JP7002733B2 - ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 - Google Patents

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Description

本発明は、IgG結合ペプチドを含む固相担体、該固相担体を含むIgG分離用カラム、該固相担体又はカラムを含むキット、及び該固相担体又はカラムを用いるIgGの精製方法等に関する。
IgG抗体は、現在最も注目されているバイオ医薬品の1つである。近年、IgG抗体を中心とした抗体医薬が、医薬分野に利用されるようになり、工業的、製薬的な利用における重要性がますます高まっている。抗体の精製にはプロテインAカラムが中心的な役割を果たしており、多くの抗体医薬の製造メーカは、このカラムを中心とした精製システムを導入している。
しかしながら、このプロテインAカラムは、いくつかの問題点が指摘されている。１つには、精製抗体中へのプロテインAの混入の問題である。プロテインAはバクテリア由来のタンパク質であり、人体投与後の免疫原性が高く、またエンドトキシンの混入が危惧される。IgGのような医薬品の精製に用いるアフィニティーリガンドとしては、不都合な物質の混入が起こらないよう、リガンドとしてのプロテインAには高い精製度が求められており、これが医薬品精製に利用するプロテインAカラムのコストを上げる要因になっている。このため、プロテインAに代わる新たなアフィニティーカラムの開発が期待されている。
本発明者らは、これまでにジスルフィド結合で環化された特定の配列を含むペプチドリガンドによりIgGを精製し得ることを報告しているが（特許文献1）、本ペプチドリガンドは、アルカリ溶液洗浄の繰り返しにより、親和性が低下するという問題を抱えていた。
WO2013/027796
本発明は、IgG精製のために用いることができ、かつ安定性、例えばアルカリ安定性に優れたIgG結合ペプチドを提供すること等を課題とする。また、本発明は、上記IgG結合ペプチドを用いてIgGを精製する方法等を提供することを課題とする。
本発明者は、ペプチド中のシステイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋することにより、ペプチドの安定性が顕著に改善することを見出し、本願発明を完成させた。
したがって、本発明は、以下の態様を包含する。
（１）ヒトIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
前記ペプチドが、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000001
 で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されており、ここでRは、置換された若しくは置換されていないC1～C6アルキルである、固相担体。
（２）前記ペプチドが、下記の式II：
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、（１）に記載の固相担体。
（３）前記ペプチドが、下記の式III：
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）に記載の固相担体。
（４）17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
である、（１）～（３）のいずれかに記載の固相担体。
（５）前記ペプチドが、以下の１）～１４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、Xaa2はホモシステインである、（４）に記載の固相担体：
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）
３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）
５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）
６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）
７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）
８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）
９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）
１０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）
１１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）
１２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号１４）。
（６）前記ペプチドが、下記の式IV：
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）に記載の固相担体。
（７）前記ペプチドが、以下の１）～４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体である、（６）に記載の固相担体：
１）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）
２）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１６）
３）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）
４）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１８）。
（８）ヒトIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
前記ペプチドが、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000002
 で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されており、ここでRは、置換された若しくは置換されていないC1～C6アルキルである、固相担体。
（９）Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体、又はロイシン残基である、（１）～（８）のいずれかに記載の固相担体。
（１０）前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列からなる、（１）に記載の固相担体：
GPDCAYHRGELVWCTFH（配列番号３１）。
（１１）前記リンカーが、以下の式：
Figure 0007002733000003
 で表されるリンカーである、（１）～（１０）のいずれかに記載の固相担体。
（１２）前記ペプチドのN末端がPEG化されている、（１）～（１１）のいずれかに記載の固相担体。
（１３）前記ペプチドのC末端がアミド化されている、（１）～（１２）のいずれかに記載の固相担体。
（１４）前記ペプチドが多量体化されている、（１）～（１３）のいずれかに記載の固相担体。
（１５）前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、（１４）に記載の固相担体。
（１６）前記ペプチドと固相間にスペーサーを有する、（１）～（１５）のいずれかに記載の固相担体。
（１７）（１）～（１６）のいずれかに記載の固相担体を含む、IgG分離用カラム。
（１８）（１）～（１６）のいずれかに記載の固相担体又は（１７）に記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
（１９）（１）～（１６）のいずれかに記載の固相担体、又は（１７）に記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程を含む、IgGの精製方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-225483号の開示内容を包含する。
