CN117377501A - 放射性抗肿瘤剂 - Google Patents

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CN117377501A
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antibody
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agent
seq
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香本祥汰
山田直明
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Nihon Medi Physics Co Ltd
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
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Nihon Medi Physics Co Ltd
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

本发明的课题在于，提供对于粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异且肾脏毒性得以降低的、用锕‑225标记的抗MUC5AC人源化抗体。本发明涉及复合物，其为螯合有锕‑225的螯合剂与抗体的复合物，前述抗体是与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体，并且，该人源化抗体具有由SEQ ID NO:1～4中任一者所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由SEQ ID NO:5～8中任一者所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。

Description

放射性抗肿瘤剂
技术领域
本发明涉及放射性抗肿瘤剂。更详细而言，涉及包含螯合有作为放射性核素的225Ac(锕-225)的螯合剂与特异性结合于粘蛋白亚型5AC的人源化抗体的复合物作为有效成分、且与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用的放射性抗肿瘤剂等。
背景技术
粘蛋白是由动物上皮细胞等分泌的粘液的主成分，其是大量包含分子量100万～1000万的糖的糖蛋白。粘蛋白有上皮细胞等产生的分泌型粘蛋白、以及具有疏水性的跨膜部位且以结合于细胞膜的状态存在的膜结合型粘蛋白。粘蛋白的核心蛋白统称为MUC，已知编码核心蛋白的基因至少存在20个种类。作为其中一种的粘蛋白亚型5AC(MUC5AC)属于分泌型粘蛋白。
MUC5AC在正常组织中在胃、气管中进行表达，有报告称其会在胰腺癌中过度表达，除此之外，有报告称其在甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌中也会过度表达。关于针对MUC5AC的抗体，存在下述报告：以从人胰腺癌细胞株SW1990的xenograft中纯化出的胰腺癌粘蛋白级分作为抗原而制作的小鼠抗体(非专利文献1)；以其为基础而制作的嵌合抗体(专利文献1、2、非专利文献2、3)；人源化抗体(专利文献3、4)。
抗体利用抗体所具备的对于靶分子的特异性而用作用于检测靶分子的试剂、诊断药或用于治疗疾病的药品。出于进一步提高检测性能和治疗效果的目的，进行了与放射性核素、药剂结合的抗体的相关研究。非专利文献1中报告了：使用被作为β射线放射核素(β核素)的131I标记的小鼠抗体进行的胰腺癌模型小鼠的放射免疫治疗。非专利文献3中报告了：使用被作为γ射线放射核素(γ核素)的111In标记的嵌合抗体进行的胰腺癌患者的SPECT造影。专利文献3和4中存在特定的MUC5AC特异性人源化抗体的相关记载，也记载了可以包含用90Y、111In等标记的物质，但实施例中仅示出该MUC5AC特异性人源化抗体的ADCC(抗体依赖性细胞毒)活性。
专利文献5和非专利文献4中存在被作为α射线放射核素(α核素)的225Ac标记的抗体(225Ac标记抗体)的相关记载，并报告了该抗体存在给药后迟发性的肾脏毒性。为了降低肾脏毒性而组合使用各种药剂(非专利文献4)。
专利文献6中公开了将具有特定结构的凝乳酶抑制剂与作为类固醇系醛固酮拮抗剂的螺内酯、依普利酮加以组合来用于保护肾脏的药物组合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平7-203974号公报
专利文献2：日本特开平11-5749号公报
专利文献3：国际公开2013/157102号单行本
专利文献4：国际公开2013/157105号单行本
专利文献5：国际公开2005/028021号单行本
专利文献6：日本特表2007-529459号公报
非专利文献
非专利文献1：Japanese Journal of Cancer Research,87,977-984,1996
非专利文献2：日本临床64卷,增刊号1,2006,274-278
非专利文献3：Japanese Journal ofCancer Research,90,1179-1186,1999
非专利文献4：Cancer Res.2005Jun 1；65(11):4888-95.
发明内容
发明所要解决的课题
其目的在于，提供在给药用作为放射性核素的225Ac(锕-225)标记且与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体(以下也称为225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体)时，降低由给药包含锕-225的药剂导致的或者由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾毒性的药剂。
用于解决课题的手段
本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现：通过将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，从而能够降低包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂或者包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和降低肾脏毒性的药剂这两者作为有效成分的放射性抗肿瘤剂的肾脏毒性，对其效果进行确认并完成了本发明。
本发明的一个方式提供放射性抗肿瘤剂，其与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，且包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分。
本发明的另一方式提供放射性抗肿瘤剂，其包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和用于降低肾脏毒性的药剂作为有效成分。
本发明的另一方式提供用于降低肾脏毒性的药剂，其与包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂组合使用。
本发明的另一方式提供组合药物，其具有：
包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂；以及
用于降低肾脏毒性的药剂。
附图说明
图1是表示给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后26个星期内的小鼠的平均体重的推移的图。示出与可期待肾脏保护作用的化合物(Zn-DTPA)的组合给药组(实施例1)、225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体单独给药组(比较例1)、以及可期待肾脏保护作用的化合物(Zn-DTPA)单独给药组(比较例2)的结果。
图2是表示给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后26个星期内的小鼠的平均体重的推移的图。示出与可期待肾脏保护作用的化合物(呋塞米)的组合给药组(实施例2、实施例5)、225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体单独给药组(比较例1)、以及可期待肾脏保护作用的化合物(呋塞米)单独给药组(比较例3)的结果。
图3是表示给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后26个星期内的小鼠的平均体重的推移的图。示出与可期待肾脏保护作用的化合物(螺内酯)的组合给药组(实施例3、实施例6)、225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体单独给药组(比较例1)、以及可期待肾脏保护作用的化合物(螺内酯)单独给药组(比较例4)的结果。
图4是表示给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后26个星期内的小鼠的平均体重的推移的图。示出与可期待肾脏保护作用的化合物(依普利酮)的组合给药组(实施例4、实施例7)、225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体单独给药组(比较例1)、以及可期待肾脏保护作用的化合物(依普利酮)单独给药组(比较例5)的结果。
图5是表示给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后第16个星期的各给药组的小鼠的尿中N/C比的图(各组n＝4～5)。“*”表示Dunnett检验中确认到显著差异的给药组(p<0.05)。
图6是表示各给药组的肾脏的病理学评价结果的图。各组为2～5只，示出确认到在表现栏中记载的表现的各等级的个体数。在各表现中通用的是：等级“-”表示未确认到表现。在髓质外层中的肾曲小管上皮的变性/再生中，等级“+”表示散发性地确认到肾曲小管上皮细胞的变性，等级“2+”表示弥漫性地确认到该变化，等级“3+”表示进一步变性和再生肾曲小管明显活跃的状态。在伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管中，等级“+”表示与与自然发生相同程度的频率确认到表现，等级“2+”表示确认到比自然发生更多的表现且确认为多灶性，等级“3+”表示在肾脏整体确认到明显变化。
图7是表示各实施例和比较例的髓质外层中的肾曲小管上皮细胞的变性/再生的代表性病理学表现的图(比例尺为70μm)。箭头表示确认到病理学表现的部位。
图8是表示各实施例和比较例中的伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管的代表性病理学表现的图(比例尺为300μm)。箭头表示确认到病理学表现的部位。
图9是表示使用111In标记的各抗体实施SPECT-CT造影的结果的图。示出111In标记的各抗体的SPECT图像。
图10是表示根据111In标记的各抗体的SPECT图像对各时间点的肿瘤(上)和肝脏(下)进行VOI(volume ofinterest、三维ROI)分析而得到的结果的图。
图11是表示给药111In标记的各抗体并确认168小时后的体内分布(上)和排泄路径(下)而得到的结果的图。
图12是表示对111In标记的各抗体的基于体外ARG的结合能力加以对比的结果的图像。
图13是表示对111In标记的各抗体的基于体外ARG的结合能力进行定量化并加以对比的结果的图。
具体实施方式
本说明书中使用的术语只要没有特别提及，就可以以在该技术领域中通常使用的含义来使用。
(1)225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体
本发明中使用的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体是使用锕-225作为放射性核素，且由该放射性核素络合形成的螯合剂与特异性结合于MUC5AC的人源化抗体的复合物(以下有时称为本发明的复合物)。
(1-1)基于锕-225的标记(225Ac标记)
本发明的复合物中包含的作为放射性核素的225Ac作为放射α射线的核素是已知的。225Ac可使用回旋加速器、线形加速器等加速器并利用公知方法来制造，可通过使用例如回旋加速器对226Ra靶材照射质子，从而利用(p,2n)的核反应来生成。所生成的225Ac可通过从靶材进行分离纯化来纯化，例如，通过将包含225Ac的靶材用酸等溶解，并向溶解液中添加碱，从而使包含225Ac的盐析出，并对该盐进行分离纯化，由此能够得到纯化的225Ac。通过对如此操作而纯化的225Ac根据需要实施化学处理，从而制成适于RI标记的化学形态，由此能够用于RI标记。
(1-2)抗体
本发明的复合物中包含的抗体是与MUC5AC特异性结合的人源化抗体(以下也称为本发明中使用的人源化抗体)。该抗体可以以其抗原结合片段的形式使用，该方式也包括在本申请发明中。具体而言，包含后述特定的重链可变区和轻链可变区，根据期望具有适当的重链恒定区和轻链恒定区。本说明书中，“抗原结合片段”是指由本发明中使用的人源化抗体的一部分构成的抗体片段，且具有与MUC5AC结合的能力。只要具有与MUC5AC结合的能力即可，构成抗原结合片段的多肽中包含的氨基酸数就没有特别限定。
以下示出作为本发明中使用的人源化抗体的重链可变区而优选的氨基酸序列。重链可变区1(H01)、重链可变区2(H02)、重链可变区3(H03)和重链可变区4(H04)分别相当于本说明书中后附的序列表的SEQ ID NO：1～4。标注下划线的部位为CDR部位。
[化1]
【重链可变区1(H01)】
【重链可变区2(H02)】
【重链可变区3(H03)】
【重链可变区4(H04)】
以下示出在本发明中作为人源化抗体的轻链可变区而优选的氨基酸序列。轻链可变区1(L01)、轻链可变区2(L02)、轻链可变区3(L03)和轻链可变区4(L04)分别相当于本说明书中后附的序列表的SEQ ID NO：5～8。标注下划线的部位为CDR部位。
[化2]
【轻链可变区1(L01)】
【轻链可变区2(L02)】
【轻链可变区3(L03)】
【轻链可变区4(L04)】
换言之，本发明中优选的人源化抗体的重链可变区由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中任一者所示的氨基酸序列构成，轻链可变区由SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8中任一者所示的氨基酸序列构成。即，本发明中使用的人源化抗体包含上述说明的4个重链可变区(H01～H04)中的任一者与4个轻链可变区(L01～L04)中的任一者的组合。
本发明中适合的人源化抗体是重链可变区为H01、H03或H04，且轻链可变区为L01～L04中任一者的人源化抗体。
本发明中最适合的人源化抗体是重链可变区为H01且轻链可变区为L03的抗体。
本发明中，人源化抗体的重链可变区不限定于利用SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列进行规定的可变区，还包括保持功能的变异体。即，由与SEQ ID NO:1～SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有90％以上、优选具有95％以上、96％以上或97％以上、进一步优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的变异的重链可变区只要在与本发明的轻链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的重链可变区。具有这种氨基酸序列的抗MUC5AC人源化抗体是具有与MUC5AC特异性结合的能力的人源化抗体，具有稳定的物性且肿瘤蓄积性优异。
