WO2020075670A1 - ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 - Google Patents

ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 Download PDF

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WO2020075670A1
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xaa1
peptide
amino acid
igg
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祐二 伊東
誠一 内村
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国立大学法人鹿児島大学
株式会社ダイセル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a solid phase carrier containing an IgG-binding peptide, an IgG separation column containing the solid phase carrier, a kit containing the solid phase carrier or column, and a method for purifying IgG using the solid phase carrier or column. .
  • IgG antibody is one of the most popular biopharmaceuticals at present. In recent years, antibody drugs centered on IgG antibodies have come to be used in the pharmaceutical field, and their importance in industrial and pharmaceutical applications is increasing. A protein A column plays a central role in antibody purification, and many antibody drug manufacturers have introduced a purification system centered on this column.
  • Protein A is a protein derived from bacteria, has high immunogenicity after human administration, and may be contaminated with endotoxin.
  • affinity ligand used for the purification of pharmaceuticals such as IgG
  • protein A as a ligand is required to have a high degree of purification so that inconvenient substances are not mixed in. It is a factor that raises costs. Therefore, the development of a new affinity column that replaces protein A is expected.
  • the present inventors have crosslinked a peptide ligand containing a specific sequence cyclized with a disulfide bond (Patent Document 1) or a sulfide group in a cysteine residue in a peptide with a linker having a specific structure.
  • IgG can be purified with an IgG-binding peptide (Patent Document 2).
  • the peptide ligand described in Patent Document 1 had a problem that its affinity was lowered by repeated washing with an alkaline solution.
  • the IgG-binding peptide described in Patent Document 2 has a higher alkali tolerance than the peptide ligand described in Patent Document 1, but has a problem of low IgG-binding affinity.
  • the present invention provides a solid-phase carrier having resistance to repeated washing of an alkaline solution after purification of IgG, and having a high IgG-binding affinity and immobilized IgG-binding peptide. To aim.
  • the present invention includes the following.
  • X is independently any amino acid residue except cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • the peptide has the following formula II: (X 1-3 ) -C- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWC- (X 1-3 ) (II) [In the formula, Each of X is independently any amino acid residue except cysteine, C is a cysteine residue, H is a histidine residue, Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof, G is a glycine residue, Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue, L is a leucine residue, V is a valine residue, W is a tryptophan residue, Xaa3 is an alanine, serine or threonine residue, and Xaa4 is a tyrosine or tryptophan residue]
  • the solid phase carrier according to (1) which comprises
  • the peptide has the following formula IV: DC- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWCT (IV) [In the formula, D is an aspartic acid residue, C is a cysteine residue, H is a histidine residue, Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof, G is a glycine residue, Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue, L is a leucine residue, V is a valine residue, W is a tryptophan residue, T is a threonine residue, Xaa3 is an alanine residue or a threonine residue, and Xaa4 is a tyrosine residue or tryptophan residue]
  • the solid phase carrier according to (1) or (2), which comprises an amino acid sequence consisting
  • Solid phase carrier 1) DCTYH (Xaa1) GNLVWCT (SEQ ID NO: 15) 2) DCAYH (Xaa1) GNLVWCT (SEQ ID NO: 16) 3) DCTYH (Xaa1) GELVWCT (SEQ ID NO: 17) 4) DCAWH (Xaa1) GELVWCT (SEQ ID NO: 18).
  • the solid phase carrier according to (1), wherein the peptide has the following amino acid sequence: GPDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 31).
  • An IgG separation column comprising the solid phase carrier according to any one of (1) to (15).
  • a kit for purifying IgG comprising the solid phase carrier according to any one of (1) to (15) or the column for IgG separation according to (16).
  • a method for purifying IgG comprising:
  • the peptide contained in the solid phase carrier according to the present invention has improved alkali resistance and IgG binding affinity by crosslinking the sulfide group in the cysteine residue with a linker having a specific structure. Therefore, the solid-phase carrier according to the present invention is less likely to have reduced IgG binding ability due to an alkaline washing step or the like, and has a high IgG binding affinity, so that it can be used for efficient IgG purification.
  • 5 shows the results of DBC measurement of the cross-linked cyclic IgG-binding peptide prepared in Example 1 (Example 3) and the disulfide-bond cross-linked IgG binding peptide in Comparative Example 3 during sodium hydroxide treatment.
  • 5 shows the fluctuation rate of DBC of the cross-linked cyclic IgG-binding peptide prepared in Example 1 (Example 3) and the disulfide-bond cross-linked IgG binding peptide of Comparative Example 3 during sodium hydroxide treatment.
  • the solid phase carrier according to the present invention is a solid phase carrier having a peptide characterized by being capable of binding to IgG (IgG-binding peptide) immobilized, wherein the two cysteine residues outside the peptide are:
  • the solid-phase carrier is linked as shown in FIG.
  • the solid-phase carrier has an IgG-binding peptide that has resistance to repeated washing with an alkaline solution after IgG purification, and has a high IgG-binding affinity, thereby efficiently IgG can be purified.
  • Solid phase carrier containing IgG-binding peptide in one aspect, relates to a solid phase carrier comprising an IgG binding peptide.
  • the "solid-phase carrier” in the present specification is not limited, but includes glass beads, an inorganic carrier such as silica gel, a cross-linked polyvinyl alcohol, a cross-linked polyacrylate, a cross-linked polyacrylamide, a cross-linked polystyrene, or another synthetic polymer or a crystalline substance.
  • examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, and crosslinked dextran, and composite carriers such as organic-organic and organic-inorganic obtained by a combination thereof.
  • hydrophilic carriers are not It is preferable because the specific adsorption is relatively small and the selectivity of the IgG-binding peptide is good.
  • hydrophilic carrier refers to a carrier having a contact angle with water of 60 degrees or less when the compound constituting the carrier is formed into a flat plate.
  • Such carriers include polysaccharides such as cellulose, chitosan and dextran, polyvinyl alcohol, saponified products of ethylene-vinyl acetate copolymer, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethylmethacrylate, polyacrylic acid grafted
  • Representative examples include carriers made of polyethylene, polyacrylamide-grafted polyethylene, glass and the like.
  • the form of the solid phase carrier can be any of beads, fibers, particles, membranes (including hollow fibers), gels, etc., and any form can be selected.
  • a bead form is particularly preferably used because it is easy to produce a carrier having a specific exclusion limit molecular weight. Beads having an average particle size of 10 to 2500 ⁇ m are easy to use, and in particular, a range of 25 ⁇ m to 800 ⁇ m is preferable from the viewpoint of ease of IgG-binding peptide immobilization reaction.
  • Specific examples of the solid phase carrier include magnetic beads, glass beads, polystyrene beads, silica gel beads, and polysaccharide beads.
  • a functional group that can be used for the immobilization reaction of IgG-binding peptides on the surface of the solid phase carrier.
  • these functional groups include hydroxyl group, amino group, aldehyde group, carboxyl group, thiol group, silanol group, epoxy group, succinimide group, N-hydroxysuccinimide group, etc., acid anhydride group, iodoacetyl group, etc. Can be mentioned.
  • a commercially available product may be used as the solid phase carrier.
  • Commercially available products are GCL2000, GC700, which are porous cellulose gel, Sephacryl S-1000, which is covalently crosslinked with allyl dextran and methylenebisacrylamide, Toyopearl, which is an acrylate carrier, Sepharose CL4B, which is an agarose carrier, and epoxy.
  • Examples thereof include Eupergit C250L, which is a group-activated polymethacrylamide, and an NHS-activated prepack column containing a Sepharose carrier activated by an NHS group.
  • the present embodiment is not limited to these carriers and activated carriers.
  • the above solid-phase carriers may be used alone or in any combination of two or more.
  • the solid phase carrier preferably has a large surface area in view of its intended use and method, and preferably has a large number of pores of an appropriate size, that is, is porous.
  • the above-mentioned solid phase carrier is preferably immobilized with the IgG-binding peptide described in the present specification, and immobilization of the peptide can be carried out by a method well known to those skilled in the art, for example, physical It can be performed by an adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or the like.
