JPWO2020075670A1 - ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 - Google Patents
ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2020075670A1 JPWO2020075670A1 JP2020551141A JP2020551141A JPWO2020075670A1 JP WO2020075670 A1 JPWO2020075670 A1 JP WO2020075670A1 JP 2020551141 A JP2020551141 A JP 2020551141A JP 2020551141 A JP2020551141 A JP 2020551141A JP WO2020075670 A1 JPWO2020075670 A1 JP WO2020075670A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- residue
- xaa1
- peptide
- amino acid
- igg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 193
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 74
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 45
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 38
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 34
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 29
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 18
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 17
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 17
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 17
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 16
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 15
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 13
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 12
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 9
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 29
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N homoserine Chemical compound OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 11
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- -1 cellulose Chemical class 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 4
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 4
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1-(2,4,6-trimethylphenyl)sulfonyl-1,2,4-triazole Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)N1N=C([N+]([O-])=O)N=C1 SFYDWLYPIXHPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012052 hydrophilic carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000906444 Loristes Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N [C-]#N.Br Chemical compound [C-]#N.Br CWGJBBRZFIPXNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000004018 acid anhydride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001105 surface plasmon resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、IgG精製のために用いることができる、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドを固定化した固相担体を提供することを目的とし、具体的には、IgG結合性ペプチドを固定化した固相担体であって、前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[化１]
[式中、
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、前記固相担体に関する。
[化１]
[式中、
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、前記固相担体に関する。
Description
本発明は、IgG結合性ペプチドを含む固相担体、該固相担体を含むIgG分離用カラム、該固相担体又はカラムを含むキット、及び該固相担体又はカラムを用いるIgGの精製方法等に関する。
IgG抗体は、現在最も注目されているバイオ医薬品の1つである。近年、IgG抗体を中心とした抗体医薬が、医薬分野に利用されるようになり、工業的、製薬的な利用における重要性がますます高まっている。抗体の精製にはプロテインAカラムが中心的な役割を果たしており、多くの抗体医薬の製造メーカーは、このカラムを中心とした精製システムを導入している。
しかしながら、このプロテインAカラムは、幾つかの問題点が指摘されている。1つには、精製抗体中へのプロテインAの混入の問題である。プロテインAはバクテリア由来のタンパク質であり、人体投与後の免疫原性が高く、またエンドトキシンの混入が危惧される。IgGのような医薬品の精製に用いるアフィニティーリガンドとしては、不都合な物質の混入が起こらないよう、リガンドとしてのプロテインAには高い精製度が求められており、これが医薬品精製に利用するプロテインAカラムのコストを上げる要因になっている。このため、プロテインAに代わる新たなアフィニティーカラムの開発が期待されている。
本発明者等は、これまでにジスルフィド結合で環化された特定の配列を含むペプチドリガンド(特許文献１)、又はペプチド中のシステイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋したIgG結合ペプチド(特許文献２)によりIgGを精製することができることを報告する。
しかしながら、特許文献１に記載のペプチドリガンドは、アルカリ溶液洗浄の繰り返しにより、親和性が低下するという問題を抱えていた。また、特許文献２に記載のIgG結合ペプチドは、特許文献１に記載のペプチドリガンドに比べ高いアルカリ耐性を有するものの、IgG結合親和性が低いという問題を抱えていた。
本発明は、上述の実情に鑑み、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドを固定化した固相担体を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、IgG結合性ペプチド中のシステイン残基におけるスルフィド基を、特許文献２に記載のリンカーとは異なる特定の構造を有するリンカーによって架橋することにより、当該ペプチドのアルカリ耐性及びIgG結合親和性が顕著に改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、 前記ペプチドが、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（２）前記ペプチドが、下記の式II：
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）記載の固相担体。
（３）前記ペプチドが、下記の式III：
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（４）17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
である、（１）〜（３）のいずれか１記載の固相担体。
（５）前記ペプチドが、以下の1)〜14)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、且つXaa2はホモシステインである、（４）記載の固相担体：
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)。
（６）前記ペプチドが、下記の式IV：
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（７）前記ペプチドが、以下の1)〜4)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である、（６）記載の固相担体：
1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)
2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)
3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)
4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)。
