KR102651537B1 - IgG 결합 펩타이드에 의한 항체의 특이적 변형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IgG 결합 펩타이드, 가교제(cross-linking agent)로 변형된 IgG 결합 펩타이드, 상기 가교제로 변형된 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체(conjugate) 및 상기 복합체를 생산하는 방법 등에 관한 것이다.

Description

IgG 결합 펩타이드에 의한 항체의 특이적 변형{SPECIFIC MODIFICATION OF ANTIBODY BY IgG-BINDING PEPTIDE}
본 발명은 IgG 결합 펩타이드, 가교제(cross-linking agent)로 변형된 IgG 결합 펩타이드, 상기 가교제로 변형된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체(conjugate), 및 상기 복합체를 생산하는 방법 등에 관한다.
항체는 종래부터 각종 연구·개발에 있어서 표적 분자의 검출에 많이 이용되고 있으며, 검출 시약과 진단약으로 산업면에서도 매우 중요하다. 또한 항체는 표적 분자에 대한 특이성에서 질병의 치료를 위한 의약품으로도 주목받고 있다.
항체의 기능 추가를 위한 화학 변형(Chemical modification)으로 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; AP) 또는 퍼옥시데이즈(peroxidase; HRP) 등의 효소(비특허문헌 1-2), 또 방사성 동위 원소에 대한 요오드화(iodation) 및 킬레이트 화합물의 부가(비특허문헌 3), 비오틴 등과 같은 저분자 화합물에 의한 변형(비특허문헌 4)이 이루어져 왔다. 이러한 변형은 주로 라이신의 아미노기(lysine amino group)와 시스테인의 티올기(cysteine thiol group), 및 활성화된 카르복실기(activated carboxyl group) 등을 통해 이루어지고 있으며, 이들은 관능기에 대해 특이적이지만, 부위 특이적(site-specifically)이지 않기 때문에 항체의 항원 결합 부위에 대한 변형 등에 의해 항체의 활성을 저하시키는 등의 문제와, 결합하는 화합물의 수를 컨트롤하기 어려운 등의 문제가 있었다. 최근 등장한 항체 의약의 항체 약물 복합체(ADC)(비특허문헌 5-6)에서도 항암제를 부위 특이적으로 항체에 결합시키기 위해 항체 자체의 활성이 약화되거나 항암제 결합 수의 컨트롤의 어려움에서 그 제제화 단계가 복잡하게 되는 등의 문제가 있었다.
이러한 문제를 극복하기 위해 특정 작용기를 부위 특이적으로 도입한 항체를 사용하여 항체를 변형하는 일이 수행되고 있다. 예를 들어, 비 천연 아미노산(비특허문헌 7-9)과 프리 시스테인(free cysteine)(비특허문헌 10-11)을 특정 부위에 유전자 공학적으로 변경하여 도입함으로써 특정 부위의 변형이 가능하게 되었다. 또한 트랜스 글루타미나제(transglutaminase; TG)를 이용하여 항체 중의 천연 또는 인공적으로 도입된 특정 글루타민을 표적으로 하고 변형하는 것으로 보고되고 있지만(비특허문헌 12-13), 도입하는 화합물의 구조와 표적으로 하는 글루타민 잔기의 공간적 환경에 따라 그 반응 수율이 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 또한 항체의 Fc의 당쇄를 대상으로 하는 변형 기술도 이용되고 있으며(비특허문헌 14-15), 이러한 방법은 부위 특이적이지만, 당쇄의 산화 변형(oxidative modification)이 필요하기 때문에 반응 공정이 복잡한 것 등의 문제가 있다. 이처럼 부위 특이적인 항체 변형 기술은 개발되고 있지만, 대부분의 경우 항체 자체를 항체 공학으로 변경해야 할 필요가 있고, 그 변경에 따른 항체의 기능 저하와 개발의 높은 비용을 생각하면 반드시 유리한 방법이라고 할 수 없다.
[비특허문헌 1] Imagawa, M. et al., Journal of Applied Biochemistry, 1982, 4, pp. 41-57 [비특허문헌 2] Hashida, S et al., Journal of Applied Biochemistry, 1984, 6, pp. 56-63 [비특허문헌 3] Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632-2636 [비특허문헌 4] Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, The third edition, Elsevier, USA, 2013 [비특허문헌 5] Lewis Phillips, G. D. et al., Cancer Research, 2008, 68, pp. 9280-9290 [비특허문헌 6] Boyraz, B. et al., Current Medical Research and Opinion, 2013, 29, pp. 405-414 [비특허문헌 7] Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101-16106 [비특허문헌 8] Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766-1771 [비특허문헌 9] Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351-361 [비특허문헌 10] Shen, B. Q. et al., Nature Biotechnology, 2012, 30, pp. 184-189 [비특허문헌 11] Bernardes, G. J. et al., Nature Protocols, 2013, 8, pp. 2079-2089 [비특허문헌 12] Dennler, P. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 569-578 [비특허문헌 13] Jeger, S. et al., Angewandte Chemie 2010, 49, pp. 9995-9997 [비특허문헌 14] Bejot, R et al., J. Labelled. Compd. Rad., 2012, 55, pp. 346-353 [비특허문헌 15] Zhou, Q. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 510-520
따라서 특이적이고 간편하게(specifically and conveniently) 항체를 변형할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명자들은 지금까지 IgG에 특이적 또는 선택적으로 결합하는 펩타이드 (이하 "IgG 결합 펩타이드"이라 한다)을 보고 해왔다(WO2013/027796 및 WO2008/054030 참조). 상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자는 IgG 결합 펩타이드와 IgG Fc와의 복합체의 X 선 결정 구조 해석에 따라 결합 상태에서 IgG 결합 펩타이드의 각 아미노산의 위치와 IgG Fc의 각 아미노산과의 위치 관계를 상세하게 검토했다. 또한, 가교제와 결합 가능한 아미노산 펩타이드에 도입하고, 상기 아미노산을 가교제에 의해 변형하는 것으로, 가교제에 의해 부위 특이적으로 변형된 IgG 결합 펩타이드를 제조하고, 이를 이용하여 IgG가 변형 가능한 것임을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 하기의 양태를 포함한다.
(1) 하기의 식 I에 의해 나타내지는 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인(cysteine) 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘(histidine) 잔기이며,
Xaa1은 리신(lysine) 잔기, 시스테인(cysteine) 잔기, 아스파르트산(aspartic acid) 잔기, 글루탐산(glutamic acid) 잔기, 2-아미노스베린산(2-aminosuberic acid), 또는 디아미노프로피온산(diaminopropionic acid)이며,
G는 글리신(glycine) 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산(glutamic acid) 잔기 또는 아스파라긴(asparagine) 잔기이며,
L은 류신(leucine) 잔기이며,
V는 발린(valine) 잔기이며, 및
W는 트립토판(tryptophan) 잔기).
(2) 상기 (1)에 있어서, 하기의 식 II에 의해 나타내지는 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
Xaa3은 알라닌(alanine) 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌(threonine) 잔기이며, 및
Xaa4은 티로신(tyrosine) 잔기 또는 트립토판 잔기).
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 하기의 식 III에 의해 나타내지는 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
A는 알라닌 잔기이며,
Y는 티로신 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
E는 글루탐산 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며, 및
W는 트립토판 잔기).
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 17 아미노산 잔기인 경우 N 말단에서 1 내지 3번째 및 15 내지 17 번째의 각 아미노산 잔기가 하기와 같은 펩타이드:
1번째 아미노산 잔기 = S, G, F 또는 없음
2번째 아미노산 잔기 = D, G, A, S, P, 호모시스테인(homocysteine) 또는 없음
3번째 아미노산 잔기 = S, D, T, N, E 또는 R,
15번째 아미노산 잔기 = S, T 또는 D,
16번째 아미노산 잔기 = H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음, 및
17번째 아미노산 잔기 = Y, F, H, M 또는 없음.
(5) 상기 (4)에 있어서, 하기의 1) 내지 15) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 그러나 Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산 또는 디아미노프로피온산이며, Xaa2는 호모시스테인인, 펩타이드:
1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 1)
2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 2)
3) RCAYH (Xaa1) GELVWCS (서열번호 3)
4) GPRCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 4)
5) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 5)
6) GDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 6)
7) GPSCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 7)
8) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 8)
9) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTHH (서열번호 9)
10) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 10)
11) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 11)
12) SDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 12)
13) RGNCAYH (Xaa1) GQLVWCTYH (서열번호 13)
14) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (서열번호 36)
15) RRGPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 37).
(6) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 하기의 식 IV에 의해 나타내지는 13 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(상기 식에서,
D는 아스파르트산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
T는 트레오닌 잔기이며,
Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이며, 및
Xaa4은 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기).
(7) 상기 (6)에 있어서, 하기의 1) 내지 4) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 그러나 Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산 또는 디아미노프로피온산인 펩타이드:
1) DCTYH (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 14)
2) DCAYH (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 15)
3) DCTYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 16)
4) DCAWH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 17).
(8) 하기의 식 V에 의해 나타내지는 13 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(상기 식에서,
D는 아스파르트산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
G는 글리신 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
T는 트레오닌 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산 또는 디아미노프로피온산이며,
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이며,
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa5는 글루탐산 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파르트산 잔기이며, 및
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기).
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 펩타이드가 외부 2개의 시스테인(C) 잔기 사이에 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하거나 또는 펩티드의 바깥 쪽 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹(sulfide group)이 하기 화학식 1로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있는 펩타이드:
(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 표지 물질(labeling agent)에 의해 표지된 펩타이드.
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 약제(drug)가 결합된 펩타이드.
(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, Xaa1이 리신 잔기인 펩타이드.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, Xaa1이 가교제(cross-linking agent)로 변형되는 펩타이드.
(14) 상기 (13)에 있어서, 상기 가교제는 DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS (dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride), 및 DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드.
(15) 상기 (14)에 있어서, 상기 가교제가 DSG (disuccinimidyl glutarate) 또는 DSS (disuccinimidyl suberate)인 펩타이드.
(16) 상기 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 펩타이드 및 IgG의 복합체(conjugate)로, 상기 복합체는 가교제로 변형된 펩타이드 및 IgG의 가교 반응에 의해 형성되는 복합체.
(17) 상기 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 펩타이드 및 IgG를 혼합하여, 가교제로 변형된 펩타이드와 IgG를 가교 반응시키는 공정을 포함하는, 펩타이드 및 IgG의 복합체를 생산하는 방법.
(18) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 펩타이드, 또는 (16)에 기재된 복합체를 포함하는 약학적 조성물.
(19) 시스테인 잔기를 2개 이상 포함하는 펩타이드 및 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물:
(여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 임의의 할로겐 원자)
을 혼합하여, 2개 이상의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹(sulfide group)이 하기의 화학식 3으로 표시되는 링커:
에 의해 연결된 펩타이드를 얻는 공정을 포함하는, 2개 이상의 시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 펩타이드를 생산하는 방법.
(20) 상기 (19)에 있어서, 상기 화합물에서 R1 및 R2가 동일하고, 또한 Cl, Br 또는 I인 방법.
(21) 상기 (19) 또는 (20)에 있어서, 상기 펩타이드가 (1) 내지 (8) 및 (10) 내지 (15) 중 어느 한 항에 따른 펩타이드인 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 2015-103153 호에 공개된 내용을 포함하고 있다.
본 발명의 가교제에 의해 변형된 IgG 결합 펩티드는 단시간에, 게다가 거의 부작용 없이 IgG에 추가 할 수 있기 때문에, 상기 IgG 결합 펩티드에 다양한 화합물을 결합시킴으로써 여러 가지 화합물에 의해 IgG 특이적이고, 간편하게 변형할 수 있다. 또한, 본 발명의 가교제에 의해 변형된 IgG 결합 펩타이드는 야생형(wild-type) IgG 등에 그대로 결합시킬 수 있어, 항체 분자의 배열을 변경할 필요가 없기 때문에 항체 분자의 유전자 변형(genetic engineering)에 따른 기능 저하 없이 보다 저렴한 비용으로 다양한 화합물을 항체에 결합시킬 수 있다. 또한 도입하는 화합물은 IgG 결합 펩타이드에 미리 결합시켜 둘 수 있어, 해당 IgG 결합 펩타이드와 항체와의 결합 반응은 온화한 반응 조건(mild reaction conditions)에서 할 수 있기 때문에, 도입하는 화합물과 IgG를 직접 반응시키는 공정에서 종래 필요로 했던 복잡한 반응을 필요로 하지 않으며, 해당 반응에 의한 항체의 기능 저하를 막을 수 있다.
[도 1] 도 1 (A)는 IgG 결합 펩타이드 (C35A-3/15 : DCAYHRGELVWCT (서열번호 33))와 인간 IgG Fc와의 복합체의 구조를 나타낸다. IgG 결합 펩타이드는 스페이스 필링 모델(space-filling model)로, IgG Fc는 리본 모델(ribbon model)로, Fc의 당쇄를 와이어 모델(wire model)로 나타낸다. 도 1 (B)는 DSG으로 변형된 IgG 결합 펩타이드 (C35A-3/15 (R8K) : DCAYHKGELVWCT (서열번호 34))과 IgG Fc와의 가교 구조의 모델을 보여준다. 펩티드의 주쇄는 리본 모델로 나타낸다. peptide-Lys8는 C35A-3/15 (R8K)의 6번째 리신 잔기를, peptide-Tyr6-Gly9는 C35A-3/15 (R8K)의 4번째 티로신 잔기에서 7번째 글리신 잔기를 나타낸다. 또한 Fc-Lys248는 EU numbering에 따라 Fc의 Lys248을, Fc-Pro247-Asp249은 EU numbering에 따라 Fc의 Pro247에서 Asp249를 나타낸다.
[도 2] 도 2는 표지된 IgG 결합 펩타이드 및 각종 단백질 혼합물의 SDS-PAGE (A) 및 웨스턴 블롯 (B)의 결과를 나타낸다. 도 중 DSG는 DSG (disuccinimidyl glutarate)와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드를, DSS는 DSS (disuccinimidyl suberate)와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드가 처리되었음을 나타낸다. 또한 도 중 hIgG은 인간 IgG를, hIgA은 인간 IgA를, HSA는 사람 혈청 알부민을 각각 나타낸다.
[도 3] 도 3은 표지된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 반응에서, 반응 몰비(A) 및 반응 시간(B)의 ELISA에 의한 검토 결과를 나타낸다. DSS R8K 0 min은 IgG의 10배 몰비의 표지된 IgG 결합 펩타이드 Tris-HCl (pH7.0)을 추가하여 NHS기를 블로킹 후, 웰에 첨가한 것이다. No DSS R8K은 DSS를 결합시키지 않은 비오틴화 IgG 결합(R8K) 펩타이드를 사용한 것이며, no pep은 펩타이드를 첨가하지 않은 컨트롤을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 표지된 IgG 결합 펩타이드의 각 단백질 (hIgA, hIgG, BSA (소 혈청 알부민))에 대한 반응성을, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다. (A)는 DSS에 의해 변형된 IgG 결합 펩타이드의 반응성을, (B)는 DSG에 의해 변형된 IgG 결합 펩타이드의 반응을 측정한 결과를 나타낸다.