  • the immobilization is preferably carried out, for example, by covalently bonding the N-terminal amino group of the IgG-binding peptide to the solid phase carrier directly or via a spacer.
  • Immobilization via a hydrophilic spacer is more preferred in order to improve the separation efficiency by reducing the steric hindrance of the IgG-binding peptide and to suppress non-specific binding.
  • the hydrophilic spacer is not particularly limited, but for example, it is preferable to use a polyalkylene oxide derivative in which both ends are substituted with a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like.
  • the immobilization method and conditions for the IgG-binding peptide to be introduced into the solid phase carrier and the organic compound used as the spacer are not particularly limited, but are generally adopted when immobilizing a protein or peptide on the carrier.
  • a method is illustrated.
  • the carrier is activated by reacting with a compound containing an amino group, a compound containing an N-hydroxysuccinimidyl group, cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, etc.
  • a method of reacting with an IgG-binding peptide and immobilizing it (changing the functional group that the carrier originally has into a functional group in which the IgG-binding peptide reacts more easily), and carbodiimide in a system in which the carrier and the IgG-binding peptide are present.
  • Examples of such methods include a condensation reagent such as that described above, or an immobilization method by adding and condensing and cross-linking a reagent having multiple functional groups in the molecule such as glutaraldehyde. It is more preferable to apply an immobilization method in which the binding peptide is not easily released from the solid phase carrier.
  • the solid-phase carrier containing the IgG-binding peptide described in the present specification can be packed in a chromatography column or the like and used for purifying or separating IgG.
  • the IgG-binding peptide that can be contained in the solid phase carrier according to the present invention will be described in detail below.
  • ⁇ IgG '' is a mammal, for example, primates such as humans and chimpanzees, experimental animals such as rats, mice, and rabbits, livestock animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, And IgG of companion animals such as dogs and cats, preferably human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • IgG in the present specification is more preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, and particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • the IgG-binding peptide that can be included in the solid phase carrier according to the present invention has the following formula I: (X 1-3 ) -C- (X 2 ) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWC- (X 1-3 ) (I) [In the formula, Each of X is independently any amino acid residue except cysteine, C is a cysteine residue, H is a histidine residue, Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof, G is a glycine residue, Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue, L is a leucine residue, V is a valine residue and W is a tryptophan residue]
  • the amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues represented by and the two cysteine residues outside the peptide are represented by the following formula: [In
  • the notation X 1-3 at the N-terminus or C-terminus means that 1 to 3 consecutive arbitrary amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are independently formed.
  • the amino acid residues that make up are the same or different residues, but preferably all three consist of sequences that are not the same residue.
  • X 2 also means that any amino acid residue X independently of cysteine (C or Cys) is two consecutive, and the amino acid residues constituting it are the same or different residues. However, preferably, the two consecutive amino acid residues consist of sequences that are not the same.
  • the peptide represented by the formula I ′ is (X 1-3 ) -C- (X 1 ) -YH- (Xaa1) -GNLVWC- (X 1-3 ) (I ')
  • X is independently any amino acid residue except cysteine
  • C is a cysteine residue
  • Y is a tyrosine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • N is an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • the peptide represented by the formula I '' is (X 1-3 ) -CA- (X 1 ) -H- (Xaa1) -GELVWC- (X 1-3 ) (I '')
  • X is independently any amino acid residue except cysteine
  • C is a cysteine residue
  • A is an alanine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • E is a glutamic acid residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • the peptide represented by formula II is (X 1-3 ) -C- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWC- (X 1-3 ) (II)
  • X is independently any amino acid residue except cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue
  • a lysine residue a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • Xaa3 is an alanine, serine or threonine residue
  • Xaa4 is a tyrosine or tryptophan residue
  • amino acid residues X at the 1st and 2nd positions and the 16th and 17th positions from the N-terminus are deleted when the 17 amino acid residues are used. It may be missing and such a peptide consists of 13 amino acids in length.
  • the peptide represented by formula III is (X 1-3 ) -CAYH- (Xaa1) -GELVWC- (X 1-3 ) (III)
  • X is independently any amino acid residue except cysteine
  • C is a cysteine residue
  • A is an alanine residue
  • Y is a tyrosine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • E is a glutamic acid residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • the Such peptides may consist of 13 amino acids in length.
  • amino acid residues other than cysteine (C) in the amino acid sequences of the peptides of the above formulas that is, the amino acids 1 to 3, 5, 6, 15 to 17 from the N-terminal when the amino acid residues are 17 amino acid residues
  • the peptide represented by formula IV is DC- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWCT (IV)
  • D is an aspartic acid residue
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue
  • a lysine residue a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • T is a threonine residue
  • Xaa3 is an alanine residue or a threonine residue
  • Xaa4 is a tyrosine residue or tryptophan residue
  • the IgG-binding peptide described in the present specification has the following formula V as a primary structure in a broad sense: DC- (Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1) -G- (Xaa5) -L- (Xaa6) -WCT (V)
  • D is an aspartic acid residue
  • C is a cysteine residue
  • G is a glycine residue
  • L is a leucine residue
  • W is a tryptophan residue
  • T is a threonine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue or an asparagine residue or a derivative thereof
  • Xaa2 is an alanine residue, a serine residue or a threonine residue
  • Xaa3 is a tryptophan residue or a tyrosine residue
  • Xaa4 is a histidine residue
  • Xaa1 is an arginine residue, a lysine residue, a leucine residue, or an asparagine residue, or a derivative thereof, preferably an arginine residue, a lysine residue.
  • it is a derivative thereof, a leucine residue or an asparagine residue, more preferably an arginine residue, a lysine residue or a derivative thereof, or a leucine residue.
  • the type of the derivative is not particularly limited, but an acylated derivative such as an acetyl group or a propynyl group (the acylated derivative is represented by the general formula: R-CO-, wherein R is a hydrocarbon, preferably Is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms).
  • R-CO- a hydrocarbon, preferably Is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • the derivative include a derivative in which the ⁇ -amino group of a lysine residue is acylated, for example, acetylated.
  • the IgG-binding peptides described herein have at least two cysteine (C) residues spaced within each amino acid sequence, the cysteine residues having the formula: [In the formula, The upper cysteine residue is the N-terminal cysteine residue in the peptide, and the lower cysteine residue is the C-terminal cysteine residue in the peptide] It is characterized by being connected as shown in.
  • the method for preparing the peptide having the above linker is not particularly limited.
  • the sulfur atom (S) involved in the formation of the linker is derived from a cysteine residue or a homocysteine residue and undergoes a substitution reaction with the leaving group X of the other amino acid side chain to form the linker.
  • Leaving group X binds to the ⁇ -position of the other amino acid when it undergoes a substitution reaction with a cysteine residue, and leaving group X binds to the ⁇ -position of the other amino acid when it undergoes a substitution reaction with homocysteine.
  • a general leaving group can be used as the leaving group X, and examples thereof include a halogen atom and a sulfonylated hydroxyl group.
  • a halogen atom is preferable, and a chlorine atom can be more preferably used.
  • the substitution reaction can be carried out at room temperature (for example, about 15 ° C to 30 ° C) or at an elevated temperature (30 ° C to 70 ° C) in a suitable buffer, and the starting peptide is preferably 40 ° C to 60 ° C, more preferably It can be performed at 50 ° C.
  • the substitution reaction step may be carried out by adding an appropriate amount of a base (or alkali) that promotes the substitution reaction, for example, a weakly basic inorganic or organic (eg, guanidinium chloride, sodium bicarbonate, diethylamine, etc.).
  • a base or alkali
  • a weakly basic inorganic or organic eg, guanidinium chloride, sodium bicarbonate, diethylamine, etc.
  • the mixing ratio of the sulfur atom (S) and the leaving group (X) in the substitution reaction step is not particularly limited.
  • the molar ratio of the sulfur atom (S) to the leaving group (X) can be, for example, 1: 0.2 to 1: 5, preferably 1: 0.5 to 1: 2, and more preferably 1: 1.
