达的人胃癌细胞株即SNU-16细胞，制作荷瘤小鼠。其后，摘出A431肿瘤和SNU-16肿瘤并包埋于ティシュー·テックO.C.T.复合物(サクラファインテックジャパン公司制)，制作冷冻切片。将实施例1和比较例1中得到的放射性复合物分别以成为1kBq/mL的方式添加至含有1％牛血清白蛋白的PBS中，对A431肿瘤切片和SNU-16肿瘤切片进行浸渍。使切片切出成像板后，利用扫描仪类型的图像分析装置进行读取，评价与切片结合的放射能量。将结果示于图1。
通过利用向各种溶液中添加有西妥昔单抗的溶液，同样地进行评价，从而能够确认各放射性复合物相对于EGFR的特异性。
在保存最终点(14天)，按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物均确认到相对于EGFR的结合活性。按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物对于A431肿瘤切片和SNU-16肿瘤切片均显示出结合，更牢固地接合于A431肿瘤切片，显示出EGFR选择性结合。在添加有西妥昔单抗的溶液中，对于A431肿瘤切片的结合受到抑制，确认到所结合的EGFR特异性。在保存最终点(14天)，全部样品维持了对于EGFR的结合选择性。关于与A431肿瘤切片结合的放射能，使用按照实施例1的记载而制造的放射性复合物得到的样品多于按照比较例1的记载而制造的放射性复合物。
[评价2]体内肿瘤聚集性
按照评价1-2，使用小鼠来制作A431细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例2或比较例2的记载而制造的放射性复合物的肿瘤聚集。
将自ATCC购入的EGFR阳性的人类上皮癌株即A431细胞悬浮于DMEM培养基(gibco、Thermo Fisher Scientific公司制)，向5周龄的雌性BALB/c nu/nu(日本チヤ一ルス·リバ一公司制)的侧腹皮下给药5×106cells，制作荷瘤小鼠。使肿瘤生长至其体积约为100～250mm3为止，以3.7MBq/只(各n＝3)的用量尾静脉内给药按照实施例2或比较例2的记载而制造的放射性复合物。在给药后的96小时后，使用小动物PET成像装置(PET/CT Si78、Bruker公司制)，利用表8的条件来进行拍摄。
将实施PET拍摄的结果的代表例示于图2(实施例2)和图3(比较例2)。与其它脏器相比，放射能以高浓度聚集于肿瘤，能够描绘出EGFR阳性肿瘤。另外，按照实施例2的记载而制造的放射性复合物与按照比较例2的记载而制造的放射性复合物的肿瘤聚集性在视觉上为相同程度，在图2或图3所示的代表例的图像中，设定VOI(关注体积)而对肿瘤进行分析时，按照实施例2的记载而制造的放射性复合物以每单位体积的放射能相对于给药放射能的比例计为5.1％ID/cc(Injected dose/cc)，按照比较例2的记载而制造的放射性复合物为4.6％ID/cc，是相同的程度。
[表8]
| 同位素 | 89-Zr |
| 取数时间 | 600sec |
| 能量窗口 | 30％(357.7-664.3keV) |
| PET图像再构成 | MLEM GPU 32x320.25(Iterations：12) |
| 校正 | Scatter、Randoms、Decay、Partial volume、Attenuation |
[实施例5]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记西妥昔单抗的抗肿瘤效果)
使用小鼠来制作A431的皮下荷瘤模型，确认按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果。
将自ECACC购入的EGFR高表达的人类上皮癌细胞株即A431细胞悬浮于DMEM培养基(gibco、Thermo Fisher Scientific公司制)，在5周龄的雌性BALB/c nu/nu(日本チャールス·リバー社制)的侧腹皮下给药5×106cells来制作荷瘤小鼠。使肿瘤生长至其体积为200～350mm3为止，从适于测定肿瘤直径的形状的个体中随机实施分组。将此时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于表9。肿瘤体积按照下式进行计算。
肿瘤体积(mm3)＝(肿瘤长径×(肿瘤短径)2)×1/2
[表9]
将按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物均以15kBq/只(以西妥昔单抗计为100μg/只)的用量进行尾静脉内给药。另外，作为对照组，设定给药了与各放射能复合物相同抗体量的西妥昔单抗的组(抗体对照组)和给药了保存缓冲液的溶剂对照组。各组设为6只，至给药后的37天为止，经时性地进行一般状态的观察，测量体重和肿瘤体积。将经时性肿瘤体积的变化示于图4，将经时性体重变化示于图5。