[도 5] 도 5 (A)는 인간 IgG의 Fc 용액과, DMF에 용해된 DSG 변형한 IgG 결합 펩타이드를 인간 IgG에 대해 몰비(molar ratio)로 0.5, 1.0, 2.0 또는 5.0 첨가하여 교반 후 실온에서 반응시킨 후, 액체 크로마토그래피(liquid chromatography)의 결과를 나타낸다. 도 5 (B)는 인간 IgG와 DSG 변형한 IgG 결합 펩티드를 각 몰비로 반응시킨 경우의, 미반응(피크 2), 1개의 펩티드의 부가물(피크 3) 및 2개의 펩티드의 부가물(피크 4)의 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
[도 6] 도 6은 pH4.0 (A), pH5.5 (B) 또는 pH7.0 (C)에서 조제한 인간 IgG의 Fc 용액에 대해 DMF에 용해된 DSG 변형한 IgG 결합 펩타이드를 몰비로 1.0 추가하여 교반 후 실온에서 반응시켜 반응의 5 및 10 또는 30분 후, 미반응(피크 2), 1개의 펩티드의 부가물(피크 3) 및 2개의 펩티드의 부가물(피크 4)의 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
[도 7] 도 7A는 유방암 세포주 SK-BR3에서 HER2 항원에 4D5-Fc 항체의 결합을, DSG 변형한 비오틴화(Biotinylated) IgG 결합 펩타이드(Biotin화 IgG 결합 펩타이드) 또는 비오틴화 항인간 IgG 마우스 항체(Anti hIgG mAb-biotin 표지) 및 PE 표지 Streptavidin (SA-PE 표지)에 의해 검출한 결과를 나타낸다. 도 7B는 4D5-Fc 항체를 가하지 않고 동일한 실험 (Biotin 화 IgG 결합 펩타이드 + SA-PE 표지 또는 Anti hIgG mAb-biotin 표지 + SA-PE 표지)를 실시한 결과, 그리고 양성 대조군(positive control)으로 4D5-Fc 항체와 PE 표지 항인간 IgG 마우스 항체(Anti hIgG mAb-PE 표지)를 이용한 결과를 나타낸다.
[도 8] 도 8A는 아지드화 펩타이드(azidated peptide) 항체와 Dibenzocyclooctyne-maleimide 화 VHH와 클릭 반응(Click reaction)에 의한 연결 후 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)의 결과 얻어진 3개의 주요 피크 (a, b 및 c)를 나타낸다. 도 8B는 얻어진 피크의 각각을 환원 상태에서 SDS-PAGE로 분석 한 결과를 나타낸다. 레인 1은 항 HER2 인간 IgG 항체, 레인 2는 항 HER2 인간 IgG 항체-아지드화 펩타이드, 레인 3은 피크 a (미반응의 항 HER2 인간 IgG 항체), 레인 4는 피크 b (항 HER2 인간 IgG 항체-1가(monovalent) VHH), 레인 5는 피크 c (항 HER2 인간 IgG 항체 -2가(divalent)의 VHH), 레인 6은 VHH, 레인 7은 분자량 마커를 각각 전기 영동한 결과를 나타낸다.
[도 9] 도 9A ~ C는 7-AAD 염색으로 죽은 세포를 제외한 세포 분획을 사용하여 HER2을 고 발현하는 SK-BR3 세포를, 1차 항체로서 항 HER2 인간 IgG 항체(도 9A), 항 IgA 수용체 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9B), 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9C)을 사용하여, 2차 항체로서 최종 농도 50 nM의 비오틴화 항 HIS 항체 + PE 표지한 SA의 혼합물을 사용하여 FACS 분석을 실시한 결과를 나타낸다. 도 9D ~ F는 DMSO1.3%에 의하여 분화 유도로 IgA 수용체을 고발현하는 HL60 세포에의 결합을, 1차 항체로서 항 HER2 인간 항체(도 9D), 항 IgA 수용체 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9E), 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH(도 9F)를 이용하여, 2차 항체로서 PE 표지된 항 인간 IgG 폴리클로날 항체를 사용하여 검출한 결과를 나타낸다.
[도 10-1] 도 10은 0-10 nM의 약제(Herceptin 또는 실시예 11에서 제조된 항체 약물 복합체)의 존재하에서 SK-BR3 세포를 배양하여, 72시간 후 세포 수를 세포 측정 키트를 사용하여 흡광도 (Abs)에 의해 평가한 결과를 나타낸다. 도 중 BG (Back ground)는 세포를 첨가하지 않은 컨트롤을 나타낸다. 도 10A는 SK-BR3 세포에 대한 항 HER2 항체 -DM1*1의 효과를, 도 10B는 SK-BR3 세포에 대한 항 HER2 항체 -DM1*2의 효과를 나타낸다.
[도 10-2] 도 10-1의 계속되는 도이다. 도 10C는 C6 세포에 대한 항 HER2 항체 -DM1*1의 효과를 도 10D는 C6 세포에 대한 항 HER2 항체 -DM1*2의 효과를 나타낸다.
[도 11] 도 11은 실시예 12에서 제조된 디클로로프로판온(dichloropropanone)을 통한 SS 가교 구조를 가지는 IgG 결합 펩타이드의 합성 구조를 나타낸다.
[도 12] 도 12은 0-500 nM의 약제의 존재하에서 SK-BR3 세포를 배양, 72시간 후 세포 수를 셀 측정 키트를 사용하여 평가한 결과를 나타낸다. 도 12A는 Herceptin 또는 VcMMAE를 첨가한 경우의 결과를, 도 12B는 Herceptin 또는 실시예 12에서 제조된 항체 약물 복합체를 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.
[도 13] 도 13A는 인간, 쥐, 토끼 및 쥐의 각종 IgG 항체의 SDS-PAGE에 의한 전기 영동의 결과를 나타낸다 (레인 1: 마커, 레인 2: Trastuzumab (IgG1), 레인 3: Human IgG1, 레인 4: Human IgG2, 레인 5: Human IgG3, 레인 6: Human IgG4, 레인 7: Mouse IgG1, 레인 8: Mouse IgG2b, 레인 9: Mouse IgG3, 레인 10: Rabbit IgG (polyclonal antibody), 레인 11: Rat IgG1, 레인 12: Rat IgG2b, 레인 13: Rat IgG2c). 도 13B는 전기 영동한 후 젤을 PVDF 막에 전사하고, 비오틴 표지된 IgG 결합 펩타이드 및 HRP 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)을 사용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸다.
<IgG 결합 펩티드(IgG-binding peptide)>
본 명세서에서 사용되는 "IgG"는 포유동물, 예를 들어 인간과 침팬지 같은 영장류, 쥐, 마우스 및 토끼 등의 실험동물, 돼지, 소, 말, 양, 산양 등의 가축 동물, 및 개 및 고양이 등의 애완동물의 IgG, 바람직하게는 인간의 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)을 가리키는 것으로 한다. 본 명세서에서 IgG는 더욱 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4, 또는 토끼 IgG이며, 특히 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기의 식 I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인(cysteine) 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘(histidine) 잔기이며,
Xaa1은 리신(lysine) 잔기, 시스테인(cysteine) 잔기, 아스파르트산(aspartic acid) 잔기, 글루탐산(glutamic acid) 잔기, 2-아미노스베린산(2-aminosuberic acid), 또는 디아미노프로피온산(diaminopropionic acid)이며,
G는 글리신(glycine) 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산(glutamic acid) 잔기 또는 아스파라긴(asparagine) 잔기이며,
L은 류신(leucine) 잔기이며,
V는 발린(valine) 잔기이며, 및
W는 트립토판(tryptophan) 잔기이다.)
에 의해 나타내지는, 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드에 관한 것이다.
상기 식에서, N 말단 또는 C 말단의 X1-3라는 표기는 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 1 ~ 3개 연속하고 있는 것을 의미하고, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 같거나 다른 잔기이지만, 바람직하게는 3개 모두 같은 잔기가 아닌 배열로 구성된다. 마찬가지로, X2도 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 2개 연속하고 있는 것을 의미하고 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 같거나 다른 잔기이지만, 바람직하게는 상기 2개의 연속된 아미노산 잔기는 같은 잔기가 아닌 배열로 구성된다.
식 I의 2개의 시스테인 잔기는 이황화 결합하여 환상 펩티드(cyclic peptide)를 형성할 수 있다. 통상적으로, 식 I의 펩타이드에서 바깥 쪽 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹은 하기 화학식:
으로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있어도 좋다. 상기 화학식에서 점선 부분(broken line moieties)은 설파이드 그룹과의 결합 부분을 의미한다. 해당 링커는 보통의 이황화 결합보다 환원 반응 등에 대하여 안정하다. 이 펩티드는 예를 들어 이하의 <시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 펩타이드를 생산하는 방법>에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
식 I의 펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 I '및 식 I'로 표시되는 펩티드는 다음과 같다.
즉, 식 I'로 표시되는 펩타이드는
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
Y는 티로신 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
N은 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며, 및
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는, 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능함을 특징으로 한다.
식 I''로 표시되는 펩타이드는
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
A는 알라닌 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
E는 글루탐산 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며, 및
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는, 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능함을 특징으로 한다.
또한, 식 I의 펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 II로 표시되는 펩티드는 다음과 같다.
즉, 식 II로 표시되는 펩타이드는
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
Xaa3은 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며, 및
Xaa4은 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는, 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능함을 특징으로 한다.
상기의 식 I', 식 I'' 및 식 II의 펩티드의 아미노산 서열에서 17 아미노산 잔기로 한 경우, N 말단에서 1번째와 2번째 및 16번째와 17번째 아미노산 잔기 X는 없어도 좋고, 그런 펩타이드는 13 아미노산 길이로 구성된다.
본 명세서에서 사용하는 "17 아미노산 잔기로 한 경우"라 함은 펩타이드의 아미노산 잔기를 아미노산 번호로 부를 때, 식 I의 펩티드 등에 대해서는 최장의 아미노산 길이인 17 잔기의 N 말단부터 순서대로 1번째에서 17번째까지 번호를 부여하기 위해 편의적으로 표현한 용어이다.
또한, 식 I의 펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 III로 표시되는 펩티드는 다음과 같다.
즉, 식 III로 표시되는 펩타이드는
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
A는 알라닌 잔기이며,
Y는 티로신 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
E는 글루탐산 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며, 및
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 나타내지는, 13 내지 17 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능함을 특징으로 한다.
상기의 식 III의 펩티드의 아미노산 서열에서 17 아미노산 잔기로 한 경우의, N 말단에서 1번째와 2번째 및 16번째와 17번째 아미노산 잔기 X는 결실되어 있어도 좋고, 이와 같은 펩타이드는 13 아미노산 길이로 구성된다.
또한, 상기 각 식의 펩티드의 아미노산 서열의 시스테인(C) 이외의 아미노산 잔기, 즉 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단에서 1 ~ 3, 5, 6, 15 ~ 17번째 각 아미노산 잔기는, 하기로부터 선택되는 것이 바람직하다. 여기에서 각 대문자는 아미노산의 일문자(single-letter code) 표기이다:
1번째 아미노산 잔기 = S, G, F 또는 없음
2번째 아미노산 잔기 = D, G, A, S, P, 호모시스테인 또는 없음
3번째 아미노산 잔기 = S, D, T, N, E 또는 R,
15번째 아미노산 잔기 = S, T 또는 D,
16번째 아미노산 잔기 = H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음,
17번째 아미노산 잔기 = Y, F, H, M 또는 없음.
5번째 아미노산 잔기 = A 또는 T,
6번째 아미노산 잔기 = Y 또는 W.
또한, 식 I의 펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 X를 더 특정한 식 IV로 표시되는 펩티드는 다음과 같다.
즉, 식 IV로 표시되는 펩타이드는
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(상기 식 중,
D는 아스파르트산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
H는 히스티딘 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
G는 글리신 잔기이며,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
V는 발린 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
T는 트레오닌 잔기이며,
Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이며, 및
Xaa4은 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)에 의해 나타내지는, 13 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능함을 특징으로 한다.
식 I의 펩티드의 구체적인 예 몇 가지를 하기의 1) ~ 19)에 열거하나, 이에 제한되지 않음은 물론이다:
1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 1)
2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 2)
3) RCAYH (Xaa1) GELVWCS (서열번호 3)
4) GPRCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 4)
5) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 5)
6) GDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 6)
7) GPSCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 7)
8) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 8)
9) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTHH (서열번호 9)
10) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 10)
11) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 11)
12) SDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 12)
13) RGNCAYH (Xaa1) GQLVWCTYH (서열번호 13)
14) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (서열번호 36)
15) RRGPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 37)
16) DCTYH (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 14)
17) DCAYH (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 15)
18) DCTYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 16) 및
19) DCAWH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 17)
(상기 식 중, Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며, Xaa2는 호모시스테인이며, 바람직하게는 호모시스테인끼리는 서로 이황화 결합을 형성하고 있다).
식 I의 펩티드의 바람직한 구체적인 예로서
1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 1)
2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 2)
13) RGNCAYH (Xaa1) GQLVWCTYH (서열번호 13)
14) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (서열번호 36) 및
15) RRGPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 37)
(식에서, Xaa1은 리신 잔기이며, Xaa2는 호모시스테인이며, 바람직하게는 시스테인끼리 및/또는 호모시스테인끼리는 서로 이황화 결합을 형성하고 있다)을 들 수있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 광의(broad sense)의 일차 구조(primary structure)로서 하기의 식 V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(식 중,
D는 아스파르트산 잔기이며,
C는 시스테인 잔기이며,
G는 글리신 잔기이며,
L은 류신 잔기이며,
W는 트립토판 잔기이며,
T는 트레오닌 잔기이며,
Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이며,
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이며,
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이며,
Xaa5는 글루탐산 잔기 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파르트산 잔기이며, 한편
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기)에 의해 나타내지는, 13 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, 인간 IgG 및/또는 토끼 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드이다.
식 V의 2개의 시스테인 잔기는 이황화 결합하여 환상 펩티드를 형성할 수 있다. 통상적으로, 식 V 펩타이드의 바깥 쪽 2개의 시스테인 잔기는 이황화 결합하고 있다. 또는 식 V의 펩타이드에서 바깥 쪽 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹은 하기의 화학식:
으로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있어도 좋다. 상기 화학식에서 점선 부분은 설파이드 그룹이 결합 부분을 의미한다. 상기 링커는 보통의 이황화 결합보다 환원 반응 등에 대하여 안정하다. 이 펩티드는 예를 들어 이하의 <시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 펩타이드를 생산하는 방법>에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
식 V 펩타이드의 구체예 중 일부를 하기 20) ~ 31)에 열거하나, 이에 제한되지 않음은 물론이다:
20) DCTYT (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 18)
21) DCAYT (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 19)
22) DCSYT (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 20)
23) DCTWT (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 21)
24) DCTYH (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 22)
25) DCTYR (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 23)
26) DCTYS (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 24)
27) DCTYT (Xaa1) GNLVWCT (서열번호 25)
28) DCTYT (Xaa1) GELVWCT (서열번호 26)
29) DCTYT (Xaa1) GRLVWCT (서열번호 27)
30) DCTYT (Xaa1) GDLVWCT (서열번호 28) 및
31) DCTYT (Xaa1) GNLIWCT (서열번호 29)
(식에서, Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산이다.)