（８）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、 前記ペプチドが、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（９）Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体又はロイシン残基である、（１）〜（８）のいずれか１記載の固相担体。
（１０）前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列から成る、（１）記載の固相担体：
GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)。
（１１）前記ペプチドのN末端がPEG化されている、（１）〜（１０）のいずれか１記載の固相担体。
（１２）前記ペプチドのC末端がアミド化されている、（１）〜（１１）のいずれか１記載の固相担体。
（１３）前記ペプチドが多量体化されている、（１）〜（１２）のいずれか１記載の固相担体。
（１４）前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、（１３）記載の固相担体。
（１５）前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、（１）〜（１４）のいずれか１記載の固相担体。
（１６）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体を含むIgG分離用カラム。
（１７）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
（１８）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程、
を含む、IgGの精製方法。
（１）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、 前記ペプチドが、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（２）前記ペプチドが、下記の式II：
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）記載の固相担体。
（３）前記ペプチドが、下記の式III：
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（４）17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
である、（１）〜（３）のいずれか１記載の固相担体。
（５）前記ペプチドが、以下の1)〜14)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、且つXaa2はホモシステインである、（４）記載の固相担体：
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)。
（６）前記ペプチドが、下記の式IV：
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、（１）又は（２）記載の固相担体。
（７）前記ペプチドが、以下の1)〜4)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である、（６）記載の固相担体：
1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)
2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)
3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)
4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)。
（８）IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、 前記ペプチドが、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。
（９）Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体又はロイシン残基である、（１）〜（８）のいずれか１記載の固相担体。
（１０）前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列から成る、（１）記載の固相担体：
GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)。
（１１）前記ペプチドのN末端がPEG化されている、（１）〜（１０）のいずれか１記載の固相担体。
（１２）前記ペプチドのC末端がアミド化されている、（１）〜（１１）のいずれか１記載の固相担体。
（１３）前記ペプチドが多量体化されている、（１）〜（１２）のいずれか１記載の固相担体。
（１４）前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、（１３）記載の固相担体。
（１５）前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、（１）〜（１４）のいずれか１記載の固相担体。
（１６）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体を含むIgG分離用カラム。
（１７）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
（１８）（１）〜（１５）のいずれか１記載の固相担体又は（１６）記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程、
を含む、IgGの精製方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-192083号の開示内容を包含する。
本発明に係る固相担体に含まれるペプチドは、システイン残基におけるスルフィド基を、特定の構造を有するリンカーによって架橋することによって、アルカリ耐性及びIgG結合親和性が改善されている。従って、本発明に係る固相担体は、アルカリ洗浄工程等によってIgG結合能が低減されにくく、また、高いIgG結合親和性を有することで、効率的なIgG精製に用いることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る固相担体は、IgGと結合可能であることを特徴とするペプチド(IgG結合性ペプチド)を固定化した固相担体であって、該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、固相担体である。本発明に係る固相担体によれば、当該固相担体上の、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドにより、効率的にIgGを精製することができる。
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、固相担体である。本発明に係る固相担体によれば、当該固相担体上の、IgG精製後のアルカリ溶液洗浄の繰り返しに対して耐性を有し、且つIgG結合親和性が高いIgG結合性ペプチドにより、効率的にIgGを精製することができる。
＜IgG結合性ペプチドを含む固相担体＞
一態様において、本発明は、IgG結合性ペプチドを含む固相担体に関する。本明細書における「固相担体」としては、限定するものではないが、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類から成る有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合担体等が挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、IgG結合性ペプチドの選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等から成る担体が代表例として挙げられる。
一態様において、本発明は、IgG結合性ペプチドを含む固相担体に関する。本明細書における「固相担体」としては、限定するものではないが、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類から成る有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合担体等が挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、IgG結合性ペプチドの選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等から成る担体が代表例として挙げられる。
固相担体の形態としては、ビーズ状、線維状、粒子条、膜状(中空糸も含む)、ゲル状等いずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10〜2500μmのものが使いやすく、とりわけ、IgG結合性ペプチド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。固相担体としては、具体的には例えば、磁性ビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、及び多糖類ビーズ等が挙げられる。
さらに固相担体表面には、IgG結合性ペプチドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとIgG結合性ペプチドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、スクシンイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミド基等、酸無水物基、ヨードアセチル基等が挙げられる。
固相担体としては、市販品を用いることもできる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L、NHS基で活性化されたセファロース担体を含むNHS活性化プレパックカラム等を例示することができる。ただし、本実施態様においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。
上述の固相担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。また、固相担体としては、その使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