给药了按照实施例1和比较例1的记载而制造的放射性复合物的组在给药后的第37天，与两个对照组(抗体对照组、溶剂对照组)相比，抗肿瘤效果确认到显著差异(P<0.05或P<0.01)。在显著差异的检验中，使用统计分析软件Stat Preclinica(インフォメーションテクノロジー公司制)来进行Tukey检验。另外，各组在一般状态下均没有显著变化，未确认到显著的体重减少等毒性征兆。
[实施例6]使用225Ac标记DOTAGA-DBCO来制造其与帕尼单抗的复合物
(1.抗体修饰工序)
按照国际公开第2017/217347号中记载的方法，得到上述(P3)所示的包含17个氨基酸残基的肽。
使将含有上述肽和帕尼单抗(Amgen公司制)的溶液混合至0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0)而得到的混合液在室温下反应60分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体位点特异性地用上述肽修饰抗体的Fc区域。
接着，对IgG-BP柱通液，得到包含相对较多的未标记抗体和一价抗体的抗体组合物。以回收的级分中包含的一价抗体的浓度成为15mg/mL的方式，用含有0.1mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.8)调整浓度。将所得包含相对于较多的未标记抗体和一价抗体的溶液供于后述标记工序。
(2.络合物形成工序)
与实施例1同样操作来制造DOTAGA-DBCO。使该螯合剂分散于作为溶剂的0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)，制成包含螯合剂0.3mmol/L的分散液。使将该分散液0.0136mL、0.156mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)0.0136mL和作为放射性金属源的含有225Ac离子的溶液(0.1mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为210～222MBq/mL、由Oak Ridge NationalLaboratory制进行制备、液量为0.0093mL)1.95～2.06MBq(检验日时根据放射能进行衰减计算而得到的计算值)混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到225Ac络合物溶液。此时的螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:225Ac离子＝约989:1，反应液的加热条件设为70℃，加热时间设为30分钟。
与实施例1同样地测定所得225Ac络合物的RCP。其结果，225Ac络合物的RCP为95％。将所得225Ac络合物溶液直接用于标记工序。
(3.标记工序)
向历经上述工序(2)而得到的未纯化状态的225Ac络合物的溶液中添加上述工序(1)中得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液，在37℃下使其进行2小时的点击反应，得到225Ac络合物标记抗体。DBCO基与叠氮基的摩尔比分别为约1:1.2。将未纯化时的225Ac络合物标记抗体的反应率示于以下的表10。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的225Ac络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC803096)进行纯化。将纯化后的225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY示于以下的表10。需要说明的是，225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY根据利用与实施例1相同的方法而得到的放射能量来计算。
[表10]
[比较例4]使用225Ac标记DOTA-DBCO来制造其与帕尼单抗的复合物
除了将DOTAGA-DBCO变更为DOTA-DBCO之外，按照实施例6来进行操作。将结果示于表11。需要说明的是，225Ac络合物标记抗体的RCP和RCY根据利用与实施例1相同的方法而得到的放射能量进行计算。
[表11]
[实施例7]使用89Zr标记DOTAGA-DBCO来制造其与帕尼单抗的复合物
(1.络合物形成工序)
与实施例2同样地，制备包含螯合剂的分散液，将该分散液0.0939mL、含有0.150mol/L龙胆酸的0.156mmol/L乙酸钠溶液(pH5.5)0.0626mL、作为放射性金属源的含有89Zr离子的溶液(0.1mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为2.6GBq/mL、由日本Medi-Physics公司制进行制备、液量为0.0626mL)161.6MBq混合，按照实施例2，得到89Zr络合物溶液。此时的螯合剂与放射性金属离子的摩尔比率为螯合剂:89Zr离子＝约236:1。
利用与实施例2相同的方法来测定所得89Zr络合物的RCP。其结果，89Zr络合物的RCP为98％。将所得89Zr络合物溶液直接用于标记工序。