本说明书中，氨基酸序列的同一性是指作为对象的两种蛋白质之间的氨基酸序列的同一性，用在使用本技术领域中公知的数学算法而制作的氨基酸序列的最佳对比中保持一致的氨基酸残基的比例(％)来表示。氨基酸序列的同一性可通过视觉检查和数学计算来确定，可使用本领域技术人员公知的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA)、序列比对程序(例如ClustalW))或遗传信息处理软件(例如GENETYX[注册商标])等来计算。具体而言，本说明书中的氨基酸序列的同一性可使用DDBJ(DNA DataBank of Japan)的网站公开的系统分析程序ClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php？lang＝ja)，利用初始设定条件(Version2.1、Alignment type:slow、DNA Weight Matrix:Gonnet、GAP OPEN:10、GAP EXTENSION:0.1)来求出。
并且，作为本发明中使用的人源化抗体的重链可变区，由在SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加10个以下、优选8个以下、进一步优选5个以下、最优选3个以下(3个、2个或1个)氨基酸的氨基酸序列构成的变异的重链可变区只要在与本发明的轻链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的重链可变区。
本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区不限定于SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，还包括保持功能的变异体。即，由与SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上、优选具有95％以上、96％以上或97％以上、进一步优选具有98％以上、最优选具有99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的变异的轻链可变区只要在与本发明的重链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区。
并且，作为本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区，由在SEQ ID NO:5～SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加10个以下、优选8个以下、进一步优选5个以下、最优选3个以下(3个、2个或1个)氨基酸的氨基酸序列构成的变异的轻链可变区只要在与本发明的重链可变区组合时具有与MUC5AC结合的能力，就可用作本发明中使用的人源化抗体的轻链可变区。
本发明中使用的人源化抗体可通过在本技术领域中通常实施的方法或基于其的方法来制造。具体而言，可按照以下的步骤来进行。
本发明中使用的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列已经被SEQID NO:1～SEQ ID NO:8公开，因此，构建对根据这些氨基酸序列信息而得到的该抗体进行编码的核酸，并插入至适当的表达载体中。表达载体在包含对本发明中使用的人源化抗体进行编码的核酸的基础上，还可任选包含用于提高翻译效率的科扎克(Kozak)序列、向宿主导入时促进本发明中使用的人源化抗体向培养基中分泌的信号序列和启动子序列等。本发明中可使用的载体可以从本技术领域中通常使用的载体中选择，优选为作为质粒载体的pcDNA3.4。表达载体向宿主细胞中的导入也没有特别限定，作为向细胞内导入基因的方法，可使用在本技术领域中一直以来使用的方法、例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、DEAE-葡聚糖法的本领域技术人员公知的方法。如在下述实施例中进行的那样，特别适合为使用脂质转染法进行的导入方法。需要说明的是，出于该目的而使用的宿主细胞也可以使用在本技术领域中一直以来使用的宿主细胞。作为这样的宿主细胞的例子，可列举出CHO细胞、293细胞、大肠杆菌、毕赤氏酵母、Sf9细胞等。需要说明的是，当今用于表达目标蛋白质的表达系统的试剂盒已有市售，下述实施例中使用的ExpiCHO System(Thermo FisherScientific公司制)对于迅速且可靠地表达目标蛋白质而言特别优选。
将对本发明中使用的人源化抗体进行编码的核酸插入至表达载体中，利用包含该核酸的表达载体向宿主细胞中导入该核酸，并对导入有核酸的宿主细胞进行培养，利用色谱法等纯化手段，能够从该培养上清得到本发明中使用的人源化抗体。通过对本方法中宿主细胞进行培养，从而使培养上清分泌出本发明中使用的人源化抗体。使用色谱法等纯化手段，能够由培养上清得到本发明中使用的人源化抗体或其抗原结合片段。作为色谱法的手段，可以使用亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法等本技术领域中已知的各种手段。使用在下述实施例中使用的蛋白A柱进行的亲和色谱法是特别优选的。
另外，上述人源化抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
(1-3)螯合剂
本发明中，螯合剂只要在结构中具有锕-225进行配位的部位即可，没有特别限定，优选具有锕-225发生配位的部位即螯合部和用于能够与抗体复合化的取代基。作为螯合部，可列举出例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(环己烷-反式-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫代甲酰基]硫基]-戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTA-GA-NHS、DOTP(((1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基)四(亚甲基))四膦酸)、DOTPA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、1,4,7,10-四(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Lpy)、p-SCN-Bn-DOTA(S-2-(4-异硫氰酸根合苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)、MeO-DOTA-NCS(1-[(2-甲氧基-5-异硫氰酸根合苯基)-羧甲基]-4,7,10-三羧基-5-甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、EuK-106、DOTMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(乙酰氨基亚甲基膦酸)、D02P(四氮杂环十二烷二甲烷膦酸)、去铁胺(DFO)、DTPA(甘氨酸,N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]-)、DTPA-BMA(5,8-双(羧甲基)-11-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]-3-氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸)、EDTA(2,2’,2”,2’”-(乙烷-1,2-二基双(氮烷三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基三(亚甲基膦酸)、TETPA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N’”-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮杂环十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-四(1,2-二氢-1-羟基-2-氧代吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮杂十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-N,N’,N”,N’”,N””-五乙酸)、H4octapa(N,N’-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)乙二胺-N,N’-二乙酸)、H2bispa2(6,6’-({9-羟基-1,5-双(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基}双(亚甲基))二吡啶甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基氨基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-N,N’-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N”-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)二亚乙基三胺-N,N’,N”-三乙酸)、H6phospa(N,N’-(亚甲基膦酸酯)-N,N’-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二氨基乙烷)、HP-D03A(羟基丙基四氮杂环十二烷三乙酸)、卟啉、DO3A(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三钠盐)、DO3A-NHS(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单-N-羟基琥珀酰亚胺酯)之类的物质，优选具有源自下述式(A)所示化合物的结构。
[化3]
(A)
(式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基，p为0以上且3以下的整数，R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子，R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。)
作为式(A)所示的具体结构，可列举出来自以下的式(A-1)～(A-12)所示化合物的结构。
[化4]
[化5]
[化6]
螯合部与用于能够与抗体复合化的取代基的连接部位优选为酰胺键或硫脲键，从稳定性的观点出发，更优选为酰胺键。
酰胺键通过例如上述式(A-10)、(A-11)的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基或上述(A-12)的2,6-二氧代四氢-2H-吡喃基与伯胺的反应来形成。另外，硫脲键通过上述式(A-2)、(A-3)所示的化合物的异硫氰酸酯基与伯胺或马来酰亚胺基的反应来形成。
本发明的复合物中，螯合剂只要相对于抗体1分子具备至少1分子以上即可，优选具备1分子以上且8分子以下。其中，从维持抗体自身的活性(抗原识别作用、中和作用、补体活化作用和/或调理素作用)的观点出发，优选向抗体的Fc区域(恒定区)位点特异性地导入螯合剂，在本发明中，螯合剂更优选相对于抗体1分子具备1分子或2分子。
本发明的复合物中，螯合剂可以借助接头与抗体连接。作为接头，可列举出取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)基、肽、糖链、二硫醚基和它们的组合等。
螯合剂优选借助接头位点特异性地修饰抗体，更优选修饰Fc区域。在该情况下，接头可以使用包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的肽(以下也称为“抗体修饰肽”)并且通过用交联剂修饰的抗体修饰肽与抗体的交联反应而形成的接头。需要说明的是，在式(i)中，以氨基酸序列的纸面左侧表示N末端侧、氨基酸序列的纸面右侧表示C末端侧的形式进行说明。在螯合剂借助作为接头的抗体修饰肽而与抗体连接的情况下，螯合剂与抗体修饰肽发生连接的位置没有特别限定，例如可以直接或间接连接于抗体修饰肽的N末端或C末端，优选为N末端。另外，抗体修饰肽的C末端为了提高其稳定性等而可以受到酰胺化等的修饰。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接，
Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用交联剂进行修饰。
作为上述式(i)中的X可包含的氨基酸残基，可列举出例如来自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等氨基酸的氨基酸残基，X可以为由同一种类的氨基酸构成的氨基酸残基，也可以为由彼此不同种类的氨基酸构成的氨基酸残基。
式(i)中的a、b、c和d只要是上述范围的数即可，没有特别限定，从肽与抗体的结合稳定性的观点出发，以a+b+c+d≤14为条件，a优选为1以上且3以下的整数，b优选为1以上且3以下的整数，c优选为3以上且5以下的整数，并且，d优选为1以上且3以下的整数。
Xaa1和Xaa3为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，该氨基酸彼此可以相同也可以不同。作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸，可列举出例如半胱氨酸、同半胱胺酸。这种氨基酸残基优选通过二硫醚键进行键合、或者经由下述式(4)所示的接头而键合有硫醚基。式(4)中，波浪线部分表示与硫醚基的键合部分。
[化7]
(4)
关于Xaa1和Xaa3，代替上述组合，可以是Xaa1和Xaa3之中的一者为来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者为来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基。它们借助硫醚键而进行键合。卤代乙酰基的末端被碘等卤素取代，通过与另一个侧链中的硫醇基的反应而使卤素脱离，形成硫醚键。
式(i)所示的抗体修饰肽的具体氨基酸序列可列举出例如国际公开2016/186206号单行本、国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的肽，也可以使用它们。
这些之中，作为抗体修饰肽的氨基酸序列，优选具有下述序列(1)～(14)中的任一者，进一步优选具有下述序列(1)、(2)、(13)或(14)。在以下的氨基酸序列(1)～(14)中，(Xaa2)表示赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，(Xaa1)和(Xaa3)均表示同半胱胺酸残基。另外，在以下的氨基酸序列(1)～(14)中，除(Xaa1)、(Xaa2)和(Xaa3)之外的氨基酸用单文字简写来表述。
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(SEQ ID NO:9)
(2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:10)
(3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(SEQ ID NO:11)
(4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:12)
(5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:13)
(6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:14)
(7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(SEQ ID NO:15)
(8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(SEQ ID NO:16)
(9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(SEQ ID NO:17)
(10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:18)
(11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:19)
(12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(SEQ ID NO:20)
(13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:21)
(14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(SEQ ID NO:22)
(1-4)复合物的制造方法
本发明的复合物的制造方法中，可以由下述的两个工序进行制造：缀合工序，将螯合剂与抗体进行缀合；以及络合物形成工序，形成锕-225与螯合剂的络合物。缀合工序可以在络合物形成工序之前，也可以在络合物形成工序之后。
在缀合工序中，可以使用各种抗体的化学修饰法。具体而言，可列举出(a)～(f)的方法。
(a)胺偶联法(使用具有用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基进行了活化的羧基的螯合剂或螯合物，对抗体的赖氨酸残基的氨基进行修饰的方法)；
(b)利用具有对SH基具有反应性的马来酰亚胺基的螯合剂或接头，对通过将位于抗体的关键部位的多肽链之间的二硫醚键(SS键)进行部分还原而产生的巯(SH)基进行修饰的方法；
(c)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的半胱氨酸，修饰具有马来酰亚胺基的螯合剂或接头的方法；
(d)对于通过基于基因工程学的氨基酸突变而向抗体中新导入的叠氮化赖氨酸的叠氮基，利用点击反应来修饰具有炔烃(例如二苯并环辛炔：DBCO)的螯合剂或接头的方法；
(e)对于利用转谷氨酰胺酶向抗体的特定位置导入的谷氨酰胺，修饰具有赖氨酸的侧链的螯合剂或接头的方法；
(f)利用具有前述(i)所示的抗体修饰肽的螯合剂或接头，位点特异性地修饰抗体的Fc区域的方法。
在络合物形成工序中，使锕-225螯合于螯合剂(形成络合物)。从提高络合物形成效率的观点出发，此处使用的锕-225优选以能够电离的方式来使用，进一步优选以离子方式来使用。络合物形成工序只要能够与放射性核素形成络合物即可，向螯合剂中添加放射性核素的顺序没有限定。例如，可以将在以水为主体的溶剂中溶解有放射性金属离子的溶液用作放射性核素。
在形成络合物后，可以使用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等对所得络合物进行纯化。
本发明的复合物的制造方法中，优选在络合物形成工序之后实施缀合工序。
在更优选的方式中，在络合物形成工序(A)中，在锕-225与螯合剂之间形成络合物，所述螯合剂具有能够发生点击反应的第一原子团作为用于能够与抗体复合化的取代基。接着，在缀合工序(B)中，在肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物形成的螯合剂之间实施点击反应，得到本发明的复合物，所述肽修饰抗体是使用具有前述(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头位点特异性地修饰Fc区域而得到的。
以下，针对工序(A)和(B)进行详述。
作为能够发生点击反应的第一原子团与第二原子团的组合，根据点击反应的种类来选择适当的组合，可列举出例如炔烃与叠氮的组合、1,2,4,5-四嗪与烯烃的组合等。这些原子团只要第一原子团具有上述原子团的组合之中的一者且第二原子团具有上述原子团的组合之中的与第一原子团不同的一种原子团即可。从兼顾螯合剂和抗体的稳定性和它们的结合效率的提高的观点出发，优选的是：螯合接头为炔烃且抗体修饰接头为叠氮，或者，螯合接头为1,2,4,5-四嗪且抗体修饰接头为烯烃。作为基于这种原子团的组合的点击反应的具体例，可列举出Huisgen环化加成反应或反电子需求型Diels-Alder反应等。
能够能够发生点击反应的原子团的组合的具体例，如下式所示那样，可列举出：包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团(式(1a))与包含叠氮基作为第二原子团的叠氮的原子团(式(2a))的组合、或者、第一原子团包含1,2,4,5-四嗪的原子团(式(1b))与包含反式环辛烯(TCO)作为第二原子团的烯烃的原子团(式(2b))的组合。优选为式(1a)与式(2a)的组合。
[化8]
(式中，R1表示与螯合剂的连接部位，R2表示与抗体中的抗体修饰肽的连接部位。)
[化9]
(式中，R3和R4之中的一者表示与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位，另一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基；R5表示根据R3或R4而与螯合剂或抗体中的抗体修饰肽中任一者的连接部位。)
使用上述式(1a)所示的包含二苄基环辛炔(DBCO)作为第一原子团的炔烃的原子团时，可列举出市售的各种DBCO试剂。具体而言，可以选择例如DBCO-C6-酸、二苄基环辛炔-胺、二苄基环辛炔马来酰亚胺、DBCO-PEG-酸、DBCO-PEG-NHS酯、DBCO-PEG-醇、DBCO-PEG-胺、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基罗丹明-PEG-DBCO、磺基罗丹明-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-马来酰亚胺、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，优选使用二苄基环辛炔马来酰亚胺。
在工序(A)中，更优选使用具有下述式(ii)所示结构的螯合剂。
A-B-C…(ii)
式(ii)中，A为下述式(iia)所示的螯合部。
[化10]
(iia)
式(iia)中，Ra、Rb和Rc独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数，Rd或Re中的任一者为与B的结合部位(*)，另一者为氢原子或者包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团，p为0以上且3以下的整数。
式(ii)中，B用下述式(iib)表示。
[化11]
(iib)
式(iib)中，La和Lb独立地是至少包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，t为0以上且30以下的整数，s为0或1，*为与A的结合部位，**为与C的结合部位。
式(ii)中，C为下述式(iic)所示的炔烃衍生物或式(iid)所示的四嗪衍生物中的任一者。
[化12]
式(iic)中，X为CHRk-**或N-**，Y为CHRk或C＝O，Rk独立地为氢原子或者碳原子数1以上且5以下的烷基，在X为CHRk-**且Y为CHRk的情况下，Rk部分任选一同形成环烷基，Rf、Rg、Rh和Ri独立地为氢原子、卤素原子、碳原子数1以上且5以下的烷基，Rf与Rg任选一同形成烃环，或者，Rh与Ri任选一同形成烃环，**表示与B的结合部位，式(iid)中，**表示与B的结合部位，Rj表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基。
作为工序(A)中使用的螯合剂，更优选为上述式(iia)中的Ra～Rd为-(CH2)pCOOH、p为1、Re为与B的结合部位的DOTA衍生物；或者，Ra～Rc为-(CH2)pCOOH、p为1、Rd为与B的结合部位、Re为氢原子的DO3A衍生物；或者DOTAGA衍生物中的任一者。
式(ii)中，在A为上述DOTA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位；或者，B更进一步优选为下述DOTA-PEGt-Tz衍生物，其中，La为包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iid)所示的四嗪衍生物。
式(ii)中，在A为上述DO3A衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DO3A-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
式(ii)中，在A为上述DOTAGA衍生物的情况下，B更进一步优选为下述DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中，La为包含酰胺键或硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，s为0或1，s为1时，t为0以上且30以下的整数，Lb为包含酰胺键或包含硫脲键的碳原子数1以上且50以下的键合接头，C为式(iic)所示的炔烃衍生物，式(iic)中，X为N-**，Y为CHRk，Rk为氢原子，Rf与Rg一同形成苯环，Rh与Ri一同形成苯环，**为与B的结合部位。
螯合剂与锕-225的摩尔比率以螯合部/锕-225计，下限优选为10/1以上，更优选为100/1以上，进一步优选为500/1以上，上限优选为10000/1以下，更优选为8000/1以下，进一步优选为7000/1以下，例如，优选为100/1以上且7000/1以下的范围，更优选为500/1以上且7000/1以下的范围。
络合物形成反应优选在溶剂中进行。作为溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES缓冲液)或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。
溶剂的液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点出发，在工序(A)开始时，下限为0.01mL以上、优选为0.1mL以上、更优选为1.0mL以上、进一步优选为10mL以上、更进一步优选为100mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1.0mL以下，例如为0.01mL以上且100mL以下的范围。
关于络合物形成反应的反应液中的螯合剂的浓度，从作为目标的螯合剂的收率的观点出发，在工序(A)开始时，下限各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更优选为1μmol/L以上，上限各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下、进一步优选为10μmol/L以下，可列举出例如1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
作为络合物形成反应的温度，例如可以为室温(25℃)，也可以为在加热条件下，从兼顾螯合剂的分解抑制和络合物的形成效率提高的观点出发，下限优选为20℃以上、更优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上、更进一步优选为37℃以上、特别优选为45℃以上，上限优选为150℃以下、更优选为120℃以下、进一步优选为100℃以下、更进一步优选为90℃以下，例如优选为30℃以上且100℃以下的范围，更优选为35℃以上且90℃以下的范围。
以上述反应温度为条件，反应时间的下限优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上、进一步优选为20分钟以上、更进一步优选为30分钟以上、特别优选为45分钟以上，上限优选为180分钟以下、更优选为150分钟以下、进一步优选为120分钟以下、更进一步优选为90分钟以下、特别优选为60分钟以下，例如，优选为10分钟以上且150分钟以下的范围，更优选为10分钟以上且60分钟以下的范围。
工序(B)中使用的抗体是使用具有前述(i)所示的抗体修饰肽和能够发生点击反应的第二原子团的抗体修饰接头，位点特异性地修饰在上述“(1-2)抗体”一项中详述的人源化抗体的Fc区域(恒定区)而得到的肽修饰抗体。
抗体修饰肽可通过组合使用氨基酸(天然氨基酸和非天然氨基酸均可)，并供于例如液相合成法、固相合成法、自动肽合成法、基因重组法和噬菌体展示法等肽合成法来制造。在肽的合成中，根据需要可以进行所使用的氨基酸的官能团的保护。它们可按照例如国际公开2017/217347号单行本和国际公开2018/230257号单行本中记载的方法来进行。
抗体修饰接头可以为抗体修饰肽与下述式(S1)所示的接头结合而成的接头。
*-((L1)m-Z)k-L2-AG2…(S1)
(式中，*表示与肽的N末端或C末端的结合部位，
L1为聚乙二醇(PEG)接头部，
m为1以上且50以下的整数，
Z为将(L1)m与L2键合的第二接头部，
k为0或1，
L2为第二PEG接头部，
AG2为第二原子团。)
在前述式(S1)中，Z的结构只要是将(L1)m与L2彼此键合的接头结构即可，没有特别限定，可以包含例如由1个以上且5个以下的氨基酸残基构成的氨基酸序列。在该情况下，Z中包含的氨基酸序列优选包含半胱氨酸残基，更优选为借助通过半胱氨酸残基的硫醇基与马来酰亚胺基的键合而形成的硫醚基，与L2进行键合。
本发明中，构成L2的PEG接头部优选具有下述式(P2)所示的结构。式(P2)中，n为整数，优选为1以上且50以下，更优选为1以上且20以下，进一步优选为2以上且10以下，更进一步优选为2以上且6以下。
[化13]
(P2)
PEG接头部的结构的一端可以用来自市售的PEG化试剂的结构或者来自在PEG化时通常使用的试剂的结构进行修饰，没有特别限定，可例示出例如来自二甘醇酸或其衍生物、马来酰亚胺或其衍生物的结构。
向抗体修饰接头中导入前述第二原子团的方法可列举出下述方法：通过上述方法而得到具有期望的氨基酸序列的抗体修饰肽后，将该肽溶解于添加有溶解辅助剂和还原剂、以及根据需要的酸的溶液中，向该溶液中添加作为第二原子团的包含叠氮基或反式-环辛烯(TCO)的原子团的有机溶剂溶液，并在室温下进行搅拌来导入。
在导入包含叠氮基的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用市售的叠氮基导入试剂，并按照常规方法向肽的N末端或C末端直接导入叠氮基；或者，借助上述接头结构来导入包含叠氮基的原子团。作为所使用的叠氮基导入试剂，可列举出例如甲硅烷基叠氮化物、磷酸叠氮化物、烷基铵叠氮化物、无机叠氮化物、磺酰基叠氮化物或PEG叠氮化物等。
另外，在导入包含TCO的原子团作为第二原子团的情况下，可以使用包含TCO的市售的点击化学用试剂，并按照常规方法，向肽的N末端或C末端直接导入TCO；或者，经由上述接头结构来导入包含TCO的原子团。
使抗体修饰肽与抗体结合而得到肽修饰抗体的方法可使用例如交联剂来进行。交联剂是指用于使抗体修饰肽与抗体借助共价键进行连接的化学物质，作为其例子，可列举出：双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)等有限包含2个以上琥珀酰亚胺基的交联剂；包含己二亚氨酸二甲酯等优选包含2个以上亚胺酸部分的化合物或其盐的交联剂；以及包含3,3’-二硫代双丙亚胺酸二甲酯、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸等具有二硫醚键的化合物或其盐的交联剂等。通过使用这种交联剂，从而能够在抗体修饰肽中的Xaa2的氨基酸残基与抗体之间发生交联反应。在使用例如本发明的人源化抗体作为抗体的情况下，抗体中的交联反应在Xaa2的氨基酸残基与本发明的人源化抗体中的基于Eu编号的Lys252残基之间位点特异性地发生。这些Lys残基存在于本发明的人源化抗体中的Fc区域。
抗体修饰肽与抗体的结合方法可通过使例如上述抗体修饰肽、抗体、交联剂和根据需要的催化剂在10℃以上且30℃以下的环境下分散在适当的缓冲液中来进行。反应时间可以设为10分钟以上且2小时左右。肽与抗体的反应时的摩尔比率以抗体/肽计，下限优选为1/5以上、更优选为1/3以上、进一步优选为1/1.5以上，上限优选为20/1以下、更优选为10/1以下、进一步优选为5/1以下、更进一步优选为1/1以下、特别优选为1/1.7以下，例如优选为1/5以上且20/1以下的范围，更优选为1/1.5以上且1/1.7以下。
历经上述工序而得到的肽修饰抗体是以任意比例含有相对于1分子抗体结合有1分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“一价抗体”)和相对于1分子抗体结合有2分子抗体修饰肽的抗体(以下称为“二价抗体”)的混合物，可以将其直接供于后续工序，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、各种色谱等方法对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化后，仅将任意价数的抗体供于后续工序。经纯化的结果，在未修饰抗体与其它价数的抗体无法分离的情况下，可以以含有它们的混合物的形式供于之后的工序。
在对未修饰抗体、一价抗体和二价抗体进行分离纯化的情况下，可以利用上述的任意纯化方法进行分离纯化，优选使用填充有各种填充剂的柱，更优选使用填充有适于抗体等蛋白质的分离纯化的填充剂的柱。
作为适于抗体等蛋白质的分离纯化的填充剂，只要是与抗体特异性结合的免疫球蛋白结合性蛋白质固定于由水不溶性基材形成的载体而得到的填充剂即可，没有特别限定。作为免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举出例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L等。这些免疫球蛋白结合性蛋白质可以为经基因操作的重组型，作为重组型的免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举出基因改变型蛋白质A、基因改变型蛋白质G、或者蛋白质A的域与蛋白质G的域的融合型。本发明中，作为至少适于一价抗体与二价抗体的分离纯化的填充剂，更优选为蛋白质A，进一步优选为基因改变型蛋白质A。此处，蛋白质A和蛋白质G是指能够与作为抗体分子的IgG特异性结合的蛋白质分子，根据被分离的微生物来源的差异而分类为蛋白质A(金黄色葡萄球菌：Staphylococcus aureus)或蛋白质G(链球菌：Streptococcus属)。基因改变型蛋白质A是指对蛋白质A的IgG结合域(E、D、A、B和C域)中的任意域的氨基酸残基导入有至少1个氨基酸突变的蛋白质A，在本发明中，优选为使导入有至少1个氨基酸突变的域发生多聚化而得到的基因改变型蛋白质A，更优选为使蛋白质A的导入有至少1个氨基酸突变的A、B或C域发生多聚化而得到的蛋白质，更进一步优选为多聚化至二聚物以上且五聚物以下而得到的蛋白质。氨基酸突变可以来自基因转录翻译工序中的氨基酸序列或者编码氨基酸的碱基序列的替换、缺失、插入等任意突变。没有特别限定，作为一例，可列举出国际公开2003/080655号单行本、国际公开2011/118699号单行本中记载的基因改变型蛋白质A等。
作为对免疫球蛋白结合性蛋白质加以固定化的水不溶性基材，可列举出玻璃珠、硅胶等无机载体；交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子；包含结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类的有机载体；进而，通过它们的组合而得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。
作为填充上述基因改变型蛋白质A作为填充剂而得到的柱，以例如カネカ公司的KanCap(注册商标)系列(KANEKA KanCapA prepacked column)、GEヘルスケア公司的HiTrap(注册商标)系列(HiTrap Mabselect、HiTrap Mabselect SuRe、HiTrap MabselectXtra)、GEヘルスケア公司的HiScreen系列(HiScreen Mabselect SuRe)或东曹公司的TOYOPEARL(注册商标)系列(TOYOPEARL AF-rProtein A-650F)等的形式上市销售。
以下，以对工序(B)中的点击反应所使用的肽修饰抗体进行分离纯化的情况为例进行说明。
肽修饰抗体历经抗体修饰工序和抗体纯化工序而供于工序(B)中的点击反应，所述抗体修饰工序利用具备抗体修饰肽的接头(抗体修饰接头)位点特异性地修饰抗体的Fc区域而得到修饰抗体，所述抗体纯化工序使用固定有上述免疫球蛋白结合性蛋白质的载体对修饰抗体进行纯化。另外，抗体纯化工序还包括：保持工序，将要被载体保持的修饰抗体保持于载体；清洗工序，对未被载体保持的修饰抗体进行清洗；以及洗脱工序，将在保持工序中被载体保持的修饰抗体洗脱。
更具体而言，在抗体修饰工序中，以包含未修饰有抗体修饰接头的未修饰抗体、一价抗体和二价抗体的混合物的形式获得修饰抗体，在抗体纯化工序中，利用未修饰抗体、一价抗体和二价抗体分别相对于免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的差异，分别洗脱包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物和包含相对较多的二价抗体的第二抗体组合物。即，在抗体纯化工序之中，在保持工序和清洗工序中，包含相对较多的与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的程度低的肽修饰抗体(二价抗体)的第二抗体组合物发生洗脱，在抗体纯化工序之中，在洗脱工序中，包含相对较多的与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用的程度高的肽修饰抗体(未修饰抗体和一价抗体)的第一抗体组合物发生洗脱。此处，“包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体”是指：第一抗体组合物中包含的未修饰抗体与一价抗体的总量多于该抗体组合物中包含的二价抗体，意味着：相对于该抗体组合物中包含的未修饰抗体与修饰抗体的总量(100％)，未修饰抗体与一价抗体的总量优选为55％以上、63％以上、70％以上、80％以上或90％以上，“包含相对较多的二价抗体”是指：第二抗体组合物中包含的二价抗体的量多于该抗体组合物中包含的一价抗体，意味着：相对于该抗体组合物中包含的未修饰抗体与修饰抗体的总量(100％)，二价抗体的量优选为55％以上、63％以上、70％以上、80％以上或90％以上。
在保持工序中，将通过抗体修饰工序而得到的含有未修饰抗体、一价抗体和二价抗体的混合物的溶液添加至柱中，使要被载体保持的未修饰抗体和一价抗体保持于柱，使未被载体保持的二价抗体通过。此处，在保持工序中通过的溶液构成第二抗体组合物的一部分。为了使未修饰抗体和一价抗体易于保持于柱，另外，为了防止它们的聚集或改性，优选将肽修饰抗体的混合溶液用适当的稀释溶剂稀释并添加至柱中。作为稀释溶剂，只要是肽修饰抗体发生溶解而不易在溶剂中发生聚集或改性的溶剂即可，没有特别限定，可以使用水、生理盐水或乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(TRIS)缓冲液、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液等缓冲液等，优选使用上述任意的缓冲液，更优选使用乙酸钠缓冲液。在稀释溶剂中使用缓冲液的情况下，作为缓冲剂的浓度下限，为10mmol/L以上、优选为15mmol/L以上、更优选为20mmol/L以上，作为上限，为1000mmol/L以下、优选为500mmol/L以下、更优选为100mmol/L以下。另外，从降低二价抗体、抗体修饰肽对于柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在清洗工序中，使用清洗溶剂将残留在柱内的修饰抗体从柱中洗脱。在上述保持工序中通过柱后的溶液和在清洗工序中从柱洗脱的溶液中包含相对较多的二价抗体，因此，可以将它们一并用作第二抗体组合物。
作为清洗溶剂，只要是肽修饰抗体发生溶解且不易在溶剂中发生聚集或改性、具备适当的pH缓冲能力的缓冲液即可，没有特别限定，可以使用乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(TRIS)缓冲液、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液等缓冲液等，优选使用上述任意的缓冲液，更优选使用乙酸钠缓冲液。关于清洗溶剂中使用的缓冲剂的浓度，作为下限，为20mmol/L以上、优选为30mmol/L以上，作为上限，为200mmol/L以下、优选为70mmol/L以下。另外，关于清洗溶剂的pH，作为下限，为4.0以上、优选为4.5以上、更优选为4.8以上，作为上限，为7.4以下、优选为6.0以下、更优选为5.2以下。进而，从降低二价抗体、抗体修饰肽对于柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在洗脱工序中，使用洗脱溶剂，将被载体保持的修饰抗体从柱中洗脱。即，使用洗脱溶剂，将包含相对较多的未修饰抗体和一价抗体的第一抗体组合物从柱中洗脱。
作为洗脱溶剂，可以使用乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、柠檬酸缓冲液等缓冲液等。另外，从降低对于抗体修饰接头、未修饰抗体和修饰抗体柱载体的非特异性结合的观点出发，洗脱溶剂可以含有氯化钠、氯化钾等添加剂。洗脱溶剂所含有的添加剂的浓度没有特别限定，可以使用例如0.15mol/L。
在洗脱溶剂包含缓冲剂的情况下，关于缓冲剂的浓度，作为下限，为20mmol/L以上、优选为30mmol/L以上，作为上限，为200mmol/L以下、优选为70mmol/L以下。另外，关于洗脱溶剂的pH，由于会减弱未修饰抗体和一价抗体与免疫球蛋白结合性蛋白质的相互作用，另外，从防止抗体的改性和聚集的观点出发，作为下限，pH优选为3.0以上，作为上限，pH优选为4.2以下。
在抗体纯化工序中获取的第一抗体组合物或第二抗体组合物可以直接用于随后的工序(B)中的点击反应，也可以在调节所含有的肽修饰抗体的蛋白质浓度后，再用于工序(B)中的点击反应。
工序(B)中的点击反应是在螯合剂所具有的能够进行点击反应的第一原子团与肽修饰抗体所具有的能够进行点击反应的第二原子团之间实施的。通过该点击反应，形成将螯合剂与抗体连接的键合基团(能够与抗体复合化的取代基)。
只要肽修饰抗体与工序(A)中得到的络合物能够进行点击反应即可，对它们的添加顺序没有限定，例如，可以向收纳有溶剂的反应容器内添加该络合物和该肽修饰抗体中的一者，接着添加另一者并使其反应，也可以在将该螯合剂和该抗体中的一者分散于溶剂而得到的分散液中添加另一者并使其反应。或者，可以向收纳有溶剂的反应容器内同时添加它们并使其反应。
作为在工序(B)的点击反应中使用的溶剂，可以使用包括水在内的溶剂，可以使用例如水、生理盐水、或者乙酸钠缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或四甲基乙酸铵缓冲液等缓冲液等。在使用缓冲液的情况下，从兼顾络合物和抗体的稳定性以及它们的结合效率的观点来看，将25℃下的pH优选设为4.0以上且10.0以下、进一步优选设为5.5以上且8.5以下。
反应液量没有特别限定，从制造工序中的实用性的观点来看，在工序(B)开始时，下限优选为0.001mL以上、更优选为0.01mL以上、进一步优选为0.1mL以上、更进一步优选为1mL以上，上限优选为1000mL以下、更优选为100mL以下、进一步优选为10mL以下、更进一步优选为1mL以下，例如优选为0.001mL以上且1000mL以下的范围、更优选为0.1mL以上且10mL以下的范围。
另外，关于螯合剂和抗体在反应液中的浓度，在工序(B)开始时，作为下限，各自独立地优选为0.001μmol/L以上、更优选为0.01μmol/L以上、进一步优选为0.1μmol/L以上、更进一步优选为1.0μmol/L以上，作为上限，各自独立地优选为1000μmol/L以下、更优选为100μmol/L以下，例如优选为0.1μmol/L以上且1000μmol/L以下的范围，从作为目标的复合物的收量的观点出发，更优选为1μmol/L以上且100μmol/L以下的范围。
从防止抗体的不希望的变性且提高反应效率的观点来看，关于工序(B)中的点击反应，反应温度的上限优选为50℃以下、更优选为40℃以下。另外，反应温度的下限只要是发生反应的温度即可，没有特别限定，优选为15℃以上。点击反应的反应时间以上述反应温度为条件，优选为5分钟以上、更优选为10分钟以上，且优选为24小时以下、更优选为20小时以下，例如优选为5分钟以上且24小时以下的范围、更优选为10分钟以上且20小时以下的范围。
所得到的复合物可以直接使用，或者，也可以利用过滤过滤器、膜滤器、填充有各种填充剂的柱、色谱等进行纯化。
通过工序(A)和(B)而制造的复合物是与MUC5AC特异性结合的人源化抗体的特定部位(例如抗体的Fc区域的赖氨酸残基)用螯合剂特异性修饰而得到的复合物。该复合物中，相对于1分子的该抗体，具备1分子或2分子的前述螯合剂。螯合剂经由接头位点特异性地修饰本发明的抗体的Fc区。该接头由与螯合剂连接的螯合接头、与该接头连接的第一原子团、能够与第一原子团进行点击反应的第二原子团、与第二原子团连接的抗体修饰接头(包含上述式(i)所示的抗体修饰肽)构成。因此，该接头具有来自第一原子团和第二原子团的化学结构。作为这种化学结构，可以考虑下述式(10a)或(10b)所示的含有三唑骨架的结构或下述式(10c)所示的含有哒嗪骨架的结构。由于式(10a)与式(10b)处于异构体的关系，因此，可以以任意的比例来包含。
[化14]
式(10a)和式(10b)中，R1A表示与螯合接头的结合部位，R2A表示与抗体修饰接头的结合部位。式(10c)中，R3A和R4A之中的一者表示氢原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示与螯合接头的结合部位，R5A表示与抗体修饰接头的结合部位。
(1-5)用于降低肾脏毒性的药剂
本发明的特征在于，组合使用225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和用于降低肾脏毒性的药剂(以下也称为肾脏保护剂)。
225Ac的子体核素之中，221Fr和217At的半衰期短(分别为4.9分钟、32.3毫秒)，因此，可以认为其在与225Ac的分布部位相同的部位发生崩坏。另一方面，213Bi与其它子体核素相比时半衰期长(46分钟)，因此，有报告称其可能在裂变后在生物体内发生再分布，并蓄积于铋的生理蓄积脏器即肾脏。因此，在给药225Ac标记抗体时，作为用于防止来自包含锕-225的药剂的给药或者来自锕-225或锕-225的子体核素的肾毒性的一个方法，可以认为使在生物体内生成的213Bi向肾脏中的蓄积降低是重要的。因此，本发明中使用的肾脏保护剂只要是能够使放射性核素和/或其子体核素、优选使213Bi向肾脏中的蓄积降低的药剂即可，没有特别限定。可列举出例如降压剂、抗凝剂(肝素、华法林等)、抗血小板剂(双嘧达莫、盐酸地拉卓等)、口服吸附剂(球形吸附炭等)、类固醇剂(地塞米松、泼尼松龙等)、免疫抑制剂(咪唑立宾、环孢素等)等。作为降压剂，可列举出例如血管紧张肽II受体拮抗剂(例如氯沙坦、坎地沙坦、厄贝沙坦、缬沙坦、依普罗沙坦、替米沙坦)、血管紧张肽转换酶抑制剂(例如依那普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、卡托普利、依那普利拉、阿拉普利、培哚普利叔丁胺盐、地拉普利、喹那普利、雷米普利、西拉普利、福辛普利、群多普利、替莫普利、莫昔普利、螺普利、佐芬普利)、Ca拮抗剂(例如氨氯地平、硝苯地平、尼卡地平、地尔硫卓、马尼地平、贝尼地平、尼伐地平、尼群地平、尼索地平、巴尼地平)、金属去除剂(例如DTPA、Ca-DTPA或Zn-DTPA)、利尿剂(例如螺内酯、氢氯噻嗪、呋塞米、氨苯蝶啶、依普利酮)、α阻断剂(例如多沙唑嗪、哌唑嗪、布那唑嗪、特拉唑嗪、乌拉地尔)和β阻断剂(例如美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、阿罗洛尔、塞利洛尔、倍他洛尔)。
肾脏保护剂可以为上述化合物的药学上可接受的前体药物和它们的药学上可接受的盐。
优选为利尿剂或金属去除剂，更优选为选自DTPA、Ca-DTPA和Zn-DTPA中的金属去除剂或者选自呋塞米、螺内酯和依普利酮中的利尿剂。更进一步优选为Zn-DTPA或呋塞米。
(1-6)放射性药物(放射性抗肿瘤剂)
利用上述(1-4)所示的方法而制造的复合物(225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体)可以与上述(1-5)中记载的用于降低肾脏毒性的药剂(肾脏保护剂)组合用作放射性抗肿瘤剂(以下在本说明书中也称为放射性抗肿瘤剂1)。作为本发明的另一实施方式，可以用作包含利用上述(1-4)所示的方法而制造的复合物(225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体)和上述(1-5)中记载的用于降低肾脏毒性的药剂(肾脏保护剂)作为有效成分的放射性抗肿瘤剂(以下在本说明书中也称为放射性抗肿瘤剂2)。
本发明的放射性抗肿瘤剂1或放射性抗肿瘤剂2中的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的量根据该放射性抗肿瘤剂的给药形态(后述)、疾病的严重程度、成为给药对象的动物种类、给药对象的药物接受性、体重、年龄等而异。通常，成人每次可以给药250kBq/kg以下。即便是每次80kBq/kg以下的用量也能够发挥效果。在该情况下，通常只要组合使用的肾脏保护剂的用量为临床上使用的用量即可，没有特别限定。例如，在肾脏保护剂为金属去除剂的情况下，成人每日以500～2000mg、优选以700～1500mg、更优选以800～1200mg的用量来使用，作为更具体的例子，在组合Ca-DTPA或Zn-DTPA作为金属去除剂的情况下，成人每日特别优选为900～1100mg。另外，在肾脏保护剂为利尿剂的情况下，成人每日以10～200mg、优选以20～150mg、更优选以40～100mg的用量来使用，作为更具体的例子，在组合呋塞米作为利尿剂的情况下，成人每日特别优选为40～80mg的用量，在组合螺内酯或依普利酮作为利尿剂的情况下，成人每日特别优选为50～100mg的用量。
作为本发明的放射性抗肿瘤剂1中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和与其组合给药的肾脏保护剂的给药形态没有特别限定，在给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体时，只要由包含锕-225的药剂的给药导致的或者由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾毒性降低即可。关于作为本发明的放射性抗肿瘤剂1中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的给药形态，可列举出口服给药或者静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等非口服给药，优选为静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等非口服给药，更优选为静脉内给药。
另外，关于作为本发明的放射性抗肿瘤剂1中的有效成分的肾脏保护剂的给药形态，可列举出口服给药或者静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等非口服给药，这些肾脏保护剂优选为在临床上使用的给药形态，更优选根据上述肾脏保护剂的种类进行选择。例如，如果肾脏保护剂为血管紧张肽II受体拮抗剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、Ca拮抗剂、利尿剂、α阻断剂或β阻断剂，则优选为口服给药，如果为金属去除剂，则优选为静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等的非口服给药，更优选为静脉内给药、皮下给药或腹腔内给药。同样地，作为本发明的放射性抗肿瘤剂2中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂的给药形态没有特别限定，在给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体时，只要由包含锕-225的药剂的给药导致的或者由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾毒性降低即可。关于作为本发明的放射性抗肿瘤剂2中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂的给药形态，可列举出口服给药或静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等非口服给药，优选为静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药等非口服给药，更优选为静脉内给药。
作为本发明的放射性抗肿瘤剂1或本发明的放射性抗肿瘤剂2的给药形态，可列举出例如：
(1)将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体与肾脏保护剂同时制剂化而得到的单一制剂形式的给药；
(2)将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂分别制剂化而得到的两种制剂的同一给药路径下的同时给药；
(3)将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂分别制剂化而得到的两种制剂的同一给药路径下的隔开时间差的给药；
(4)将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂分别制剂化而得到的两种制剂的不同给药路径下的同时给药；
(5)将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂分别制剂化而得到的两种制剂的不同给药路径下的隔开时间差的给药等。
从简便性的观点出发，优选为单一制剂形式的给药或两种制剂的同一路径下的同时给药。从使降低肾脏保护剂的肾脏毒性的效果最大化的观点出发，两种制剂的同一给药路径下的隔开时间差的给药或者两种制剂的不同给药路径下的隔开时间差的给药也是优选方式。
在前述隔开时间差的给药的情况下，包括在给药肾脏保护剂之前给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的情况以及在给药肾脏保护剂后给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的情况这两种情况。
制剂化可通过例如使本发明的复合物和/或肾脏保护剂分别溶解于以水为主体且与生物体大致等张的溶剂来实施。根据需要，可以包含药学上可接受的其它成分。
本发明中，在简称为“放射性抗肿瘤剂”的情况下，意味着包括本发明的放射性抗肿瘤剂1和2，还包括将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂同时制剂化而得到的单一制剂、以及将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂分别制剂化而得到的两种制剂各自中的任一者。
本发明的放射性抗肿瘤剂中，除了包含作为有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂之外，可以包含任选的添加物、例如药物上可接受的载体。作为药物上可接受的载体，可列举出例如蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯树胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等结合剂；淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、钠-二醇-淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、AEROSIL、滑石、月桂基硫酸钠等润滑剂；柠檬酸、薄荷脑、甘氨酰基赖氨酸铵盐、甘氨酸、橙粉等芳香剂；苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、甲基对羟基苯甲酸、丙基对羟基苯甲酸等保存剂；柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂；甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂；表面活性剂等分散剂；水、生理盐水、橙汁等稀释剂；可可脂、聚乙二醇、精制煤油等底蜡等，但不限定于它们。
一个实施方式中，本发明的放射性抗肿瘤剂可以制成适合于口服给药的制剂来进行处方。适合于口服给药的制剂是在水、生理盐水那样的稀释液中溶解有有效量的物质的液体制剂；以固体、颗粒的形式包含有效量的物质的胶囊剂、颗粒剂、散剂或片剂；在适当的分散介质中悬浮有有效量的物质的悬浮液体制剂；将溶解有有效量的物质的溶液分散至适当的分散介质中并使其乳化而得到的乳剂等。
作为本发明的放射性抗肿瘤剂1中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和与其组合给药的肾脏保护剂的给药路径没有特别限定，在给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体时，只要由包含锕-225的药剂的给药导致的或者由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾毒性降低即可。同样地，作为本发明的放射性抗肿瘤剂2中的有效成分的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂的给药路径没有特别限定。在给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体时，只要由包含锕-225的药剂的给药导致的或者由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾毒性降低即可。作为这种给药路径，可列举出例如(1)静脉内注射225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体，口服给药肾脏保护剂；(2)静脉内注射225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂这两者等。
在其它实施方式中，本发明的放射性抗肿瘤剂可以制成适合于非口服给药的制剂来进行处方。作为适合于非口服给药(例如静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入等)的制剂，有水性和非水性的等张无菌的注射液体制剂，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂、等张化剂等。另外，可列举出水性和非水性的无菌的悬浮液体制剂，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。该制剂可以如安瓿、管瓶那样地分别将单位给药量或多次给药量封入至容器中。另外，也可以在下述状态下加以保存：将有效成分和药物上可接受的载体进行冻结干燥，并在即将使用之前溶解或悬浮于适当的无菌溶剂即可。
使用225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和肾脏保护剂作为有效成分的本发明的放射性抗肿瘤剂对于哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、绵羊、山羊、狗、猫、猪、牛、马)、优选对于人具有抗肿瘤效果，因此，作为各种癌症的治疗用途是有用的。
作为优选的对象疾病，可列举出胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌或子宫内膜癌，特别优选应用于胰腺癌。
作为本发明中要治疗的癌症的例子，也可列举出胆管癌。
另外，有多个报告称MUC5AC为CA19-9的抗原载体(PLoS ONE(December2011,Volume6,Issue12,e29180,p1-10))。因此，作为本发明中要治疗的癌症，也可列举出过度表达CA19-9的胆管癌、子宫癌、肺癌或食道癌，能够高效地进行治疗。
根据上述本发明的实施方式，提供对于MUC5AC的特异性和在肿瘤中的蓄积性优异且肾脏毒性得以降低的放射性抗肿瘤剂。
本发明的上述实施方式包括以下的技术思想。
[1]放射性抗肿瘤剂，其与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，且包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体(用锕-225标记且与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体)作为有效成分。
[2]放射性抗肿瘤剂，其包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体(用锕-225标记且与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体)和用于降低肾脏毒性的药剂作为有效成分。
[3]根据上述[1]或[2]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，用于降低肾脏毒性的药剂为用于降低由包含锕-225的药剂的给药导致的肾脏毒性的药剂。
[4]根据上述[1]或[2]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，用于降低肾脏毒性的药剂是用于降低由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾脏毒性的药剂。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述肾脏毒性是在给药前述放射性抗肿瘤剂后经过10个星期以上后产生的迟发型肾脏毒性。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述用于降低肾脏毒性的药剂为利尿剂或金属去除剂。
[7]根据上述[6]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述金属去除剂包含DTPA、Ca-DTPA或Zn-DTPA。
[8]根据上述[7]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述金属去除剂包含Zn-DTPA。
[9]根据上述[6]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述利尿剂包含呋塞米、螺内酯或依普利酮。
[10]根据上述[9]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述利尿剂包含呋塞米。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述抗MUC5AC人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区由下述氨基酸序列构成：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)、与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；或者
(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)、与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列，
所述轻链可变区由下述氨基酸序列构成：
(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)、与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列；或者
(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)、与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上或95％以上的序列同一性的氨基酸序列、或者在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中缺失、替换或添加3个、2个或1个氨基酸而得到的氨基酸序列。
[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述抗MUC5AC人源化抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列构成，
所述轻链可变区由(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体是由锕-225络合形成的螯合剂与前述抗MUC5AC人源化抗体的复合物，前述抗MUC5AC人源化抗体的Fc区域借助接头用前述螯合剂位点特异性地进行修饰。
[14]根据上述[11]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述接头包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的肽，所述接头通过用交联剂修饰的前述肽与前述抗体的交联反应来形成。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
(式中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接，Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用前述交联剂进行修饰。)
[15]根据上述[13]或[14]所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构。
[化15]
(A)
(式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团；R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基；p为0以上且3以下的整数；R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子，R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。)
[16]根据上述[1]～[15]中任一项所述的放射性抗肿瘤剂，其用于治疗胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌或胆管癌。
[17]用于降低肾脏毒性的药剂，其与包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂组合使用。
[18]根据上述[17]所述的药剂，其中，该用于降低肾脏毒性的药剂为利尿剂或金属去除剂。
[19]组合药物，其具有：包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂、以及用于降低肾脏毒性的药剂。
[20]肿瘤的治疗方法，其特征在于，对哺乳动物组合给药有效量的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和有效量的用于降低肾脏毒性的药剂。
[21]225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的用于制造与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用的放射性抗肿瘤剂的用途。
[22]225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和用于降低肾脏毒性的药剂的用于制造放射性抗肿瘤剂的用途。
[23]抗体，其为用于治疗肿瘤的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体，其特征在于，与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用。
[24]用于治疗肿瘤的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体与用于降低肾脏毒性的药剂的组合。
[25]试剂盒，其用于制造与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用的放射性抗肿瘤剂，所述试剂盒包含由锕-225络合形成的螯合剂和抗MUC5AC人源化抗体，前述抗MUC5AC人源化抗体为上述[11]或[12]所述的抗体。
[26]试剂盒，其用于制造放射性抗肿瘤剂，所述试剂盒包含由锕-225络合形成的螯合剂、抗MUC5AC人源化抗体和用于降低肾脏毒性的药剂，前述抗MUC5AC人源化抗体为上述[11]或[12]所述的抗体。
[27]试剂盒，其用于治疗癌症，所述试剂盒包含用于降低肾脏毒性的药剂、由锕-225络合形成的螯合剂和抗MUC5AC人源化抗体，前述抗MUC5AC人源化抗体为上述[11]或[12]所述的抗体。
[28]试剂盒，其用于癌症的RI内服疗法，所述试剂盒包含用于降低肾脏毒性的药剂、由锕-225络合形成的螯合剂和抗MUC5AC人源化抗体，前述抗MUC5AC人源化抗体为上述[11]或[12]所述的抗体。
根据本发明的放射性抗肿瘤剂，含有具备与MUC5AC特异性结合的人源化抗体和放射α射线的锕-225的复合物作为有效成分，因此，通过将其用于癌症的RI内服疗法，从而对表达MUC5AC的肿瘤特异性地蓄积，不对正常细胞造成影响，能够肿瘤细胞特异性地照射α射线，能够得到更高的安全性和治疗效果。进而，由于与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，因此，降低在癌症治疗中担心的副作用。
以下，通过实施例等来详细说明本发明，但本发明不限定于它们。
实施例
制造例1.抗MUC5AC人源化抗体的制造
边考虑呈现适合于CHO细胞中的表达的密码子用法，边将增加有信号序列的各种可变区的氨基酸序列和各种恒定区的氨基酸序列转换成碱基序列。在信号序列的开始密码子部位增加科扎克序列，在恒定区的C末端侧增加终止密码子。进而，在科扎克序列的上游和终止密码子的下游增加限制酶位点，使得其能够导入至哺乳类细胞表达用质粒(pcDNA3.4)的表达用基因导入位点。这样设计的各DNA片段通过化学合成来制作。使用融合PCR将包含形成目标H链和目标L链那样的可变区的DNA片段与包含恒定区的DNA片段进行连接。
对制作的各种抗体基因进行限制处理后再进行纯化。同样地，哺乳类细胞瞬时表达用质粒(pcDNA3.4)也利用相同的限制酶进行处理后再进行纯化。将两种片段以适当的混合比混合并进行连接。将连接反应液与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，进行转化。对生成的转化物进行菌落PCR、单菌落分离、来自小批量培养液的质粒提取、插入部分的碱基序列测序，选出所设计的抗体基因全长以所设计的序列朝着设想方向正确插入的质粒(大肠杆菌克隆)。针对选出的大肠杆菌克隆体，实施大批量培养，进行包括内毒素去除工序在内的质粒提取/纯化。针对纯化的质粒测定260nm的吸光度，计算浓度。
使用ExpiCHO System(Thermo Fisher Scientific公司制)，实施基于CHO细胞的瞬时表达。从所制作的各H链表达用质粒和各L链表达用质粒中，以呈现目标组合的方式选择1种H链、1种L链，利用脂质转染法进行转染，并进行培养、进料。在自转染起7天～13天后，回收培养液。将经离心分离和过滤器过滤的培养上清添加至ProteinA柱中，利用通常的亲和柱色谱(吸附后清洗、基于酸性缓冲液的洗脱、洗脱液的中和)对抗体进行纯化。针对纯化的抗体测定280nm的吸光度，计算浓度。
使用上述说明的方法，制作下述抗MUC5AC人源化抗体。以下，示出对重链可变区与轻链可变区的组合标注的抗体的编号。
抗体1：H01L03
抗体2：H01L04
抗体3：H02L04
抗体4：H04L04
此处，H01、H02和H04分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的重链可变区，L03和L04分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。以下的实施例中使用的抗体包括重链恒定区1(SEQ ID NO:25)与轻链恒定区1(SEQ ID NO:26)的组合以及上述抗体1～抗体4的重链可变区与轻链可变区的组合。
制造例2.基于肽接头的位点特异性抗体修饰
(1)抗体修饰工序
按照国际公开2017/217347号单行本中记载的方法来制造抗体修饰肽，得到下述式(P3)所示的包含17个氨基酸残基的肽。该肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的Xaa2为赖氨酸残基的序列相同，赖氨酸残基的侧链末端氨基用R1所示的结构修饰。另外，两个半胱氨酸残基彼此形成二硫醚键，肽的N末端经由具有二甘醇酸和8个PEG的接头结构而键合有乙基叠氮来作为原子团，所述原子团包含作为第二原子团的叠氮基。
[化16]
(式(P3)中，Gly表示甘氨酸，Pro表示脯氨酸，Asp表示天冬氨酸，Cys表示半胱氨酸，Ala表示丙氨酸，Tyr表示酪氨酸，His表示组氨酸，Lys表示赖氨酸，Glu表示谷氨酸，Leu表示亮氨酸，Val表示缬氨酸，Trp表示色氨酸，Thr表示苏氨酸，Phe表示苯丙氨酸。)
使将该肽和制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体(抗体1)混合至乙酸钠缓冲液(pH6.0)而得到的混合液在室温下反应30分钟，得到包含肽修饰抗体的溶液。该肽修饰抗体利用上述肽位点特异性地修饰抗体的Fc区域。
(2)肽修饰抗体分离工序
将该肽修饰抗体用1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)稀释，添加至ProteinA柱(GEヘルスケア公司制、HiTrap MabSelect SuRe)中，流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.7)，回收修饰有2分子肽的肽修饰抗体(以下也称为“二价抗体”)，以回收的级分中包含的二价抗体的浓度成为15mg/mL的方式调整浓度。其后，向ProteinA柱中流通含有0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L乙酸钠缓冲液(pH3.5)，回收修饰有1分子肽的肽修饰抗体(以下也称为“一价抗体”)，以回收的级分中包含的一价抗体的浓度成为15mg/mL的方式调整浓度。
制造例3.225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的制造
(1)螯合剂合成工序
将本实施例中使用的螯合部(DOTAGA-DBCO)的结构示于以下的式(L1-5)。式(L1-5)所示的DOTAGA-DBCO按照Bernhard et al.DOTAGA-Anhydride:A Valuable BuildingBlock for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem.Eur.J.2012,18,7834-7841中记载的方法进行制造。使该螯合部分散至作为溶剂的0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)中，制成包含1.7mmol/L螯合部的分散液。使将该分散液0.004mL、含有225Ac离子作为放射性金属源的溶液(由0.2mol/L盐酸水溶液、放射能浓度为1225MBq/mL、Oak RidgeNational Laboratory制制备，液体量为0.004mL)4.9MBq(根据检验日时的放射能进行衰减计算而得到的计算值)和0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)0.06mL混合而得到的反应液在加热条件下发生反应，得到225Ac络合物溶液。螯合部与放射性金属离子的摩尔比率为螯合部:225Ac离子＝约670:1，反应液的加热温度为70℃、加热时间为30分钟。
[化17]
L1-5
利用下述方法来测定所得225Ac络合物的放射化学的纯度。即，将225Ac络合物溶液的一部分用薄层色谱(Agilent公司制、型号：SGI0001、展开溶剂：乙腈/水混合液(体积比为1:1))展开，其后，利用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star)进行测定。将在原点附近检测到的峰的放射能(计数)相对于检测到的总放射能(计数)的百分率设为225Ac络合物的放射化学的纯度(％)。其结果，225Ac络合物的放射化学的纯度为85％。将所得225Ac络合物溶液直接用于标记工序。
(2)标记工序
将制造例2中得到的一价抗体的洗脱液和通过上述(1)工序而得到的225Ac络合物的溶液分别添加至含有0.02mol/L(20mM)抗坏血酸的0.09mol/L乙酸钠缓冲液中，在37℃下使其点击反应120分钟，得到225Ac标记一价抗体。225Ac络合物量和肽修饰抗体量分别为44μmol和46μmol，第一原子团(DBCO)与第二原子团(叠氮)的摩尔比分别约为1:1。
进而，针对在37℃下反应2小时而得到的225Ac标记一价抗体的溶液，使用超滤过滤器(Merck公司制、型号：UFC505096)进行纯化，供于之后的实验。纯化后的225Ac标记一价抗体(根据检验日时的放射能量进行衰减计算而得到的放射能量为0.303MBq)的放射化学的纯度为93％，放射化学的收率为39％。此处，放射化学的纯度是利用薄层色谱进行分析时的与225Ac标记一价抗体相当的峰的放射能计数相对于薄层板的总放射能计数的比例(％)，放射化学的收率是指：由225Ac标记一价抗体的放射能计数算出的放射能量相对于由利用γ射线光谱仪(Ge半导体检测器：GMX10P4-70(ORTEC公司制)、多槽道分析仪：M7-000(セイコー·イージーアンドジー公司制)、数据处理：Spectrum Navigator：DS-P300(セイコー·イージーアンドジー公司制)和Gamma Studio：DS-P600(セイコー·イージーアンドジー公司制))而测得的标记工序开始时的放射能计数算出的放射能量的比例(％)。
实施例1～7、比较例1～5：通过可期待肾脏保护作用的化合物的组合给药而实现 的迟发型的肾脏毒性的降低
实施下述评价：通过组合给药使用225Ac标记DOTAGA-DBCO而制作的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和可期待肾脏保护作用的化合物(肾脏保护剂)，是否确认到由225Ac或225Ac的子体核素放射出的辐射线导致的迟发型的肾脏毒性的降低。
对于CD-1小鼠(5星期龄、雄性、日本チャールスリバー公司制)，以各组n＝5和15kBq/只的用量给药制造例3中制造的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体，按照表1所示的给药量、给药方法、给药次数和初次给药时间组合给药作为肾脏保护剂的Zn-DTPA、呋塞米、螺内酯或依普利酮中的任一者。即，设置仅给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的组(比较例1)、组合给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体和各肾脏保护剂的组(实施例1～实施例7)、以及不给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体而仅给药肾脏保护剂的组(比较例2～5)。将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的给药量、各肾脏保护剂和给饵条件示于表1。在各肾脏保护剂的经皮给药组中使用的缓释片剂使用Innovative Research of America公司制，含有0.004％各肾脏保护剂的混合饲料使用オリエンタル酵母工业公司制。
针对各个体，在自225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药日起的26个星期内(184天内)进行观察。在观察期间内，经时性地进行体重测定、血细胞测定、尿中的肾毒性标记物测定，进行毒性症兆的评价。
[表1]
[评价1]体重变化
将自225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药日起的观察期间内的各组的平均体重推移示于图1～图4。在任意组中均未确认到平均体重减少的倾向。
[评价2]尿中的肾脏毒性标记物
从自225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药日起经过16个星期内的各个体中回收尿，利用ELISA法来测定所得尿样品中的嗜中性白细胞明胶酶结合性脂质运载蛋白(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin；NGAL)和肌酸酐浓度。NGAL值在正常的肾脏中几乎检测不到，但发生肾损伤时，从远侧肾曲小管迅速衍生且来自近侧肾曲小管的再吸收受到阻碍，向尿中排泄的比例增加，被用作肾曲小管损伤标记物。通过所得NGAL值除以肌酸酐值，从而计算尿浓度得以校正的NGAL值(尿中NGAL/肌酸酐比、以下记作尿中N/C比)。算出的尿中N/C比使用Stat PreClinica(タクミインフォメーションテクノロジー公司制)来确认测定值的等分散性，针对全部项目确认等分散性后，进行将225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药组作为对照组的参数检验的基于Dunnett法的显著差异检验。显著水平设为5％。
将给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的第16个星期的尿中N/C比的计算结果示于表2。将腹腔内给药组(实施例1)和口服给药组(实施例2)的尿中N/C比的图示于图5。在第16个星期，在Zn-DTPA组合给药组(实施例1)中，与225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药组(比较例1)相比，确认到N/C比的显著降低。在其它组之中，在基于口服的全部化合物的组合给药组(实施例2～4)和基于经皮的呋塞米的组合给药组(实施例5)中，未确认到统计学的显著差异，但与比较例1中确认到的N/C比的平均值相比，显示出半分钟以下的值。根据这些结果而启示出由口服给药Zn-DTPA、呋塞米、螺内酯、依普利酮的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药引起的肾曲小管障害得以降低的可能性。
[表2]
N/C比
实施例1 0.2±0.17
实施例2 0.3±0.09
实施例3 0.9±0.41
实施例4 1.0±0.59
实施例5 1.7±0.72
实施例6 2.7±2.69
实施例7 10.6±4.94
比较例1 4.0±0.60
比较例2 1.1±0.60
比较例3 1.0±0.81
比较例4 0.8±0.67
比较例5 2.9±3.40
[评价3]剖检和肾脏重量的测定
在观察期间最终日(自225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药日起的第184天)，在异氟烷麻醉下通过放血来进行安乐死和剖检。在剖检后，采取肾脏并测定重量。针对所得脏器重量测定结果(其中不包括实施例7)，确认测定值的等分散性，针对全部项目确认等分散性后，通过参数检验的Tukey法来进行显著差异检验。显著水平设为5％。
经剖检的结果，在任意225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药组中，均未确认到外观外观性的毒性表现。另外，在全部组中，未确认到剖检后的肾脏重量的显著差异(表3)。
[表3]
体重(g) 肾脏的重量(g) 肾脏重量/体重比
实施例1 41.97±3.1 0.58±0.11 0.014±0.002
实施例2 41.30±4.8 0.57±0.11 0.014±0.001
实施例3 39.35±4.5 0.53±0.09 0.013±0.001
实施例4 39.06±2.0 0.53±0.07 0.013±0.001
实施例5 44.48±3.6 0.67±0.15 0.015±0.003
实施例6 40.97±3.4 0.52±0.07 0.013±0.001
实施例7 42.06※1 0.53※1 0.013※1
比较例1 43.14±3.0 0.69±0.14 0.016±0.003
比较例2 44.48±4.5 0.75±0.12 0.017±0.001
比较例3 42.68±2.3 0.78±0.06 0.018±0.000
比较例4 43.90±3.5 0.66±0.05 0.015±0.001
比较例5 46.29±5.6 0.83±0.12 0.018±0.001
*1：在剖检的时间点，n＝2，因此未记载标准偏差值。
[评价4]病理学评价
针对测定脏器重量后的肾脏，利用10％中性缓冲福尔马林液进行1个星期以上的固定操作。针对固定的组织，进行石蜡包埋、薄切(切片厚度：3μm)，对所得组织切片进行苏木精·曙红染色，并供于病理学评价。需要说明的是，评价由具有毒性病理学专业资格的人员来进行。
将各给药组的肾脏的病理学评价结果示于图6。将肾脏的髓质外层的肾曲小管上皮细胞的变性/再生以及伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管的代表性病理学表现分别示于图7和图8。在比较例1中，在全部的5例中确认到髓质外层中的肾曲小管上皮的变性/再生。在比较例1中，任意例子均为弥漫性变化(以下，在该段落中称为“等级2”)。另一方面，在实施例1～7中，5例中有0～2例均是等级2以上的变化。即，在实施例1～6中，髓质外层中的肾曲小管上皮的变性/再生的等级2以上的变化与比较例1相比，出现频率降低。
关于伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管，在比较例1中，5例中有3例确认到在自然发生中也可见到的程度(以下，在本段落中称为“等级1”)，5例中有2例确认到多灶性(以下，在本段落中称为“等级2”)。另一方面，在实施例1中，未确认到伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管的例子为1例，观察到等级1的变化为3例，观察到等级2的变化为1例。另外，在实施例2、5和7中，未确认到等级2以上的该变化。即，在实施例1、2、5和7中，伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管的等级2以上的变化与比较例1相比，出现频率降低。
根据上述结果而示出如下可能性：进行评价的任意化合物均使启示出对肾曲小管上皮造成伤害的变化即髓质外层中的肾曲小管上皮的变性/再生降低，进而示出如下可能性：Zn-DTPA(实施例1)和呋塞米(实施例2、5)也会使伴有炎症性细胞浸润和纤维化的嗜碱性肾曲小管降低。
制造例4.225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的制造
除了将DOTAGA-DBCO变更为下述结构式所示的DOTA-Bn-DBCO之外，按照制造例3进行操作，得到225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体。所得纯化后的225Ac标记一价抗体(放射能量为1,1MBq)的放射化学的纯度为95％，放射化学的收率为23％。
[化18]
实施例8.225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体的稳定性评价
将按照制造例3和4而制造的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体在室温和冷藏下在2个星期内进行保存，在各时间点(0天、1天、2天、7天和14天)评价放射化学的纯度。需要说明的是，自制造结束起的14天内，以225Ac的物理学半衰期作为基准，相当于约1.5个半衰期。
[评价5]放射化学的纯度
放射化学的纯度利用薄层色谱(TLC)进行分析。TLC的条件设为与在制造例3中调查放射化学纯度时使用的条件相同。将结果示于表4。
[表4]
在具有源自DOTAGA-DBCO的结构的制造例3中制造的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体在制造结束后在室温下保存7天时，作为放射化学的纯度，维持了99％以上，在冷藏下保存7天时，作为放射化学的纯度，维持了99％以上。另外，在制造结束后在室温下保存14天时，作为放射化学的纯度，维持了90％以上，在冷藏下保存14天时，作为放射化学的纯度，维持了95％以上。
在具有源自DOTA-Bn-DBCO的结构的制造例4中制造的225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体在制造结束后在室温下保存7天时，作为放射化学的纯度，维持了75％以上，在冷藏下保存7天时，作为放射化学的纯度，维持了90％以上。另外，在制造结束后在室温下保存14天时，作为放射化学的纯度，维持了50％以上，在冷藏下保存14天时，作为放射化学的纯度，维持了85％以上。
综上可以认为：通过将Zn-DTPA、呋塞米、螺内酯和依普利酮与225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体进行组合给药，从而实现下述目的：有助于降低肾曲小管损伤且改善在给药225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体后经过10个星期以上后可能迟发性发生的病理学的毒性表现，降低与225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体给药相伴的肾脏毒性。
参考例1：使用In-111(111In)标记抗体进行的人源化抗体的筛选
参考例1-1：111In标记抗体的制备
为了找出肿瘤蓄积能力高且最大耐用量高的抗MUC5AC抗体，对各种抗体进行111In标记，对荷瘤小鼠进行给药，并进行SPECT-CT拍摄，根据所得图像来计算肿瘤和肝脏的累积放射能量和吸收剂量，并进行对比。
抗体使用4种制造例1中制作的抗MUC5AC人源化抗体和1种专利文献1中公开的抗MUC5AC嵌合抗体，进行111In标记。
专利文献1中公开的嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:23和24)如下所示。
针对具有下述式所示结构的标记前体与各种抗体的复合物进行111In标记。
[化19]
【重链可变区】
【轻链可变区】
[化20]
上述标记前体具有下述结构：作为螯合部的DOTA借助8个聚乙二醇而连接于抗体修饰肽(包含与SEQ ID NO:10的Xaa2为赖氨酸残基的序列具有相同序列的17个氨基酸残基的肽)的N末端，并且，借助该结构中的N-羟基琥珀酰亚胺酯基而连接于各种抗体中的EU编号为第252号的赖氨酸残基。
使该标记前体溶解于450μg作为溶剂的100mmol/L的4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(pH5.5)。将该溶液与含有111In离子作为放射性金属源的溶液(氯化铟(111In)注射液、日本メジフィジックス公司制)(以放射能量计为10MBq)混合，在45℃下进行120分钟的标记反应。
将各种111In标记抗体的放射化学的收率、放射化学的纯度、对动物给药的放射能量示于表5。此处提及的放射化学的收率是指111In标记抗体的放射能量相对于所使用的111In的放射能量。放射能测定使用放射性同位素剂量校准器(CAPINTEC公司制、型号：CRC-15R)。放射化学的纯度是指利用滤纸色谱进行分析时的与111In标记抗体相当的峰的放射能计数相对于滤纸的总放射能计数的比例(％)。滤纸色谱利用滤纸：ADVANTEC公司制、型号：No.590、展开溶剂：0.01％EDTA、50mM柠檬酸-柠檬酸钠水溶液)进行展开，放射能计数的检测使用放射性γ-TLC分析仪(raytest公司制、MODEL GITA Star)。
[表5]
111In标记信息
(平均±标准偏差、n＝4)
参考例1-2：使用荷瘤小鼠进行的体内分布
(荷瘤小鼠的制作方法)
在Balb/c裸小鼠(雄性)的侧腹～背部，皮下给药人胰腺癌细胞株SW1990 0.7×107个。
在移植SW1990 14天后的肿瘤大小约为150-300mm3的时刻，从小鼠尾静脉给药参考例1-1中制备的各种111In标记抗体。另外，肿瘤的体积利用以下的计算式来计算。
肿瘤的体积＝(肿瘤的短径2×肿瘤的长径)/2
[表6]
动物信息(各111In标记抗体给药时)
(平均±标堆偏差、n＝4)
(评价方法)
SPECT-CT造影(小动物用SPECT-CT装置：FX-3000、Trifoil公司制)利用下表的条件来实施。拍摄时间点为给药后的1、6、24、48、72、168小时后。关于图像重建，SPECT利用OSEM法来实施，CT利用FBP法来实施。实施各时间点的肿瘤和肝脏的VOI(volume ofinterest、三维ROI)分析。将每单位体积脏器的计数值校正为％ID/g，将物理半衰期从111In换算成225Ac，校正物理学半衰期的差异，进一步加上生物学半衰期而得到时间放射能曲线。根据该时间放射能曲线的积分值来计算累积放射能量，利用球体模型(OLINDA/EXMver2.0)来计算吸收剂量，利用各抗体对其进行比较研究。其中，针对H01L03，在给药后的168小时未确认到时间放射能曲线的减少，因此，未考虑生物学半衰期，仅加上物理半衰期。
[表7]
SPECT拍摄条件
同位素 铟-111介质+高能量
准直器 MMP952
旋转半径 50mm
发射界限 150sec
发射计数 16
旋转角度 90度
[表8]
CT拍摄条件
发射计数 207个视场
帧平均值 1帧
检测器bining 2x2
X射线管电流 270uA
X射线管电压 60kV
曝光时间 230ms
放大倍数 2.0
(结果)
将实施SPECT-CT拍摄的结果示于图9。将实施各时间点的肿瘤和肝脏的VOI分析的结果示于图10。将表示对给药后168小时后的SPECT-CT拍摄结束后的体内分布/排泄路径进行确认而得到的结果的图示于图11。
关于在肿瘤中的蓄积，使用人源化抗体(H01L03)时最高，另一方面，使用嵌合抗体时最低。关于在肝脏中的蓄积，使用嵌合抗体时最高，使用人源化抗体时，与嵌合抗体相比均低。使用人源化抗体(H01L03)时的排泄最慢，血液滞留性高。在使用任意抗体的情况下，在正常脏器中，均是在肝脏和脾脏中的蓄积高，接着，在肺和肾脏中的蓄积高。
关于将肝脏的阈值剂量设定为30Gy时的最大耐受剂量，在使用人源化抗体(H01L03)时为高达3.90MBq的值，另一方面，在使用嵌合抗体时为低至0.43MBq的值。最大耐受剂量(MBq)通过阈值剂量(Gy)/吸收剂量(Gy/MBq)进行计算。
参考例1-3：体外自动射线照相术
使用参考例1-1中制备的各种111In标记抗体，利用体外自动射线照相术(ARG)评价各种抗体对于MUC5AC的结合性和特异性，将由此得到的图像结果示于图12。另外，将对切片整体设定关注区域(ROI)而算出的ROI中的放射能密度(Bq/mm2)的数值的图示于图13。
使用クリオスタット(Leica公司制)，由将MUC5AC高表达肿瘤(SW1990移植肿瘤组织)或MUC5AC低表达肿瘤(MIAPaCa2移植肿瘤组织)在液态氮中冻结得到的冻结块制作厚度10μm的切片，并用于体外ARG。
将至使用时为止在-80℃下保存的切片恢复至室温，使其干燥30分钟以上后，在磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，接着，在含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中浸渍30分钟，由此进行切片的亲水化。
将亲水化的冻结切片在含有各种111In标记抗体5kBq/mL且含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中分别浸渍30分钟。接着，按照含有1体积％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水的顺序，在各溶液中各浸渍5分钟来进行切片的清洗。将清洗后的切片风干，利用造影板(BAS-SR2040、富士胶片和光纯药公司制)使其曝光约15小时，使用多功能荧光分析仪(Typhoon FLA 7000IP、GEヘルスケア公司制)，得到放射自显影图。针对所得放射自显影图，使用多功能荧光分析仪附带的分析软件“Image Quant TL”，对切片整体设定关注区域(ROI)，计算ROI中的放射能密度(Bq/mm2)。
确认到111In标记的全部人源化抗体保持了对于MUC5AC的结合性和特异性(参照图13、MUC5AC高表达肿瘤的数据)。可确认：与嵌合抗体相比，各种人源化抗体的非特异性结合少(参照图13、MUC5AC低/未表达肿瘤的数据)。
根据参考例1-2、1-3的结果可以明确：人源化抗体与嵌合抗体相比，对于MUC5AC的特异性高，且具有在肿瘤中的高蓄积性和在肝脏等正常脏器中的低蓄积性，因此，提供与RI标记抗体的相关技术相比更优异的传递技术。
将本参考例的结果总结于下表。表中，关于SPECT的吸收剂量，肿瘤体积设为150mm3来进行计算。另外，关于肝脏的吸收剂量，根据本参考例中使用的小鼠肝脏重量的平均值(1.15±0.14g、n＝19)来进行计算。体内分布的数值用n＝4的平均±标准偏差来表示(其中，H02L04为n＝3)。
[表9]
以上，参照实施方式对本发明进行了说明，但本发明不受上述实施方式的限定。本发明的构成、详情可以在本发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
包括此处记载的专利和专利申请说明书在内的全部刊物中记载的内容通过援引至此而以与将其全部明示的程度相同地加入至本说明书中。
产业利用性
根据本发明的放射性抗肿瘤剂，含有具备与MUC5AC特异性结合的人源化抗体和放射出α射线的锕-225的复合物作为有效成分，因此，通过用于癌症的RI内服疗法，从而相对于表达MUC5AC的肿瘤发生特异性蓄积，不对正常细胞造成影响，能够对肿瘤细胞特异性地照射α射线，能够得到更高的安全性和治疗效果。进而，由于与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，因此，在癌症治疗中担心的副作用得以降低。
本申请基于在日本申请的特愿2021-072206(申请日：2021年4月21日)，将其内容全部援引至本说明书中。
序列表
<110> 日本医事物理股份有限公司
<120> 放射性抗肿瘤剂
<130> 093254
<150> JP2021-072206
<151> 2021-04-21
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 1 (H01)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 2 (H02)
<400> 2
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 3 (H03)
<400> 3
Leu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区 4 (H04)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区 1 (L01)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区 2 (L02)
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区 3 (L03)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区 4 (L04)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 9
Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 10
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 11
Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 12
Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe
1 5 10 15
His
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 13
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 14
Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 15
Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 16
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe
1 5 10 15
His
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 17
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His
1 5 10 15
His
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 18
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 19
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 20
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<400> 21
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 抗体结合的肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为同半胱胺酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为赖氨酸, 半胱氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酸, 2-氨基辛二酸, 或二氨基丙酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa为同半胱胺酸
<400> 22
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体重链可变区 7 (H07)
<400> 23
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Pro Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Leu Asp Tyr Ala Asn Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体轻链可变区 8 (L08)
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Phe Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Tyr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定区
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定区
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (17)

1.放射性抗肿瘤剂，其与用于降低肾脏毒性的药剂组合使用，且包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体(用锕-225标记且与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体)作为有效成分。
2.放射性抗肿瘤剂，其包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体(用锕-225标记且与粘蛋白亚型5AC特异性结合的人源化抗体)和用于降低肾脏毒性的药剂作为有效成分。
3.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，用于降低肾脏毒性的药剂是用于降低由包含锕-225的药剂的给药导致的肾脏毒性的药剂。
4.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，用于降低肾脏毒性的药剂是用于降低由锕-225或锕-225的子体核素导致的肾脏毒性的药剂。
5.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述肾脏毒性是在给药前述放射性抗肿瘤剂后经过10个星期以上后产生的迟发型肾脏毒性。
6.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述用于降低肾脏毒性的药剂为利尿剂或金属去除剂。
7.根据权利要求6所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述金属去除剂包含DTPA、Ca-DTPA或Zn-DTPA。
8.根据权利要求6所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述利尿剂包含呋塞米、螺内酯或依普利酮。
9.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述抗MUC5AC人源化抗体具有重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区由下述氨基酸序列构成：
(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)、或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(H02)、或者与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(H03)、或者与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；或者
(4)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(H04)、或者与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列，
所述轻链可变区由下述氨基酸序列构成：
(5)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(L01)、或者与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(6)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(L02)、或者与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；
(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)、或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列；或者
(8)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(L04)、或者与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述抗MUC5AC人源化抗体为具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，
所述重链可变区由(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H01)或者与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列构成，
所述轻链可变区由(7)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(L03)或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
11.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体是由锕-225络合形成的螯合剂与前述抗MUC5AC人源化抗体的复合物，前述抗MUC5AC人源化抗体的Fc区域借助接头用前述螯合剂位点特异性地进行修饰。
12.根据权利要求11所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述接头包含下述式(i)所示的由13个以上且17个以下的氨基酸残基构成的肽，所述接头通过用交联剂修饰的前述肽与前述抗体的交联反应来形成，(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)…(i)
式(i)中，Xa、Xb、Xc和Xd分别表示连续的a个X、连续的b个X、连续的c个X和连续的d个X；
X为在侧链上不具有硫醇基和卤代乙酰基的氨基酸残基；
a、b、c和d各自独立地为1以上且5以下的整数，且满足a+b+c+d≤14；
Xaa1和Xaa3各自独立地表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，或者
一者表示来自在侧链上具有硫醇基的氨基酸的氨基酸残基，另一者表示来自在侧链上具有卤代乙酰基的氨基酸的氨基酸残基，Xaa1与Xaa3连接，Xaa2为赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，其用前述交联剂进行修饰。
13.根据权利要求11所述的放射性抗肿瘤剂，其中，前述螯合剂具有来自下述式(A)所示的化合物或其盐的结构，
[化1]
IA)
式(A)中，R11、R13和R14各自独立地为包含-(CH2)pCOOH、-(CH2)pC5H5N、-(CH2)pPO3H2、-(CH2)pCONH2或-(CHCOOH)(CH2)pCOOH的基团；R12或R15中的一者为氢原子、羧基、或者碳原子数2或3的羧基烷基，另一者为用于与前述抗体复合化的取代基；p为0以上且3以下的整数；R12为用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为氢原子；R12不是用于与前述抗体复合化的取代基时，R15为用于与前述抗体复合化的取代基。
14.根据权利要求1或2所述的放射性抗肿瘤剂，其用于治疗胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌或胆管癌。
15.用于降低肾脏毒性的药剂，其与包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂组合使用。
16.根据权利要求15所述的药剂，其中，该用于降低肾脏毒性的药剂为利尿剂或金属去除剂。
17.组合药物，其具有：
包含225Ac标记抗MUC5AC人源化抗体作为有效成分的放射性抗肿瘤剂；以及
用于降低肾脏毒性的药剂。
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