上記固相担体には、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドが固定化されていることが好ましく、ペプチドの固定化は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。固定化は、例えばIgG結合性ペプチドのN末端のアミノ基を、直接又はスペーサーを介して固相担体に共有結合させることによって行うことが好ましい。IgG結合性ペプチドの立体障害を小さくすることにより分離効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することがより好ましい。親水性スペーサーは特に限定しないが、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
上記固相担体へ導入されるIgG結合性ペプチド及びスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法及び条件は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。例えば、担体をアミノ基を含む化合物、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を含む化合物、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン等と反応させて活性化し(担体が元々持っている官能基よりIgG結合性ペプチドが反応しやすい官能基に変え)、IgG結合性ペプチドと反応、固定化する方法、また、担体とIgG結合性ペプチドが存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、又は、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、固相担体の滅菌時又は利用時にIgG結合性ペプチドが固相担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
本明細書に記載のIgG結合性ペプチドを含む固相担体は、クロマトグラフィーカラム等に充填して、IgGを精製又は分離するために用いることができる。
本発明に係る固相担体に含まれ得るIgG結合性ペプチドについて、以下詳細に説明する。
本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG(IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
一態様において、本発明に係る固相担体に含まれ得るIgG結合性ペプチドは、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
上記式で、N末端又はC末端のX1-3という表記は、システイン(C又はCys)以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが1〜3個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは3個全てが同じ残基でない配列から成る。同様に、X2もシステイン(C又はCys)以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが2個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該2個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列から成る。
式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式I'及び式I''で表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式I'で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
式I''で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
上記の式I'、式I''及び式IIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長から成る。
本明細書で使用する「17アミノ酸残基とした場合の」とは、ペプチドのアミノ酸残基をアミノ酸番号で呼ぶときに、式Iのペプチドについて最長のアミノ酸長である17残基のN末端から順番に1番目から17番目まで番号付けするために便宜的に表現した用語である。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIIで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IIIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
上記の式IIIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1番目及び2番目、並びに16番目及び17番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなってよい。
さらに、上記の各式のペプチドのアミノ酸配列のシステイン(C)以外のアミノ酸残基、すなわち、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1〜3、5、6、15〜17番目の各アミノ酸残基は、以下のものから選択されることが好ましい。ここで、各大文字のアルファベットは、アミノ酸の一文字表記である:
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IVで表されるペプチドを以下に示す。
すなわち、式IVで表されるペプチドは、
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む。
式Iのペプチドの具体例のいくつかを以下の1)〜18)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)、
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)、
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)、
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)、
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)、
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)、
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)、
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)、
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)、
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)、
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)、
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)、
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)、
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)、
15) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)、
16) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)、
17) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)、及び
18) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)
[式中、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している]。
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)、
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)、
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)、
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)、
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)、
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)、
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)、
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)、
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)、
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)、
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)、
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)、
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)、
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)、
15) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)、
16) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)、
17) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)、及び
18) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)