전술한 바와 같이, 본 발명에 관한 상기 식의 펩티드는 각 아미노산 서열 중에 떨어진 적어도 2개의 시스테인(C) 잔기를 가지고, 상기 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있는 것처럼 시스테인 잔기가 배치되어 있는 것을 특징으로 하고 있으며, 바람직한 펩티드는 2개의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합하여 환상 펩티드를 형성하고, 각 시스테인 잔기의 N 말단 측 및 C 말단에 1 또는 2개의 시스테인 이외의 아미노산 잔기를 가지고 있어도 좋다. 각 시스테인 잔기의 N 말단 측 및 C 말단에 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 갖는 경우, 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단에서 1 ~ 2, 16 ~ 17번째 각 아미노산 잔기는, 상기 예시한 것이다.
상기와 같이, 본 발명의 펩타이드에서 Xaa1은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기 및 글루탐산 잔기 등의 단백질 구성 아미노산, 및 디아미노프로피온산 및 2-아미노스베린산 등의 비 단백질 구성 아미노산, 바람직하게는 리신 잔기이다. Xaa1은 후술하는 가교제에 의해 변형이 가능한 것이 바람직하다. 본 명세서에서 "비 단백질 구성 아미노산"은 생체에서 단백질을 구성하는 데 사용되지 않는다 아미노산을 말한다. 본 발명의 펩티드를 가교제에 의해 변형할 때 부위 특이성을 높이기 위해, 본 발명의 펩타이드는, 그 서열 중 Xaa1와 동일한 잔기를 전혀 갖지 않거나, 거의 갖지 않는 것이 바람직하다 (예: 1개 또는 2개 밖에 갖지 않는). 예를 들어, Xaa1이 리신 잔기인 경우에는 본 발명의 펩타이드는, 그 서열 중 Xaa1 이외의 장소에 리신 잔기를 전혀 갖지 않거나, 거의 갖지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 인간 IgG와의 결합 친화성이, 다른 인간 면역 글로불린 (IgA, IgE, IgM)에 비해 약 10배 이상, 바람직하게는 약 50배 이상, 보다 바람직하게는 약 200배 이상 높다. 본 발명의 펩티드와 인간 IgG와의 결합에 대한 해리 상수(dissociation constant)(Kd)는 표면 플라즈몬 공명 분광 분석(surface plasmon resonance spectroscopy)(예를 들어 BIACORE 시스템 사용)에 의해 결정 가능하고, 예를 들면 1×10-1M ~ 1×10-3M 미만, 바람직하게는 1×10-4M 이하, 보다 바람직하게는 1×10-5M 미만이다.
본 발명의 IgG 결합 펩티드는 IgG의 Fc 도메인에 결합한다. 본 발명의 IgG 결합 펩티드는 후술하는 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 Xaa1에서 IgG Fc의 특정 영역, 즉 인간 IgG Fc의 Eu numbering에 따라 Lys248 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 "Lys248"로 표기하고, 인간 IgG CH2(서열번호 30)의 18번째 잔기에 해당) 또는 Lys246 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 "Lys246"로 표기하고, 인간 IgG CH2(서열번호 30)의 16번째 잔기에 해당), 바람직하게는 Lys248 근접한다.
본 발명의 펩티드는 관용의 액상 합성법, 고상 합성법 등의 펩타이드 합성법, 자동 펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성 등 (Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, JK eds., Plenum Press NY (1990) Vol.12, p.1-19; S tewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) WH Freeman Co .; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82 : p.5132 "새로운 생화학 실험 강좌 1 단백질 IV”(1992) 일본 생화학 회편, 도쿄 화학 동인)에 의해 제조할 수 있다. 또는, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 재조합법이나 파지 디스플레이법 등에 의해 펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 발현 벡터 중에 내장시켜, 숙주 세포에 도입하여 배양함으로써 원하는 펩타이드를 제조할 수 있다. 제조된 펩타이드는 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC 등의 크로마토그래피, 황산 암모늄 분획(ammonium sulfate fractionation), 한외 여과(ultrafiltration) 및 면역 흡착법(immunoadsorption) 등에 의해 회수 또는 정제할 수 있다.
펩타이드 합성은 예를 들어, 각 아미노산(천연, 비천연을 불문)의 결합하려고 하는 α-아미노기와 α-카르복실기 이외의 관능기를 보호하는 아미노산 류를 준비하고, 각각의 아미노산의 α-아미노기와 α-카르복실기 사이에 펩티드 결합 형성 반응을 한다. 일반적으로 펩타이드의 C 말단에 있는 아미노산 잔기의 카르복실기를 적당한 스페이서 또는 링커를 통해 고상에 결합 해 둔다. 이렇게 얻어진 디펩타이드(dipeptide)의 아미노 말단의 보호기를 선택적으로 제거하고, 다음 아미노산의 α-카르복실기 사이의 펩타이드 결합을 형성한다. 이러한 작업을 연속하여 수행하여 측기(side group)가 보호된 펩타이드를 제조하고, 마지막으로, 모든 보호기를 제거하고 고상 분리한다. 보호기의 종류와 보호 방법, 펩타이드 결합 방법의 자세한 내용은 상기 문헌에 자세히 설명되어 있다.
유전자 재조합에 의한 제조는, 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현 벡터 중에 삽입하여 적당한 숙주 세포에 벡터를 도입하고 세포를 배양하여 세포 내에서 또는 세포 외액 에서 원하는 펩타이드를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 이루어진다. 벡터는 한정되지 않지만, 예를 들면, 플라스미드(plasmid), 파지(phage), 코스미드(cosmid), 파지미드(phagemid) 및 바이러스(virus) 등의 벡터이다.
플라스미드 벡터로는 한정하는 것은 아니지만, 대장균 유래의 플라스미드(예 pET22b (+) pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript 등), 고초균 유래의 플라스미드(예 pUB110, pTP5 등) 및 효모 유래 플라스미드(예 YEp13, YCp50 등) 등을 들 수 있다.
파지 벡터로는 한정하는 것은 아니지만, T7 파지 디스플레이 벡터(T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c 등 (Novagen)) 및 λ 파지 벡터(Charon4A, Charon21A , EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII 등)을 들 수 있다. 바이러스 벡터로는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스(adeno-associated virus), 우두 바이러스 및 센다이 바이러스 등 동물 바이러스, 및 바큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스 등을 들 수 있다. 코스미드 벡터로는 한정하는 것은 아니지만, Lorist 6 Charomid9-20 및 Charomid9-42 등을 들 수 있다.
파지미드 벡터로는 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 pSKAN, pBluescript, pBK 및 pComb3H 등이 알려져 있다. 벡터는, 목적 DNA가 발현 가능하도록 조절서열(control sequence)과, 목적 DNA를 포함하는 벡터를 선별하기 위한 선택 마커(selective marker), 목적 DNA를 삽입하는 멀티 클로닝 사이트(multicloning site) 등이 포함되어 있다. 그러한 조절 서열은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 터미네이터(terminator), S-D 배열(S-D sequence) 또는 리보좀 결합 부위(ribosomal binding site), 복제 개시점(replication origin) 및 폴리 A 사이트(poly-A site) 등이 포함된다. 또한, 선택 마커는, 예를 들어 암피실린(ampicillin) 내성 유전자, 네오마이신(neomycin) 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자 및 디히드로 엽산 환원 효소 유전자(dihydrofolate reductase gene) 등이 사용될 수 있다. 벡터를 도입하는 숙주 세포는 대장균이나 고초균 등의 세균, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포(예를 들어, 포유 동물 세포) 및 식물 세포 등이며, 이러한 세포에 형질 전환(transformation) 또는 형질 감염(transfection)은, 예를 들어, 인산 칼슘법(calcium phosphate method), 일렉트로 포레이션법(electroporation), 리포펙션법(lipofection method), 입자총법(particle gun method ) 및 PEG 법 등을 포함한다. 형질 전환 세포의 배양은 숙주 생물의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 대장균이나 효모 세포 등의 미생물의 배양액은 숙주 미생물에 의해 이용 가능한 탄소원, 질소원 및 무기 염류 등을 함유한다.
본 발명의 펩티드의 회수를 용이하게 하기 위해 발현에 의해 생성된 펩티드를 세포 밖으로 분비시키는 것이 바람직하다. 이것은 세포에서 펩타이드의 분비를 가능하게 하는 단백질 서열을 코딩하는 DNA를, 목적 펩타이드를 코딩하는 DNA의 5' 말단에 결합하여 할 수 있다. 세포막으로 전환된 융합 펩타이드가 신호 펩티다아제(signal peptidase)에 의해 절단되어 목적 펩타이드가 배지에 분비 방출된다. 또는 세포 내에 축적된 목적 펩티드를 회수할 수 있다. 이 경우, 세포를 물리적 또는 화학적으로 파괴하고 단백질 정제 기술을 사용하여 원하는 펩타이드를 회수한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한다. 여기서, 핵산은 DNA 또는 RNA (예를 들면 mRNA)를 포함한다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드 및 다른 단백질을 융합시키는 경우 IgG 결합 펩타이드 및 다른 단백질을 별도로 제조한 후, 필요에 따라 링커를 사용하여 IgG 결합 펩타이드와 단백질을 융합시켜도 좋고, 유전자 재조합법에 의해 필요에 따라 적당한 링커를 첨가하여 융합 단백질로 제조할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 IgG와의 결합성을 손상시키지 않도록 융합 단백질을 제조하는 것이 바람직하다.
<가교제로 변형된 펩티드>
일 실시양태에서, 본 발명의 상기 IgG 결합 펩티드는 가교제에 의해 변형되는 것이 바람직하다.
상기와 같이, 본 발명의 IgG 결합 펩티드는 후술하는 실시예에서 알 수 있듯이, 상기 Xaa1에서 IgG Fc의 특정 영역, 즉 인간 IgG Fc의 Eu numbering에 따라 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 근접하여 위치한다. 따라서, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드의 Xaa1을 가교제로 변형하고, IgG와 가교 반응시킴으로써, IgG 결합 펩타이드의 Xaa1와 IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이의 부위 특이적으로 가교 구조를 형성시킬 수 있다. 상기와 같이, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드의 Xaa1을 가교제 및 다양한 화합물로 변형하고 IgG와 가교 반응시킴으로써 여러 가지 화합물을 특이적이고 간편하게 IgG에 도입할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, IgG 결합 펩티드를 통해 화합물을 도입할 수 있기 때문에 다양한 구조의 화합물을 IgG에 도입할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은, 얻어지는 산물의 수율이 높고, 또한 항체 자체 변경(engineering)을 수반하지 않기 때문에, 항체의 기능을 저하시킬 가능성이 낮다는 장점도 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩티드는 인간 이외의 동물, 바람직하게는 포유동물의 IgG에 사용할 수도 있다. 이 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 결합하는 IgG의 부위는 본 명세서를 읽은 당업자라면, 예를 들어 인간 IgG의 배열 및 다른 동물의 IgG의 배열을 정렬하여(aligning) 쉽게 특정할 수 있다.
본 발명에서 "가교제(cross-linking agent)"는 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG Fc를 공유 결합(covalent bond)으로 연결시키기 위한 화학물질이다. 본 발명의 가교제는, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하며, 원하는 아미노산(예를 들면, 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노스베린산, 또는 디아미노프로피온산 및 아르기닌 등)과 결합 가능한 부위를 적어도 2개소(two sites) 갖는 화합물로 할 수 있다. 그 예로 한정하는 것은 아니지만, DSG (disuccinimidyl glutarate), (DSS(disuccinimidyl suberate) 등의 숙신이미딜 그룹(succinimidyl groups)을 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, DMA (dimethyl adipimidate·2 HCl), DMP (dimethyl pimelimidate·2 HCl) 및 DMS (dimethyl suberimidate·2 HCl) 등의 이미드산 부분(imidic acid moieties)을 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, 및 DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl) 및 DSP (dithiobis(succinimidyl propionate)) 등의 SS 결합을 갖는 가교제를 들 수 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드는 다른 기능성 물질, 예를 들면, IgA 또는 VHH 등의 항체, 표식 물질 및/또는 다른 약물에 의해 변형이 있어도 좋다. IgG 결합 펩타이드 및 기타 기능성 물질의 결합은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 아지드 그룹(azide group)과 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne)과의 반응, 또는 말레이미드 그룹(maleimide group)과 설프하이드릴 그룹(sulfhydryl group)의 반응 등에 의해 수행될 수 있다. 표지 물질에 의해 표지되는 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드가 IgG와 복합체를 형성함으로써, 상기 표지 물질을 통해 IgG의 검출 또는 정량할 수 있게 된다. 표식 물질은 한정되지 않지만, 예를 들면 형광 색소, 화학 발광 색소, 방사성 동위 원소 (예를 들어, 방사성 요오드(radioactive iodine) 또는 방사성 동위 원소 금속 이온(radioisotope metal ion)의 킬레이트 화합물, 예를 들면 DOTA 또는 데스페리옥사민(desferoxamine) 킬레이트 화합물) 및 비오틴 및 GFP (녹색 형광 단백질) 등의 형광 단백질 발광 단백질, 및 퍼옥시다아제 등의 효소를 포함하고 바람직한 표지 물질의 예는 플루오레세인(fluorescein) 및 FITC 등의 플루오레세인 유도체, 로다민(rhodamine) 및 테트라 메틸 로다민(tetramethylrhodamine) 등의 로다민 유도체 및 텍사스 레드(Texas Red) 등 형광 염료이다. 본 발명의 펩티드를 다른 약으로 변형(modifying)하는 경우, 약으로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 오리스타틴 E(auristatin E) 등의 오리스타틴, 메이탄신(maytansine), 에무탄신(emtansine), 독소루비신(doxorubicin), 부레오마이신(bleomycin) 또는 이들의 유도체 등의 항암제; 및 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)의 수용체에 결합하여 중추 신경로의 전환을 가능하게 하는 약(drugs), 또는 암세포 등을 결합하여 항체의 세포 내로의 이동을 가능하게 하는 약 등의 표적화제(targeting agent)가 꼽힌다. 약을 연결하는 경우, 본 발명의 IgG 결합 펩티드는 예를 들어 의약 항체로 사용되는 IgG와 복합체를 형성하여 질환의 치료 효과를 높일 수 있다.
본 발명의 가교제에 의해 변형된 IgG 결합 펩티드는 예를 들어 상기 <IgG 결합 펩티드> 항목에 기재 한 방법에 따라 얻은 IgG 결합 펩타이드를 가교제와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 경우 IgG 결합 펩타이드 중 상기 Xaa1의 아미노산 잔기의 측쇄를 특이적으로 변형하는 것이 필요하며, 이것은 예를 들어, Xaa1의 종류와 가교제의 조합을 선택함으로써 이루어지고 있다. 예를 들어, DSS 또는 DSG 등의 숙신이미딜 그룹을 포함하는 가교제는 리신 잔기의 측쇄 및 폴리 펩타이드의 N 말단에 존재하는 일급 아민(primary amines)과 반응하기 때문에, IgG 결합 펩타이드의 N 말단을 차단한 후 DSS 또는 DSG와 반응시킴으로써, 리신 잔기의 측쇄만을 DSS 또는 DSG에서 특이적으로 변형할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기와 가교제의 조합은 당업자라면 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 가교제에 의해 변형된 IgG 결합 펩티드는, 예를 들면, 가교제에 의해 변형된 아미노산 잔기를 이용하여 펩타이드 합성함으로써 제조할 수 있다. 마찬가지로, IgG 결합 펩티드를 표지 물질 및/또는 다른 약물로 변형하는 경우에는 이 변형을 부가한 아미노산 잔기를 이용하여 펩타이드 합성에 의해 표지 물질 및/또는 다른 약물로 변형한 IgG 결합 펩타이드를 제조할 수 있다.