(2.标记工序)
将历经上述工序(1)而得到的未纯化状态的89Zr络合物溶液同与实施例6同样操作而得到的包含肽修饰抗体(一价抗体)的溶液混合，在37℃下进行90分钟的点击反应，得到89Zr络合物标记抗体。DBCO与叠氮的摩尔比分别为约1:1。将未纯化时的89Zr络合物标记抗体的反应率(％)示于以下的表12。
进而，针对在37℃下使其反应2小时而得到的89Zr络合物标记抗体的溶液，使用超滤过滤器进行纯化。将纯化后的89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY(％)示于以下的表12。需要说明的是，89Zr络合物标记抗体的RCP和RCY根据利用与实施例1相同的方法而得到的放射能量来进行计算。
[表12]
[实施例8]制剂化工序
分别抽取1.0mL按照实施例6和比较例4而制造的放射性复合物，置于5mL微量离心管(LoBind、Eppendorf公司制)中，用处方缓冲液(含有0.1mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.8))1.5mL进行稀释。
[评价3]稳定性评价
将实施例8中得到的各放射性复合物在室温(24.5～25.5℃)下保存2星期，在各时间点(0天、1天、7天和14天)评价RCP、聚集体的比例和抗原结合活性。
[评价3-1]RCP
RCP根据TLC分析结果进行计算。TLC的条件设为与在实施例1中评价反应率时使用的条件相同。将结果示于表13。
[表13]
不含硫脲键且按照实施例6的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了99％以上。在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，也维持了99％以上。包含硫脲键且按照比较例4的记载而制造的放射性复合物在制造结束后在室温下保存7天的情况下，作为RCP，维持了95％以上。在制造结束后在室温下保存14天的情况下，作为RCP，低于93％。
[评价3-2]聚集体的比例
聚集体的比例利用尺寸排阻色谱法(SEC)进行确认。作为液相色谱装置，使用Waters公司制的2695型分离模块或e2695型分离模块，作为UV检测器，使用Waters公司制的2489型UV/Vis检测器，利用下述条件进行分析。将在制造结束后保存7天时的各成分的比例示于表14。在制造结束后保存7天的情况下，按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的聚集体的比例与按照比较例4的记载而制造的放射性复合物的聚集体为同等。
[表14]
| 体 | 主峰的比例 | 聚集体的峰比例 |
| 放射性复合物(实施例6)0天 | 92.20 | 7.80 |
| 放射性复合物(比较例4)0天 | 91.49 | 8.51 |
| 放射性复合物(实施例6)7天 | 89.92 | 10.03 |
| 放射性复合物(比较例4)7天 | 89.77 | 10.17 |
〔HPLC条件〕
柱：TOSOH TSKgel guardcolumn SWXL(6mm×4cm)，TOSOH TSKgel G3000SWXL(5μm、7.8×30cm)×2根(串联)
柱温度：25℃附近的恒定温度
流动相：含有0.2mol/L精氨酸盐酸盐的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)
流量：每分钟1.0mL
面积测定范围：30分钟
检测波长：280nm
[评价3-3]抗原结合活性
关于抗原结合活性，除了对进行评价的肿瘤切片追加自ATCC购入的EGFR高表达的人结肠癌来源细胞株即SW48细胞、自ATCC购入的EGFR低表达的人结肠癌来源细胞株即HCT-116和自ECACC购入的EGFR低表达的人大肠癌来源细胞株即COLO205细胞之外，按照实施例1的记载并通过体外ARG进行确认(仅制造日)。另外，利用向各种溶液中添加未标记的帕尼单抗而得到的溶液(所添加的帕尼单抗浓度：10nM)同样地进行评价，确认放射性复合物相对于EGFR的特异性。将结果示于图6。确认到按照实施例6的记载而制造的放射性复合物对于EGFR的结合活性。确认到按照实施例6而制造的放射性复合物结合于A431肿瘤切片、SNU-16肿瘤切片、SW48肿瘤切片、HCT-116肿瘤切片和COLO205肿瘤切片，更牢固地结合于A431肿瘤切片和SW48肿瘤切片，确认到EGFR表达依赖性的结合活性。添加有帕尼单抗的溶液在用于评价的全部切片中的结合受到抑制，确认到结合的EGFR特异性。
[实施例9]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的细胞杀伤效果评价)