[式中、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している]。
式Iのペプチドの好ましい具体例として、
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１、但し、Xaa1はアルギニン(R))、
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、但し、Xaa1はR、L、リシン(K)又はアセチル化リシン)、及び
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４、但し、Xaa1はR)、
が挙げられ、特に好ましい例として、GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)が挙げられる。
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１、但し、Xaa1はアルギニン(R))、
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、但し、Xaa1はR、L、リシン(K)又はアセチル化リシン)、及び
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４、但し、Xaa1はR)、
が挙げられ、特に好ましい例として、GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)が挙げられる。
また、一態様において、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、広義の一次構造として、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
該ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている。
式Vのペプチドの具体例の幾つかを以下の19)〜30)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
19) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１９)、
20) DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２０)、
21) DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２１)、
22) DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２２)、
23) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２３)、
24) DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２４)、
25) DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２５)、
26) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２６)、
27) DCTYT(Xaa1)GELVWCT(配列番号２７)、
28) DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(配列番号２８)、
29) DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(配列番号２９)、及び
30) DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(配列番号３０)
[式中、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である]。
19) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１９)、
20) DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２０)、
21) DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２１)、
22) DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２２)、
23) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２３)、
24) DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２４)、
25) DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２５)、
26) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号２６)、
27) DCTYT(Xaa1)GELVWCT(配列番号２７)、
28) DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(配列番号２８)、
29) DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(配列番号２９)、及び
30) DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(配列番号３０)
[式中、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である]。
上記の通り、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドにおいて、Xaa1は、アルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基、若しくはアスパラギン残基、又はそれらの誘導体、好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基、さらに好ましくはアルギニン残基、リシン残基若しくはその誘導体、又はロイシン残基である。本明細書において、誘導体の種類は特に限定しないが、アセチル基又はプロピニル基等のアシル化誘導体(アシル化誘導体は、一般式：R-CO-で表され、式中、Rは炭化水素、好ましくは炭素数1〜6のアルキル基である)が挙げられる。誘導体の例として、例えばリシン残基のεアミノ基がアシル化、例えばアセチル化された誘導体が挙げられる。
前述の通り、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも2つのシステイン(C)残基を有し、該システイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されていることを特徴としている。
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されていることを特徴としている。
上記リンカーを有するペプチドを調製する方法は特に限定されない。
リンカーの形成に関与する硫黄原子（Ｓ）はシステイン残基、あるいはホモシステイン残基に由来し、他方のアミノ酸側鎖の脱離基Xと置換反応することによってリンカーが形成される。
リンカーの形成に関与する硫黄原子（Ｓ）はシステイン残基、あるいはホモシステイン残基に由来し、他方のアミノ酸側鎖の脱離基Xと置換反応することによってリンカーが形成される。
システイン残基と置換反応する場合、脱離基Ｘは他方のアミノ酸のβ位に結合し、ホモシステインと置換反応する場合、脱離基Xは他方のアミノ酸のγ位に結合する。
脱離基Ｘは一般的な脱離基が利用可能であり、例えば、ハロゲン原子、スルフォニル化された水酸基などが挙げられる。本方法のリンカー形成における置換反応では、ハロゲン原子が好ましく、更に好ましくは塩素原子を用いることができる。
該置換反応は原料ペプチドを適当なバッファー中において、室温(例えば約15℃〜30℃)または高温下(30℃〜70℃)で行うことができ、好ましくは40℃〜60℃、更に好ましくは50℃で行うことができる。
該置換反応工程は、置換反応を促進する塩基(又はアルカリ)、例えば弱塩基性の無機又は有機(例えば、塩化グアニジウム、重炭酸ナトリウム、及びジエチルアミン等)を適量加えて行ってもよい。
該置換反応工程における硫黄原子(S)と脱離基(X)の混合比率は、特に限定しない。硫黄原子(S)と脱離基(X)のモル比率は、例えば1：0.2〜1：5、好ましくは1：0.5〜1：2、更に好ましくは1：1とすることができる。
該置換反応工程における反応時間は、硫黄原子（S）と脱離基(X)の間で置換反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1時間〜96時間、好ましくは10時間〜72時間、更に好ましくは24〜48時間とすることができる。
本方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のペプチド及び化合物等を分離し、置換反応によって連結されたペプチドを精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
また、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、N末端のPEG化(ポリエチレングリコール付加)、及びC末端のアミド化等により修飾されていても良い。PEG化を行う場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1〜50分子、1〜20分子、2〜10分子、2〜6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
また、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、多量体化されていてもよい。本明細書において、IgG結合性ペプチドの「多量体化」とは、共有結合を介して2分子以上の上記IgG結合性ペプチドが連結されていることを指し、IgG結合性ペプチドの多量体は、例えば2〜6量体、2〜5量体、2〜4量体、2〜3量体、好ましくは2量体であってよい。
前記ペプチドの多量体は、該ペプチド間にスペーサーを有していてもよい。多量体化は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば上記IgG結合性ペプチドのN末端のアミノ基を、スペーサーを介して2分子以上連結することによって行うことができる。スペーサーの種類は特に限定しないが、例えば両末端にカルボキシル基を有するアスパラギン酸及びグルタミン酸等のアミノ酸、並びに両末端をカルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、N-ヒドロキシスクシンイミジル基等の官能基で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体が挙げられる。