<가교 반응(Cross-linking reaction)>
일 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 가교제로 변형되는 IgG 결합 펩타이드와 IgG를 혼합하는 공정을 포함하는, IgG 결합 펩타이드 및 IgG의 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 공정에 의해, 가교제로 변형되어있는 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 발생할 수 있다. 가교 반응은 특히 IgG 결합 펩타이드의 상기 Xaa1 아미노산 잔기와, IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이의 부위 특이적으로 발생할 수 있다.
상기 혼합 공정의 조건은 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 생기는 조건으로 수행하는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG를 적당한 버퍼에서 실온(예를 들어 약 15℃ ~ 30℃)에서 혼합하여 반응할 수 있다. 상기 혼합 공정은 필요에 따라 가교 반응을 촉진하는 촉매를 적당량 더해 수행할 수 있다.
상기 혼합 공정에 있어서 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 혼합 비율은 특별히 한정하지 않는다. 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 몰 비율은 예를 들어 1:1 ~ 20:1, 바람직하게는 2:1 ~ 20:1 또는 5:1 ~ 10:1로 할 수 있다.
상기 혼합 공정에서 혼합 시간 (반응 시간)은 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG 사이에서 가교 반응이 생기는 한 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 1분 ~ 5시간, 바람직하게는 10분 ~ 2시간 또는 15분 ~ 1시간으로 할 수 있다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 생산하는 방법은 필요에 따라 상기 공정을 수행한 후 혼합물에서 불순물, 예를 들어, 미반응의 IgG 결합 펩타이드, IgG 및 시약 등을 분리하고 상기 복합체를 정제하는 공정을 더 포함할 수 있다. 상기 공정은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC 등의 크로마토그래피 등으로 할 수 있다.
<복합체(Conjugate)>
일 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체는 상기 가교 반응에 의해 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 IgG 결합 펩타이드의 상기 Xaa1 아미노산 잔기와, IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이가 부위 특이적으로 가교제를 통해 결합된 IgG 결합 펩타이드와 IgG와의 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 복합체는 부위 특이적인 가교 반응에 의해 형성되기 때문에, 상기 가교 반응이 IgG의 활성에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 적다. 또한 변형된 IgG 결합 펩타이드를 IgG에 연결하여 IgG에 새로운 기능을 추가할 수 있다. 예를 들어, 표지 물질에 의해 변형된 IgG 결합 펩타이드를 IgG에 결합시키면, 상기 표지 물질을 통해 IgG의 검출 또는 정량을 수행할 수 있게 된다. 표지 물질의 예는 상기 기재한 대로이며 여기에서는 설명을 생략한다. 또한 예를 들어, 약제는 변형한 IgG 결합 펩타이드를, 의약 항체인 IgG에 결합시키면, IgG 질환의 치료 효과를 높일 수 있다. 약제의 예는 상기 기재한 대로이며 여기에서는 설명을 생략한다.
<의약 조성물 또는 진단제>
일 실시양태에서, 본 발명은 상기 IgG 결합 펩타이드, 상기 가교제로 변형된 IgG 결합 펩타이드, 또는 상기 가교제로 변형된 IgG 결합 펩타이드와 IgG의 복합체를 포함하는 약학적 조성물 또는 진단제에 관한 것이다. 의약 조성물에 포함되는 경우, IgG 결합 펩티드는 예를 들어 상기의 약제에 의해 변형되는 것이 바람직하고, 진단제에 포함되는 경우, IgG 결합 펩티드는 예를 들어 상기 표지 물질에 의해 변형되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물 및 진단제의 대상이 되는 질환으로는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 항체에 의해 표적화 가능한 질환 또는 장애, 바람직하게는 암, 염증성 질환, 감염, 및 신경 퇴행성 질환을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여(예를 들어, 정맥 주사, 근육 주사, 피하 주사, 복강 내 투여, 직장 투여 또는 경점막 투여 등)에 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 투여 경로에 따라 적당한 제형으로 할 수 있다. 구체적으로는 과립, 정제, 환제, 캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제, 정맥 주사, 동맥 주사, 혹은 근육 주사용 주사제, 점적제, 외용제 또는 좌제 등의 각종 제제 형태로 제조할 수 있다. 투여 방법 및 제형은 환자의 성별, 연령, 체중, 증상 등에 따라 당업자라면 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있고 (예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, 미국을 참조), 의약적으로 허용되는 담체 및 첨가제를 함께 포함된 것이라도 좋다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체 및 의약 첨가제의 예로는 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐(collagen), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 카르복시 비닐 폴리머(carboxyvinyl polymers), 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨(carboxymethylcellulose sodium), 폴리아크릴산 나트륨(sodium polyacrylate), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 수용성 덱스트란(water-soluble dextran), 카르복시 메틸 스타치 나트륨(carboxymethyl starch sodium), 펙틴(pectin), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 에틸셀룰로오스(ethylcellulose), 잔탄검(xanthan gum), 아라비아 고무(gum arabic), 카제인(casein), 한천(agar), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 디글리세린(diglycerin), 글리세린(glycerin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 바셀린(Vaseline), 파라핀(paraffin), 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 스테아르산(stearic acid), 사람 혈청 알부민(HSA), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 락토스(lactose) 및 의약 첨가물로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
실제 첨가제는 본 발명의 의약 조성물의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합하여 선정되는데, 이에 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 주사용 제제로 사용하는 경우, 본 발명의 IgG 결합 단백질 또는 IgG 결합 단백질과 IgG의 복합체를 용액, 예를 들면 생리 식염수, 완충 용액, 포도당 용액 등에 용해하여, 여기에 용기 흡착 방지제, 예를 들어 Tween80, Tween 20, 젤라틴, 사람 혈청 알부민 등을 부가한 것을 사용할 수 있다. 또는 사용 전에 용해하여 재구성하는 제형으로 하는 동결 건조된 것으로서도 좋고, 동결 건조를 위한 안정화제로는 예를 들어, 만니톨, 포도당 등의 당알콜 및/또는 당류를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량 및 투여 간격은, 환자의 성별, 연령, 체중 및 증상 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 시기는, 상기 질환의 임상 증상이 발생하는 전후를 불문하고 예방적 투여에도, 치료적 투여에도 좋다.
<시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 펩타이드를 생산하는 방법>
일 실시양태에서, 본 발명은 시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 시스테인 잔기를 2개 이상, 바람직하게는 2개를 포함하는 펩타이드와, 하기의 화학식:
로 표시되는 화합물(식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 임의의 할로겐 원자이다)를 혼합하여, 2개 이상, 바람직하게는 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹이, 하기의 화학식:
로 표시되는 링커에 의해 연결된 펩타이드를 얻는 공정을 포함한다. 상기 화학식에서 점선 부분은 설파이드 그룹이 결합 부분을 의미한다. 시스테인 잔기가 해당 링커에 의해 연결된 펩타이드는 통상적으로 이황화 결합으로 연결된 펩타이드보다 환원 반응 등에 대하여 안정하다.
상기 화합물에서 R1 및 R2는, 바람직하게는 F, Cl, Br 및 I, 더욱 바람직하게는 Cl, Br 및 I로 이루어진 군에서 선택된다. R1 및 R2는 바람직하게는 동일하며, 더욱 바람직하게는 R1 및 R2는 모두 Cl이다.
본 방법의 혼합 공정의 조건은 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에서 연결 반응이 생기는 조건이라면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 펩타이드와 상기 화합물을 적절한 버퍼, 예를 들면 구아니듐 염화물(guanidium chloride) 포함 완충액에서 실온(예를 들어 약 15℃ ~ 30℃)에서 혼합하여 반응할 수 있다. 상기 혼합 공정은 필요에 따라 연결 반응을 촉진하는 촉매를 적당량 더해 수행할 수 있다.
본 방법의 혼합 공정에서 펩타이드 화합물의 혼합 비율은 특별히 한정하지 않는다. 펩타이드 화합물의 몰 비율은 예를 들어 1:0.2 ~ 1:10, 바람직하게는 1:0.5 ~ 1:5 또는 1:1 ~ 1:2로 할 수 있다.
상기 혼합 공정에서 혼합 시간(반응 시간)은 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에 연결 반응이 생기는 한 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 1분 ~ 5시간, 바람직하게는 10분 ~ 2시간 또는 15분 ~ 1시간으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 필요에 따라 상기 공정을 수행한 후 혼합물에서 불순물, 예를 들어, 미반응의 펩티드 및 화합물 등을 분리하여, 시스테인 잔기가 결합된 펩타이드를 정제하는 공정을 더 포함해도 좋다. 상기 공정은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC 등의 크로마토그래피 등으로 할 수 있다.
본 방법에서 사용되는 펩타이드의 종류는 시스테인 잔기가 상기 화합물에 의해 연결 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드 또는 WO2013/027796 명세서에 기재된 펩타이드를 들 수 있다. WO2013/027796 명세서에 기재된 펩타이드의 예는 본 명세서에 기재된 IgG 결합 펩타이드의 Xaa1 잔기를 아르기닌 잔기(R)로 치환 한 펩타이드를 들 수 있다.
실시예
[ 실시예 1:IgG 결합 펩타이드 및 IgG의 복합체의 X 선 결정 구조 해석]
<방법>
(1) IgG 결합 펩티드 용액의 제조
G (HC) DCAYHRGELVWCT (HC) H-NH2의 배열 (서열번호 31, 그러나 HC는 호모시스테인이며, 4번째와 14번째의 두 개의 Cys, 2번째 및 16번째의 두 개의 호모시스테인은 각각 분자 내에서 이황화 결합을 형성)를 갖는 환상 호모시스테인 펩타이드를, F-moc 법에 의한 펩타이드 고상 합성법에서 통상적인 방법에 따라 제조하였다. 조제한 IgG 결합 펩타이드 0.8 mg의 분말을 24 μL의 100% 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 녹여 IgG 결합 펩티드 용액을 제조하였다.
(2) Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체 제조
인간 IgG (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.)의 힌지 부분(hinge moiety)을 10 mM EDTA 및 1 mM L- 시스테인을 포함하는 20 mmol/L 인산 완충액 (pH7.0) 중 37℃에서 파파인(papain)(F. Hoffmann-La Roche, Ltd.)를 이용하여 절단했다. 이어 인간 IgG Fc를 양이온 교환 컬럼 (TSKgel SP5-PW (Tosoh Corp.))를 이용하여 유속 1 mL/min, 20 mM 초산나트륨 완충액 (pH5.0) 중 0-0.3 M NaCl의 그레디언트 용출(gradient elution)로 정제하였다. 16mg/mL의 인간 IgG Fc를 포함하는 63μL의 용액 (0.1M 염화나트륨 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 0.04M 2-몰포리노에탄술폰산(2-morpholinoethanesulfonic acid)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH6.0))를 상기 (1)에서 제작한 IgG 결합 펩티드 용액 2 μL와 혼합하고 Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체 용액을 제조하였다.
(3) Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체 결정의 제작
Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체 결정은, 시팅 드롭 증기 확산법(sitting drop vapor diffusion method )에 의해 얻었다. 즉, 상기 (2)에서 제작한 Fc와 IgG 결합 펩타이드의 복합체 용액 0.3μL과 결정화제(20% 폴리에틸렌글리콜 3350 (Sigma-Aldrich Co. LLC), 0.2M 요오드화 칼륨 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH6.9)) 0.3μL을 결정화용 로봇인, HydoraII + (Matrix Technologies Corp.)를 이용하여 인텔리 결정화 플레이트 (VERITAS Corp.)의 S1 웰에서 혼합하여 결정화 드롭했다(crystallized drops). 저장용액(reservoir solution)으로 상기 결정화제 70μL를 분주하였다. 플레이트를 PowerSeal CRISTAL VIEW (Greiner Bio-One Co., Ltd.)로 밀폐한 후 20℃의 항온조 내에서 약 2주간 정치하여 결정을 얻었다.
(4) Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체 결정의 X 선 회절 강도(diffraction intensity) 데이터의 수집
상기 (3)에서 얻어진 결정을 안정화 모액(stabilizing mother liquor)(22% 폴리에틸렌 글리콜 3350,0.2M 요오드화 칼륨, 0.1M 염화나트륨, 25% 글리세롤 (w/v), 0.04M 2-몰포리노에탄술폰산 (pH6.0))에 옮겨 -170℃의 질소 가스 기류에서 급속 동결하고 X 선 회절 데이터를 진동법으로 측정했다. X 선의 파장은 1 옹스트롬, 진동(oscillation) 각도는 1°/프레임에서 실시했다. 그런 회절 강도 데이터 처리 프로그램 HKL2000 (HKL Research Inc.)를 사용하여 회절 강도 데이터를 해상도 3.0 옹스트롬으로 처리했다. 그 결과, 결정의 공간 그룹이 P21이며, 격자 상수(lattice constant)는 a = 66.1 옹스트롬, b= 60.5 옹스트롬, c= 69.5 옹스트롬, α= γ = 90°, 및 β= 101.3°였다. 얻어진 데이터 Completeness은 99.9%, Rmerge은 13.8%였다.
(5) Fc및 IgG 결합 펩타이드의 복합체의 결정 구조 결정
DCAYHRGELVWCT (서열번호 33)에 대해 상기 (4)에서 얻어진 회절 강도 데이터를, CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4)에 포함된 프로그램 Phaser을 이용하여 분자 치환 법에 의한 위상 결정을 시도했다. 분자 치환법(molecular replacement method)의 검색 모델에는 Protein Data Bank (PDB, URL:http://www.rcsb.org/pdb/)에 PDB accession code:1DN2로 등록된 Fc 부분 모델을 이용했다. 그 결과, 비대칭 단위에서 1 분자의 모델을 발견할 수 있었다. 다음 CCP4에 포함된 구조 정밀화 프로그램 Refmac5을 이용한 구조 정밀화 및 모델 구축 프로그램 인 X-tal view를 이용한 모델의 수정을 반복 실시하고 Fc와 IgG 결합 펩타이드 (DCAYHRGELVWCT (서열번호 33) )의 복합체의 결정 구조를 얻었다. Fc의 펩타이드 결합 부위에 IgG 결합 펩티드에 상당하는 전자 밀도가 관찰되었다. 결정 결정 구조의 정확도의 지표인 R 인자는 0.216였다. 또한 정밀화 단계에서 계산에 넣지 않았던 전반사의 5%에 상당하는 구조 인자로부터 계산되는 Rfree 인자는 0.317였다.
(6) 가교 구조 모델의 준비
상기의 X 선 결정 해석의 구조를 바탕으로, 계산 과학 소프트웨어 MOE (Molecular Operating Environment)에 가교 구조 모델을 준비했다. DCAYHRGELVWCT (서열번호 33)의 6번째 아미노산을 Lys로 치환 후, 이 Lys의 ε 아미노기 및 항체 Fc의 248번째 Lys의 ε 아미노기 사이를 잇는 형태로, DSG 또는 DSS에 의한 가교 구조를 모델링했다.