使用培养细胞，确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的细胞杀伤效果。将COLO205细胞(RPMI 1640培养基)、HCT-116细胞(MaCoy’s 5A培养基)、SW48细胞(Leibovitz’s L-15培养基)、自ECACC购入的EGFR高表达的人胰脏癌症来源细胞株即MIAPaCa-2细胞(D-MEM培养基)、自ATCC购入的EGFR高表达的非小细胞肺癌症来源细胞株即NCI-H358细胞(RPMI 1640培养基)分别用适合的培养基进行培养，将按照实施例6而制造的放射性复合物以成为0、0.001、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30kBq/mL(以帕尼单抗计为0.000764、0.00764、0.0229、0.0764、0.229、0.764、2.29、7.64、22.9μg/mL)的方式用各培养基稀释，并添加至细胞中。另外，以成为与各放射能浓度的样品相同的抗体浓度的方式添加未标记的帕尼单抗，并进行培养。在自添加样品起的120小时后，向培养基中添加CellTiter-Glo(注册商标)2.0Cell Viability Assay(Promega公司制)，使用酶标仪(SpectraMax i3x、モレキュラーデバイス公司制)来检测化学发光，计算活细胞数。采取未添加抗体这一条件时的活细胞数与所算出的活细胞数的比率，评价细胞杀伤效果。将结果示于图7A～7C。另外，使用GraphPad Prism7(GraphPad Software公司制)，通过非线性直线回归法对所得结果进行拟合，计算EC50。其结果，按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的细胞杀伤效果中的EC50相对于SW48细胞为0.5pM、相对于NCI-H358细胞为2.8pM、相对于COLO205细胞为7.3pM。另外，利用未标记的帕尼单抗，在所添加的最大浓度(抗体浓度：156nM)以下未确认到细胞杀伤效果。
在评价细胞中，包括在KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog)和BRAF(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)中具有变异的细胞在内，在利用未标记的帕尼单抗未确认到细胞杀伤效果的细胞中，也利用225Ac络合物标记帕尼单抗而确认到细胞杀伤效果。
[实施例10]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的细胞凋亡诱导评价)
确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物对于培养细胞的细胞凋亡诱导。
利用与实施例9相同的条件，培养人大肠癌来源细胞即SW48细胞、COLO205细胞，将按照实施例6的记载而制造的放射性复合物以成为0、0.001、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3kBq/mL(以帕尼单抗计为0.00764、0.0764、0.229、0.764、2.29、7.64、22.9μg/mL)的方式进行添加。另外，以成为与各放射能浓度的组相同的抗体浓度的方式添加未标记的帕尼单抗，并进行培养。在添加样品72小时后，添加细胞凋亡分析试剂盒(Caspase-Glo(注册商标)3/7Assay、Promega公司制)，使用酶标仪来检测Caspase-3/7的活性。将其结果示于图8。关于两种细胞，利用未标记的帕尼单抗均未确认到细胞凋亡的诱导，但利用225Ac络合物标记帕尼单抗，Caspase-3/7的活性添加放射能依赖性地增加，确认到基于放射线的细胞凋亡诱导。
[实施例11]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的DNA双链断裂评价)
确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物对于培养细胞的DNA双链断裂效果。
与实施例9同样地培养SW48细胞、MIAPaCa-2细胞、NCI-H358细胞，以成为1kBq/mL、10kBq/mL、30kBq/mL(以帕尼单抗计为3.73、37.3、112μg/mL)的方式添加按照实施例6的记载而制造的放射性复合物，并进行培养。在添加样品48小时后，利用DNA损伤检测试剂盒(DNA Damage Detection Kit-γH2AX-Green、同仁化学研究所制)，对γH2AX进行染色，使用含有DAPI的水溶性固定剂(ProLongTM Diamond Antifade Mountant with DAPI、ThermoFisher Scientific社制)，进行核染色和封入。在封入后，使用HS一体荧光显微镜(BZ-9000、基恩士公司制)，检测γH2AX阳性部位和细胞核。将其结果示于图9A～9C。关于各细胞，γH2AX阳性细胞的比例均添加放射能依赖性的增加，确认到由放射线导致的DNA双链断裂。
[实施例12]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的抗肿瘤效果)
使用小鼠，制作COLO205细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果。