本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、ヒトIgGとの結合親和性が、他のヒト免疫グロブリン(IgA、IgE、IgM)と比較して約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高いものであり得る。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析(例えばBIACOREシステム使用)により決定可能であり、例えば1×10-1M未満、1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、IgGのFcドメインに結合し得る。
本明細書に記載のIgG結合性ペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132;「新生化学実験講座１ タンパク質IV」(1992) 日本生化学会編，東京化学同人)によって製造することができる。あるいは、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、IgG結合性ペプチドを製造してもよい。例えば本明細書に記載のIgG結合性ペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のIgG結合性ペプチドを製造することができる。製造されたIgG結合性ペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸(天然であるか非天然であるかを問わない)の、結合しようとするα−アミノ基とα−カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα−アミノ基とα−カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα−カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
遺伝子組換え法による製造は、例えば、本明細書に記載のIgG結合性ペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のIgG結合性ペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、及び酵母由来のプラスミド(例えばYEp13、YCp50等)等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及びλファージベクター(Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。本明細書に記載のIgG結合性ペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したIgG結合性ペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのIgG結合性ペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的のIgG結合性ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のIgG結合性ペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的のIgG結合性ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的のIgG結合性ペプチドを回収する。
＜IgG分離用カラム又はIgGの精製のためのキット＞
一態様において、本発明は、上記のIgG結合性ペプチドを含む固相担体を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)分離用カラムに関する。
一態様において、本発明は、上記のIgG結合性ペプチドを含む固相担体を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)分離用カラムに関する。
上記IgG分離用カラムは、IgGの精製又は分離のための、クロマトグラフィーカラム、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム等のカラムを包含する。カラムのサイズは特に制限されないものとし、分析用、精製用、分取用等の用途、アプライ(搭載)又は注入する量、カラムの長さ又は内径等に応じて変化させうる。また、カラムの材質は、金属、プラスチック、ガラス等のカラムとして通常使用されるようなものでよい。
上記のカラムは、上記の本発明に係る固相担体(乾燥又は湿潤状態のいずれであってもよい)をカラムに密に充填することによって製造できる。
また、一態様において、本発明は、上記のIgG結合性ペプチドを含む固相担体又は上記のIgG分離用カラムを含む、IgG(好ましくはヒトIgG)の精製のためのキットに関する。
本発明に係るキットは、IgGの分析手順や精製手順を記載した使用説明書、精製に必要な試薬やバッファー、固相担体の充填用カラムの少なくとも1つを含んでよい。
＜IgGの精製方法＞
一態様において、本発明は、上記固相担体、又は上記IgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)の精製方法に関する。
一態様において、本発明は、上記固相担体、又は上記IgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程を含む、IgG(好ましくはヒトIgG)の精製方法に関する。
結合工程は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、上記固相担体又はIgG分離用カラムを適当なバッファーで平衡化し、0℃〜室温、好ましくは0℃〜約10℃、更に好ましくは約4℃の低温でIgGを含有する液をアプライし、固相担体上のIgG結合性ペプチドにIgGを結合させる。例えば血清中のIgGを分離する場合には、中性域のpH、例えばpH6.0〜7.5のバッファーを使用してカラムにアプライし、結合工程を行うことができる。
溶出工程も、当業者に公知の方法より行うことができる。例えば、酸性域のpH、例えばpH2〜4のバッファー(例えば0.3MのNaClを含有するpH3.5〜pH2.5の0.2Mグリシン-HClバッファー又は20 mM クエン酸バッファー)をカラムに流して行ってもよいし、上記のIgG結合性ペプチドを用いて競合溶出により溶出させてもよい。特に、コストの点から酸により溶出を行うことが好ましい。この場合、固相担体又はカラムを、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、及び水酸化カリウム溶液等のアルカリ性の溶液(例えば、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液)で洗浄することにより固相担体又はカラムを再生し、再度結合工程に用いることができる。溶液のアルカリ性の程度は当業者であれば容易に決定することができる。従って、本発明に係る方法は、任意に、アルカリ性の溶液により洗浄することにより固相担体又はカラムを再生する工程を含み得る。
IgGが回収されたか否かは、例えば、電気泳動による分子量の確認、及び任意にその後の抗IgG抗体を使用するウエスタンブロット法によって判定できる。例えば、電気泳動は、5〜20％アクリルアミドグラジエントゲルを用いたSDS-PAGEにより行ってよく、また、ウエスタンブロットは、泳動後のタンパク質をPVDF膜に転写し、スキムミルクでブロッキング後、抗IgGα鎖ヤギ抗体とHRP標識抗ヤギIgGマウス抗体で検出を行うことができる。
本発明に係る方法は、種々の方法で生産されたIgG含有生産物からIgGを精製する工程において、IgGに富む画分を得る場合に有用である。それゆえに、アフィニティークロマトグラフィー、HPLC等のカラムクロマトグラフィーにおいて本発明に係る方法を使用することが好ましい。IgGの精製に際しては、このようなクロマトグラフィー法に加えて、タンパク質の慣用的な精製技術、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過等を適宜組み合わせることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：架橋環状ペプチドの調製及び結合親和性の測定〕
原料ペプチド[配列:H2N-PEG4-GPD(Hse)AYHRGELVWCTFH, Hse: ホモセリン(配列番号３２)]を、自動ペプチド合成機Prelude(Protein Technologies, Inc.)を用いて、固相ペプチド合成法(Fmoc法)にて合成した。すなわち、Rink Amide-ChemMatrix樹脂にα-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をMSNT/NMI/DCM条件により縮合し、樹脂へのC末端アミノ酸の担持を完了した。これにFmoc基脱保護溶液(20％ピペリジン/DMF)を注入してFmoc基を除去した後に、α-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をHCTU/NMM/DMF条件によって縮合し、ジペプチドを合成した。Fmoc基脱保護溶液によるFmoc基の脱保護とHCTU/NMM/DMF条件によるアミノ酸の縮合操作を繰り返すことにより、目的とする配列のペプチドを合成した。
原料ペプチド[配列:H2N-PEG4-GPD(Hse)AYHRGELVWCTFH, Hse: ホモセリン(配列番号３２)]を、自動ペプチド合成機Prelude(Protein Technologies, Inc.)を用いて、固相ペプチド合成法(Fmoc法)にて合成した。すなわち、Rink Amide-ChemMatrix樹脂にα-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をMSNT/NMI/DCM条件により縮合し、樹脂へのC末端アミノ酸の担持を完了した。これにFmoc基脱保護溶液(20％ピペリジン/DMF)を注入してFmoc基を除去した後に、α-アミノ基がFmoc基で、側鎖官能基が一般的な保護基で保護されたアミノ酸をHCTU/NMM/DMF条件によって縮合し、ジペプチドを合成した。Fmoc基脱保護溶液によるFmoc基の脱保護とHCTU/NMM/DMF条件によるアミノ酸の縮合操作を繰り返すことにより、目的とする配列のペプチドを合成した。