<결과>
도 1A에 나타낸 바와 같이, IgG 결합 펩타이드는 단백질 A의 결합 부위와 겹치는 CH2및 CH3 도메인의 경계에 결합하고, 이미 보고된 IgG 결합 펩타이드 Fc-III (DeLano, WL et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283)과 유사한 형태로 IgG와 결합하고 있다고 생각되었다. IgG 결합 펩타이드와 Fc와의 특징적인 상호 작용은 IgG 결합 펩타이드의 8번째 잔기 Arg의 측쇄의 구아니디노 그룹(guanidino group)이, 2.91 옹스트롬에서 Fc의 Glu380 (EU numbering에 근거한다. 이하 동일)의 측쇄 카복실산과 염 결합(salt linkage)하고 있는 점이다. 이 Glu380 측쇄는 인간 IgG Fc에서 Lys248과 염 결합하여 분자 내에서의 염 결합 네트워크를 형성하고 있으며, IgG 결합 펩타이드의 Arg8 및 Fc의 Lys248는 Fc의 Glu380과의 상호 작용을 통해 접근했다. 그래서 IgG 결합 펩타이드의 8번째 잔기 Arg를 Lys으로 바꾸고, 이 염 결합 네트워크 구조와 유사한 형태로, 펩티드의 Lys8및 항체 Lys248의 측쇄의 아미노기를 가교제로 가교하는 것을 고안했다. 사실, IgG 결합 펩타이드 및 인간 IgG Fc의 복합체 구조를 기반으로, DSG (disuccinimidyl glutarate) 또는 DSS (disuccinimidyl suberate)에 의한 가교 구조의 모델을 작성했는데, 공간적으로도 또한 항체의 주쇄 구조의 변형을 수반하지 않고 가교제의 도입이 가능하다고 생각되었다(도 1B).
[ 실시예 2: 표지용 펩타이드의 제조 및 특성]
<방법>
아미노기를 Biotin 또는 5/6TAMURA succinimidyl ester (AnaSpec, Inc.) (형광 색소)에서 변형한 amino-PEG4 화합물성 펩타이드 GPDCAYHXGELVWCTFH (서열번호 2) (단, C 말단은 아미드화)은 Fmoc 고상합성법에 따라 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 보호기(protective groups)를 제거한 후, pH8.5의 수용액 중에서 산화 조건에서 분자내 SS 결합을 형성시켜 역상 HPLC를 이용하여 유속 1.0 ml/min, 0.1%의 TFA를 포함하는 10%에서 60% 아세토니트릴(acetonitrile)의 그레디언트 용출에 의해 분자 내 SS 결합을 갖는 펩타이드를 정제하였다.
정제한 IgG 결합 펩타이드를 1 mM 포함하는 DMF 용액 100μL와 100 mM의 DSS 또는 DSG (Thermo Fisher Scientific 사)의 아세토니트릴 용액 100μL를 혼합 후 실온에서 밤새 반응시켰다. 반응물을 0.1% TFA에서 2.5 배로 희석 후 Waters 사의 μ Bondasphere 5C18 100 옹스트롬 (직경 3.9 mm x 150 mm)에 인젝트하여 0.1% TFA를 포함한 4%에서 60%까지의 아세토니트릴의 그레디언트로 용출했다. 얻어진 생성물에 가교제의 추가에 대해서는, BEH300 C18 (1.7μm, 직경 2.1 mmx 50 mm) 컬럼을 연결한 LC-Mass spectrometry (Acquity SQD UPLC system, Waters Corp.) 위에서, 0.1% 포름산 를 포함한 4%에서 60%로의 아세토니트릴의 그레디언트로 용출 피크의 분자량 측정에 의해 확인되었다.
얻어진 라벨화 시약 펩타이드의 친화성 분석은 1M Tris-HCl(pH = 7.0)를 10 분의 1 양을 첨가하여 15분 반응시킴으로써 NHS기를 가수 분해 후 다음의 방법으로 실시했다. BIAcoreT200 (GE healthcare)에 넣은 CM5 센서 칩에, 0.4 M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)와 0.1 M sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide)를 동량 혼합 후 10 μl/ml의 유속으로 센서 칩에 7분 인젝트하여 센서 칩을 활성화하고 pH4.0 (10 mM 초산 Na)의 조건에서 고정화량이 RU 값으로 4000 ~ 5000가 되도록, IgG를 고정했다. HBS-EP 완충액(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA, pH 7.0)을 사용하면서 유속 50 μl/ml에서, 10nM에서 2μM의 농도의 펩티드를 180초간 인젝트하여 결합 반응을 모니터한 후 완충액에 의해 600 sec 세척하여 해리 반응을 측정했다. 결합 매개 변수의 분석은 BIAevalution T100 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
<결과>
가교 구조의 도입이 IgG 결합 펩타이드의 특이성 및 친화성에 영향을 미치는지 검토하기 위해, 가교 구조를 도입한 IgG 결합 펩타이드의 IgG에 대한 결합력을 SPR 분석에서 측정하였다(표 1). 8번째 잔기 아르기닌을 리신으로 치환한 IgG 결합 펩타이드(이하 Type I (R8K)라고도 함)의 인간 IgG에 대한 선호도는 131 nM (Kd)이며, 치환 이전 IgG 결합 펩타이드 (이하 Type I라고도 함)에 비해 10배 친화성이 떨어졌다. Type I (R8K) 펩타이드에 각 가교제를 결합시킨 것에서는, 인간 IgG에 대한 선호도는 Type I (R8K)-DSG-OH에서 약 330 nM (Kd), Type I (R8K)-DSS-OH 에서 약 390 nM (Kd)이며, 가교제가 결합한 것으로 인하는 친화력의 큰 감소는 보이지 않았다. 어느 펩타이드에서도, Kd 값으로 μM 이하의 친화력을 갖고 있기 때문에 충분히 특이적인 표지화가 가능하다고 생각되었다.
Type I(R8K)와 각 가교제 결합 펩티드의 가수분해물의 친화성(전부, 펩티드의 N 말단을 비오틴화된 PEG4로 차단한 것을 이용함). Type I(R8K)-DSG-OH 및 Type I(R8K)-DSS-OH는, Type I(R8K)에 있어서 도입한 가교제의 NHS 그룹을 가수분해한 것을 나타낸다.
[ 실시예 3: IgG 결합 펩타이드에 의한 인간 IgG - Fc 특이적 변형]
<방법>
실시예 2와 동일한 방법으로 N 말단에 Biotin-PEG4을 부가한 IgG 결합 펩타이드(TypeI (R8K))를 DSS 또는 DSG으로 변형한 표지된 시약 펩타이드를 제조하고, 이를 인간 IgG Fc를 반응시켜 인간 IgG Fc의 표지 반응을 조사했다. 즉, 실시예 2와 동일한 방법으로 과도한 DSS 또는 DSG와 반응시킨 IgG 결합 펩타이드(R8K) (200 pmol/5μL in 0.1% TFA)을 역상 컬럼에서 정제 후, 감압 하에서 아세토니트릴을 제거 후, 0.5 M Na2HPO4를 약 1/8 첨가하여 중화하여, 즉시 단백질 샘플(hIgG (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), hIgA (Athens Research & Technology, Inc.), HSA (Sigma-Aldrich Co. LLC) 또는 혈청 (정상인에서 채혈한 것)) (각 40 pmol/5μL, 혈청은 PBS에 의해 10배 희석한 것을 사용)에, 몰비 10배 양을 더해, 최종 양을 PBS로 20 μL로 한 후, 실온에서 5분 방치했다. 그 후, 1 M Tris-HCl(pH = 7.0)을 1 μl 추가하여 반응을 정지한 후, 4xSDS 샘플 용액 6.7μl 및 2-메르캅토에탄올 1.4 μl (최종 5%)을 첨가하고 95℃, 10분 처리 후, 프리캐스트젤 SuperSepTMAce, 5-20% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 이용하여 SDS-PAGE를 실시했다. 영동 후의 젤은 Hoefer Semiphor(Hoefer Semiphor TE70) transblot system을 이용하여 35 mA, 60 분에서 PMDF 막에 전사 후, 0.5% BSA로 차단했다. 비오틴화 펩티드로 표지된 단백질은, SA 콘쥬 게이트 HRP(1000배 희석, Vector Laboratories)를 이용하여, 화학 발광 시약(ImmunoStar(R) Basic, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 의해 검출했다.
<결과>
도 2B에 나타낸 것처럼, 웨스턴 블랏에서 IgG와 반응시킨 경우에만, 복합체인 것으로 보이는 밴드가 관찰된 것으로부터, DSG 또는 DSS와 반응시킨 IgG 결합 펩티드는, 모두가 IgA, HAS 및 혈청 중 IgG 이외의 단백질과 결합하지 않고, IgG에 선택적으로 결합하고 있는 것으로 나타났다.
[ 실시예 4: IgG에 대한 IgG 결합 펩타이드의 반응 조건 검토]
<방법>
(1) 반응 몰비 검토
96 well 마이크로 플레이트 (Nunc (등록 상표) MaxiSorp)의 웰에 각 단백질 (IgG (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), IgA (Athens Research & Technology) 또는 Bovine gelatin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) (50 ng (0.33 pmol)/μl/well)을 포함하는 0.1 M NaHCO3 용액을 플레이트에 첨가하여 실온에서 하룻밤 방치하여 각 단백질을 플레이트의 표면에 흡착시켜, 0.5% BSA로 차단을 수행한 후, 각 웰에 실시예 2와 동일하게 제조한 DSG변형한 비오틴화 IgG 결합 펩타이드(몰비에서 0, 1, 2, 5, 10)을 넣고 1시간 후 1M Tris-HCl (pH7.0)을 3μL 추가하여 반응을 정지했다. 0.5% BSA에서 2000배 희석한 SA-HRP(Vector Laboratories)를 50μL 첨가하여 실온에서 한 시간 반응 후 0.1% PBST로 5회 세척 후 HRP의 정색에 TMB 용액(Wako Chemicals)를 이용하여, 5분의 발색 반응 후, 450 nm의 흡광도를 ELISA 플레이트 리더(model 680 microplate reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.))로 측정했다.
(2) 반응 시간 검토
50 ng/50 μL 용액으로 4℃에서 하룻밤 고정된 hIgG(50 ng)에 대해 DSG변형한 비오틴화 IgG 결합 펩타이드를 몰비 2로 추가, 각 반응 시간(0 ~ 60분)에서 1M Tris-HCl(pH7.0)을 3μL 추가하여 반응을 정지했다. 결합 검출은 (A)와 동일하게 수행하였다.
<결과>
DSS 표지된 IgG 결합 펩티드를 사용하여 항체와 반응시키는 몰수 및 반응 시간의 차이에 의한 반응 효율을 ELISA로 검토했다(도 3). 즉, 플라스틱 플레이트에 고정된 IgG 결합 펩티드의 몰비를 1에서 10까지 변화시켜 hIgG과 반응시킨 결과, 거의 몰비 5주변에서 포화가 보였기 때문에, 몰비 5 정도의 펩티드 시약을 가하면 항체의 표지화에는 충분하다고 생각되었다(도 3A). DSS로 변형하지 않은 비오틴화 IgG 결합 (R8K) 펩타이드 (NO DSS R8K)는 매우 약한 결합을 볼 수 있는데, 이것은 비공유 결합으로 결합된 펩타이드에 의한 결합 활성으로 생각된다. 또한 표지된 IgG 결합 펩티드 시약을 과량 첨가해도, 다른 단백질(hIgA, Bovine gelatin 또는 차단제로 사용하는 BSA)에 결합은 전혀 검출되지 않았다.
다음으로, IgG 및 IgG 결합 펩티드의 몰비 1:2로 반응시켰을 때의 반응 시간의 검토를 실시했다. 그 결과, 약 15분에서 포화가 보였던 것으로부터 반응은 15분에서 거의 종료된 것으로 간주되었다(도 3 B).
이상의 결과로부터 가교제로 변형한 본 발명의 IgG 결합 펩티드는, 단시간에, 그리고 특이적으로 IgG와 결합하는 것으로 나타났다.
[ 실시예 5: 형광 IgG 결합 펩타이드에 의한 Fc의 표지화]
<방법>
IgG(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), IgA(Athens Research & Technology) 또는 BSA(Sigma-Aldrich Co. LLC)(15 μg:IgG 환산으로 100 pmol)과 실시예 2에 따라 제조된 DSG 가교 펩타이드 또는 DSS 가교 펩타이드 (500 pmol)를 200μL에서 ,실온에서 60분 반응시켜 1M Tris-HCl(pH = 7.0)을 10μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, SuperdexTM200 10/30GL 직경 1.0cm×30cm (GE Healthcare Japan Corp.); 유속: 0.3 ml/min; 런닝 버퍼: PBS pH 7.4, 에서 크기배제 크로마토그래피를 실시하여 형광 검출기 RF-10A (Shimadzu Corp.) (여기 광(excitation light): 541 nm, 형광(fluorescence): 565 nm)를 이용하여 측정하였다.
<결과>
DSS 또는 DSG를 반응시킨 표지된 IgG 결합 펩티드를 각 단백질에 대한 몰비 1:5에서 단백질과 실온에서 60분 반응시키고, 크기배제 크로마토그래피로 분석했다. 표지된 IgG 결합 펩타이드(DSS 또는 DSG) 어느것을 이용하여도 IgG에 대한 반응성의 특이성은 동일한 정도이며, hIgA와 BSA 등 다른 단백질에의 형광 표식화는 전혀 검출되지 않았다(도 4). 이상으로부터, 제작한 어떤 IgG 결합 펩타이드를 이용하여도 높은 특이성을 가지고, 인간 IgG를 형광 표지할 수 있는 것으로 나타났다.
[ 실시예 6: IgG 결합 펩타이드에 의한 Fc의 변형물 분석( pH4 .5)]
<방법>
인간 IgG (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.)의 Fc 용액 (20μM, 0.1M 초산 완충액 pH4.5) 200μL와 DMF에 용해한 실시예 2와 동일한 방법으로 DSG 변형한 IgG 결합 펩타이드(RGNCAYHXGQLVWCTYH (서열번호 35 ), X는 리신) (4 mM)를 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μL (몰비로 0.5, 1.0, 2.0, 5.0) 첨가하여, 빠르게 교반 후 실온에서 15분 반응하고 1 M Tris-HCl (pH7. 0)을 10 μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응물 50 μL를 Shodex IEC SP-825 컬럼을 연결한 NGC Chromatography system(바이오 래드)에 인젝트하여 25mM Acetate buffer (pH4.5)에서 1 M NaCl을 포함하는 25 mM Acetate buffer (pH4.5)에 그레디언트 용출하고, 단백질의 용출을 215 nm의 흡광도에서 모니터했다. 얻어진 각 피크를 분취, LC/MS에 의한 분자량 측정에 사용하였다.
Waters ACQUITY UPLC BEH C8 (1.7μm 2.1mm×100mm) 컬럼을 연결한 Shimadzu LCMS-8030에, 얻어진 피크의 분획을 20μL 주입한 후 0.1% 포름산을 포함한 4% 아세토니트릴에서 0.1% 포름산을 포함한 60% 아세토니트릴까지의 그레디언트 용출을 실시했다. 용출된 피크의 질량 스펙트럼 분석하고 해석 소프트웨어를 이용한 다가이온 피크(polyvalent ion peaks)로부터 데콘볼루션(deconvolution)에 의해 질량을 계산했다.
<결과>
인간 IgG1-Fc와 DSG 변형한 IgG 결합 펩타이드(4 mM, Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2; 분자량 2760, X는 DSG화한 리신으로, 두 개의 Cys는 분자 내 SS 결합을 형성)을 몰비 0.5, 1.0, 또는 5.0에서 반응시킨 결과, 도 5A에 나타낸 것처럼, 원래 인간 IgG1-Fc의 용출 위치의 피크(피크 2)와 2개의 피크 3, 4가 나타났다(피크 1은, DSG화한 IgG 결합 펩타이드로 간주). 이러한 분자 종을 식별하기 위해 LCMS 분석을 실시했다. 반응 전의 IgG1-Fc는 이온 교환 크로마토그램에서 피크 1 부분에서 용출되었고, LCMS 분석에서는 55084이라는 값이 얻어졌다. 반응 후 2, 3, 4 피크 LCMS 분석을 실시한 결과, 각각 55087, 57735(55087 + 2648), 60384(55087 + 5297)이라는 값이 얻어졌다. 이 때문에 반응 후 피크 2는 미반응의 Fc이며, 피크 3과 4는 Fc에 각각 1개와 2개의 펩타이드가 결합된 것임을 알 수 있었다.
도 5B는 각 몰비로 반응시킨 경우의 미반응(피크 2), 1개의 펩티드의 부가물 (피크 3), 두 개의 펩티드의 부가물 (피크 4)의 생성량의 변화를 그래프화한 것이다. 예를 들어, 몰비 1:1로 반응시킨 경우에도 미반응물은 20% 이하가 되며, 몰비 1:2에서는 미반응물은 10% 이하로 매우 수익률이 높은 것을 알 수 있다. 또한 과도한 몰비 1:5의 경우에도 상대적으로 2개의 펩티드 부가물의 생성 비율이 증가했지만, 그 이상의 펩티드가 부가된 Fc는 이온교환 크로마토그램에서 검출되지 않았다는 것으로부터 이 표지 반응은 매우 특이적이라는 것을 알 수 있었다.
[ 실시예 7: IgG 결합 펩타이드에 의한 Fc의 반응에 대한 pH 및 반응 시간의 영향]
<방법>
pH4.0 (25 mM 초산 완충액), pH5.5 (25 mM 초산 완충액) 또는 pH7.0 (PBS)에서 조제한 인간 IgG의 Fc 용액 200μL에 대하여, 실시예 5에서 제조한 DMF 중에 용해된 DSG 수식된 IgG 결합 펩타이드 (4 mM)를 1.0 μL (몰비 1.0) 첨가하여 신속하게 교반 후 실온에서 반응했다. 반응 후 1, 5 및 10 또는 30분에 1 M Tris-HCl (pH7.0)을 10 μL 첨가하여 반응을 정지시키고, 반응물 50 μL를 Shodex IEC SP-825 컬럼을 연결한 NGC Chromatography system (바이오 래드)에 인젝트하여 25 mM Acetate buffer (pH4.5)에서 1 M NaCl을 포함하는 25 mM Acetate buffer (pH4.5)에 그레디언트 용출하고, 단백질의 용출을 215 nm의 흡광도에서 모니터했다. 얻어진 크로마토그램을 바탕으로 각 피크의 비율을 계산했다.
<결과>
도 6에 나타낸 것처럼, 시험한 pH 4.0, pH 5.5 및 pH 7.0 모두에서 표지 반응은 빠르고, 반응의 90% 이상이 1분 이내에 종료하는 것으로 나타났다. 또한 pH4.0에서 미반응물의 잔량이 40%를 넘고 있어 반응 수율이 낮고, 특히 2개의 펩티드의 부가물(피크 4)의 수율이 15% 정도로 다른 pH의 경우 (35-40%)에 비해 낮았다. pH 5.5 및 7.0에서는, 미반응물의 수율도 10%대로 낮아 효율적으로 반응하고 있는 것으로 나타났다. pH5.5 및 7.0의 차이로는, 약간 피크 4의 수율이 pH 7.0에서 낮아지는 경향을 보였다.
[ 실시예 8: IgG 결합 펩타이드를 이용한 단쇄 Fv - Fc 항체의 형광 표지에 의한 FACS 분석]
<방법>
Her2에 대한 scFv (4D5) 및 Fc 유전자를 연결한 scFv-Fc를 보유하는 pcDNA3.1/Zeo(+)를, HEK293 세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 transfection하고, 5일간 배양 후 배양액으로 분비된 scFv-Fc를 프로테인 A 컬럼에 의해 정제하여, 4D5-Fc 항체(HER2에 대한 특이성을 가진 단쇄 Fv 클론 4D5와 Fc 융합 단백질)을 제조하였다. 이어 조제한 4D5-Fc 항체 1.0 μg을 3% BSA를 포함한 PBS 10 μL에 희석한 것을, 실시예 2와 동일한 방법으로 DSG 변형한 N 말단 비오틴화 IgG 결합 펩타이드 (Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH (서열번호 35), X는 DSG 변형한 리신으로, 두 개의 Cys는 분자 내 SS 결합을 형성) 0.16 μg (20 p mol)과 혼합하여 10분간 반응시켰다. 이 반응물을 10% FBS를 포함하는 PBS 100 μL에 분산된 유방암 세포주 SK-BR3 (ATCC에서 구입) (5.0×105 세포)에 첨가하여, 30분간 4℃에서 방치하였다. 3% BSA를 포함한 PBS로 1회 세척하고 3% BSA를 포함한 PBS 100 μL에 현탁한 후, PE 표지 Streptavidin(Vector Laboratories) 0.01 μg (0.2 pmol)를 더해 30분간 4℃에서 방치하였다. 다시 3% BSA를 포함한 PBS로 1회 세척한 후 3% BSA를 포함 PBS 100 μL에 분산하여, 7-AAD Viability Dye (Beckman Coulter Inc.)를 10μL 첨가한 후 15분간 방치했다. PBS 400 μL를 첨가하여 분산하고, 35 μm 메쉬 (Corning)을 통과한 후 S3eTM cell sorter (Bio-Rad Laboratories, Inc.)에서 분석했다.
<결과>
유방암 세포주 SK-BR3에서 HER2 항원에 4D5-Fc 항체의 결합을 DSG 변형 비오틴화 IgG 결합 펩타이드와 PE 표지 Streptavidin 의해 검출한 결과를 도 7A에 나타낸다. 컨트롤로 DSG 변형 비오틴화 IgG 결합 펩타이드 (Biotin 화 IgG 결합 펩타이드) 대신 비오틴화 항 인간 IgG 마우스 항체 (Anti hIgG mAb-biotin 표지) (0.01μg)를 사용하는 경우, 유동 세포 계측법 분석 결과도 함께 나타내었다(두 경우 모두, 7-AAD 염색으로 염색된 죽은 세포를 제외한 세포 분획만을 사용하여 분석 하였다). 2개의 시스템에서 모두 모두 형광 강도는 거의 차이가 없었던 것으로 부터, SG 변형 비오틴화 IgG 결합 펩티드는 인간 Fc 특이적으로 표지함으로써 단쇄 Fv-Fc 등의 FACS 염색에 이용할 수 있는 것으로 나타났다. 한편, 대조군(negative control)으로, 4D5-Fc를 가하지 않은 시스템도 검토를 실시했지만(도 7B), SG 변형 비오틴화 IgG 결합 펩타이드를 첨가하지 않는 시스템(Anti hIgG mAb-biotin 표지 + SA-PE 표지 및 Anti hIgG mAb-PE 표지)과 마찬가지로, 전혀 형광 강도의 변화가 보이지 않았던 것으로부터, DSG 변형 비오틴화 IgG 결합 펩타이드 단독으로는 세포에 대한 특이적인 변형은 일어나지 않은 것으로 나타났다.
[실시예 9: IgG 결합 펩타이드에 의한, 항 IgA 수용체 VHH와 인간 IgG 항체의 복합체(Conjugate) 형성]
<방법>
DSG 변형 N 말단 아지드화 IgG 결합 펩타이드 (Azide-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH (서열번호 2), X는 DSG 변형 리신으로, 두 개의 Cys는 분자 내의 SS 결합을 형성, C 말단은 아미드화)은 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다. 이 펩티드를 10 mM의 농도로 DMSO에 용해하고,이 용액 20 μL를 25 mM 초산 완충액(pH5.0)에 녹인 16.6μM의 항 HER2 인간 IgG 항체(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) 용액 8 mL에 첨가하여(펩타이드 및 항체 몰 비율 = 1:1.5) 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 후 CIMmultusTM SO3-1 (SHOWA DENKO)의 컬럼(1 mL)에, 25 mM 초산 완충액 (pH5.0)의 0에서 1 M 까지 NaCl 그레디언트 용출로 아지드화 펩티드 항 HER2 인간 IgG 항체 (1가 아지드화 펩타이드 항체, 2가 아지드화 펩타이드 항체의 혼합물)을 정제했다.
알파카 유래의 항 IgA 수용체 VHH 항체 클론 2b1-L9 (C 말단에 HIS 태그를 추가)는, 대장균 HB2151에서 분비 발현한 것을, C 말단에 부가한 HIS 태그를 사용하여 어피니티 정제했다. 구체적으로는 대장균 HB2151에 VHH 유전자를 보유하는 파지미드 벡터 pKSTV03를 도입 후, 2TYAG 플레이트에서 선택하고, 2TYA 액체 배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액 10 mL를 2TYA 500 mL에 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 후 1M IPTG을 500 μL 첨가하여 16시간 진탕 배양하였다. 원심 후 균체를 TES buffer (0.2M Tris-base, 0.5mM EDTA, 0.5M sucrose) 10 mL에 현탁하고 얼음에 2시간 방치했다. 4배 희석한 TES buffer를 20 mL 첨가하여 다시 현탁하고 얼음에 1시간 정치한 후 원심 분리하여 상층 분획 (periplasm fraction)을 회수했다. 상층액은 어피니티 컬럼(affinity column) (His trap excel, GE Healthcare)으로, Profinia (BioRad)의 정화 시스템을 이용하여 VHH를 정제하였다(유속은 결합 용출 2 mL/min, 세정 2 mL/min, Buffer는 평형 Buffer: 0.5 M NaCl, 20 mM 인산 Na, 세척 Buffer: 0.5 M NaCl, 20 mM 인산 Na, 용출 Buffer: 500 mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20 mM 인산 Na를 사용하였다). 이어서, PBS (pH7.4)에서, 0.1 mM의 DTT의 존재 하 1시간, 실온에서 환원 처리 후, IEC SP-825 (Shodex) 컬럼 (8.0mm×75mm)에, 10 mM 초산 완충액(pH4.5) 중 0에서 1M까지의 NaCl 그레디언트 용출로 정제하였다. 환원 처리한 VHH 용액 (41.2μM, pH4.5) 200 μL와 10 mM 초산 완충액 (pH4.5)에 녹인 870 μM Dibenzocyclooctyne(DBCO)-maleimide (Click Chemistry Tools) 42 μL를 혼합(몰비로 1:4.4)하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 이와 같이하여 조제한 Dibenzocyclooctyne-maleimide 화 VHH (22μM) 290 L을, 상기와 같이 제조된 아지드화 펩타이드 항체 용액 (17μM, pH4.5) 116μL와 혼합(몰비 3.3:1)하고 4℃에서 14시간 반응시켰다. 반응물은 IEC SP-825(Shodex) 컬럼 (8.0mm×75mm)에, 10 mM 초산 완충액 (pH4.5) 중 0에서 1 M까지 NaCl의 그레디언트 용출로 정제되었다. 정제된 분획은 환원 후 5-20%의 그레디언트 젤 Super Sep Ace (WAKO)에서, SDS-PAGE에 의해 분리 후, CBB 의해 단백질 염색했다.
<결과>
아지드화 펩타이드 항체와 Dibenzocyclooctyne-maleimide 화 VHH와의 클릭 반응에 의한 연결 후 이온 교환 크로마토그래피 결과, 3개(a, b 및 c)의 주요 피크를 얻을 수 있었다(도 8A). 각각 환원 상태에서 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도 8B에 나타낸다. a(레인 3)는 원래 IgG (레인 1)과 같은 H 사슬 유래의 50 kDa 및 L 사슬 유래의 25 kDa의 밴드가 보였다. b(레인 4)는 L 체인 밴드에 변화는 없었지만, 원래 IgG 항체의 중쇄(약 50 kDa)(레인 1)에 부가하여 거의 동등 농도의 약 80 kDa의 위치의 새로운 밴드가 보였다. c(레인 5)에서는 L 사슬의 밴드에 변화는 없었지만, 원래의 중쇄(약 50 kDa)의 밴드가 사라지고 약 80 kDa의 밴드만이 보였다. 이러한 점에서 a는 VHH가 부가되지 않는 IgG 항체, b는 1 개의 VHH가 연결된 IgG 항체(항 HER2 인간 항체-1가의 VHH), c는 2개의 VHH가 연결된 IgG 항체(항 HER2 인간 항체-2가의 VHH)인 것으로 나타났다.
이상으로부터, IgG 항체에 IgG 결합 펩티드 시약을 사용하여 도입한 아지드 그룹과, VHH 저분자 항체에 도입한 Dibenzocyclooctyne 그룹간 클릭 반응에 의해 IgG 항체 저분자 항체(VHH 등)를 연결할 수 있다는 것을 확인하였다.
[ 실시예 10: 항 IgA 수용체 VHH 및 항 HER2 인간 IgG 항체의 IgG 결합 펩티드를 통한 복합체의 FACS에 의한 항원 결합 분석]
<방법>
HL60 세포 (JCRB로 부터 입수)는 10% FBS 및 100 units/mL 페니실린 G와 100 μg/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함한 RPMI1640 배지(Life Technologies 사)에서, 1.3% DMSO 첨가에 의해 6일간 분화 유도를 실시했다. SK-BR3 세포(ATCC에서 구입)에 대해서는 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 G 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함하는 McCoy's 5A (Life Technologies 사) 배지에서, 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양 후 트립신-EDTA (Life Technologies 사)에서 세포를 박리, 회수했다. 각 2×105 세포를 200 μL의 3% BSA를 포함한 PBS에 분산시켜 최종 농도가 200 nM가 되도록 1차 항체(항 HER2 인간 IgG 항체, 실시예 9에서 제조한 항 IgA 수용체 VHH(C 말단 HIS 태그 추가), 또는 실시예 9에서 제조한 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH(C 말단 HIS 태그 추가))를 추가하고, 4℃에서 30분 방치하였다. 1회 세척 후, 3% BSA를 포함한 PBS에 분산된 세포 용액 200μL에 2차 항체로서 1) 비오틴화 항 HIS 태그 항체(MBL 생명 과학)+PE 표지된 SA(최종 농도 50 nM)(Vector Laboratories), 또는 2) PE 표지 항 인간 IgG 폴리클로날 항체(Affimetrix eBioscience)(최종 농도 13 nM)을 넣고 4℃에서 30분 방치하였다. 1회 세척 후, 3% BSA를 포함한 PBS에 분산된 세포 용액 200μL에 7-AAD Viability Dye(Beckman Coulter Inc.) 10μL를 첨가하여 15분 방치 후, 800μL의 PBS를 추가, 35μm 메쉬 (Corning)를 통과한 후, S3eTM cell sorter(Bio-Rad Laboratories, Inc.)에서 분석했다.
<결과>
7-AAD 염색을 통해 죽은 세포를 제외한 세포 분획을 사용하여 HER2을 고발현하는 SK-BR3 세포를 1차 항체로서, 항 HER2 인간 IgG 항체(도 9A), 항 IgA 수용체 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9B), 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9C)을 사용하여 2차 항체로서 최종 농도 50 nM의 비오틴화 항 HIS 항체+PE 표지한 SA의 혼합물을 사용하여 FACS 분석을 실시한 결과를 도 9A ~ C에 나타낸다. 도 9C의 경우에는 큰 형광 시프트 변화를 보인 점으로부터, 조제한 항 HER2 인간 항체-1가 VHH 중 항 HER2 항체는, SKBR-3 세포에 결합 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
한편, DMSO 1.3%에 의하여 분화 유도로 IgA 수용체를 고발현하는 HL60 세포에 결합을, 1차 항체로서 항 HER2 인간 항체(도 9D), 항 IgA 수용체 VHH(C 말단 HIS 태그 추가)(도 9E), 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH(도 9F)를 이용하여 2차 항체로서 PE 표지 항 인간 IgG 폴리클로날 항체를 사용하여 검출한 결과를 도 9D ~ F로 나타낸다. 여기에서도, 도 9F의 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH에서만 HL60에 결합을 볼 수 있다는 것으로부터, 항 HER2 인간 항체-1가의 VHH중 VHH는, IgA 수용체에 대한 항원 결합 활성을 유지하고 있는 것으로 나타났다. 또한, 도 9D에서 약간의 형광 변화는 분화된 HL60 세포에 HER2가 소량 발현하고 있는 것을 나타내고 있지만, 이 결합에 의한 형광 강도에 비해서 도 9F에서의 형광 강도는 훨씬 크기 때문에, HER2에 결합의 기여는 무시할 정도라고 생각된다.
[ 실시예 11: IgG 결합 펩타이드에 의한 항체 약물 복합체의 세포 증식 억제]
<방법>
N 말단의 아미노기를 Maleimideacetoxyl succinimidyl ester으로 변형한 말레이미드(maleimide)-PEG4 화합성 펩타이드 RRGPDCAYHXGELVWCTFH (서열번호 37: 서열번호 2의 펩티드의 N 말단에 2개의 Arg을 추가 한 것, X는 라이신으로, C 말단은 아미드화)은 Fmoc 고상합성법으로 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 보호기를 제거한 후, pH8.5의 수용액 중 산화 조건에서 분자 내 SS 결합을 형성시켜 역상 HPLC를 이용하여 유속 1.0 ml/min, 0.1% TFA를 포함하는 10%에서 60% 아세토니트릴 의 그레디언트 용출에 의해 분자 내 SS 결합을 갖는 펩타이드를 정제하였다. DMSO에 용해된 펩티드(18.5 mM) 40 μL에 동일하게 DMSO에 용해된 DM-1(emtansine (XDCExplorer 사), 50 mM) 24 μL (펩티드와 DM-1의 몰비 = 1:1.6)를 넣고, 피리딘(pyridine) 3.4μL (최종 농도 5%)을 첨가하고 50℃에서 3시간 반응시켰다. 이어 아세토니트릴에 용해된 DSG (500 mM) 80μL 추가하고 50℃에서 3시간 반응시켜 IgG 결합 펩타이드의 말레이미드기와 DM-1의 설프히드릴기(sulfhydryl group)의 사이에서 가교 구조를 형성시켰다. 전량을 0.1% TFA를 포함하는 10% 아세토니트릴 10 ml에 희석하여 원심 후 상청을 Inertsustain C18 컬럼(7.6mm 1×250mm, GL Science)에 주입하고, 0.1% TFA를 포함하는 10%에서 70%까지 아세토니트릴의 그레디언트로 용출했다. 용출물의 질량 분석을 수행하고, 목적물을 회수한 후 용매 제거 후 동결 건조했다.
DMSO에 용해된 12.0mM의 DM-1을 연결한 DSG 변형 말레이미드-PEG4 화 IgG 결합 펩티드 시약 0.56μL과 10 mM 초산 완충액 (pH5.5)에 녹인 6.8μM 항 HER2 인간 항체(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. ) 1 mL를 혼합하고 실온에서 30 분간 반응(펩타이드와 항체의 몰비 = 1:1)시켰다. 이렇게 제조한 DM-1 변형 인간 항체(항체 약물 복합체 ADC)는 양이온 이온 교환 컬럼 Shodex SP825 (8.0mm×75mm, Shodex)에서 10 mM 초산 완충액 (pH5.5)을 포함하는 0M에서 1.0M까지의 NaCl의 그레디언트 용출로 정제되었다. 미반응 항체 이외의 2개의 피크 (피크 A, B)을 분취 후 Vivaspin (10000Da 컷오프, Sartorius)에서, 3000g의 원심 분리에 의해 탈염 농축을 실시했다. 얻어진 샘플은 MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG (Bruker Daltonics)에 질량을 측정하고, 피크 A가 원래(original) 항 HER2 인간 항체에 비해 3553 (이론치 3535), 피크 B가 원래 항 HER2 인간 항체에 비해 7092 (이론치 7070) 증가하고 있기 때문에 DM-1을 연결한 말레이미드-PEG4 화 IgG 결합 펩타이드가 각각 하나(항 HER2 항체-DM1*1) 및 두 개(항 HER2 항체-DM1*2)씩 도입되는 것을 확인했다.
96 웰의 세포 배양 플레이트의 각 웰에, 10,000 cell/100μL가 되도록 10% FBS와 100 units/mL 페니실린 G와 100 μg/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함하는 McCoy’s 5A (Life Technologies Corp.) 배지에, SK- BR3 세포(ATCC에서 구입) 또는 C6 세포(JCRB에서 얻음)를 파종했다. 37℃에서 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 각 농도의 상기와 같이 제조된 항체 약물 복합체(ADC)를 포함하는 배지 100μL를 첨가하고, 또한 37℃의 CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories)을 각 well에 10 μL 씩 첨가하여 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간 보온 후 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정했다.
<결과>
유방암 세포주 SK-BR3 대한, 조제한 ADC의 세포 증식 억제 효과를 평가하기 위해 0-10 nM의 ADC의 존재하에서 SK-BR3 세포를 배양, 72시간 후 세포 수를 셀 측정 키트를 사용하여 평가하였다(도 10). 이번에 조제한 항 HER2 항체-DM1*1, 항 HER2 항체-DM1*2는 모두, HER2을 고발현하는 SK-BR3 대해 0.4 nM 이상의 농도에서 현저한 세포 증식 억제 활성을 나타내었다. 한편, HER2를 발현하지 않는 C6 세포에 관해서는, 사용한 항체 약물 복합체의 농도 범위에서는 세포 증식 억제는 보이지 않았다. 이상으로부터, IgG 결합 펩티드를 통해 공유 결합에 의한 항체 약물 복합체는, 암 세포주에 대해, 유효한 세포 증식 억제 활성을 발현할 수 있는 것으로 나타났다.
[실시예 12: 디클로로프로판온에 의한 SS 가교 구조를 가지는 IgG 결합 펩타이드에 의한 항체 약물 복합체의 세포 증식 억제]
<방법>
N 말단 아세틸화 RRC(Acm 보호)-PEG4 화합성 펩타이드 GPDCAYHXGELVWCTFH (서열번호 2, X는 라이신으로, C 말단 아미드화)는, 펩타이드 합성 비즈(Rink-amide-Chemmatrix resin, Biotage) 상에서, Fmoc 고상합성법으로 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 수지의 펩타이드 잘라 탈보호한 후, 펩타이드(도 11 a)를 얻었다. 얻어진 펩타이드 65 mg(15.6μmol)을 6 M Gn·HCl을 포함하는 인산 완충액 (pH = 7.3) 5 mL에 용해하고, 이를 아세토니트릴 120μL에 용해된 1,3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5 등량몰)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 1시간 후, HPLC 분석에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 직접 HPLC로 정제하여 고리화(cyclized) 펩타이드(도 11, b, 33 mg, 7.8 μmol, 수율 50%)를 얻었다. 이 고리화 펩타이드에 대해 90% 초산 수용액(8.8 mL)에 현탁한 초산은(30.8 mg, 184.5 μmol)을 첨가하여 실온 하, 차광에서 5시간 교반하였다. 디티오트레이톨(Dithiothreitol)(DTT: 352 mg, 2.3 mmol)을 가하고, 생긴 침전을 원심 분리하여 제거하고, 얻어진 상층액을 HPLC로 정제하여 고리화 펩타이드(도 11, c, 20.5 mg, 5.2 μmol, 수율 67%)을 얻었다.
상기와 같이 제조한 고리화 펩타이드를 DMSO에 녹인 용액 (60mM) 6μL에, 동일하게 DMSO에 용해된 27mM의 VcMMAE (Maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl-monomethyl auristatin E, MedChem Express) 18μL (펩티드와 VcMMAE의 몰비 = 1:1.4)를 넣고, 이어서 피리딘 1.2μL (최종 농도 5%)을 첨가하고 50℃에서 3시간 반응시켰다. 이어, 아세토니트릴에 용해된 DSG (500 mM) 25 μL 추가하고, 50℃에서 3시간 반응시켰다. 전량을 0.1% TFA를 포함한 10% 아세토니트릴 10ml에 희석하여 원심 후 상청을 Inertsustain C18 컬럼(7.6mm×250mm, GL Science)에 주입하고, 0.1% TFA를 포함한 10%에서 80%까지 아세토니트릴의 그레디언트로 용출했다. 용출물의 질량 분석을 수행하고, 목적물을 회수한 후 용매 제거 후 동결 건조했다.
DMSO에 용해된 5.0mM의 DSG 변형 N 말단 아세틸화 RRC-PEG4 화 IgG 결합 펩티드 시약 (R8K) 5.4μL와 10 mM 초산 완충액 (pH5.5)에 녹인 6.8μM 항 HER2 인간 IgG 항체 (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) 1mL를 혼합하고 실온에서 15시간 반응(펩타이드와 항체의 몰비 = 1:4)시켰다. 이렇게 하여 조제한 VcMMAE 변형 인간 IgG 항체(항체 약물 복합체 ADC)는 양이온 이온 교환 컬럼 Shodex SP825 (8.0mm×75mm, Shodex)에서 10 mM 초산 완충액 (pH4.5)을 포함하는 0M에서 1.0M까지의 NaCl의 그레디언트 용출로 정제되었다. 미반응 항체 이외의 주요 1 개의 피크를 분취 후 Vivaspin (10000Da 컷오프, Sartorius)에서, 3000g의 원심 분리에 의해 탈염 농축을 실시했다. 얻어진 샘플은 MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG (Bruker Daltonics)에 질량을 측정하고, 원래의 항 HER2 인간 항체에 비해 3941 (이론치 4178) 증가하고 있는 것으로부터, VcMMAE가 추가된 N 말단 아세틸-RRC-PEG4 화 IgG 결합 펩타이드(R8K)가 하나 도입되는 것을 확인했다.
96 웰의 세포 배양 플레이트의 각 웰에, 10,000 cell/100 μL가 되도록 10% FBS와 100 units/mL 페니실린 G와 100 μg/mL 스트렙토마이신 황산염을 포함하는 McCoy's 5A(Life Technologies Corp.) 배지에 SK -BR3 세포(ATCC에서 구입) 또는 C6 세포(JCRB에서 수득)를 파종했다. 37℃에서 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 각 농도의 항체 약물 복합체(ADC)를 포함하는 배지 100 μL를 첨가하고, 또한 37℃의 CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories)을 각 well에 10μL 씩 첨가하여 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간 보온 후 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정했다.
<결과>
유방암 세포주 SK-BR3 대한, 조제한 ADC의 세포 증식 억제 효과를 평가하기 위해 0-500 nM ADC의 존재하에서 SK-BR3 세포를 배양하여 72시간 후 세포 수를 셀 측정 키트에 의해 평가되었다(도 12). 사용한 항암제 VcMMAE 그 자체에 대해서는, 250 nM 이상에서만 증식 억제가 보였지만(도 12A), 이번에 조제한 ADC는 HER2을 고발현하는 SK-BR3 대해, 0.4 nM 이상 농도에서 현저한 세포 증식 억제 활성을 나타내었고(도 12B), 항체의 복합체에 의해 500배 정도 세포 증식 억제 활성이 증강했다. 한편, 이러한 세포 증식 억제는 원래의 항 HER2 인간 항체에서만은 볼 수 없었다. 이상으로부터, IgG 결합 펩티드를 통해 공유 결합에 의한 항체 약물 복합체는 암 세포주에 유효한 세포 증식 억제 활성을 발휘할 수 있는 것으로 나타났다.
[ 실시예 13: 각종 IgG에 대한 IgG 결합 펩타이드에 의한 표지 평가]
<방법>
인간, 마우스, 토끼 및 랫트의 각종 항체 용액 (14μM) 1.25μL (항체 2.5μg 상당)에, PBS 3.15μL을 추가하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 DSG 변형한 N 말단 비오틴화 IgG 결합 펩타이드 Biotin -PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH (서열번호 35, X는 DSG 변형한 리신으로, 두 개의 Cys는 분자 내의 SS 결합을 형성)의 DMSO 용액 (118μM) 0.65μL을 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응(항체와 펩타이드 몰비 = 1:4)시켰다. 이 반응액(5.0 μL)에 SDS-PAGE 샘플 버퍼(4×) 5.0 μL, 2-mercaptoethanol 0.6 μL, 초순수 9.35 μL를 추가하여 혼합한 후 95℃에서 10분간 가열하고 그레디언트 젤(Super SepTM Ace 5-20 %, Wako Chemicals)에서, SDS-PAGE를 실시했다. 젤은 CBB에서 단백질 염색을 하고, 또한 겔에서 PBDF 막에 전사한 단백질은 Western Blot에 제공했다. 즉, 전사 후 PVDF 막을 0.5% BSA로 차단하고, HRP가 스트렙토아비딘(Vector Laboratories)을 실온에서 1시간 반응시켜 화학 발광 검출 시약 Chemi-Lumi One (NACALAI TESQUE)를 이용하여 화학 발광 이미저 ChemDock (BioRad)에서 검출했다. 표지에 사용된 항체는 다음과 같다. 인간 IgG1 (Clone ID:CB1), 인간 IgG2 (Clone ID:CB2), 인간 IgG3 (Clone ID:CB3), 인간 IgG4 (Clone ID:CB4), 마우스 IgG1 (Clone ID:CB5), 마우스 IgG2b (Clone ID:CB8) 및 마우스 IgG3 (Clone ID:CB9)은 Crown Bioscience Inc.에서 구입했다. 쥐 IgG1 (Clone #:43414)와 IgG2b (Clone #:141945)는 R & D 사에서, IgG2c (Clone Name:SB68b)는 LifeSpan BioScience 사에서, 토끼 IgG는 Thermo Scientific 사에서 구입했다.
<결과>
도 13에 나타낸 바와 같이, Trastuzumab (항 HER2 인간화 IgG1 항체)와 같은 정도로, 인간 단클론(monoclonal) IgG1, 인간 IgG2 및 인간 IgG4에서 진한 밴드가 확인되었다. 또한 사용한 동물 항체 중 토끼 다클론(polyclonal) IgG 항체가 특히 강하게 염색되었다. 이상으로부터, 본 IgG 결합 펩티드를 사용한 표지는, 인간 IgG1, 2 및 4 및 토끼 IgG 항체를 효율적으로 표지할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 IgG 결합 펩타이드를 이용하여, IgG 결합 펩타이드에 결합시킨 다양한 화합물을 단시간에, 게다가 대부분의 부작용(side reactions)없이 IgG의 Fc에 추가할 수 있다. 이에 따라 검출 시약, 진단약 및 의약 등으로 사용되는 IgG를 다양한 화합물에 의해 특이하고 편리하게 변형될 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
<110> Kagoshima University <120> Specific modification of an antibody with an IgG binding peptide <130> 2017FPI-09-003_JP <150> JP 2015-103153 <151> 2015-05-20 <150> PCT/JP 2016/065061 <151> 2016-05-20 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 1 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 2 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 3 Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 4 Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 5 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid 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Cys Thr His 1 5 10 15 His <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 10 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 11 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 12 Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 13 <211> 17 <212> PRT 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19 Asp Cys Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 20 Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 21 Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 22 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 23 Asp Cys Thr Tyr Arg Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 24 Asp Cys Thr Tyr Ser Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 25 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 26 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 27 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 28 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 29 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 110 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is homoserine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is homoserine <400> 31 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 32 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <400> 33 Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <400> 34 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 35 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is homoserine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is homoserine <400> 36 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is lysine, cystein, aspartic acid, glutamic acid, 2-amino suberic acid, or diaminopropionic acid <400> 37 Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys 1 5 10 15 Thr Phe His

Claims (29)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기의 식 III에 의해 나타내지는 13개 내지 17개 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하고, Xaa1에서 변형된 가교제를 통해 인간 IgG 및 토끼 IgG로 구성되는 군에서 선택되는 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드:
    (X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
    (상기 식에서, X는 각각 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이며,
    C는 시스테인 잔기이며,
    A는 알라닌 잔기이며,
    Y는 티로신 잔기이며,
    H는 히스티딘 잔기이며,
    Xaa1은 리신 잔기이며,
    G는 글리신 잔기이며,
    E는 글루타민산 잔기이며,
    L은 류신 잔기이며,
    V는 발린 잔기이며, 및
    W는 트립토판 잔기).
  4. 제 3항에 있어서, 17개 아미노산 잔기인 경우 N 말단에서 1 내지 3번째 및 15 내지 17번째의 각 아미노산 잔기가 하기와 같은 것을 특징으로 하는 펩타이드:
    1번째 아미노산 잔기 = S, G, F 또는 없음
    2번째 아미노산 잔기 = D, G, A, S, P, 호모시스테인(homocysteine) 또는 없음
    3번째 아미노산 잔기 = S, D, T, N, E 또는 R,
    15번째 아미노산 잔기 = S, T 또는 D,
    16번째 아미노산 잔기 = H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음, 및
    17번째 아미노산 잔기 = Y, F, H, M 또는 없음.
  5. 제 4항에 있어서, 하기의 1) 내지 14) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이되, 여기서 Xaa1은 리신 잔기이며, Xaa2는 호모시스테인인, 펩타이드:
    1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (서열번호 1)
    2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 2)
    3) RCAYH (Xaa1) GELVWCS (서열번호 3)
    4) GPRCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 4)
    5) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 5)
    6) GDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 6)
    7) GPSCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 7)
    8) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (서열번호 8)
    9) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTHH (서열번호 9)
    10) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 10)
    11) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 11)
    12) SDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFY (서열번호 12)
    13) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (서열번호 36)
    14) RRGPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (서열번호 37).
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 3항에 있어서, 펩타이드가 외부 2개의 시스테인(C) 잔기 사이에 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하거나 또는 펩타이드의 바깥 쪽 2개의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹(sulfide group)이 하기 화학식 1로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드:
    [화학식 1]

  10. 제 3항에 있어서, 표지 물질(labeling agent)에 의해 표지되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  11. 제 3항에 있어서, 약제(drug)가 결합된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  12. 삭제
  13. 제 3항에 있어서, Xaa1이 가교제(cross-linking agent)로 변형되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  14. 제 3항에 있어서, 상기 가교제는 DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS (dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride), 및 DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 가교제가 DSG (disuccinimidyl glutarate) 또는 DSS (disuccinimidyl suberate)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  16. 제 3항에 기재된 펩타이드 및 IgG의 복합체(conjugate)로, 상기 복합체는 가교제로 변형된 펩타이드 및 IgG의 가교 반응에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  17. 제 3항에 기재된 펩타이드 및 IgG를 혼합하여, 가교제로 변형된 펩타이드와 IgG를 가교 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드 및 IgG의 복합체를 생산하는 방법.
  18. 삭제
  19. 시스테인 잔기를 2개 이상 포함하는 펩타이드 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물
    [화학식 2]

    (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 임의의 할로겐 원자)
    을 혼합하여, 2개 이상의 시스테인 잔기 중 설파이드 그룹(sulfide group)이 하기의 화학식 3으로 표시되는 링커
    [화학식 3]

    에 의해 연결된 펩타이드를 얻는 공정을 포함하는, 2개 이상의 시스테인 잔기가 링커에 의해 연결된 제3항의 펩타이드를 생산하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 화합물에서 R1 및 R2가 동일하고, Cl, Br, 또는 I인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16항에 있어서, 펩타이드가 방사성 동위 원소로 표지된 것을 특징으로 하는 복합체.
  22. 제 21항에 있어서, 펩타이드가 방사성 동위 원소 금속 이온의 킬레이트 복합체 또는 DOTA의 킬레이트 복합체로 표지된 것을 특징으로 하는 복합체.
  23. 제 21항에 있어서, 방사성 동위 원소에 의한 펩타이드의 표지는 아지드기 (azide group)와 디벤조시클로옥틴 (dibenzocyclooctyne)의 반응을 통해 형성되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  24. 제 16항에 있어서, IgG가 제약 항체 또는 진단 항체이거나 항-HER2 항체인 것을 특징으로 하는 복합체.
  25. 제 16항에 있어서, 펩타이드는 다음과 같은 것을 특징으로 하는 복합체:
    상기 펩타이드가 17개의 아미노산 잔기인 경우, N 말단으로부터 1 번 내지 3 번 및 15 번 내지 17 번 위치의 아미노산 잔기가 각각 다음과 같다:
    1 번째 아미노산 잔기 = S, G, F 또는 없음,
    2 번째 아미노산 잔기 = D, G, A, S, P, 호모시스테인 또는 없음,
    3 번째 아미노산 잔기 = S, D, T, N, E 또는 R,
    15 번째 아미노산 잔기 = S, T 또는 D,
    16 번째 아미노산 잔기 = H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음, 및
    17 번째 아미노산 잔기 = Y, F, H, M 또는 없음, 및
    여기서 Xaal은 리신 잔기; 또는
    펩타이드는 다음 아미노산 서열 1) 내지 14) 중 하나로 구성되며, 여기서 Xaa1은 리신 잔기이고, Xaa1은 가교제로 변형되고, Xaa2는 호모시스테인:
    1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT (서열번호 1),
    2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열번호 2),
    3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS (서열번호 3),
    4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (서열번호 4),
    5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열번호 5),
    6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열번호 6),
    7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열번호 7),
    8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (서열번호 8),
    9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH (서열번호 9),
    10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열번호 10),
    11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열번호 11),
    12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (서열번호 12),
    13) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H (서열번호 36), 및
    14) RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (서열번호 37).
  26. 제 16항에 있어서, 상기 펩타이드는 바깥쪽에 있는 2 개의 시스테인 (C) 잔기 또는 바깥쪽에 있는 2 개의 시스테인 잔기의 황화물 그룹 사이에 형성된 이황화 결합을 갖는 복합체이되, 여기서 펩타이드는 화학식 1로 표시되는 링커를 통해 연결되는 복합체:
    [화학식 4]

  27. 제 16항에 있어서, 상기 복합체는 펩타이드의 Xaa1 잔기와 IgG Fc 사이, 또는 펩타이드의 Xaa1 잔기와 IgG Fc의 Lys248 또는 Lys246 사이, 또는 펩타이드의 Xaa1 잔기와 IgG Fc의 Lys248 사이에 형성된 가교 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 복합체.
  28. 제 16항에 있어서, 상기 가교제는 DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS (dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride), 및 DSP (dithiobis succinimidyl propionate)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  29. 제 28항에 있어서, 가교제는 DSG (disuccinimidyl glutarate) 또는 DSS (disuccinimidyl suberate)인 것을 특징으로 하는 복합체.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200181196A1 (en) * 2016-06-13 2020-06-11 Kagoshima University SITE-SPECIFIC RADIOISOTOPE-LABELED ANTIBODY USING IgG-BINDING PEPTIDE
CA3036768A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Fujifilm Corporation Cyclic peptide, affinity chromatography support, labeled antibody, antibody drug conjugate, and pharmaceutical preparation
JP7002733B2 (ja) * 2016-11-18 2022-02-04 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
KR20200002858A (ko) * 2017-04-28 2020-01-08 아지노모토 가부시키가이샤 가용성 단백질에 대한 친화성 물질, 절단성 부분 및 반응성기를 갖는 화합물 또는 이의 염
US11472865B2 (en) 2017-06-16 2022-10-18 Kagoshima University IgG-binding peptide, and specific modification of antibody with said peptide
KR20200143366A (ko) 2018-04-16 2020-12-23 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 수식 항체 및 방사성 금속 표지 항체
CN112262152A (zh) * 2018-06-14 2021-01-22 味之素株式会社 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
EP3811978A4 (en) * 2018-06-14 2022-03-16 Ajinomoto Co., Inc. SUBSTANCE HAVING AFFINITY FOR AN ANTIBODY, AND COMPOUND OR SALT THEREOF HAVING A BIOORTHOGONAL FUNCTIONAL GROUP
JP2020019723A (ja) * 2018-07-30 2020-02-06 国立大学法人 鹿児島大学 抗ＣＤ７０抗体とＩｇＧ結合ペプチドの複合体
US20210380637A1 (en) * 2018-10-10 2021-12-09 Kagoshima University SOLID-PHASE CARRIER INCLUDING IgG-BINDING PEPTIDE, AND IgG SEPERATION METHOD
CN113227124A (zh) * 2018-10-31 2021-08-06 味之素株式会社 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
WO2020153774A1 (ko) * 2019-01-23 2020-07-30 앱티스 주식회사 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
WO2022080481A1 (ja) 2020-10-16 2022-04-21 日本メジフィジックス株式会社 抗ｈｅｒ２抗体の放射性複合体、及び、放射性医薬
AU2020234394B2 (en) * 2019-03-08 2024-02-15 AbTis Co., Ltd. Site-specific antibody conjugation and antibody-drug conjugate as specific example thereof
EP4047010A4 (en) * 2019-10-18 2024-01-10 Nihon Mediphysics Co Ltd METHOD FOR PRODUCING ANTIBODIES LABELED WITH A RADIOACTIVE METAL
IL292133A (en) 2019-10-18 2022-06-01 Nihon Mediphysics Co Ltd Humanized antibody labeled with a radioactive isotope
WO2021080008A1 (ja) 2019-10-24 2021-04-29 国立大学法人 鹿児島大学 １価ｃｃａｐ生成物の製造方法
US20230210967A1 (en) 2020-04-23 2023-07-06 Brightpath Biotherapeutics Co., Ltd. Improved peptide vaccine
CN115803037A (zh) 2020-06-30 2023-03-14 盖亚生物制药有限公司 稳定nk细胞与抗体的结合的方法及其应用
JPWO2022080385A1 (ko) * 2020-10-13 2022-04-21
MX2023005411A (es) 2020-11-09 2023-05-22 Univ Kagoshima Agente entrelazante de peptido y peptido entrelazado que se entrelaza usando dicho agente entrelazante.
JP2021049375A (ja) * 2020-12-09 2021-04-01 株式会社三洋物産 遊技機
CN116711028A (zh) 2021-01-08 2023-09-05 日本医事物理股份有限公司 Ac-225溶液的制造方法及使用了Ac-225溶液的医药的制造方法
KR20230133294A (ko) 2021-01-18 2023-09-19 아지노모토 가부시키가이샤 화합물 또는 그 염, 및 그것들에 의해 얻어지는 항체
WO2022178754A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates with therapeutic agents and oligonucleotides and uses thereof
WO2022178753A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates comprising targeting moiety binding fragments and uses thereof
EP4306535A1 (en) 2021-03-11 2024-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Compound or salt thereof, and antibody obtained using same
WO2022196675A1 (ja) 2021-03-16 2022-09-22 味の素株式会社 複合体またはその塩、およびその製造方法
JPWO2022211051A1 (ko) 2021-03-31 2022-10-06
EP4327831A1 (en) 2021-04-20 2024-02-28 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Radioactive complex of anti-cd20 antibody, and radiopharmaceutical
CN117377501A (zh) 2021-04-21 2024-01-09 日本医事物理股份有限公司 放射性抗肿瘤剂
WO2022225006A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 β線を放出する核種で標識されたヒト化抗体
CA3222359A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Conjugates of checkpoint inhibitors with il-2, and uses thereof
TW202325343A (zh) 2021-08-31 2023-07-01 日商日本醫事物理股份有限公司 去醣基化抗體之放射性複合體，及放射性醫藥
WO2023038082A1 (ja) 2021-09-08 2023-03-16 国立大学法人 鹿児島大学 化合物、化合物の塩、抗体修飾試薬、修飾抗体の製造方法及び修飾抗体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012033446A1 (en) 2010-09-06 2012-03-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for labeling of compounds
WO2013027796A1 (ja) 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751286A (en) * 1985-11-19 1988-06-14 The Johns Hopkins University Protein label and drug delivery system
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
US6013763A (en) * 1996-06-04 2000-01-11 Genentech, Inc. Peptide variants of protein A
DE69942148D1 (de) 1998-06-22 2010-04-29 Immunomedics Inc Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie
DE60331827D1 (de) 2002-05-29 2010-05-06 Immunomedics Inc Zusammensetzungen für die radioimmuntherapie von gehirn-tumoren
JP5806112B2 (ja) * 2008-07-18 2015-11-10 トリニティー セラピューティクス インコーポレイテッド デング出血熱およびデングショック症候群を含む免疫介在性デング熱感染症およびデング熱感染症の抗体依存性増強を処置するための方法
WO2011148952A1 (ja) * 2010-05-24 2011-12-01 国立大学法人鹿児島大学 IgA結合性ペプチド及びそれによるIgAの精製
US20200181196A1 (en) * 2016-06-13 2020-06-11 Kagoshima University SITE-SPECIFIC RADIOISOTOPE-LABELED ANTIBODY USING IgG-BINDING PEPTIDE
US20210380637A1 (en) * 2018-10-10 2021-12-09 Kagoshima University SOLID-PHASE CARRIER INCLUDING IgG-BINDING PEPTIDE, AND IgG SEPERATION METHOD

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012033446A1 (en) 2010-09-06 2012-03-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for labeling of compounds
WO2013027796A1 (ja) 2011-08-24 2013-02-28 大塚化学株式会社 IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法
US20140274790A1 (en) * 2011-08-24 2014-09-18 Kagoshima University IgG-BINDING PEPTIDE AND METHOD FOR DETECTING AND PURIFYING IgG USING SAME

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