  • the reaction time in the substitution reaction step is not limited as long as the substitution reaction occurs between the sulfur atom (S) and the leaving group (X), but is, for example, 1 hour to 96 hours, preferably 10 hours to 72 hours.
  • the time can be more preferably 24-48 hours.
  • the method may further include a step of separating impurities such as unreacted peptides and compounds from the mixture after the above steps and purifying the linked peptides by a substitution reaction, if necessary.
  • the step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the IgG-binding peptide described in the present specification may be modified by, for example, N-terminal PEGylation (polyethylene glycol addition), C-terminal amidation, etc. in order to improve its stability.
  • the number of PEG molecules for PEGylation is not particularly limited, and for example, 1 to 50 molecules, 1 to 20 molecules, 2 to 10 molecules, 2 to 6 molecules, or 4 molecules of PEG can be added.
  • the IgG-binding peptide described in the present specification may be multimerized.
  • “multimerization” of IgG-binding peptide means that two or more molecules of the IgG-binding peptide are linked via a covalent bond, and a multimer of IgG-binding peptide is For example, it may be a dimer to a hexamer, a dimer to a pentamer, a dimer to a tetramer, a dimer to a trimer, preferably a dimer.
  • the multimer of the peptide may have a spacer between the peptides.
  • the multimerization can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, by linking two or more molecules of the N-terminal amino group of the above IgG-binding peptide via a spacer.
  • the type of spacer is not particularly limited, for example, amino acids such as aspartic acid and glutamic acid having carboxyl groups at both ends, and functional groups such as carboxyl group, aldehyde group, epoxy group, N-hydroxysuccinimidyl group at both ends. Examples thereof include derivatives of polyalkylene oxide substituted with.
  • the IgG-binding peptides described herein have a binding affinity with human IgG, which is about 10 times or more, preferably about 50 times or more, as compared with other human immunoglobulins (IgA, IgE, IgM), and more. It may preferably be about 200 times higher or more.
  • the dissociation constant (Kd) for the binding of the IgG-binding peptides described herein to human IgG can be determined by surface plasmon resonance spectral analysis (e.g. using the BIACORE system), for example less than 1 x 10 -1 M, It is less than 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M, preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M, more preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M.
  • the IgG binding peptides described herein can bind to the Fc domain of IgG.
  • the IgG-binding peptides described in the present specification include conventional liquid phase synthesis methods, peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods
  • peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer etc.
  • the IgG-binding peptide may be produced by a gene recombination method or a phage display method using the nucleic acid encoding the IgG-binding peptide described in the present specification.
  • the desired IgG-binding peptide can be produced by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence of the IgG-binding peptide described in the present specification into an expression vector, introducing the DNA into a host cell and culturing.
  • the produced IgG-binding peptide by a conventional method, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, And can be collected or purified by immunoadsorption method or the like.
  • peptide synthesis for example, prepare amino acids in which functional groups other than the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group to be bound of each amino acid (whether natural or unnatural) are protected, A peptide bond forming reaction is carried out between the ⁇ -amino group and the ⁇ -carboxyl group of each amino acid.
  • the carboxyl group of the amino acid residue located at the C-terminal of the peptide is bound to the solid phase via an appropriate spacer or linker.
  • the amino-terminal protecting group of the dipeptide thus obtained is selectively removed to form a peptide bond with the ⁇ -carboxyl group of the next amino acid.
  • This operation is continuously performed to produce a peptide having a protected side group, and finally, all protecting groups are removed and the peptide is separated from the solid phase. Details of the types of protecting groups, protection methods, and peptide binding methods are described in detail in the above-mentioned documents.
  • Production by the gene recombination method includes, for example, inserting a DNA encoding the IgG-binding peptide described in an appropriate expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, culturing the cell, and It can be done by a method comprising recovering the IgG binding peptide of interest from within or from extracellular fluid.
  • Vectors include, but are not limited to, vectors such as plasmids, phages, cosmids, phagemids, and viruses.
  • Examples of the plasmid vector include, but are not limited to, E. coli-derived plasmids (e.g.
  • phage vector examples include, but are not limited to, T7 phage display vector (T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c, etc.
  • ⁇ phage vector (Charon4A, Charon21A).
  • viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, animal viruses such as Sendai virus, and insect viruses such as baculovirus.
  • Cosmid vectors include, but are not limited to, Lorist6, Charomid9-20, Charomid9-42, and the like.
  • the phagemid vector for example, pSKAN, pBluescript, pBK, pComb3H and the like are known, although not limited thereto.
  • the vector may include a regulatory sequence so that the target DNA can be expressed, a selectable marker for selecting a vector containing the target DNA, a multi-cloning site for inserting the target DNA, and the like.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, terminators, SD sequences or ribosome binding sites, origins of replication, polyA sites, and the like.
  • an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, or the like can be used as the selection marker.
  • Host cells for introducing the vector include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells and the like, and transformation or transfection into these cells.
  • bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • yeast cells insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells and the like
  • transformation or transfection into these cells Examples of the action include calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, PEG method and the like.
  • Cultivation of the transformed cells is carried out according to the usual methods used for culturing host organisms.
  • the culture fluid of microorganisms such as Escherichia coli and yeast cells contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be assimilated by the host microorganism.
  • the IgG-binding peptides described herein it is preferred to secrete the IgG-binding peptides produced by expression extracellularly. This can be done by ligating the DNA encoding the peptide sequence enabling secretion of the IgG-binding peptide from the cells to the 5'-terminal side of the DNA encoding the IgG-binding peptide of interest.
  • the fusion peptide transferred to the cell membrane is cleaved by a signal peptidase, and the target IgG-binding peptide is secreted and released into the medium.
  • the target IgG-binding peptide accumulated in the cells can be recovered. In this case, the cells are physically or chemically disrupted and protein purification techniques are used to recover the IgG binding peptides of interest.
  • the present invention relates to an IgG (preferably human IgG) separation column comprising a solid phase carrier containing the above-mentioned IgG-binding peptide.
  • the above-mentioned IgG separation column includes columns such as a chromatography column and a high performance liquid chromatography (HPLC) column for purifying or separating IgG.
  • the size of the column is not particularly limited, and may be changed depending on the use for analysis, purification, fractionation, etc., the amount of applied (loaded) or injected, the length or inner diameter of the column, and the like.
  • the material of the column may be one that is usually used as a column of metal, plastic, glass or the like.
  • the above column can be manufactured by closely packing the above-mentioned solid phase carrier according to the present invention (which may be in a dry or wet state) into the column.
  • the present invention also relates to a kit for purifying IgG (preferably human IgG), which comprises a solid phase carrier containing the above IgG-binding peptide or the above column for separating IgG.
  • IgG preferably human IgG
  • the kit according to the present invention may include at least one of an instruction manual describing an IgG analysis procedure and a purification procedure, reagents and buffers necessary for purification, and a column for packing a solid phase carrier.
  • the present invention comprises a step of binding IgG to the solid phase carrier, or the column for separating IgG, and a step of eluting the bound IgG to recover IgG, preferably IgG (preferably human IgG). Purification method
  • the binding step can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the above solid phase carrier or IgG separation column is equilibrated with an appropriate buffer, and a liquid containing IgG is applied at a low temperature of 0 ° C to room temperature, preferably 0 ° C to about 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • IgG is bound to the IgG-binding peptide on the solid phase carrier.
  • the binding step can be performed by applying to a column using a buffer having a neutral pH range, for example, pH 6.0 to 7.5.
  • the elution step can also be performed by a method known to those skilled in the art.
  • a buffer with a pH in the acidic range for example, pH 2 to 4 (for example, 0.2 M glycine-HCl buffer or 20 mM citrate buffer containing 0.3 M NaCl at pH 3.5 to pH 2.5) is run through the column.
  • it may be eluted by competitive elution using the above IgG-binding peptide.
  • the solid phase carrier or column is washed with an alkaline solution such as sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution, and potassium hydroxide solution (for example, 0.1M sodium hydroxide solution).
  • the method according to the present invention may optionally include the step of regenerating the solid phase carrier or column by washing with an alkaline solution.
  • IgG Whether or not IgG has been recovered can be determined by, for example, confirmation of the molecular weight by electrophoresis and optionally subsequent Western blotting using an anti-IgG antibody.
  • electrophoresis may be performed by SDS-PAGE using a 5-20% acrylamide gradient gel
  • Western blot may be performed by transferring the electrophoresed protein onto a PVDF membrane and blocking with skim milk followed by anti-IgG ⁇ -chain goat.
  • Detection can be performed with an antibody and an HRP-labeled anti-goat IgG mouse antibody.
  • the method according to the present invention is useful for obtaining an IgG-rich fraction in the step of purifying IgG from an IgG-containing product produced by various methods. Therefore, it is preferable to use the method according to the present invention in column chromatography such as affinity chromatography and HPLC.
  • column chromatography such as affinity chromatography and HPLC.
  • a conventional purification technique for proteins for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, chromatography such as reverse phase column chromatography, ammonium sulfate fractionation, Ultrafiltration and the like can be appropriately combined.
  • Example 1 Preparation of cross-linked cyclic peptide and measurement of binding affinity
  • the raw material peptide [sequence: H 2 N-PEG4-GPD (Hse) AYHRGELVWCTFH, Hse: homoserine (SEQ ID NO: 32)] was used for the solid phase peptide synthesis method using an automatic peptide synthesizer Prelude (Protein Technologies, Inc.). Fmoc method).
  • Rink Amide-Chem Matrix resin ⁇ -amino group is an Fmoc group
  • the side chain functional group is condensed with an amino acid protected by a general protecting group under MSNT / NMI / DCM conditions, and the C-terminal amino acid of the resin is condensed.
  • Loading was completed.
  • an Fmoc group deprotection solution (20% piperidine / DMF) to remove the Fmoc group
  • an amino acid in which the ⁇ -amino group is the Fmoc group and the side chain functional group is protected with a general protecting group is used.
  • the dipeptide was synthesized by condensation under HCTU / NMM / DMF conditions.
  • the Fmoc group deprotection solution By deprotecting the Fmoc group with a Fmoc group deprotection solution and condensing amino acids under HCTU / NMM / DMF conditions, the peptide of the target sequence was synthesized.
  • the N-terminal Fmoc group was deprotected, and the N-terminal amino group was converted to Boc with di-tert-butyl dicarbonate and DIPEA. Then, in order to chlorinate the hydroxyl group of Hse, only the Trt group, which is a protective group of Hse, was deprotected with 2% TFA / 5% TIPS / 93% DCM. The free hydroxyl group of deprotected Hse was chlorinated with triphosgene and triphenylphosphine.
  • the resin was removed by filtration, and the obtained filtrate was added to cold ether to recover the peptide as a precipitate.
  • the obtained peptide was purified by a Proteonavi column (SHISEIDO) using 0.1% TFA aqueous solution and acetonitrile as a solvent system.
  • the purity of the final purified peptide was confirmed using a CAPCELL PAK UG120 column (SHISEIDO) and an HPLC system (HITACHI). The molecular weight was confirmed by ESI-MS system (SynaptHDMS, WATERS) and freeze-dried.
  • the starting peptide obtained by chlorinating the Hse side chain hydroxyl group obtained as described above was dissolved in 6M Gn-HCl, 0.2M Tris-HCl, 1mM TCEP aqueous solution and cyclized by reacting at 50 ° C. 39 hours after the start of the reaction, the cyclized product was confirmed by HPLC analysis.
  • the target cyclized peptide was purified on a Proteonavi column (SHISEIDO) using 0.1% TFA aqueous solution and acetonitrile as a solvent system.
  • the purity of the final purified peptide was confirmed using a CAPCELL PAK UG120 column (SHISEIDO) and an HPLC system (HITACHI). The molecular weight was confirmed by ESI-MS system (SynaptHDMS, WATERS) and freeze-dried.
  • DCM dichloromethane
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • Fmoc 9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl
  • Boc tert-buthoxycarbonyl
  • DIPEA N, N'-diisopropylethylamine
  • HCTU 1- [bis (dimethylamino) methylene] -5-chloro -1H-benzo-triazolium 3-oxide hexafluorophosphate
  • MSNT 1- (mesitylene-2-sulfonyl) -3-nitro-1,2,4-triazole
  • NMI N-methylimidazole
  • NMM N-methylmorpholine.
  • the amino acid sequence represented by GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, Xaa1 is arginine, C-terminal is amidated; corresponding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31) and the outside of the peptide is contained.
  • the two cysteine residues in the formula are: [In the formula, The upper cysteine residue is the N-terminal cysteine residue in the peptide, and the lower cysteine residue is the C-terminal cysteine residue in the peptide] A N-terminal PEG4-modified and C-terminal amidated peptide (cross-linked cyclic peptide), which was ligated as shown in, was obtained.
  • Affinity analysis was performed by the following method. First, 0.4M MEDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) mixed in equal amounts was placed on the CM5 sensor chip set on BIAcore T200 (GE healthcare). ) Carbodiimide) and 0.1M sulfo-NHS (sulfo-N-hydroxysuccinimide) solution were injected into the sensor chip at a flow rate of 10 ⁇ l / ml to activate the sensor chip. Then, human IgG was immobilized on the sensor chip under the condition of pH 5.5 (10 mM Na acetate).
  • HBS-EP buffer solution (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA, pH 7.4) was used at a flow rate of 50 ⁇ l / ml at 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250.
  • the binding reaction was monitored by injecting 500, 1000 nM of the above purified crosslinked cyclic peptide for 180 seconds. At the time of dissociation reaction measurement, only the buffer solution was injected for 600 seconds. Analysis of interaction parameters was performed using BIAevalution T100 software.
  • Comparative Example 1 As Comparative Example 1, the crosslinked cyclic peptide described in Patent Document 2 was synthesized, and the affinity was measured by the same method as in Example 1. The peptide synthesis and cross-linking reaction were performed under the following conditions.
  • NH2-PEG4 synthetic peptide GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, Xaa1 is arginine, C-terminal is amidated) was synthesized by Fmoc solid phase synthesis on peptide synthetic beads (Rink-amide-Chemmatrix resin, Biotage). It was synthesized according to a conventional method.
  • Table 1 shows the affinity measurement results of Example 1 and Comparative Example 1.
  • Example 2 Dynamic binding capacity (DBC) measurement
  • DBC measurement was performed using a liquid chromatography device AKTA explore (GE Healthcare). After equilibrating the prepared column with an adsorption solution, 1 mg / mL human serum-derived ⁇ -globulin (Sigma-Aldrich) dissolved in the adsorption solution was sent at a flow rate of 1 mL / min. The DBC was calculated from the amount of the sample that had been sent until the value at 280 nm absorbance excluding non-adsorbed components reached 10% of the absorbance of the entire sample.
  • Comparative Example 2 As Comparative Example 2, a column in which the peptide synthesized and crosslinked in Comparative Example 1 was immobilized in the same manner as in Example 2 was prepared and DBC measurement was performed.
  • Example 2 9.4 mg / mL-column and Comparative Example 2: 2.3 mg / mL-column
  • the cyclic peptide having a cross-linked structure shown in Example 1 is a cross-linked cyclic peptide described in Patent Document 2. It was revealed that the IgG adsorption performance was higher than that of the peptide.
  • Example 3 Evaluation of alkali resistance
  • 10 mL of a 0.1 M sodium hydroxide solution was transferred to a 1 mL peptide-immobilized 1 mL column produced by the same method as in Example 2, and then washed with 10 mL of an adsorption solution.
  • DBC measurement was performed at a flow rate of 1 mL / min in the same manner as in Example 2. The DBC fluctuation rate was calculated assuming that the DBC before the sodium hydroxide treatment was 100%.
  • Comparative Example 3 As Comparative Example 3, in the same manner as in Example 2, an NH2-PEG4-modified synthetic peptide (GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, Xaa1 is arginine, C-terminal is amidated), which is crosslinked by a disulfide bond, is shown. A column containing 1 mg of a peptide containing an amino acid sequence and having two outer cysteine residues cross-linked by a disulfide bond was immobilized, and alkali resistance evaluation was carried out in the same manner as in Example 3.
  • GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, Xaa1 is arginine, C-terminal is amidated
  • Example 3 and Comparative Example 3 are shown in FIG. 1, and the DBC fluctuation rates in Example 3 and Comparative Example 3 are shown in FIG.
  • the measured values are summarized in Table 2.

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Abstract

本発明は、IgG精製のために用いることができる、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドを固定化した固相担体を提供することを目的とし、具体的には、IgG結合性ペプチドを固定化した固相担体であって、前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：[式中、　上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ　下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である] に示すように連結されている、前記固相担体に関する。

Description

ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法
　本発明は、IgG結合性ペプチドを含む固相担体、該固相担体を含むIgG分離用カラム、該固相担体又はカラムを含むキット、及び該固相担体又はカラムを用いるIgGの精製方法等に関する。
　IgG抗体は、現在最も注目されているバイオ医薬品の1つである。近年、IgG抗体を中心とした抗体医薬が、医薬分野に利用されるようになり、工業的、製薬的な利用における重要性がますます高まっている。抗体の精製にはプロテインAカラムが中心的な役割を果たしており、多くの抗体医薬の製造メーカーは、このカラムを中心とした精製システムを導入している。
　しかしながら、このプロテインAカラムは、幾つかの問題点が指摘されている。1つには、精製抗体中へのプロテインAの混入の問題である。プロテインAはバクテリア由来のタンパク質であり、人体投与後の免疫原性が高く、またエンドトキシンの混入が危惧される。IgGのような医薬品の精製に用いるアフィニティーリガンドとしては、不都合な物質の混入が起こらないよう、リガンドとしてのプロテインAには高い精製度が求められており、これが医薬品精製に利用するプロテインAカラムのコストを上げる要因になっている。このため、プロテインAに代わる新たなアフィニティーカラムの開発が期待されている。
　本発明者等は、これまでにジスルフィド結合で環化された特定の配列を含むペプチドリガンド(特許文献１)、又はペプチド中のシステイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋したIgG結合ペプチド(特許文献２)によりIgGを精製することができることを報告する。
　しかしながら、特許文献１に記載のペプチドリガンドは、アルカリ溶液洗浄の繰り返しにより、親和性が低下するという問題を抱えていた。また、特許文献２に記載のIgG結合ペプチドは、特許文献１に記載のペプチドリガンドに比べ高いアルカリ耐性を有するものの、IgG結合親和性が低いという問題を抱えていた。
国際公開第2013/027796号 国際公開第2018/092867号
　本発明は、上述の実情に鑑み、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドを固定化した固相担体を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、IgG結合性ペプチド中のシステイン残基におけるスルフィド基を、特許文献２に記載のリンカーとは異なる特定の構造を有するリンカーによって架橋することにより、当該ペプチドのアルカリ耐性及びIgG結合親和性が顕著に改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、　前記ペプチドが、下記の式I：
　(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
　前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 [式中、
　上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（２）前記ペプチドが、下記の式II：
　(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）記載の固相担体。
（３）前記ペプチドが、下記の式III：
　(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Aはアラニン残基であり、
　Yはチロシン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Eはグルタミン酸残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（４）17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
　1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
　2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
　3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
　15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
　16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
　17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
である、（１）～（３）のいずれか１記載の固相担体。
（５）前記ペプチドが、以下の1)～14)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、且つXaa2はホモシステインである、（４）記載の固相担体：
　1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)
　2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)
　3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)
　4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)
　5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)
　6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)
　7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)
　8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)
　9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)
　10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)
　11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)
　12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)
　13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)
　14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)。
（６）前記ペプチドが、下記の式IV：
　D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
　Dはアスパラギン酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Tはトレオニン残基であり、
　Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（７）前記ペプチドが、以下の1)～4)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である、（６）記載の固相担体：
　1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)
　2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)
　3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)
　4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)。
（８）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、　前記ペプチドが、下記の式V：
　D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
　Dはアスパラギン酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Tはトレオニン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
　Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
　Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
　Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
　Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
　前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 [式中、
　上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（９）Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体又はロイシン残基である、（１）～（８）のいずれか１記載の固相担体。
（１０）前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列から成る、（１）記載の固相担体：
　GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)。
（１１）前記ペプチドのN末端がPEG化されている、（１）～（１０）のいずれか１記載の固相担体。
（１２）前記ペプチドのC末端がアミド化されている、（１）～（１１）のいずれか１記載の固相担体。
（１３）前記ペプチドが多量体化されている、（１）～（１２）のいずれか１記載の固相担体。
（１４）前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、（１３）記載の固相担体。
（１５）前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、（１）～（１４）のいずれか１記載の固相担体。
（１６）（１）～（１５）のいずれか１記載の固相担体を含むIgG分離用カラム。
（１７）（１）～（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
（１８）（１）～（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
　結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程、
を含む、IgGの精製方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-192083号の開示内容を包含する。
　本発明に係る固相担体に含まれるペプチドは、システイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋することによって、アルカリ耐性及びIgG結合親和性が改善されている。従って、本発明に係る固相担体は、アルカリ洗浄工程等によってIgG結合能が低減されにくく、また、高いIgG結合親和性を有することで、効率的なIgG精製に用いることができる。
実施例１で調製した架橋環状IgG結合性ペプチド(実施例３)及び比較例３におけるジスルフィド結合で架橋されたIgG結合性ペプチドの、水酸化ナトリウム処理時のDBCの測定結果を示す。 実施例１で調製した架橋環状IgG結合性ペプチド(実施例３)及び比較例３におけるジスルフィド結合で架橋されたIgG結合性ペプチドの、水酸化ナトリウム処理時のDBCの変動率を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る固相担体は、IgGと結合可能であることを特徴とするペプチド(IgG結合性ペプチド)を固定化した固相担体であって、該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 [式中、
　上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、固相担体である。本発明に係る固相担体によれば、当該固相担体上の、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドにより、効率的にIgGを精製することができる。
＜IgG結合性ペプチドを含む固相担体＞
　一態様において、本発明は、IgG結合性ペプチドを含む固相担体に関する。本明細書における「固相担体」としては、限定するものではないが、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類から成る有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機等の複合担体等が挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、IgG結合性ペプチドの選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン－酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等から成る担体が代表例として挙げられる。
　固相担体の形態としては、ビーズ状、線維状、粒子条、膜状(中空糸も含む)、ゲル状等いずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10～2500μmのものが使いやすく、とりわけ、IgG結合性ペプチド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。固相担体としては、具体的には例えば、磁性ビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、及び多糖類ビーズ等が挙げられる。
　さらに固相担体表面には、IgG結合性ペプチドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとIgG結合性ペプチドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、スクシンイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミド基等、酸無水物基、ヨードアセチル基等が挙げられる。
　固相担体としては、市販品を用いることもできる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L、NHS基で活性化されたセファロース担体を含むNHS活性化プレパックカラム等を例示することができる。ただし、本実施態様においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。
　上述の固相担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。また、固相担体としては、その使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
　上記固相担体には、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドが固定化されていることが好ましく、ペプチドの固定化は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。固定化は、例えばIgG結合性ペプチドのN末端のアミノ基を、直接又はスペーサーを介して固相担体に共有結合させることによって行うことが好ましい。IgG結合性ペプチドの立体障害を小さくすることにより分離効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することがより好ましい。親水性スペーサーは特に限定しないが、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
　上記固相担体へ導入されるIgG結合性ペプチド及びスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法及び条件は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。例えば、担体をアミノ基を含む化合物、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を含む化合物、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン等と反応させて活性化し(担体が元々持っている官能基よりIgG結合性ペプチドが反応しやすい官能基に変え)、IgG結合性ペプチドと反応、固定化する方法、また、担体とIgG結合性ペプチドが存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、又は、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、固相担体の滅菌時又は利用時にIgG結合性ペプチドが固相担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
　本明細書に記載のIgG結合性ペプチドを含む固相担体は、クロマトグラフィーカラム等に充填して、IgGを精製又は分離するために用いることができる。
　本発明に係る固相担体に含まれ得るIgG結合性ペプチドについて、以下詳細に説明する。
　本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG(IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
　一態様において、本発明に係る固相担体に含まれ得るIgG結合性ペプチドは、下記の式I：
　(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
　該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 [式中、
　上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
　上記式で、N末端又はC末端のX1-3という表記は、システイン(C又はCys)以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが1～3個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは3個全てが同じ残基でない配列から成る。同様に、X2もシステイン(C又はCys)以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが2個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該2個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列から成る。
　式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式I'及び式I''で表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式I'で表されるペプチドは、
　(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Yはチロシン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Nはアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
　式I''で表されるペプチドは、
　(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Aはアラニン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Eはグルタミン酸残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIで表されるペプチドは、
　(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
　上記の式I'、式I''及び式IIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長から成る。
　本明細書で使用する「17アミノ酸残基とした場合の」とは、ペプチドのアミノ酸残基をアミノ酸番号で呼ぶときに、式Iのペプチドについて最長のアミノ酸長である17残基のN末端から順番に1番目から17番目まで番号付けするために便宜的に表現した用語である。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIIで表されるペプチドは、
　(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Aはアラニン残基であり、
　Yはチロシン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Eはグルタミン酸残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、且つ
　Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
　上記の式IIIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目、並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなってよい。
　さらに、上記の各式のペプチドのアミノ酸配列のシステイン(C)以外のアミノ酸残基、すなわち、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～3、5、6、15～17番目の各アミノ酸残基は、以下のものから選択されることが好ましい。ここで、各大文字のアルファベットは、アミノ酸の一文字表記である:
　1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
　2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
　3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
　15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
　16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
　17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
　5番目のアミノ酸残基= A又はT、
　6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IVで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IVで表されるペプチドは、
　D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
　Dはアスパラギン酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Hはヒスチジン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Vはバリン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Tはトレオニン残基であり、
　Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
　式Iのペプチドの具体例のいくつかを以下の1)～18)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
　1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)、
　2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)、
　3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)、
　4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)、
　5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)、
　6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)、
　7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)、
　8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)、
　9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)、
　10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)、
　11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)、
　12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)、
　13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)、
　14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)、
　15) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)、
　16) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)、
　17) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)、及び
　18) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)
[式中、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している]。
　式Iのペプチドの好ましい具体例として、
　1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１、但し、Xaa1はアルギニン(R))、
　2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、但し、Xaa1はR、L、リシン(K)又はアセチル化リシン)、及び
　4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４、但し、Xaa1はR)、
が挙げられ、特に好ましい例として、GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)が挙げられる。
　また、一態様において、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、広義の一次構造として、下記の式V：
　D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
　Dはアスパラギン酸残基であり、
　Cはシステイン残基であり、
　Gはグリシン残基であり、
　Lはロイシン残基であり、
　Wはトリプトファン残基であり、
　Tはトレオニン残基であり、
　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
　Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
　Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
　Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
　Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
　Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
　該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 [式中、
　上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
　式Vのペプチドの具体例の幾つかを以下の19)～30)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
　19) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１９)、
　20) DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２０)、
　21) DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２１)、
　22) DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２２)、
　23) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２３)、
　24) DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２４)、
　25) DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２５)、
　26) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２６)、
　27) DCTYT(Xaa1)GELVWCT(配列番号２７)、
　28) DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(配列番号２８)、
　29) DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(配列番号２９)、及び
　30) DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(配列番号３０)
[式中、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である]。
　上記の通り、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドにおいて、Xaa1は、アルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体、好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基、さらに好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、又はロイシン残基である。本明細書において、誘導体の種類は特に限定しないが、アセチル基又はプロピニル基等のアシル化誘導体(アシル化誘導体は、一般式：R-CO-で表され、式中、Rは炭化水素、好ましくは炭素数1～6のアルキル基である)が挙げられる。誘導体の例として、例えばリシン残基のεアミノ基がアシル化、例えばアセチル化された誘導体が挙げられる。
　前述の通り、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも2つのシステイン(C)残基を有し、該システイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 [式中、
　上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されていることを特徴としている。
　上記リンカーを有するペプチドを調製する方法は特に限定されない。
　リンカーの形成に関与する硫黄原子（Ｓ）はシステイン残基、あるいはホモシステイン残基に由来し、他方のアミノ酸側鎖の脱離基Xと置換反応することによってリンカーが形成される。
　システイン残基と置換反応する場合、脱離基Ｘは他方のアミノ酸のβ位に結合し、ホモシステインと置換反応する場合、脱離基Xは他方のアミノ酸のγ位に結合する。
　脱離基Ｘは一般的な脱離基が利用可能であり、例えば、ハロゲン原子、スルフォニル化された水酸基などが挙げられる。本方法のリンカー形成における置換反応では、ハロゲン原子が好ましく、更に好ましくは塩素原子を用いることができる。
　該置換反応は原料ペプチドを適当なバッファー中において、室温(例えば約15℃～30℃)または高温下(30℃～70℃)で行うことができ、好ましくは40℃～60℃、更に好ましくは50℃で行うことができる。
　該置換反応工程は、置換反応を促進する塩基(又はアルカリ)、例えば弱塩基性の無機又は有機(例えば、塩化グアニジウム、重炭酸ナトリウム、及びジエチルアミン等)を適量加えて行ってもよい。
　該置換反応工程における硫黄原子(S)と脱離基(X)の混合比率は、特に限定しない。硫黄原子(S)と脱離基(X)のモル比率は、例えば1：0.2～1：5、好ましくは1：0.5～1：2、更に好ましくは1：1とすることができる。
　該置換反応工程における反応時間は、硫黄原子（S）と脱離基(X)の間で置換反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1時間～96時間、好ましくは10時間～72時間、更に好ましくは24～48時間とすることができる。
　本方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のペプチド及び化合物等を分離し、置換反応によって連結されたペプチドを精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
　また、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、N末端のPEG化(ポリエチレングリコール付加)、及びC末端のアミド化等により修飾されていても良い。PEG化を行う場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
　また、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、多量体化されていてもよい。本明細書において、IgG結合性ペプチドの「多量体化」とは、共有結合を介して2分子以上の上記IgG結合性ペプチドが連結されていることを指し、IgG結合性ペプチドの多量体は、例えば2～6量体、2～5量体、2～4量体、2～3量体、好ましくは2量体であってよい。
　前記ペプチドの多量体は、該ペプチド間にスペーサーを有していてもよい。多量体化は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば上記IgG結合性ペプチドのN末端のアミノ基を、スペーサーを介して2分子以上連結することによって行うことができる。スペーサーの種類は特に限定しないが、例えば両末端にカルボキシル基を有するアスパラギン酸及びグルタミン酸等のアミノ酸、並びに両末端をカルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、N-ヒドロキシスクシンイミジル基等の官能基で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体が挙げられる。
　本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、ヒトIgGとの結合親和性が、他のヒト免疫グロブリン(IgA、IgE、IgM)と比較して約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高いものであり得る。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析(例えばBIACOREシステム使用)により決定可能であり、例えば1×10-1M未満、1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、IgGのFcドメインに結合し得る。
　本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132;「新生化学実験講座１ タンパク質IV」(1992) 日本生化学会編，東京化学同人)によって製造することができる。あるいは、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、IgG結合性ペプチドを製造してもよい。例えば本明細書に記載のIgG結合性ペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のIgG結合性ペプチドを製造することができる。製造されたIgG結合性ペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
　ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸(天然であるか非天然であるかを問わない)の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
　遺伝子組換え法による製造は、例えば、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のIgG結合性ペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、及び酵母由来のプラスミド(例えばYEp13、YCp50等)等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及びλファージベクター(Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したIgG結合性ペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのIgG結合性ペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的のIgG結合性ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のIgG結合性ペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的のIgG結合性ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的のIgG結合性ペプチドを回収する。
＜IgG分離用カラム又はIgGの精製のためのキット＞
　一態様において、本発明は、上記のIgG結合性ペプチドを含む固相担体を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)分離用カラムに関する。
　上記IgG分離用カラムは、IgGの精製又は分離のための、クロマトグラフィーカラム、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム等のカラムを包含する。カラムのサイズは特に制限されないものとし、分析用、精製用、分取用等の用途、アプライ(搭載)又は注入する量、カラムの長さ又は内径等に応じて変化させうる。また、カラムの材質は、金属、プラスチック、ガラス等のカラムとして通常使用されるようなものでよい。
　上記のカラムは、上記の本発明に係る固相担体(乾燥又は湿潤状態のいずれであってもよい)をカラムに密に充填することによって製造できる。
　また、一態様において、本発明は、上記のIgG結合性ペプチドを含む固相担体又は上記のIgG分離用カラムを含む、IgG(好ましくはヒトIgG)の精製のためのキットに関する。
　本発明に係るキットは、IgGの分析手順や精製手順を記載した使用説明書、精製に必要な試薬やバッファー、固相担体の充填用カラムの少なくとも1つを含んでよい。
＜IgGの精製方法＞
　一態様において、本発明は、上記固相担体、又は上記IgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)の精製方法に関する。
　結合工程は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、上記固相担体又はIgG分離用カラムを適当なバッファーで平衡化し、0℃～室温、好ましくは0℃～約10℃、更に好ましくは約4℃の低温でIgGを含有する液をアプライし、固相担体上のIgG結合性ペプチドにIgGを結合させる。例えば血清中のIgGを分離する場合には、中性域のpH、例えばpH6.0～7.5のバッファーを使用してカラムにアプライし、結合工程を行うことができる。
　溶出工程も、当業者に公知の方法より行うことができる。例えば、酸性域のpH、例えばpH2～4のバッファー(例えば0.3MのNaClを含有するpH3.5～pH2.5の0.2Mグリシン-HClバッファー又は20 mM クエン酸バッファー)をカラムに流して行ってもよいし、上記のIgG結合性ペプチドを用いて競合溶出により溶出させてもよい。特に、コストの点から酸により溶出を行うことが好ましい。この場合、固相担体又はカラムを、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、及び水酸化カリウム溶液等のアルカリ性の溶液(例えば、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液)で洗浄することにより固相担体又はカラムを再生し、再度結合工程に用いることができる。溶液のアルカリ性の程度は当業者であれば容易に決定することができる。従って、本発明に係る方法は、任意に、アルカリ性の溶液により洗浄することにより固相担体又はカラムを再生する工程を含み得る。
　IgGが回収されたか否かは、例えば、電気泳動による分子量の確認、及び任意にその後の抗IgG抗体を使用するウエスタンブロット法によって判定できる。例えば、電気泳動は、5～20％アクリルアミドグラジエントゲルを用いたSDS-PAGEにより行ってよく、また、ウエスタンブロットは、泳動後のタンパク質をPVDF膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後、抗IgGα鎖ヤギ抗体とHRP標識抗ヤギIgGマウス抗体で検出を行うことができる。
　本発明に係る方法は、種々の方法で生産されたIgG含有生産物からIgGを精製する工程において、IgGに富む画分を得る場合に有用である。それゆえに、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等のカラムクロマトグラフィーにおいて本発明に係る方法を使用することが好ましい。IgGの精製に際しては、このようなクロマトグラフィー法に加えて、タンパク質の慣用的な精製技術、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過等を適宜組み合わせることができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：架橋環状ペプチドの調製及び結合親和性の測定〕
　原料ペプチド[配列:H2N-PEG4-GPD(Hse)AYHRGELVWCTFH, Hse: ホモセリン(配列番号３２)]を、自動ペプチド合成機Prelude(Protein Technologies, Inc.)を用いて、固相ペプチド合成法(Fmoc法)にて合成した。すなわち、Rink Amide-ChemMatrix樹脂にα-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をMSNT/NMI/DCM条件により縮合し、樹脂へのC末端アミノ酸の担持を完了した。これにFmoc基脱保護溶液(20％ピペリジン/DMF)を注入してFmoc基を除去した後に、α-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をHCTU/NMM/DMF条件によって縮合し、ジペプチドを合成した。Fmoc基脱保護溶液によるFmoc基の脱保護とHCTU/NMM/DMF条件によるアミノ酸の縮合操作を繰り返すことにより、目的とする配列のペプチドを合成した。
　保護ペプチド樹脂の合成完了後、N-末端Fmoc基の脱保護、二炭酸ジ-tert-ブチル、DIPEAによるN－末端アミノ基のBoc化を行った。続いて、Hseの水酸基を塩素化する為に、Hseの保護基であるTrt基のみを2％TFA/5％TIPS/93％DCMで脱保護した。脱保護されたHseの遊離水酸基をトリフォスゲン、トリフェニルホスフィンによって塩素化した。樹脂上でのHse水酸基の塩素化終了後、脱保護溶液(2.5％トリイソプロピルシラン、2.5％水、2.5％1,2-エタンジチオール、92.5％トリフルオロ酢酸)を保護ペプチド樹脂に加えて、4時間反応することによってペプチド側鎖保護基の除去と共に、樹脂から遊離ペプチドを切り出した。
　樹脂をろ去し、得られたろ液を冷エーテルに添加することにより、ペプチドを沈澱として回収した。得られたペプチドはProteonaviカラム(SHISEIDO)にて溶媒系に0.1％TFA水溶液及びアセトニトリルを用いて精製した。
　最終精製ペプチドを、CAPCELL PAK UG120カラム(SHISEIDO)及びHPLCシステム(HITACHI)により純度を確認した。また、ESI-MSシステム(Synapt HDMS、WATERS)により分子量を確認し、凍結乾燥した。
　上記のように得られたHse側鎖水酸基が塩素化された原料ペプチドを6 M Gn・HCl, 0.2 M Tris・HCl, 1 mM TCEP水溶液に溶解し、50℃で反応させることによって環化した。反応開始から39時間後、HPLC分析によって環化生成物を確認した。目的とする環化ペプチドをProteonaviカラム(SHISEIDO)にて溶媒系に0.1％TFA水溶液及びアセトニトリルを用いて精製した。
　最終精製ペプチドを、CAPCELL PAK UG120カラム(SHISEIDO)及びHPLCシステム(HITACHI)により純度を確認した。また、ESI-MSシステム(Synapt HDMS、WATERS)により分子量を確認し、凍結乾燥した。
　なお、上記における略号は、以下の通りである：
　DCM, dichloromethane; DMF, N,N-dimethylformamide; Fmoc, 9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl; Boc, tert-buthoxycarbonyl; DIPEA, N,N'-diisopropylethylamine; HCTU, 1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzo-triazolium 3-oxide hexafluorophosphate; MSNT, 1-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole; NMI, N-methylimidazole; NMM, N-methylmorpholine。
　以上の手順により、GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化；配列番号３１に示されるアミノ酸配列に相当する)で示されるアミノ酸配列を含み、且つペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 [式中、
　上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
　下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチド(架橋環状ペプチド)を得た。
　親和性解析は、以下の方法で行った。先ず、BIAcoreT200(GE healthcare)にセットしたCM5センサーチップ上へ、等量混合した0.4 M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)と0.1 M sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)溶液を10 μl/mlの流速でセンサーチップにインジェクトすることにより、センサーチップを活性化した。その後、pH 5.5(10 mM 酢酸Na)の条件下で、ヒトIgGをセンサーチップ上に固定化した。測定には、HBS-EP緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005％ Tween 20、3 mM EDTA、pH 7.4)を用い、流速50 μl/mlにて、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 nMの上述の精製した架橋環状ペプチドを180秒間インジェクトすることで結合反応をモニターした。解離反応測定の際は、緩衝液のみを600秒間インジェクトした。相互作用パラメータの解析は、BIAevalution T100ソフトウェアを用いて行った。
〔比較例１〕
　比較例１として、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドを合成し、実施例１と同様の方法で親和性の測定を行った。ペプチドの合成、及び架橋反応は以下の条件で行った。
　NH2-PEG4化合成ペプチドGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)は、ペプチド合成ビーズ(Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。
　樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチドを得た。得られたペプチド65mg(15.6μmol)を6 M塩化グアニジウム(Gn・HCl)を含むリン酸緩衝液(pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone(2.9 mg、23.4 μmol、1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(33 mg、7.8 μmol、収率50％)を得た。
　以上の手順により、GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表されるリンカーにより連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチドを得た。
　実施例１及び比較例１の親和性測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１に示すように、実施例１に示す架橋構造の環状ペプチドはIgG結合機能を有し、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドに比べてIgG親和性が高いことが明らかとなった。
〔実施例２：動的結合容量(DBC)測定〕
　架橋環状ペプチドが、ヒト抗体精製アフィニティーリガンドとして利用可能か、NHS活性化プレパックカラム(GE Healthcare)に固定化し、吸着性能評価を実施した。ペプチド固定化カラムは以下の方法で作製した。なお、溶液の送液にはシリンジを用いた。
　1 mL容量のNHS活性化プレパックカラムに、1 mM塩酸5 mLを送液し、カラム内のイソプロパノール溶液を除去した。次いで、1.0 mg/mLペプチド溶液（DMSOに溶解した100 mg/mLの実施例１で調製したペプチド溶液をカップリング溶液(20 mM 炭酸緩衝液、50 mM 塩化ナトリウム, pH8.3)で100倍に希釈)1 mLを送液し、室温で1時間固定化した。その後、1 M Tris (pH 8.0) 5 mLで、未反応のNHSを室温1時間ブロッキングした。最後に、吸着溶液(20 mM リン酸緩衝液、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.4)5 mLを送液し、クロマトグラフィー評価に用いた。
　DBC測定は、液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore(GE Healthcare)を用いて行った。作製したカラムを吸着溶液で平衡化した後、吸着溶液に溶解した1 mg/mLヒト血清由来γ-グロブリン(Sigma-Aldrich)を1 mL/minの流速で送液した。DBCは、280 nm吸光度において、非吸着成分を除いた値がサンプル全体の吸光度の10％に到達するまでに送液されたサンプル量から求めた。
〔比較例２〕
　比較例２として、比較例１で合成、架橋したペプチドを実施例２と同様に固定化したカラムを作製し、DBC測定を実施した。
　それぞれのDBC値は、実施例２：9.4 mg/mL-column、比較例２：2.3 mg/mL-columnであり、実施例１に示す架橋構造の環状ペプチドは、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドに比べてIgG吸着性能が高いことが明らかとなった。
〔実施例３：アルカリ耐性の評価〕
　実施例２と同じ方法で作製した1 mgペプチド固定化1 mLカラムに、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液を10 mL送液し、その後、吸着溶液10 mLで洗浄を行った。1、2、5、10回前記水酸化ナトリウム溶液洗浄/吸着溶液洗浄処理を行った後に、実施例２と同様に、流速1 mL/minでDBC測定を行った。水酸化ナトリウム処理を行う前のDBCを100％とし、DBC変動率を求めた。
〔比較例３〕
　比較例３として、実施例２と同じ方法で、ジスルフィド結合で架橋されたNH2-PEG4化合成ペプチド(GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基がジスルフィド結合で架橋されたペプチド)を1 mg固定化したカラムを作製し、実施例３と同様にアルカリ耐性評価を実施した。
　実施例３及び比較例３の測定結果を図１に示し、また実施例３及び比較例３におけるDBC変動率を図２に示す。また、実測値を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　図１及び２並びに表２に示すように、ジスルフィド結合で架橋されたペプチドでは、10回の水酸化ナトリウム処理により、DBCが45.2％にまで低下した(比較例３)。一方、実施例１に示す架橋構造を有する環状ペプチドでは、DBCの低下はほとんど認められず、高いアルカリ耐性を有することが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. 　IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
    　前記ペプチドが、下記の式I：
    　(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
    [式中、
    　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Cはシステイン残基であり、
    　Hはヒスチジン残基であり、
    　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
    　Gはグリシン残基であり、
    　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    　Lはロイシン残基であり、
    　Vはバリン残基であり、且つ
    　Wはトリプトファン残基である]
    によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
    　前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [式中、
    　上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
    　下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
    に示すように連結されている、
    前記固相担体。
  2. 　前記ペプチドが、下記の式II：
    　(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
    [式中、
    　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Cはシステイン残基であり、
    　Hはヒスチジン残基であり、
    　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
    　Gはグリシン残基であり、
    　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    　Lはロイシン残基であり、
    　Vはバリン残基であり、
    　Wはトリプトファン残基であり、
    　Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
    　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
    によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１記載の固相担体。
  3. 　前記ペプチドが、下記の式III：
    　(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
    [式中、
    　Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    　Cはシステイン残基であり、
    　Aはアラニン残基であり、
    　Yはチロシン残基であり、
    　Hはヒスチジン残基であり、
    　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
    　Gはグリシン残基であり、
    　Eはグルタミン酸残基であり、
    　Lはロイシン残基であり、
    　Vはバリン残基であり、且つ
    　Wはトリプトファン残基である]
    によって表される、13～17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の固相担体。
  4. 　17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
    　1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
    　2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
    　3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
    　15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
    　16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
    　17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
    である、請求項１～３のいずれか１項記載の固相担体。
  5. 　前記ペプチドが、以下の1)～14)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、且つXaa2はホモシステインである、請求項４記載の固相担体：
    　1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)
    　2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)
    　3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)
    　4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)
    　5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)
    　6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)
    　7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)
    　8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)
    　9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)
    　10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)
    　11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)
    　12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)
    　13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)
    　14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)。
  6. 　前記ペプチドが、下記の式IV：
    　D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
    [式中、
    　Dはアスパラギン酸残基であり、
    　Cはシステイン残基であり、
    　Hはヒスチジン残基であり、
    　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
    　Gはグリシン残基であり、
    　Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
    　Lはロイシン残基であり、
    　Vはバリン残基であり、
    　Wはトリプトファン残基であり、
    　Tはトレオニン残基であり、
    　Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
    　Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
    によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の固相担体。
  7. 　前記ペプチドが、以下の1)～4)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である、請求項６記載の固相担体：
    　1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)
    　2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)
    　3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)
    　4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)。
  8. 　IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
    　前記ペプチドが、下記の式V：
    　D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
    [式中、
    　Dはアスパラギン酸残基であり、
    　Cはシステイン残基であり、
    　Gはグリシン残基であり、
    　Lはロイシン残基であり、
    　Wはトリプトファン残基であり、
    　Tはトレオニン残基であり、
    　Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
    　Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    　Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
    　Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    　Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
    　Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
    によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
    　前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     [式中、
    　上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
    　下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
    に示すように連結されている、
    前記固相担体。
  9. 　Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体又はロイシン残基である、請求項１～８のいずれか１項記載の固相担体。
  10. 　前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列から成る、請求項１記載の固相担体：
    　GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)。
  11. 　前記ペプチドのN末端がPEG化されている、請求項１～１０のいずれか１項記載の固相担体。
  12. 　前記ペプチドのC末端がアミド化されている、請求項１～１１のいずれか１項記載の固相担体。
  13. 　前記ペプチドが多量体化されている、請求項１～１２のいずれか１項記載の固相担体。
  14. 　前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、請求項１３記載の固相担体。
  15. 　前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、請求項１～１４のいずれか１項記載の固相担体。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項記載の固相担体を含むIgG分離用カラム。
  17. 　請求項１～１５のいずれか１項記載の固相担体又は請求項１６記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
  18. 　請求項１～１５のいずれか１項記載の固相担体又は請求項１６記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
    　結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程、
    を含む、IgGの精製方法。
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