保護ペプチド樹脂の合成完了後、N-末端Fmoc基の脱保護、二炭酸ジ-tert-ブチル、DIPEAによるN−末端アミノ基のBoc化を行った。続いて、Hseの水酸基を塩素化する為に、Hseの保護基であるTrt基のみを2％TFA/5％TIPS/93％DCMで脱保護した。脱保護されたHseの遊離水酸基をトリフォスゲン、トリフェニルホスフィンによって塩素化した。樹脂上でのHse水酸基の塩素化終了後、脱保護溶液(2.5％トリイソプロピルシラン、2.5％水、2.5％1,2-エタンジチオール、92.5％トリフルオロ酢酸)を保護ペプチド樹脂に加えて、4時間反応することによってペプチド側鎖保護基の除去と共に、樹脂から遊離ペプチドを切り出した。
樹脂をろ去し、得られたろ液を冷エーテルに添加することにより、ペプチドを沈澱として回収した。得られたペプチドはProteonaviカラム(SHISEIDO)にて溶媒系に0.1％TFA水溶液及びアセトニトリルを用いて精製した。
最終精製ペプチドを、CAPCELL PAK UG120カラム(SHISEIDO)及びHPLCシステム(HITACHI)により純度を確認した。また、ESI-MSシステム(Synapt HDMS、WATERS)により分子量を確認し、凍結乾燥した。
上記のように得られたHse側鎖水酸基が塩素化された原料ペプチドを6 M Gn・HCl, 0.2 M Tris・HCl, 1 mM TCEP水溶液に溶解し、50℃で反応させることによって環化した。反応開始から39時間後、HPLC分析によって環化生成物を確認した。目的とする環化ペプチドをProteonaviカラム(SHISEIDO)にて溶媒系に0.1％TFA水溶液及びアセトニトリルを用いて精製した。
最終精製ペプチドを、CAPCELL PAK UG120カラム(SHISEIDO)及びHPLCシステム(HITACHI)により純度を確認した。また、ESI-MSシステム(Synapt HDMS、WATERS)により分子量を確認し、凍結乾燥した。
なお、上記における略号は、以下の通りである：
DCM, dichloromethane; DMF, N,N-dimethylformamide; Fmoc, 9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl; Boc, tert-buthoxycarbonyl; DIPEA, N,N'-diisopropylethylamine; HCTU, 1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzo-triazolium 3-oxide hexafluorophosphate; MSNT, 1-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole; NMI, N-methylimidazole; NMM, N-methylmorpholine。
DCM, dichloromethane; DMF, N,N-dimethylformamide; Fmoc, 9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl; Boc, tert-buthoxycarbonyl; DIPEA, N,N'-diisopropylethylamine; HCTU, 1-[bis(dimethylamino)methylene]-5-chloro-1H-benzo-triazolium 3-oxide hexafluorophosphate; MSNT, 1-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole; NMI, N-methylimidazole; NMM, N-methylmorpholine。
以上の手順により、GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化；配列番号３１に示されるアミノ酸配列に相当する)で示されるアミノ酸配列を含み、且つペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
[式中、
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチド(架橋環状ペプチド)を得た。
上部のシステイン残基がペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基がペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチド(架橋環状ペプチド)を得た。
親和性解析は、以下の方法で行った。先ず、BIAcoreT200(GE healthcare)にセットしたCM5センサーチップ上へ、等量混合した0.4 M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)と0.1 M sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド)溶液を10 μl/mlの流速でセンサーチップにインジェクトすることにより、センサーチップを活性化した。その後、pH 5.5(10 mM 酢酸Na)の条件下で、ヒトIgGをセンサーチップ上に固定化した。測定には、HBS-EP緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005％ Tween 20、3 mM EDTA、pH 7.4)を用い、流速50 μl/mlにて、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 nMの上述の精製した架橋環状ペプチドを180秒間インジェクトすることで結合反応をモニターした。解離反応測定の際は、緩衝液のみを600秒間インジェクトした。相互作用パラメータの解析は、BIAevalution T100ソフトウェアを用いて行った。
〔比較例１〕
比較例１として、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドを合成し、実施例１と同様の方法で親和性の測定を行った。ペプチドの合成、及び架橋反応は以下の条件で行った。
比較例１として、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドを合成し、実施例１と同様の方法で親和性の測定を行った。ペプチドの合成、及び架橋反応は以下の条件で行った。
NH2-PEG4化合成ペプチドGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)は、ペプチド合成ビーズ(Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。
樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチドを得た。得られたペプチド65mg(15.6μmol)を6 M塩化グアニジウム(Gn・HCl)を含むリン酸緩衝液(pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone(2.9 mg、23.4 μmol、1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(33 mg、7.8 μmol、収率50％)を得た。
以上の手順により、GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
で表されるリンカーにより連結されている、N末端PEG4化及びC末端アミド化ペプチドを得た。
実施例１及び比較例１の親和性測定結果を表１に示す。
表１に示すように、実施例１に示す架橋構造の環状ペプチドはIgG結合機能を有し、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドに比べてIgG親和性が高いことが明らかとなった。
〔実施例２：動的結合容量(DBC)測定〕
架橋環状ペプチドが、ヒト抗体精製アフィニティーリガンドとして利用可能か、NHS活性化プレパックカラム(GE Healthcare)に固定化し、吸着性能評価を実施した。ペプチド固定化カラムは以下の方法で作製した。なお、溶液の送液にはシリンジを用いた。
架橋環状ペプチドが、ヒト抗体精製アフィニティーリガンドとして利用可能か、NHS活性化プレパックカラム(GE Healthcare)に固定化し、吸着性能評価を実施した。ペプチド固定化カラムは以下の方法で作製した。なお、溶液の送液にはシリンジを用いた。
1 mL容量のNHS活性化プレパックカラムに、1 mM塩酸5 mLを送液し、カラム内のイソプロパノール溶液を除去した。次いで、1.0 mg/mLペプチド溶液（DMSOに溶解した100 mg/mLの実施例１で調製したペプチド溶液をカップリング溶液(20 mM 炭酸緩衝液、50 mM 塩化ナトリウム, pH8.3)で100倍に希釈)1 mLを送液し、室温で1時間固定化した。その後、1 M Tris (pH 8.0) 5 mLで、未反応のNHSを室温1時間ブロッキングした。最後に、吸着溶液(20 mM リン酸緩衝液、150 mM 塩化ナトリウム、pH 7.4)5 mLを送液し、クロマトグラフィー評価に用いた。
DBC測定は、液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore(GE Healthcare)を用いて行った。作製したカラムを吸着溶液で平衡化した後、吸着溶液に溶解した1 mg/mLヒト血清由来γ-グロブリン(Sigma-Aldrich)を1 mL/minの流速で送液した。DBCは、280 nm吸光度において、非吸着成分を除いた値がサンプル全体の吸光度の10％に到達するまでに送液されたサンプル量から求めた。
〔比較例２〕
比較例２として、比較例１で合成、架橋したペプチドを実施例２と同様に固定化したカラムを作製し、DBC測定を実施した。
比較例２として、比較例１で合成、架橋したペプチドを実施例２と同様に固定化したカラムを作製し、DBC測定を実施した。
それぞれのDBC値は、実施例２：9.4 mg/mL-column、比較例２：2.3 mg/mL-columnであり、実施例１に示す架橋構造の環状ペプチドは、特許文献２に記載の架橋環状ペプチドに比べてIgG吸着性能が高いことが明らかとなった。
〔実施例３：アルカリ耐性の評価〕
実施例２と同じ方法で作製した1 mgペプチド固定化1 mLカラムに、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液を10 mL送液し、その後、吸着溶液10 mLで洗浄を行った。1、2、5、10回前記水酸化ナトリウム溶液洗浄/吸着溶液洗浄処理を行った後に、実施例２と同様に、流速1 mL/minでDBC測定を行った。水酸化ナトリウム処理を行う前のDBCを100％とし、DBC変動率を求めた。