本発明の固相担体に含まれるペプチドは、システイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋することによって、安定性が改善されている。したがって、本発明の固相担体は、アルカリ洗浄工程等によってIgG結合能が低減されにくいため、効率的なIgG精製に用いることができる。
図1は、実施例3で作製したペプチド固定化カラムにヒト血清由来γ-グロブリン(Wako)を吸着させ、酸性の溶出溶液(20 mM クエン酸, pH2.5)を用いて溶出した場合の結果を示す。横軸は、溶出液の体積を、縦軸は280nmの吸光度により測定されるタンパク質濃度を示す。 図2は、実施例3で作製したペプチド固定化カラムから、クエン酸又はIgG結合ペプチドによりタンパク質を溶出させ、0.5 mL分画した各フラクションのSDS-PAGEの結果を示す。タンパク質の検出は、CBB染色で行った。 図3はペプチド固定化量の異なる3種（1 mg、4 mg、10 mg）のカラムを吸着溶液で平衡化した後、吸着溶液に溶解した1 mg/mLヒト血清由来γ-グロブリンを1 mL/min (滞留時間1 min)の流速で送液した際のDBCの測定結果を示す。DBCは、280 nm吸光度において、非吸着成分を除いた値がサンプル全体の吸光度の10%に到達するまでに送液されたサンプル量から求めた。 図4は、実施例2で調製したリンカーにより架橋されたIgG結合ペプチド、及び比較例1で調製したジスルフィドにより架橋されたIgG結合ペプチドの、水酸化ナトリウム処理時のDBCの測定結果を示す。
＜IgG結合ペプチドを含む固相担体＞
一態様において、本発明は、IgG結合ペプチドを含む固相担体に関する。本明細書における「固相担体」としては、限定するものではないが、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機等の複合担体等が挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、IgG結合ペプチドの選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン－酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体が代表例として挙げられる。
固相担体の形態としては、ビーズ状、線維状、粒子条、膜状（中空糸も含む）、ゲル状等いずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10～2500μmのものが使いやすく、とりわけ、IgG結合ペプチド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。固相担体としては、具体的には例えば、磁性ビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、及び多糖類ビーズ等が挙げられる。
さらに固相担体表面には、IgG結合ペプチドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとIgG結合ペプチドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、スクシンイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミド基等、酸無水物基、ヨードアセチル基等が挙げられる。
固相担体としては、市販品を用いることもできる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L、NHS基で活性化されたセファロース担体を含むNHS活性化プレパックカラム等を例示することができる。ただし、本実施態様においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。
上述の固相担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。また、固相担体としては、その使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
上記固相担体には、本明細書に記載のIgG結合ペプチドが固定化されていることが好ましく、ペプチドの固定化は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。固定化は、例えばIgG結合ペプチドのN末端のアミノ基を、直接又はスペーサーを介して固相担体に共有結合させることによって行うことが好ましい。IgG結合ペプチドの立体障害を小さくすることにより分離効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することがより好ましい。親水性スペーサーは特に限定しないが、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
上記固相担体へ導入されるIgG結合ペプチド及びスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法及び条件は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。例えば、担体をアミノ基を含む化合物、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を含む化合物、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン等と反応させて活性化し（担体が元々持っている官能基よりIgG結合ペプチドが反応しやすい官能基に変え）、IgG結合ペプチドと反応、固定化する方法、また、担体とIgG結合ペプチドが存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、固相担体の滅菌時または利用時にIgG結合ペプチドが固相担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
本明細書に記載のIgG結合ペプチドを含む固相担体は、クロマトグラフィーカラム等に充填して、ヒトIgGを精製又は分離するために用いることができる。
本発明の固相担体に含まれ得るIgG結合ペプチドについて、以下詳細に説明する。
本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG（IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4）を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
一態様において、本発明の固相担体に含まれ得るIgG結合ペプチドは、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000004
 で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されている。
上記式で、N末端又はC末端のX1-3という表記は、システイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが1～3個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは3個すべてが同じ残基でない配列からなる。同様に、X2もシステイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが2個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該2個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列からなる。
式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式I'及び式I''で表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式I'で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
式I''で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
上記の式I'、式I''及び式IIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなる。
本明細書で使用する「17アミノ酸残基とした場合の」とは、ペプチドのアミノ酸残基をアミノ酸番号で呼ぶときに、式Iのペプチドについて最長のアミノ酸長である17残基のN末端から順番に1番目から17番目まで番号づけするために便宜的に表現した用語である。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIIで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IIIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
上記の式IIIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目、並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなってよい。
さらに、上記の各式のペプチドのアミノ酸配列のシステイン（C）以外のアミノ酸残基、すなわち、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～3、5、6、15～17番目の各アミノ酸残基は、以下のものから選択されることが好ましい。ここで、各大文字のアルファベットは、アミノ酸の一文字表記である:
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし。
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IVで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IVで表されるペプチドは、
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。）によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
式Iのペプチドの具体例のいくつかを以下の1)～18)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）、
３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）、
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）、
５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）、
６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）、
７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）、
８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）、
９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）、
１０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）、
１１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）、
１２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）、
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）、
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号１４）、
１５）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）、
１６）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１６）、
１７）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）、及び
１８）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１８）
（式中、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
式Iのペプチドの好ましい具体例として、
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１、但し、Xaa1はR）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、但し、Xaa1はR、L、K又はアセチル化リシン）、及び
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４、但し、Xaa1はR）、
が挙げられ、特に好ましい例として、GPDCAYHRGELVWCTFH（配列番号３１）が挙げられる。
また、一態様において、本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、広義の一次構造として、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000005
 で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されている。
式Vのペプチドの具体例のいくつかを以下の１９）～３０）に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
１９）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１９）、
２０）DCAYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２０）、
２１）DCSYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２１）、
２２）DCTWT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２２）、
２３）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２３）、
２４）DCTYR(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２４）、
２５）DCTYS(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２５）、
２６）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２６）、
２７）DCTYT(Xaa1)GELVWCT（配列番号２７）、
２８）DCTYT(Xaa1)GRLVWCT（配列番号２８）、
２９）DCTYT(Xaa1)GDLVWCT（配列番号２９）、及び
３０）DCTYT(Xaa1)GNLIWCT（配列番号３０）
（式中、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体である）。
上記の通り、本明細書に記載のIgG結合ペプチドにおいて、Xaa1は、アルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体、好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基、さらに好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、又はロイシン残基である。本明細書において、誘導体の種類は特に限定しないが、アセチル基又はプロピニル基等のアシル化誘導体（アシル化誘導体は、一般式：R-CO-で表され、式中、Rは炭化水素、好ましくは炭素数1～6のアルキル基である）が挙げられる。誘導体の例として、例えばリシン残基のεアミノ基がアシル化、例えばアセチル化された誘導体が挙げられる。
前述の通り、本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも2つのシステイン（C）残基を有し、該システイン残基のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000006
 で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されていることを特徴としている。
上記IgG結合ペプチドにおけるリンカーは、好ましくは、
Figure 0007002733000007
 で表されるリンカー、さらに好ましくは
Figure 0007002733000008
 で表されるリンカーである。
上記IgG結合ペプチドにおけるリンカー中のRは、置換された又は置換されていないアルキル、好ましくは置換された又は置換されていないC1～C6アルキル、即ちメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基である。Rの置換基は特に限定しないが、例えば、ヒドロキシ基、（モノ若しくはポリ）エチレンオキシド基、カルボキシル基、アルコキシ基、アシル基、アルキル基、アミド基、エステル基、ハロゲン基（F、Cl、Br、又はI）、又はこれらの組み合わせであってよい。また、波線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、安定性、例えばアルカリ耐性又は還元反応等耐性、好ましくはアルカリ耐性に優れる。
上記リンカーを有するペプチドを調製する方法は特に限定しない。例えば、以下の式：
Figure 0007002733000009
 で表されるリンカーを有するペプチドは、例えば以下の方法：
システイン残基を2つ含むペプチドと、上記リンカーの波線部分に架橋反応に関与する反応性の官能基（例えば、ハロゲン基、イミダゾール基等）を有する化合物を、例えば酸性条件下で混合する工程を含む方法により得ることができる。
さらに、上記カルボニル基を有するペプチドを、一級アミン（RNH2）と反応させることにより、
Figure 0007002733000010
 で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得ることができる（Rは上記と同じ意味である）。
前記化合物において、ハロゲン基は、好ましくはF、Cl、Br、及びI、さらに好ましくはCl、Br、及びIからなる群から選択される。ハロゲン基は好ましくは同一であり、さらに好ましくは、ハロゲン基はいずれもClである。
本方法における混合工程の条件は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる条件であれば特に限定しない。例えば、ペプチドと前記化合物を、適当なバッファー中において、室温（例えば約15℃～30℃）又は低温で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、連結反応を促進する塩基（又はアルカリ）、例えば弱塩基性の無機又は有機（例えば、塩化グアニジウム、重炭酸ナトリウム、及びジエチルアミン等）を適量加えて行ってもよい。
本方法の混合工程におけるペプチドと化合物の混合比率は、特に限定しない。ペプチドと化合物のモル比率は、例えば1：0.2～1：10、好ましくは1：0.5～1：5又は1：1～1：2とすることができる。
該混合工程における混合時間（反応時間）は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
本方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のペプチド及び化合物等を分離し、システイン残基が連結されたペプチドを精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
また、本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、N末端のPEG化（ポリエチレングリコール付加）、及びC末端のアミド化等により修飾されていても良い。PEG化を行う場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
また、本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、多量体化されていてもよい。本明細書において、IgG結合ペプチドの「多量体化」とは、共有結合を介して2分子以上の上記IgG結合ペプチドが連結されていることを指し、IgG結合ペプチドの多量体は、例えば2～6量体、2～5量体、2～4量体、2～3量体、好ましくは2量体であってよい。
前記ペプチドの多量体は、該ペプチド間にスペーサーを有していてもよい。多量体化は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば上記IgG結合ペプチドのN末端のアミノ基を、スペーサーを介して2分子以上連結することによって行うことができる。スペーサーの種類は特に限定しないが、例えば両末端にカルボキシル基を有するアスパラギン酸及びグルタミン酸等のアミノ酸、並びに両末端をカルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、N-ヒドロキシスクシンイミジル基等の官能基で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体が挙げられる。
本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、ヒトIgGとの結合親和性が、他のヒト免疫グロブリン（IgA、IgE、IgM）と比較して約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高いものであり得る。本明細書に記載のペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（例えばBIACOREシステム使用）により決定可能であり、例えば1×10-1M未満、1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。本明細書に記載のIgG結合ペプチドは、IgGのFcドメインに結合し得る。
本明細書に記載のペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等（Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132;「新生化学実験講座１ タンパク質IV」（1992）日本生化学会編，東京化学同人）によって製造することができる。あるいは、本明細書に記載のペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、ペプチドを製造してもよい。例えば本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドを製造することができる。製造されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸（天然であるか非天然であるかを問わない）の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
遺伝子組換え法による製造は、例えば、本明細書に記載のペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等）等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター（T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen））、及びλファージベクター（Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。本明細書に記載のペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的ペプチドを回収する。
＜IgG分離用カラム又はIgGの精製のためのキット＞
一態様において、本発明は、上記のIgG結合ペプチドを含む固相担体を含む、IgG、好ましくはヒトIgG分離用カラムに関する。
上記IgG分離用カラムは、IgGの精製又は分離のための、クロマトグラフィーカラム、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム等のカラムを包含する。カラムのサイズは特に制限されないものとし、分析用、精製用、分取用等の用途、アプライ(搭載)又は注入する量、カラムの長さ又は内径等に応じて変化させうる。また、カラムの材質は、金属、プラスチック、ガラス等のカラムとして通常使用されるようなものでよい。
上記のカラムは、上記の本発明の固相担体（乾燥又は湿潤状態のいずれであってもよい）をカラムに密に充填することによって製造できる。
また、一態様において、本発明は、上記のIgG結合ペプチドを含む固相担体を含む、IgG、好ましくはヒトIgGの精製のためのキットに関する。
本発明のキットは、ヒトIgGの分析手順や精製手順を記載した使用説明書、精製に必要な試薬やバッファー、固相担体の充填用カラムの少なくとも一つを含んでよい。
＜IgGの精製方法＞
一態様において、本発明は、上記固相担体、又は上記IgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程を含む、IgG、好ましくはヒトIgGの精製方法に関する。
結合工程は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、上記固相担体又はIgG分離用カラム適当なバッファーで平衡化し、0℃～室温、好ましくは0℃～約10℃、更に好ましくは約4℃の低温でIgGを含有する液をアプライし、固相担体上のペプチドにIgGを結合させる。例えば血清中のIgGを分離する場合には、中性域のpH、例えばpH6.0～7.5のバッファーを使用してカラムにアプライし、結合工程を行うことができる。
溶出工程も、当業者に公知の方法より行うことができる。例えば、酸性域のpH、例えばpH2～4のバッファー（例えば0.3MのNaClを含有するpH3.5からpH2.5の0.2Mグリシン-HClバッファー又は20 mM クエン酸バッファー）をカラムに流して行ってもよいし、上記のIgG結合ペプチドを用いて競合溶出により溶出させてもよい。特に、コストの点から酸により溶出を行うことが好ましい。この場合、固相担体又はカラムを、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、及び水酸化カリウム溶液等のアルカリ性の溶液（例えば、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液）で洗浄することにより固相担体又はカラムを再生し、再度結合工程に用いることができる。溶液のアルカリ性の程度は当業者であれば容易に決定することができる。したがって、本発明の方法は、任意に、アルカリ性の溶液により洗浄することにより固相担体又はカラムを再生する工程を含み得る。
IgGが回収されたがどうかは、例えば、電気泳動による分子量の確認、及び任意にその後の抗IgG抗体を使用するウエスタンブロット法によって判定できる。例えば、電気泳動は、5～20%アクリルアミドグラジエントゲルを用いたSDS-PAGEにより行ってよく、また、ウエスタンブロットは、泳動後のタンパク質をPVDF膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後、抗IgGα鎖ヤギ抗体とHRP標識抗ヤギIgGマウス抗体で検出を行うことができる。
本発明の方法は、種々の方法で生産されたIgG含有生産物からIgGを精製する工程において、IgGに富む画分を得る場合に有用である。それゆえに、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等のカラムクロマトグラフィーにおいて本発明の方法を使用することが好ましい。IgGの精製に際しては、このようなクロマトグラフィー法に加えて、タンパク質の慣用的な精製技術、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過等を適宜組み合わせることができる。
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例1:IgG結合ペプチドの調製及び結合親和性の測定］
N末端をビオチン化PEG4でブロックした以下の6つのIgG結合ペプチドをFmoc固相合成法により常法に従って合成した：
DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１、ただしXaa1はアルギニンで、C末端はアミド化）；
GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４、ただしXaa1はアルギニンで、C末端はアミド化）；
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、ただしXaa1はアルギニンで、C末端はアミド化）；
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、ただしXaa1はロイシンで、C末端はアミド化）；GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、ただしXaa1はリシンで、C末端はアミド化）；
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、ただしXaa1はアセチル化リシンで、C末端はアミド化）。
保護基を除去した後、pH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%のTFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。
精製したIgG結合ペプチドの親和性解析は、以下の方法で行った。BIAcoreT200（GE healthcare）にセットしたCM5センサーチップ上へ、0.4M EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）と0.1M sulfo-NHS（sulfo-N-hydroxysuccinimide、スルホ－N－ヒドロキシスクシンイミド）を等量混合後、10 μl/mlの流速で、センサーチップに7分間インジェクトすることによりセンサーチップを活性化し、pH4.0（10 mM 酢酸Na）の条件下で、固定化量がRU値で4000～5000となるように、IgGを固定化した。HBS-EP緩衝液（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、0.005% Tween 20、3 mM EDTA、pH 7.0）を用いながら、流速50 μl/mlにて、10nMから2μMの濃度のペプチドを180 秒間インジェクトすることで結合反応をモニターし、その後、緩衝液により600 sec洗浄することで解離反応を測定した。結合パラメーターの解析は、BIAevalution T100ソフトウェアを用いて行った。
親和性測定の結果を、以下の表1に示す。表1の結果は、いずれのペプチドもIgGと結合性を有し、抗体の精製に用い得ることを示している。
Figure 0007002733000011
［実施例2：リンカーにより架橋されたIgG結合ペプチドの調製］
NH2-PEG4化合成ペプチドGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化）は、ペプチド合成ビーズ（Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。
樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチドを得た。得られたペプチド65mg（15.6μmol）を6 M塩化グアニジウム（Gn・HCl）を含むリン酸緩衝液 (pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg、23.4 μmol、1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(33 mg、7.8 μmol、収率50％)を得た。
以上の手順により、GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化）で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000012
 で表されるリンカーにより連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチドａを得た。
また、上記と同様の方法にて調製したペプチド（Fmoc-HN-PEG4-GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化））1.1mgを220μLのDMFに溶解し（2mM）、これにアセトニトリルに溶解した10mMのチオカルボニルジイミダゾール22μL（0.5等量モル）を加えて、氷上で2.5時間攪拌した。HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure 0007002733000013
 で表されるリンカーにより連結されている、環化ペプチドｂを得た(0.3 mg、収率27％)。本ペプチドについて、実施例1と同様にIgGとの親和性を測定したところ、Kdは1μMであった。
［実施例3：ヒト血清由来γ-グロブリンの分離］
ジクロロアセトン架橋ペプチドが、ヒト抗体精製アフィニティーリガンドとして利用可能か、NHS活性化プレパックカラム (GE Healthcare)に固定化し、各種評価を実施した。
ペプチド固定化カラムは以下の方法で作製した。なお、溶液の送液にはシリンジを用いた。
1 mL容量のNHS活性化プレパックカラムに、1 mM塩酸5 mLを送液し、カラム内のイソプロパノール溶液を除去した。次いで、1.0 mg/mLペプチド溶液（DMSOに溶解した100 mg/mLの実施例2で調製したペプチドａの溶液をカップリング溶液(20 mM 炭酸緩衝液、50 mM 塩化ナトリウム, pH8.3)で100倍に希釈）1 mLを送液し、室温で1時間固定化した。その後、1 M Tris (pH8.0)5 mLで、未反応のNHSを室温1時間ブロッキングした。最後に、吸着溶液（20mM リン酸緩衝液、150 mM 塩化ナトリウム、pH7.4）5 mLを送液し、クロマトグラフィー評価に用いた。
作製したペプチド固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore (GE Healthcare)に接続し、吸着溶液で平衡化した。次いで、吸着溶液に溶解した1 mg/mLヒト血清由来γ-グロブリン(Wako)を1 mL/minの流速で1 min送液した。さらに、カラムを吸着溶液で洗浄し、酸性の溶出溶液(20 mM クエン酸、pH2.5)を送液することで、吸着成分を溶出した。カラムからのタンパク質の溶出は、280nmの吸光度で検出した。実験結果を図1に示す。
図1に示す様に、pHの低下により、カラムに吸着したヒト血清由来γ-グロブリンの溶出が確認されたことから、実施例2で調製したペプチドが、アフィニティーカラムのリガンドとして利用できることが明らかとなった。
［実施例4：ペプチドによる競合溶出］
実施例3と同じ方法で作製したカラムに対し、1 mgのヒト由来血清γ-グロブリンを送液し、吸着させた。カラムを吸着溶液で洗浄後、吸着溶液に溶解した0.4 mg/mLの実施例2で調製したペプチドａの溶液を2.5 mL送液した。0.5 mL分画した各フラクションを定法に従い、還元条件下でのSDS-PAGEに供した。タンパク質の検出は、CBB染色で行った。比較のため、クエン酸溶出でも同様の操作を行った。
図2に示すように、軽鎖 (L鎖)及び重鎖 (H鎖)を示す25kDa付近及び50kDa付近のバンドが確認されたことから、溶出方法として、ペプチド溶液を用いることが可能であることが明らかとなった。
［実施例5：動的結合容量(DBC)測定］
実施例3と同様の方法で、ペプチド固定化量の異なる3種 (1 mg, 4 mg, 10 mg)のカラムを作製した。ただし、ペプチド溶液は、4 mg/mL、10 mg/mLを準備し、固定化に用いた。
各カラムを吸着溶液で平衡化した後、吸着溶液に溶解した1 mg/mLヒト血清由来γ-グロブリン（Wako）を1 mL/min、0.4 mL/min、0.2 mL/min (滞留時間1 min、2.5 min、5 min)の流速で送液した。DBCは、280 nm吸光度において、非吸着成分を除いた値がサンプル全体の吸光度の10%に到達するまでに送液されたサンプル量から求めた。1 mL/min流速でのクロマトグラムを図3に示し、DBCを表2にまとめた。なお、比較のため、市販Protein A担体MabSelect (GE Healthcare)についても同じ測定を行った。
Figure 0007002733000014
図3及び表2に示すように、ペプチド固定化量を増加させることによってDBCが高くなることが明らかになった。10 mgペプチド固定化カラムのDBCは、滞留時間5 minの低流速では、MabSelectよりも低かったが、滞留時間1 minの高流速では、有意に高く、高流速での精製に適していることが示唆された (表2)。
［実施例6：アルカリ耐性の評価］
実施例3と同じ方法で作製した1 mgペプチド固定化1 mLカラムに、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液を5 mL送液した。その後、吸着溶液で洗浄を行い、実施例5と同様に、流速1 mL/minでのDBC測定を行った。続いて、水酸化ナトリウム溶液処理/DBC測定を5回繰り返し行うことでアルカリ耐性を評価した。水酸化ナトリウム処理を行う前のDBCを100%とし、DBC変動率を求めた。
［比較例1］
比較例1として、ジスルフィド結合で架橋されたペプチド を1 mg固定化したカラムを作製し、実施例5と同様にアルカリ耐性評価を実施した。
実施例5及び比較例1の結果を図4に示し、実測値を表3にまとめた。
Figure 0007002733000015
図4、及び表3に示すように、ジスルフィド結合で架橋されたペプチドでは、5回の水酸化ナトリウム処理により、DBCが86.4%にまで低下した (比較例1)。一方、ジクロロアセトン架橋ペプチドでは、DBCの低下は認められず、高いアルカリ耐性を有することが明らかになった。
本発明の固相担体に含まれるペプチドは、システイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋することによって、安定性が改善されている。したがって、本発明の固相担体は、アルカリ洗浄工程等によってIgG結合能が低減されにくいため、効率的なIgG精製に用いることができ、医薬品としても用いられるIgGの効率的な生産に利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (19)

  1. ヒトIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
    前記ペプチドが、下記の式I：
    (X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
    (式中、
    Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ
    前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
    Figure 0007002733000016
    で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されており、
    ここでRは、置換されていないC1～C6アルキルである、
    固相担体。
  2. 前記ペプチドが、下記の式II：
    (X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
    (式中、
    Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の固相担体。
  3. 前記ペプチドが、下記の式III：
    (X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
    (式中、
    Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Aはアラニン残基であり、
    Yはチロシン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Eはグルタミン酸残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の固相担体。
  4. 17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
    1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
    2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
    3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
    15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
    16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
    17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
    である、請求項１～３のいずれか一項に記載の固相担体。
  5. 前記ペプチドが、以下の１）～１４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、Xaa2はホモシステインである、請求項４に記載の固相担体：
    １）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）
    ２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）
    ３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）
    ４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）
    ５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）
    ６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）
    ７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）
    ８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）
    ９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）
    １０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）
    １１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）
    １２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）
    １３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）
    １４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号１４）。
  6. 前記ペプチドが、下記の式IV：
    D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
    によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の固相担体。
  7. 前記ペプチドが、以下の１）～４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基である、請求項６に記載の固相担体：
    １）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）
    ２）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１６）
    ３）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）
    ４）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１８）。
  8. ヒトIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
    前記ペプチドが、下記の式V：
    D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、又はアスパラギン残基であり、
    Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
    Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
    Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)
    によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ
    前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
    Figure 0007002733000017
    で表されるリンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されており、
    ここでRは、置換されていないC1～C6アルキルである、
    固相担体。
  9. Xaa1がアルギニン残基、リシン残基、又はロイシン残基である、請求項１～８のいずれか一項に記載の固相担体。
  10. 前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の固相担体：
    GPDCAYHRGELVWCTFH（配列番号３１）。
  11. 前記リンカーが、
    Figure 0007002733000018
    で表されるリンカーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の固相担体。
  12. 前記ペプチドのN末端がPEG化されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の固相担体。
  13. 前記ペプチドのC末端がアミド化されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の固相担体。
  14. 前記ペプチドが多量体化されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の固相担体。
  15. 前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、請求項１４に記載の固相担体。
  16. 前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の固相担体。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の固相担体を含む、IgG分離用カラム。
  18. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の固相担体又は請求項１７に記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
  19. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の固相担体又は請求項１７に記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
    結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程
    を含む、IgGの精製方法。
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