将自ECACC购入的EGFR高表达的人大肠癌来源细胞株即COLO205细胞悬浮于DMEM(gibco、Thermo Fisher Scientific公司制)，向6周龄的雌性BALB/c nu/nu(日本チャールス·リバー公司制)的侧腹皮下给药5×106cells，制作荷瘤小鼠。在荷瘤处置后，确认肿瘤体积约为100～300mm3，从适于测定肿瘤直径的形状的个体中随机地实施分组。将此时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于以下的表15。
[表15]
关于按照实施例6的记载而制造的放射性复合物，在高放射能给药组中以10kBq/只的用量进行尾静脉内给药，在低放射能给药组中，以5kBq/只(均以帕尼单抗计为50μg/只)的用量进行尾静脉内给药。作为对照组，设定以200μg/只的用量尾静脉内给药帕尼单抗的组(抗体对照组)和将保存缓冲液进行尾静脉内给药的溶剂对照组。另外，按照Vectibix(Vectibix；注册商标、武田药品工业公司制)的CTD(Common Technical Document)，设定将帕尼单抗以200μg/只的用量且1星期2次的频率腹腔内给药2星期的组(抗体腹腔给药组)。各组设为6只，至给药后的第33天为止，经时性地进行一般状态的观察，测量体重和肿瘤体积。将经时性肿瘤体积的变化示于图10。
在高放射能给药按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的组中，在给药后的第33天，与两个对照组(抗体对照组、溶剂对照组)和抗体腹腔给药组相比，抗肿瘤效果观察到显著差异(P<0.05或P<0.01)。在显著差异的判定中，使用统计分析软件Stat Preclinica进行Tukey检验。在低放射能给药按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的组中，在给药后的第33天，与抗体对照组和抗体腹腔给药组相比，抗肿瘤效果确认到显著差异(P<0.05或P<0.01)。另一方面，在给药各放射性复合物的组之间，抗肿瘤效果未确认到显著差异。另外，各组在一般状态下均无显著变化，未确认到显著的体重减少等毒性征兆。
[实施例13]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的抗肿瘤效果)
使用小鼠，制作HCT-116细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果。
将自ATCC购入的EGFR高表达的人结肠癌来源细胞株即HCT-116细胞悬浮于DMEM(gibco、Thermo Fisher Scientific公司制)并加以使用，除了这一点之外，与实施例12同样地确认抗肿瘤效果。将给药各溶液时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于以下的表16。
[表16]
组设定和给药放射能、给药抗体量设为与实施例12相同。各组设为6只，至给药后的26天为止，经时性地进行一般状态的观察，测量体重和肿瘤体积。将经时性肿瘤体积的变化示于图11。
高放射能给药按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的组在给药后的第26天，与两个对照组(抗体对照组、溶剂对照组)和抗体腹腔给药组相比，抗肿瘤效果确认到显著差异(P<0.01)。显著差异的判定中，使用统计分析软件Stat Preclinica来进行Tukey检验。另外，在各放射性复合物给药组之间，抗肿瘤效果确认到显著差异(P<0.05)，确认到抗肿瘤效果对于所给药的放射能的依赖。另外，各组的一般状态均无显著变化，未确认到显著的体重减少等毒性征兆。
[实施例14]使用225Ac络合物标记抗体进行的药效评价(225Ac络合物标记帕尼单抗的抗肿瘤效果)
使用小鼠，制作SW48细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果。
将自ATCC购入的EGFR高表达的人结肠癌来源细胞株的SW48细胞悬浮于DMEM(gibco、Thermo Fisher Scientific公司制)并加以使用，除了这一点之外，与实施例12同样地确认抗肿瘤效果。将给药各溶液时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于以下的表17。
[表17]
关于组设定和给药放射能、给药抗体量，除了将抗体对照组中的给药抗体量设为50μg/只之外，与实施例12同样操作。各组设为6只，至给药后的18天为止，经时性地进行一般状态的观察，测量体重和肿瘤体积。将经时性肿瘤体积的变化示于图12。
给药按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的组在给药后的第18天，与两个对照组(抗体对照组、溶剂对照组)相比，抗肿瘤效果确认到显著差异(P<0.01)。显著差异的判定中，使用统计分析软件Stat Preclinica，进行Tukey检验。另一方面，在给药各放射性复合物的组之间，抗肿瘤效果未确认到显著差异。另外，各组的一般状态均无显著变化，未确认到显著的体重减少等毒性征兆。
[实施例15]225Ac络合物标记帕尼单抗与现有药剂的药效比较
使用小鼠，制作COLO205细胞的皮下荷瘤模型，将按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的抗肿瘤效果与现有药进行比较。
与实施例12同样地，制作荷瘤有COLO205细胞的小鼠，确认抗肿瘤效果。将给药各溶液时的各小鼠的肿瘤体积和体重示于以下的表18。
[表18]
按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的给药组以10kBq/只的用量进行尾静脉内给药。作为比较组，设定将奥沙利铂33μL以5mg/mL的用量每星期3次尾静脉内给药的组(奥沙利铂给药组)。另外，作为对照组，设定将按照实施例6的记载而制造的放射性复合物的保存缓冲液进行尾静脉内给药的溶剂对照组。各组设为6只，至观察期间结束为止，经时性地进行一般状态的观察，测量体重和肿瘤体积。将经时性肿瘤体积的变化示于图13。图的纵轴表示各组的肿瘤体积的平均值，横轴表示自给药各药剂起经过的天数。图表示各组的肿瘤体积的平均值±标准偏差，“*”表示相对于奥沙利铂给药组确认到显著差异(p<0.05)的时间点，表示相对于溶剂对照组确认到显著差异(p<0.01)的时间点。另外，在最终观察日实施培检，并采取血液。针对所采取的血液，使用干式临床化学分析装置(スポットケムD-02、アークレイ公司制)，关于血浆中的天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血液脲氮(BUN)，使用スポットケムD综合A2(アークレイ公司制)进行测定，由此评价肝毒性和肾毒性。将结果示于图14。纵轴表示各标记物的浓度，横轴表示所评价的组，图表示各组的平均值±标准偏差。关于各组，在最终观察日，肝毒性和肾毒性标记物均无显著差异，在观察最终点，未确认到肝毒性和肾毒性。
[实施例16]225Ac络合物标记帕尼单抗在血浆中的稳定性评价
将按照实施例6的记载而制造的放射性复合物在各动物种(人(人血浆(池、肝素)、コスモバイオ公司制)、小鼠(小鼠血浆池BALB/c-nu系统、日本チヤ一ルス·リバ一公司制)、大鼠(血浆(池)Wistar、日本チヤ一ルス·リバ一公司制)、猴(食蟹猴血浆、日本チヤ一ルス·リバ一公司制))的血浆中在37℃下保存2星期，评价各时间点(0天、1天、7天、14天(仅人血浆))的225Ac标记帕尼单抗在血浆中的稳定性。将各动物种的血浆在37℃下进行培养，将按照实施例6的记载而制造的放射性复合物以最终浓度成为100kBq/mL的方式进行添加。在各评价时间点，使用Dynabeads(注册商标)Protein G(Thermo Fisher Scientific公司制)，进行免疫沉降，在利用含有0.1％Tween20的PBS进行清洗后，回收与Protein G结合的抗体。回收在珠的清洗中使用的含有0.1％Tween20的PBS，所回收的清洗液的放射能和所回收的抗体的放射能使用自动孔伽马粒子计数管(2480WIZARD2 gamma counter、PerkinElmer公司制)进行测定，计算所回收的抗体的放射能相对于在珠的清洗中使用的含有0.1％Tween20的PBS的放射能与所回收的抗体的放射能的合计的比率，由此评价与ProteinG结合的225Ac标记帕尼单抗的比例。将其结果示于表19。表内的数值表示所回收的抗体的放射能相对于在珠的清洗中使用的含有0.1％Tween20的PBS的放射能与所回收的抗体的放射能的合计的比率的平均值±标准偏差(n＝3)。
[表19]
| 稳定性 | 0天 | 1天 | 7天 | 14天 |
| 人血浆 | 92.4±0.4 | 85.6±5.0 | 88.6±3.9 | 71.6±6.3 |
| 猴血浆 | 91.0±2.0 | 89.9±4.5 | 86.9±3.0 | - |
| 小鼠血浆 | 97.8±0.4 | 87.9±1.2 | 88.2±0.6 | - |
| 大鼠血浆 | 96.8±1.0 | 88.5±3.3 | 69.9±6.4 | - |
按照实施例6的记载而制造的放射性复合物在除大鼠之外的各动物种的血浆中保存7天的情况下，作为稳定性，维持了85％以上，另外，在人血浆中血浆中保存14天的情况下，作为稳定性，也维持了70％以上。
[实施例17]89Zr络合物标记帕尼单抗的肿瘤聚集性评价
按照实施例12，使用小鼠来制作COLO205细胞的皮下荷瘤模型，确认按照实施例7的记载而制造的放射性复合物的肿瘤聚集性。
将自ATCC购入的EGFR高表达的人大肠癌来源细胞株即COLO205细胞悬浮于DMEM培养基，向5周龄的雌性BALB/cnu/nu(日本チャールス·リバー公司制)的侧腹皮下给药5×106cells，制作荷瘤小鼠。使肿瘤生长至体积成为约100～250mm3为止，将按照实施例7的记载而制造的放射性复合物以约6MBq/只(各n＝3)的用量进行尾静脉内给药。在给药72小时后和120小时后，使用小动物PET成像装置，在与评价2相同的条件下进行拍摄。
将实施PET拍摄的结果的代表例示于图15。图像内的箭头表示来自荷瘤COLO205细胞的肿瘤。在所拍摄的各小鼠中，对肿瘤和肌肉(大腿肌)设定VOI，并计算SUV(StandardUptake Value)时，在给药72小时后，在肿瘤中成为3.18±0.72，在肌肉中成为0.48±0.02，在给药120小时后，在肿瘤中成为4.38±0.96，在肌肉中成为0.48±0.05。使用该值来计算肿瘤相对于肌肉的放射能聚集比率，其结果，在给药72小时后，成为6.67±1.52，在给药120小时后，成为9.19±2.02，与其它脏器相比，放射能以高浓度聚集于肿瘤，能够描绘出EGFR阳性肿瘤。
本申请基于在日本申请的特愿2021-062104(申请日：2021年3月31日)、特愿2021-179348(申请日：2021年11月2日)和特愿2022-021670(申请日：2022年2月15日)，并将它们的内容全部援引至本说明书中。
Claims (14)
1.复合物，其是位点特异性地用肽修饰的抗EGFR抗体与螯合剂的复合物，
放射性金属同位素螯合于所述螯合剂，
所述肽与螯合剂经由接头(L)连接，所述接头(L)不含硫脲键。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述螯合剂为DOTAGA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其中，所述肽为下述式所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，并且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基或者来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，其中，Xaa1和Xaa3中的任一者为来自具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基；
Xaa1与Xaa3通过连接而形成环结构；
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，并且，Xaa2用交联剂修饰。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的复合物，其中，所述放射性金属同位素为Ac-225、Y-90、Lu-177或Zr-89。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的复合物，其中，所述接头(L)包含式(10a)、式(10b)或式(10c)，
[化1]
式(10a)和式(10b)中，R1A表示与所述螯合剂的连接部位；R2A表示与所述肽的连接部位，
式(10c)中，R3A和R4A中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与所述螯合剂的连接部位；R5A表示与所述肽的连接部位。
6.根据权利要求5所述的复合物，其中，在与所述肽的连接部位和所述肽之间包含聚乙二醇基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的复合物，其中，通过使抗EGFR抗体与下述式所示的DOTAGA-DBCO的放射性金属络合物发生点击反应而复合化，该抗EGFR抗体用在N末端上导入有叠氮基的所述肽进行位点特异性修饰，
[化2]
8.根据权利要求1～7中任一项所述的复合物，其中，所述抗EGFR抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。
9.放射性药物，其含有权利要求1～8中任一项所述的复合物作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的放射性药物，其用于癌症的放射线内用疗法。
11.根据权利要求9所述的放射性药物，其用于癌症的诊断。
12.根据权利要求11所述的放射性药物，其与使用了权利要求10所述的放射性药物的癌症的放射线内用疗法并用。
13.放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，
在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，
所述放射性药物满足下述(1)或(2)的条件：
(1)所述放射性金属同位素为177Lu或90Y，在室温下保管7天时的所述复合物的放射化学纯度为90％以上；
(2)所述放射性金属同位素为225Ac，在室温下保管14天时的所述复合物的放射化学纯度为90％以上。
14.放射性药物，其含有螯合有放射性金属同位素的螯合剂与抗EGFR抗体的复合物作为有效成分，
在抗EGFR抗体与螯合剂的连接中不含硫脲键，
以所述放射性金属同位素的半衰期为基准计，在经过所述半衰期的1倍以上且5倍以下的期间的时间点，所述复合物的放射化学纯度为90％以上。
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