実施例２と同じ方法で作製した1 mgペプチド固定化1 mLカラムに、0.1 M 水酸化ナトリウム溶液を10 mL送液し、その後、吸着溶液10 mLで洗浄を行った。1、2、5、10回前記水酸化ナトリウム溶液洗浄/吸着溶液洗浄処理を行った後に、実施例２と同様に、流速1 mL/minでDBC測定を行った。水酸化ナトリウム処理を行う前のDBCを100％とし、DBC変動率を求めた。
〔比較例３〕
比較例３として、実施例２と同じ方法で、ジスルフィド結合で架橋されたNH2-PEG4化合成ペプチド(GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基がジスルフィド結合で架橋されたペプチド)を1 mg固定化したカラムを作製し、実施例３と同様にアルカリ耐性評価を実施した。
比較例３として、実施例２と同じ方法で、ジスルフィド結合で架橋されたNH2-PEG4化合成ペプチド(GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２、Xaa1はアルギニンで、C末端はアミド化)で示されるアミノ酸配列を含み、外側の2つのシステイン残基がジスルフィド結合で架橋されたペプチド)を1 mg固定化したカラムを作製し、実施例３と同様にアルカリ耐性評価を実施した。
実施例３及び比較例３の測定結果を図１に示し、また実施例３及び比較例３におけるDBC変動率を図２に示す。また、実測値を表２にまとめた。
図１及び２並びに表２に示すように、ジスルフィド結合で架橋されたペプチドでは、10回の水酸化ナトリウム処理により、DBCが45.2％にまで低下した(比較例３)。一方、実施例１に示す架橋構造を有する環状ペプチドでは、DBCの低下はほとんど認められず、高いアルカリ耐性を有することが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (18)
- IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
前記ペプチドが、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。 - 前記ペプチドが、下記の式II：
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、且つ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１記載の固相担体。 - 前記ペプチドが、下記の式III：
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
[式中、
Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、且つ
Wはトリプトファン残基である]
によって表される、13〜17アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の固相担体。 - 17アミノ酸残基とした場合の、前記ペプチドのN末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は無し、
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は無し、
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は無し、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は無し、
である、請求項１〜３のいずれか１項記載の固相担体。 - 前記ペプチドが、以下の1)〜14)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、且つXaa2はホモシステインである、請求項４記載の固相担体：
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１)
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号２)
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号３)
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号４)
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号５)
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号６)
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号７)
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号８)
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号９)
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１０)
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１１)
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号１２)
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号１３)
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号１４)。 - 前記ペプチドが、下記の式IV：
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、且つ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の固相担体。 - 前記ペプチドが、以下の1)〜4)のいずれか1つのアミノ酸配列から成る、但し、Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体である、請求項６記載の固相担体：
1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１５)
2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号１６)
3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１７)
4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号１８)。 - IgGと結合可能であることを特徴とするペプチドを固定化した固相担体であって、
前記ペプチドが、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
[式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はアルギニン残基、リシン残基、ロイシン残基若しくはアスパラギン残基又はそれらの誘導体であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基又はアスパラギン酸残基であり、且つ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である]
によって表される、13アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を含み、且つ
前記ペプチドの外側の2つのシステイン残基が、以下の式：
上部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるN末端側のシステイン残基であり、且つ
下部のシステイン残基が前記ペプチドにおけるC末端側のシステイン残基である]
に示すように連結されている、
前記固相担体。 - Xaa1がアルギニン残基、リシン残基若しくはそのアシル化誘導体又はロイシン残基である、請求項１〜８のいずれか１項記載の固相担体。
- 前記ペプチドが、以下のアミノ酸配列から成る、請求項１記載の固相担体：
GPDCAYHRGELVWCTFH(配列番号３１)。 - 前記ペプチドのN末端がPEG化されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の固相担体。
- 前記ペプチドのC末端がアミド化されている、請求項１〜１１のいずれか１項記載の固相担体。
- 前記ペプチドが多量体化されている、請求項１〜１２のいずれか１項記載の固相担体。
- 前記ペプチドの多量体が、該ペプチド間にスペーサーを有する、請求項１３記載の固相担体。
- 前記ペプチドと固相の間にスペーサーを有する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の固相担体。
- 請求項１〜１５のいずれか１項記載の固相担体を含むIgG分離用カラム。
- 請求項１〜１５のいずれか１項記載の固相担体又は請求項１６記載のIgG分離用カラムを含む、IgGの精製のためのキット。
- 請求項１〜１５のいずれか１項記載の固相担体又は請求項１６記載のIgG分離用カラムにIgGを結合させる工程、及び
結合したIgGを溶出させてIgGを回収する工程、
を含む、IgGの精製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018192083 | 2018-10-10 | ||
| JP2018192083 | 2018-10-10 | ||
| PCT/JP2019/039480 WO2020075670A1 (ja) | 2018-10-10 | 2019-10-07 | ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020075670A1 true JPWO2020075670A1 (ja) | 2021-09-02 |
| JP7117741B2 JP7117741B2 (ja) | 2022-08-15 |
Family
ID=70164928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020551141A Active JP7117741B2 (ja) | 2018-10-10 | 2019-10-07 | ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210380637A1 (ja) |
| EP (1) | EP3865515A4 (ja) |
| JP (1) | JP7117741B2 (ja) |
| CN (1) | CN112789295B (ja) |
| WO (1) | WO2020075670A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102651537B1 (ko) * | 2015-05-20 | 2024-03-25 | 가고시마 유니버시티 | IgG 결합 펩타이드에 의한 항체의 특이적 변형 |
| CN112469736A (zh) * | 2018-08-01 | 2021-03-09 | 国立大学法人鹿儿岛大学 | 肽融合蛋白质 |
| IL302587A (en) | 2020-11-09 | 2023-07-01 | Univ Kagoshima | Peptide cross-linking factor and peptide cross-linked using the cross-linking factor |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6207160B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-03-27 | La Jolla Pharmaceutical Company | aPL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for aPL antibody-mediated pathologies |
| WO2013027796A1 (ja) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | 大塚化学株式会社 | IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法 |
| WO2016186206A1 (ja) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | 国立大学法人鹿児島大学 | ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾 |
| WO2018092867A1 (ja) * | 2016-11-18 | 2018-05-24 | 国立大学法人鹿児島大学 | ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 |
| JP2018516913A (ja) * | 2015-05-28 | 2018-06-28 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 癌治療で使用するためのペグ化インターロイキン−１０ |
| US20180230184A1 (en) * | 2015-10-23 | 2018-08-16 | Fujifilm Corporation | Cyclic peptide, affinity chromatography support, labeled antibody, antibody drug conjugate, and pharmaceutical preparation |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| SE0200943D0 (sv) * | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Amersham Biosciences Ab | Mutant protein |
| WO2017069269A1 (ja) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | 富士フイルム株式会社 | 環状ペプチド、アフィニティクロマトグラフィー担体、標識化抗体、抗体薬物複合体、および医薬製剤 |
| TWI787151B (zh) * | 2016-07-25 | 2022-12-21 | 國立大學法人鹿兒島大學 | 藉由ＩｇＧ結合肽之抗體之特異性裝飾 |
| JP2018192083A (ja) | 2017-05-19 | 2018-12-06 | 東芝ライフスタイル株式会社 | 自律型電気掃除機 |
-
2019
- 2019-10-07 JP JP2020551141A patent/JP7117741B2/ja active Active
- 2019-10-07 US US17/284,309 patent/US20210380637A1/en active Pending
- 2019-10-07 EP EP19871361.2A patent/EP3865515A4/en active Pending
- 2019-10-07 WO PCT/JP2019/039480 patent/WO2020075670A1/ja unknown
- 2019-10-07 CN CN201980064240.9A patent/CN112789295B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6207160B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-03-27 | La Jolla Pharmaceutical Company | aPL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for aPL antibody-mediated pathologies |
| WO2013027796A1 (ja) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | 大塚化学株式会社 | IgG結合性ペプチド及びそれによるIgGの検出および精製方法 |
| WO2016186206A1 (ja) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | 国立大学法人鹿児島大学 | ＩｇＧ結合ペプチドによる抗体の特異的修飾 |
| JP2018516913A (ja) * | 2015-05-28 | 2018-06-28 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 癌治療で使用するためのペグ化インターロイキン−１０ |
| US20180230184A1 (en) * | 2015-10-23 | 2018-08-16 | Fujifilm Corporation | Cyclic peptide, affinity chromatography support, labeled antibody, antibody drug conjugate, and pharmaceutical preparation |
| WO2018092867A1 (ja) * | 2016-11-18 | 2018-05-24 | 国立大学法人鹿児島大学 | ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KRAJEWSKI, K., ET AL.: "Design and Synthesis of Dimeric HIV-1 Integrase Inhibitory Peptides", BIOORGANIC ＆ MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 13, JPN6019048722, 2003, pages 3203 - 3205, XP001206151, ISSN: 0004685095, DOI: 10.1016/S0960-894X(03)00679-6 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3865515A1 (en) | 2021-08-18 |
| US20210380637A1 (en) | 2021-12-09 |
| JP7117741B2 (ja) | 2022-08-15 |
| CN112789295B (zh) | 2023-08-15 |
| WO2020075670A1 (ja) | 2020-04-16 |
| EP3865515A4 (en) | 2022-02-16 |
| CN112789295A (zh) | 2021-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7002733B2 (ja) | ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 | |
| JP5994068B2 (ja) | ＩｇＧ結合性ペプチド及びそれによるＩｇＧの検出および精製方法 | |
| JP7117741B2 (ja) | ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 | |
| JP5874118B2 (ja) | ＩｇＡ結合性ペプチド及びそれによるＩｇＡの精製 | |
| US10450344B2 (en) | Antibody-binding polypeptide, antibody-binding fusion polypeptide, and adsorption material | |
| KR20180041243A (ko) | 환상 펩타이드, 어피니티 크로마토그래피 담체, 표지화 항체, 항체 약물 복합체, 및 의약 제제 | |
| JP6259245B2 (ja) | 免疫グロブリンＧに対する親和性を有するペプチド及びそれを用いたＩｇＧ型抗体吸着材 | |
| JP7202577B2 (ja) | ペプチド融合タンパク質 | |
| JP7370538B2 (ja) | 分離剤 | |
| WO2020004671A1 (ja) | 分離剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210125 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220316 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220712 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220725 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7117741 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |