TWI787151B

TWI787151B - 藉由ＩｇＧ結合肽之抗體之特異性裝飾

Info

Publication number: TWI787151B
Application number: TW105123520A
Authority: TW
Inventors: 伊東祐二
Original assignee: 國立大學法人鹿兒島大學
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2016-07-25
Publication date: 2022-12-21
Also published as: TW201803888A

Abstract

本發明係關於一種IgG結合肽、經交聯劑修飾之IgG結合肽、該經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG之複合體、及生產該複合體之方法等。

Description

藉由IgG結合肽之抗體之特異性裝飾

先前以來，抗體於各種研究、開發中被大量用於檢測靶分子，作為檢測試劑或診斷藥而於產業上亦變得極重要。又，抗體因其對靶分子之特異性而亦作為用於治療疾病之醫藥品受到關注。

作為用以對抗體附加功能之化學修飾，一直採用鹼性磷酸酶(AP)或過氧化酶(HRP)等酶(非專利文獻1~2)、進而用於放射性同位素之碘化或螯合化合物之附加(非專利文獻3)、利用生物素等低分子化合物所進行之修飾(非專利文獻4)。該等修飾主要係經由離胺酸之胺基或半胱胺酸之硫醇基、及經活化之羧基等而進行，該等雖然對於官能基具有特異性，但並非部位特異性，因而存在因抗體對抗原結合部位之修飾等而導致抗體之活性降低等問題、或難以控制所結合之化合物之數量等問題。關於近年來出現之抗體醫藥之抗體藥物複合體(ADC)(非專利文獻5~6)，亦使抗癌劑部位非特異性地與抗體結合，因而存在抗體本身之活性減弱，因抗癌劑之結合數之控制之困難性而導致其後之製劑化之步驟變得複雜等問題。

為了克服此種問題，進行有使用部位特異性地導入有特定官能基之抗體，並對抗體進行修飾。例如，可藉由利用基因工程學之改型將非天然胺基酸(非專利文獻7~9)或游離之半胱胺酸(非專利文獻10~11)導入至特定部位，而實現特定部位之修飾。又，報告有利用轉麩胺醯胺酶(TG)將抗體中之天然或者人工導入之特定麩醯胺作為靶進行修飾(非專利文獻12~13)，但已知其反應產率會根據所導入之化合物之結構或設為靶之麩醯胺殘基之空間環境而大幅度受到影響。進而，亦利用將抗體之Fc上之糖鏈作為靶之修飾技術(非專利文獻14~15)，該等方法雖為部位特異性者，但需要進行糖鏈之氧化修飾，因而存在反應步驟變得複雜等問題。如此，雖然業界逐步開發出部位特異性之抗體修飾技術，但多數情形時需要對抗體本身進行抗體工程學之改型，考慮到該改型所伴隨之抗體之功能降低或開發之高成本，而未必可謂有利之方法。

[先前技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]Imagawa, M. et al., Journal of Applied Biochemistry, 1982, 4, pp. 41-57

[非專利文獻2]Hashida, S et al., Journal of Applied Biochemistry, 1984, 6, pp. 56-63

[非專利文獻3]Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632-2636

[非專利文獻4]Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques,The third edition, Elsevier, USA, 2013

[非專利文獻5]Lewis Phillips, G. D. et al., Cancer Research, 2008, 68, pp. 9280-9290

[非專利文獻6]Boyraz, B. et al., Current Medical Research and Opinion, 2013, 29, pp. 405-414

[非專利文獻7]Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101-16106

[非專利文獻8]Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766-1771

[非專利文獻9]Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351-361

[非專利文獻10]Shen, B. Q. et al., Nature Biotechnology, 2012, 30, pp. 184-189

[非專利文獻11]Bernardes, G. J. et al., Nature Protocols, 2013, 8, pp. 2079-2089

[非專利文獻12]Dennler, P. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 569-578

[非專利文獻13]Jeger, S. et al., Angewandte Chemie 2010, 49, pp. 9995-9997

[非專利文獻14]Bejot, R et al., J. Labelled. Compd. Rad., 2012, 55, pp. 346-353

[非專利文獻15]Zhou, Q. et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, pp. 510-520

因此，需要可特異性地且簡便地修飾抗體之方法。

本發明者等人迄今為止已對特異性地或選擇性地與IgG結合之肽(以下稱為「IgG結合肽」)進行了報告(參照WO2013/027796及WO2008/054030)。為了解決上述問題，本發明者基於IgG結合肽與 IgG Fc之複合體之X射線結晶結構解析，對結合狀態下之IgG結合肽之各胺基酸之位置與IgG Fc之各胺基酸之位置關係進行了詳細研究。進而發現，藉由將能夠與交聯劑結合之胺基酸導入至肽，並利用交聯劑對該胺基酸進行修飾，製備經交聯劑部位特異性地修飾之IgG結合肽，使用該IgG結合肽可對IgG進行修飾，從而完成了本案發明。

即，本發明包括以下之態樣。

(1)一種肽，其特徵在於包含下述式I：(X_1-3)-C-(X₂)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (I)

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且W為色胺酸殘基)

所表示之包含13~17個胺基酸殘基之胺基酸序列，且能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。

(2)如上述(1)所記載之肽，其特徵在於包含下述式II：(X_1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (II)

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，Xaa3為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基)

(3)如上述(1)或(2)所記載之肽，其特徵在於包含下述式III：(X_1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (III)

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，A為丙胺酸殘基，Y為酪胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，E為麩胺酸殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且W為色胺酸殘基)

(4)如上述(1)至(3)中任一項所記載之肽，其中於設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1~3、15~17號之各胺基酸殘基為第1號胺基酸殘基=S、G、F或無，第2號胺基酸殘基=D、G、A、S、P、高半胱胺酸或無，第3號胺基酸殘基=S、D、T、N、E或R，第15號胺基酸殘基=S、T或D，第16號胺基酸殘基=H、G、Y、T、N、D、F、高半胱胺酸或無，第17號胺基酸殘基=Y、F、H、M或無。

(5)如上述(4)所記載之肽，其包含以下1)~15)中之任一胺基酸序列，其中Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，Xaa2為高半胱胺酸。

1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號1)

2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號2)

3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列編號3)

4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號4)

5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號5)

6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號6)

7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號7)

8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號8)

9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列編號9)

10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號10)

11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號11)

12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號12)

13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列編號13)

14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(X(aa2)H(序列編號36)

15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號37)

(6)如上述(1)或(2)所記載之肽，其特徵在於包含下述式IV：D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)

(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa3為丙胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基)所表示之包含13個胺基酸殘基之胺基酸序列，且能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。

(7)如上述(6)所記載之肽，其包含以下1)~4)中之任一胺基酸序列，其中Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸。

1)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號14)

2)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號15)

3)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號16)

4)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(序列編號17)

(8)一種肽，其特徵在於包含下述式V： D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)

(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，G為甘胺酸殘基，L為白胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，Xaa2為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，Xaa3為色胺酸殘基或酪胺酸殘基，Xaa4為組胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，Xaa5為麩胺酸殘基、天冬醯胺殘基、精胺酸殘基、或天冬胺酸殘基，且Xaa6為異白胺酸殘基或纈胺酸殘基)所表示之包含13個胺基酸殘基之胺基酸序列，且能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。

(9)如上述(1)至(8)中任一項所記載之肽，其中肽於外側之2個半胱胺酸(C)殘基間形成二硫鍵，或肽之外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基利用以下之式：

所表示之連結子而連結。

(10)如上述(1)至(9)中任一項所記載之肽，其係利用標記物質進行標記。

(11)如上述(1)至(10)中任一項所記載之肽，其結合有藥劑。

(12)如上述(1)至(11)中任一項所記載之肽，其中Xaa1為離胺酸殘基。

(13)如上述(1)至(12)中任一項所記載之肽，其中Xaa1係經交聯劑修飾。

(14)如上述(13)所記載之肽，其中上述交聯劑為選自由DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)、DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)、DMA(己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMS(辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DSP(二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸)所組成之群中。

(15)如上述(14)之肽，其中上述交聯劑為DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)或DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)。

(16)一種複合體，其係如上述(13)至(15)中任一項所記載之肽與IgG之複合體，並且係藉由經交聯劑修飾之肽與IgG之交聯反應而形成。

(17)一種生產肽與IgG之複合體之方法，其包括將如上述(13)至(15)中任一項所記載之肽與IgG混合而使經交聯劑修飾之肽與IgG進行交聯反應之步驟。

(18)一種醫藥組合物，其包含如上述(1)至(15)中任一項所記載之肽或如上述(16)所記載之複合體。

(19)一種生產2個以上之半胱胺酸殘基利用連結子連結而成之肽的方法，其包括將包含2個以上之半胱胺酸殘基之肽與以下之式：

所表示之化合物(式中，R₁及R₂分別獨立為任意之鹵素原子)混合，而獲得2個以上之半胱胺酸殘基中之硫基利用以下之式：

所表示之連結子連結而成之肽的步驟。

(20)如上述(19)所記載之方法，其中於上述化合物中，R₁及R₂相同，且為Cl、Br、或I。

(21)如上述(19)或(20)所記載之方法，其中上述肽係如上述(1)至(8)及(10)至(15)之任一項所規定之肽。

本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽由於可於短時間內且幾乎無副反應地附加至IgG，故而藉由使各種化合物與該IgG結合肽結合，可利用各種化合物而特異性地且簡便地修飾IgG。又，本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽可直接與野生型IgG等結合，而無需對抗體分子之序列進行改型，因此不會引起抗體分子之基因改型所伴隨之功能降低，從而能夠以更低之成本使各種化合物與抗體結合。進而，所導入之化合物可預先與IgG結合肽結合，且該IgG結合肽與抗體之結合反應可於適當之反應條件下進行，因此於使所導入之化合物與IgG直接反應之步驟中無需先前所必須之複雜反應，又，可防止因該反應所引起之抗體之功能降低。

圖1(A)表示IgG結合肽(C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT(序列編號33))與人類IgG Fc之複合體之結構。IgG結合肽係以空間填充模型表示，IgG Fc係以帶模型表示，以線模型表示Fc之糖鏈。圖1(B)表示經DSG(disuccinimidylglutarate，二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)修飾之IgG結合肽(C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT(序列編號34))與IgG Fc之交聯結構之模型。肽之主鏈係以帶模型表示。肽-Lys8表示C35A-3/15(R8K)之第6號離胺酸殘基，肽-Tyr6-Gly9表示C35A-3/15(R8K)之第4號酪胺酸殘基至第7號甘胺酸殘基。又，Fc-Lys248表示依據EU編號之Fc之Lys248，Fc-Pro247-Asp249表示依據EU編號之Fc之Pro247至Asp249。

圖2表示標記化IgG結合肽與各種蛋白質之混合物之SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)(A)及西方墨點(B)之結果。圖中，DSG表示將與DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)反應之IgG結合肽供於試驗，DSS(disuccinimidylsuberate，二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)表示將與DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)反應之IgG結合肽供於試驗。又，圖中，hIgG表示人類IgG，hIgA表示人類IgA，HAS表示人類血清白蛋白。

圖3表示標記化IgG結合肽與IgG之反應中之反應莫耳比(A)及反應時間(B)之基於ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯免疫吸附測定)所獲得之研究結果。DSS R8K 0min係對IgG之10倍莫耳比之標記化IgG結合肽添加Tris-HCl(pH值7.0)而將NHS基阻斷後，添加至孔中者。No DSS R8K係使用有未與DSS結合之生物素化IgG結合(R8K)肽者，no pep表示未添加肽之對照。

圖4表示使用尺寸排除層析法測定標記化IgG結合肽對各蛋白質(hIgA、hIgG、BSA(牛血清白蛋白))之反應性而獲得之結果。(A)表示測定經DSS修飾之IgG結合肽之反應性而獲得之結果，(B)表示測定經DSG修飾之IgG結合肽之反應性而獲得之結果。

圖5(A)表示於對人類IgG添加以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、或5.0之人類IgG之Fc溶液與溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽並攪拌後，於室溫下使之反應後之液相層析法之結果。圖5(B)表示於以各莫耳比使人類IgG與經DSG修飾之IgG結合肽進行反應之情形時之未反應(波峰2)、1個肽之附加物(波峰3)、及2個肽之附加物(波峰4)之產生量之變化。

圖6表示於對以pH值4.0(A)、pH值5.5(B)、或pH值7.0(C)製備之人類IgG之Fc溶液添加以莫耳比計為1.0之溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽並攪拌後，於室溫下使之反應，反應之1、5、10、或30分鐘後之未反應(波峰2)、1個肽之附加物(波峰3)、及2個肽之附加物(波峰4)之產生量之變化。

圖7A表示藉由經DSG修飾之生物素化IgG結合肽(生物素化IgG結合肽)或生物素化抗人類IgG小鼠抗體(抗hIgG mAb-生物素標記)、及PE標記鏈黴親和素(SA-PE標記)檢測4D5-Fc抗體對乳腺癌細胞株SK-BR3上之HER2抗原之結合而獲得之結果。圖7B表示不添加4D5-Fc抗體並進行相同之實驗(生物素化IgG結合肽+SA-PE標記、或抗hIgG mAb-生物素標記+SA-PE標記)之結果、及使用4D5-Fc抗體與PE標記抗人類IgG小鼠抗體(抗hIgG mAb-PE標記)作為陽性對照之結果。

圖8A表示疊氮化肽抗體與二苯并環辛炔-順丁烯二醯亞胺(Dibenzocyclooctyne-maleimide)化VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody，重鏈抗體可變區)藉由點擊反應而進行連結後之離子交換層析法之結果所獲得之3個主要之波峰(a、b、及c)。圖8B表示於還原狀態下利用SDS-PAGE對所獲得之各個波峰進行分析而獲得之結果。區帶1表示對抗HER2人類IgG抗體進行電泳而獲得之結果，區帶2表示對抗HER2人類IgG抗體-疊氮化肽進行電泳而獲得之結果，區帶3表示對波峰a(未反應之抗HER2人類IgG抗體)進行電泳而獲得之結果，區帶4表示對波峰b(抗HER2人類IgG抗體-1價VHH)進行電泳而獲得之結果，區帶5表示對波峰c(抗HER2人類IgG抗體-2價VHH) 進行電泳而獲得之結果，區帶6表示對VHH進行電泳而獲得之結果，區帶7表示對分子量標記物進行電泳而獲得之結果。

圖9A~C表示使用藉由7-AAD染色去除死細胞後之細胞組分，並使用抗HER2人類IgG抗體(圖9A)、抗IgA受體VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9B)、抗HER2人類抗體-1價VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9C)作為1次抗體，使用最終濃度為50nM之生物素化抗HIS抗體+經PE標記之SA(Serum Albumin，血清白蛋白)之混合物作為2次抗體，對高表現HER2之SK-BR3細胞進行FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting，螢光激活細胞分類術)解析而獲得之結果。圖9D~F表示使用抗HER2人類抗體(圖9D)、抗IgA受體VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9E)、抗HER2人類抗體-1價VHH(圖9F)作為1次抗體，並使用PE標記抗人類IgG多株抗體作為2次抗體，檢測向利用DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)1.3%所進行之分化誘導而高表現IgA受體之HL60細胞之結合而獲得之結果。

圖10-1表示於0-10nM之藥劑(赫賽汀或實施例11中所製備之抗體藥物複合體)之存在下培養SK-BR3細胞，使用細胞測定套組並藉由吸光度(Abs.)對72小時後之細胞數進行評價而獲得之結果。圖中，BG(Back ground，陰影)表示未添加細胞之對照。圖10A表示抗HER2抗體-DM1* 1對SK-BR3細胞之效果，圖10B表示抗HER2抗體-DM1* 2對SK-BR3細胞之效果。

圖10-2係上接圖10-1之圖。圖10C表示抗HER2抗體-DM1* 1對C6細胞之效果，圖10D表示抗HER2抗體-DM1* 2對C6細胞之效果。

圖11表示實施例12中所製備之具有利用二氯丙酮之SS交聯結構的IgG結合肽之合成流程。

圖12表示於0-500nM之藥劑之存在下培養SK-BR3細胞，並利用細胞測定套組對72小時後之細胞數進行評價而獲得之結果。圖12A表示添加有赫賽汀或VcMMAE之情形時之結果，圖12B表示添加有赫賽汀或實施例12中所製備之抗體藥物複合體之情形時之結果。

圖13A表示人類、小鼠、兔、及大鼠之各種IgG抗體之基於SDS-PAGE所獲得之電泳之結果(區帶1：標記物，區帶2：曲妥珠單抗(IgG1)，區帶3：人類IgG1，區帶4：人類IgG2，區帶5：人類IgG3，區帶6：人類IgG4，區帶7：小鼠IgG1，區帶8：小鼠IgG2b，區帶9：小鼠IgG3，區帶10：兔IgG(多株抗體)，區帶11：大鼠IgG1，區帶12：大鼠IgG2b，區帶13：大鼠IgG2c)。圖13B表示將進行電泳後之凝膠轉印至PVDF(polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯)膜，並使用生物素標記IgG結合肽及HRP標記抗生蛋白鏈菌素進行西方墨點所獲得之結果。

<IgG結合肽>

本說明書中所使用之「IgG」係指哺乳動物、例如人類及黑猩猩等靈長類、大鼠、小鼠、及兔等實驗動物、豬、牛、馬、綿羊、及山羊等家畜動物、以及狗及貓等寵物之IgG、較佳為人類之IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本說明書中之IgG進而較佳為人類IgG1、IgG2、或者IgG4、或兔IgG，尤佳為人類IgG1、IgG2、或IgG4。

於一態樣中，本發明係關於一種肽，其特徵在於包含下述式I：(X_1-3)-C-(X₂)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (I)

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且W為色胺酸殘基)

上述式中，N末端或C末端之X_1-3之表述意指半胱胺酸(C或Cys)以外之獨立且任意之胺基酸殘基X連續存在1~3個，構成其之胺基酸殘基為相同或不同之殘基，較佳為包含全部3個並非相同殘基之序列。同樣地，X₂亦意指半胱胺酸(C或Cys)以外之獨立且任意之胺基酸殘基X連續存在2個，構成其之胺基酸殘基為相同或不同之殘基，較佳為包含該2個連續之胺基酸殘基並非相同殘基之序列。

式I之2個半胱胺酸殘基可以二硫鍵進行結合而形成環狀肽。通常，於式I之肽中，外側之2個半胱胺酸殘基以二硫鍵進行結合。或者於式I之肽中，外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基亦可利用以下之式：

所表示之連結子而連結。上述式中之虛線部分意指與硫基之鍵結部分。該連結子對於還原反應等較通常之二硫鍵穩定。該肽例如可藉由以下<生產半胱胺酸殘基利用連結子連結而成之肽的方法>中所記載之方法而製備。

將於式I之肽之胺基酸序列中進而對胺基酸殘基X進行特定之式I'及式I"所表示之肽示於以下。

即，式I'所表示之肽之特徵在於包含 (X_1-3)-C-(X₁)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X_1-3) (I')

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，Y為酪胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，N為天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且W為色胺酸殘基)

式I"所表示之肽之特徵在於包含(X_1-3)-C-A-(X₁)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (I")

(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，A為丙胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，E為麩胺酸殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基)

又，將於式I之肽之胺基酸序列中進而對胺基酸殘基X進行特定之式II所表示之肽示於以下。

即，式II所表示之肽之特徵在於包含(X_1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (II)

於上述式I'、式I"及式II之肽之胺基酸序列中設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1號及第2號以及第16號及第17號胺基酸殘基X亦可缺失，此種肽包含13個胺基酸長度。

本說明書中所使用之所謂「設為17個胺基酸殘基之情形時之」係於以胺基酸編號稱呼肽之胺基酸殘基時，用以針對式I之肽等自作為最長之胺基酸長度之17個殘基之N末端起依序自第1號至第17號進行編號而簡便地進行表述之用語。

又，將於式I之肽之胺基酸序列中進而對胺基酸殘基X進行特定之式III所表示之肽示於以下。

即，式III所表示之肽之特徵在於包含(X_1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (III)

於上述式III之肽之胺基酸序列中設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1號及第2號、以及第16號及第17號胺基酸殘基X亦可缺失，此種肽包含13個胺基酸長度。

進而，上述各式之肽之胺基酸序列之半胱胺酸(C)以外之胺基酸殘基、即設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1~3、5、6、15~17號之各胺基酸殘基較佳為自以下中選擇。此處，各大寫字母之羅馬字母係胺基酸之單字符表述：第1號胺基酸殘基=S、G、F或無，第2號胺基酸殘基=D、G、A、S、P、高半胱胺酸或無，第3號胺基酸殘基=S、D、T、N、E或R，第15號胺基酸殘基=S、T或D，第16號胺基酸殘基=H、G、Y、T、N、D、F、高半胱胺酸或無，第17號胺基酸殘基=Y、F、H、M或無。

第5號胺基酸殘基=A或T，第6號胺基酸殘基=Y或W。

又，將於式I之肽之胺基酸序列中進而對胺基酸殘基X進行特定之式IV所表示之肽示於以下。

即，式IV所表示之肽之特徵在於包含D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)

(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa3為丙胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且 Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基)所表示之包含13個胺基酸殘基之胺基酸序列，且能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。

於以下1)~19)中列舉式I之肽之若干具體例，但並不受該等所限制：1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號1)、2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號2)、3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列編號3)、4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號4)、5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號5)、6)GDDCAVH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號6)、7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號7)、8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號8)、9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列編號9)、10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號10)、11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號11)、12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號12)、13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列編號13)、14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(序列編號36)、15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號37)、16)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號14)、17)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號15)、18)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號16)、及19)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(序列編號17)，(式中，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，Xaa2為高半胱胺酸，較佳為高半胱胺酸彼此相互形成二硫鍵)。

作為式I之肽之較佳之具體例，可列舉：1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號1)、2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號2)、13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列編號13)、14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(序列編號36)、及15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號37)

(式中，Xaa1為離胺酸殘基，Xaa2為高半胱胺酸，較佳為半胱胺酸彼此及/或高半胱胺酸彼此相互形成二硫鍵)。

又，本發明之肽之特徵在於包含下述式V：D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)

(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，G為甘胺酸殘基，L為白胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，Xaa2為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，Xaa3為色胺酸殘基或酪胺酸殘基，Xaa4為組胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，Xaa5為麩胺酸殘基、天冬醯胺殘基、精胺酸殘基、或天冬胺酸殘基，且Xaa6為異白胺酸殘基或纈胺酸殘基)所表示之包含13個胺基酸殘基之胺基酸序列作為廣義之一次結構，且能夠與人類IgG及/或兔IgG 結合。

式V之2個半胱胺酸殘基可以二硫鍵進行結合而形成環狀肽。通常，式V之肽之外側之2個半胱胺酸殘基以二硫鍵進行結合。或者，於式V之肽中，外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基亦可利用以下之式：

於以下20)~31)中列舉式V之肽之若干具體例，但並不受該等所限制：20)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列編號18)、21)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(序列編號19)、22)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(序列編號20)、23)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(序列編號21)、24)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號22)、25)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(序列編號23)、26)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(序列編號24)、27)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列編號25)、28)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(序列編號26)、29)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(序列編號27)、30)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(序列編號28)、及 31)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(序列編號29)，(式中，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸)。

如上所述，與本發明相關之上述式之肽之特徵在於：於各胺基酸序列中具有隔開之至少2個半胱胺酸(C)殘基，並以可於該半胱胺酸殘基間形成二硫鍵之方式配置半胱胺酸殘基，較佳之肽亦可為2個半胱胺酸殘基以二硫鍵進行結合而形成環狀肽，且於各半胱胺酸殘基之N末端側及C末端側具有1或2個半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基。於在各半胱胺酸殘基之N末端側及C末端側具有1或2個胺基酸殘基之情形時，設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1~2、16~17號之各胺基酸殘基為上述例示者。

如上所述，於本發明之肽中，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、及麩胺酸殘基等蛋白質構成胺基酸、以及二胺基丙酸及2-胺基辛二酸等非蛋白質構成胺基酸，較佳為離胺酸殘基。Xaa1較佳為能夠利用下述交聯劑進行修飾。於本說明書中，所謂「非蛋白質構成胺基酸」係指於活體內無法用於構成蛋白質之胺基酸。為了提高利用交聯劑對本發明之肽進行修飾時之部位特異性，本發明之肽較佳為於其序列中完全不具有或幾乎不具有(例如僅具有1個或2個)與Xaa1相同之殘基。例如，於Xaa1為離胺酸殘基之情形時，本發明之肽較佳為於其序列中於Xaa1以外之部位完全不具有或幾乎不具有離胺酸殘基。

本發明之肽與人類IgG之結合親和性與和其他人類免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)之結合親和性相比高約10倍以上、較佳為約50倍以上、更佳為約200倍以上。與本發明之肽和人類IgG之結合相關之解離常數(Kd)可藉由表面電漿子共振譜分析(例如使用BIACORE系統)進行確定，例如為未達1×10^-1M~1×10^-3M，較佳為未達1×10^-4M，更佳為未達1×10^-5M。

本發明之IgG結合肽係與IgG之Fc區域結合。本發明之IgG結合肽如下述實施例中所表示般，於上述Xaa1中，與IgG Fc之特定之區域、即人類IgG Fc中之依據Eu編號之Lys248殘基(以下，於本說明書中亦簡記為「Lys248」，相當於人類IgG CH2(序列編號30)之第18號殘基)或Lys246殘基(以下，於本說明書中亦簡記為「Lys246」，相當於人類IgG CH2(序列編號30)之第16號殘基)、較佳為Lys248接近。

本發明之肽可藉由慣用之液相合成法、固相合成法等肽合成法、利用自動肽合成機所進行之肽合成等(Kelley et al.,Genetics Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.eds.,Plen μm Press NY.(1990)Vol.12,p.1-19；Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis(1989)W.H.Freeman C0.；Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：p.5132，「新生化學實驗課程1 蛋白質IV」(1992)日本生化學會編，東京化學同人)進行製造。或者，亦可藉由使用有編碼本發明之肽之核酸的基因重組法或噬菌體顯示法等而製造肽。例如可將編碼本發明之肽之胺基酸序列的DNA(deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)組入至表現載體中，將表現載體導入至宿主細胞中並對細胞進行培養，藉此製造目標之肽。所製造之肽可藉由常用方法、例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)等層析法、硫酸銨區分、超過濾、及免疫吸附法等進行回收或精製。

於肽合成中，例如準備保護了各胺基酸(不論是天然或非天然)之欲鍵結之α-胺基與α-羧基以外之官能基之胺基酸類，於各個胺基酸之α-胺基與α-羧基之間進行肽鍵形成反應。通常，經由適當之間隔基或連結子預先將位於肽之C末端之胺基酸殘基之羧基與固相結合。選擇性地去除如此而獲得之二肽之胺基末端之保護基，並與下一個胺基酸之α-羧基之間形成肽鍵。連續地進行此種操作而製造側基經保護之肽，最後去除所有保護基，並自固相分離。保護基之種類或保護方法、肽結合法之詳細內容詳細記載於上述文獻中。

藉由基因重組法所進行之製造例如可藉由包括編碼本發明之肽之DNA插入至適當之表現載體中，將載體導入至適當之宿主細胞中並對細胞進行培養，自細胞內或細胞外液回收目標之肽的方法而進行。載體並無限定，例如為質體、噬菌體、黏接質體、噬菌粒、及病毒等載體。

作為質體載體，並無限定，可列舉源自大腸桿菌之質體(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草桿菌之質體(例如pUB110、pTP5等)、及源自酵母之質體(例如YEp13、YCp50等)等。

作為噬菌體載體，並無限定，可列舉T7噬菌體顯示載體(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及λ噬菌體載體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作為病毒載體，並無限定，例如可列舉反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、牛痘病毒、及仙台病毒等動物病毒、以及桿狀病毒等昆蟲病毒等。作為黏接質體載體，並無限定，可列舉Lorist 6、Charomid 9-20、及Charomid 9-42等。

作為噬菌粒載體，並無限定，例如已知有pSKAN、pBluescript、pBK、及pComb3H等。載體可以能夠表現目標DNA之方式包含調節序列、或用以選擇包含目標DNA之載體的選擇標記物、用以插入目標DNA之多選殖位點等。此種調節序列中包含啟動子、促進子、終止子、S-D序列或核糖體結合部位、複製起始點、及poly A位點等。又，選擇標記物例如可使用安比西林耐受性基因、新黴素耐受性基因、康黴素耐受性基因、及二氫葉酸還原酶基因等。用以導入載體之宿主細胞為大腸桿菌或枯草桿菌等細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞(例如哺乳動物細胞)、及植物細胞等，向該等細胞之轉形或轉染例如包括磷酸鈣法、電穿孔法法、脂轉染法、粒子槍法、及PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)法等。轉形細胞之培養係依據宿主生物之培養所使用之通常方法而進行。例如大腸桿菌或酵母細胞等微生物之培養液含有宿主微生物可合成代謝之碳源、氮源、及無機鹽類等。

為了使本發明之肽之回收變得容易，較佳為使藉由表現所生成之肽分泌至細胞外。此可藉由將能夠實現自該細胞分泌肽之編碼肽序列之DNA結合於編碼目標肽之DNA之5'末端側而進行。轉移至細胞膜之融合肽被訊號肽酶所切斷，分泌目標肽並釋放至培養基中。或者，亦可對蓄積於細胞內之目標肽進行回收。於該情形時，物理性或化學性地破壞細胞，並使用蛋白質精製技術而回收目標肽。

因此，本發明進而亦關於一種編碼本發明之肽之核酸。此處，核酸包含DNA或RNA(RibonucleicAcid，核糖核酸)(例如mRNA(Messenger RNA，信使核糖核酸))。

於使本發明之IgG結合肽與其他蛋白質融合之情形時，可於分別製備IgG結合肽與其他蛋白質後，視需要使用連結子使IgG結合肽與蛋白質融合，亦可藉由基因重組法視需要添加適當之連結子，而以融合蛋白質之形式製作。於該情形時，較佳為以無損本發明之IgG結合肽與IgG之結合性之方式製作融合蛋白質。

<經交聯劑修飾之肽>

於一態樣中，本發明中之上述IgG結合肽較佳為經交聯劑修飾。

如上所述，本發明之IgG結合肽如下述實施例中所表示般，於上述Xaa1中，與IgG Fc之特定之區域、即人類IgG Fc中之依據Eu編碼之 Lys248或Lys246、較佳為Lys248接近。因此，藉由利用交聯劑對本發明之IgG結合肽之Xaa1進行修飾，並使之與IgG進行交聯反應，可於IgG結合肽之Xaa1與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間部位特異性地形成交聯結構。如上所述，藉由利用交聯劑及各種化合物對本發明之IgG結合肽之Xaa1進行修飾，並使之與IgG進行交聯反應，可特異性地且簡便地將各種化合物導入至IgG。又，根據本發明，由於可經由IgG結合肽而導入化合物，故而可將各種結構之化合物導入至IgG。進而，本發明之方法由於所獲得之產物之產率較高，又，不伴有抗體本身之改型，故而亦具有使抗體之功能降低之可能性較低之優點。

本發明之IgG結合肽亦可用於人類以外之動物、較佳為哺乳動物之IgG。於該情形時，關於本發明之IgG結合肽所結合之IgG中之部位，只要為閱讀了本說明書之從業者，則可藉由對例如人類IgG之序列與其他動物之IgG之序列進行配對而容易地特定。

於本發明中，所謂「交聯劑」係用以藉由共價鍵結使本發明之IgG結合肽與IgG Fc連結之化學物質。關於本發明之交聯劑，只要為從業者，則可適當選擇，可設為至少具有2處可與所需之胺基酸(例如離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸、及精胺酸等)鍵結之部位的化合物。作為該例，並無限定，可列舉：DSG(disuccinimidyl glutarate、二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)、DSS(disuccinimidyl suberate、二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)等包含較佳為2個以上之琥珀醯亞胺基之交聯劑、DMA(dimethyl adipimidate‧2 HCl、己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(dimethyl pimelimidate‧2 HCl、庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DMS(dimethyl suberimidate‧2 HCl、辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)等包含較佳為2個以上之亞胺酸部分的交聯劑、以及DTBP(dimethyl 3,3'- dithiobispropionimidate‧2HCl、3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)及DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸)等具有SS鍵之交聯劑。

本發明之IgG結合肽亦可藉由其他功能性物質、例如IgA或VHH等抗體、標記物質及/或其他藥劑進行修飾。IgG結合肽與其他功能性物質之連結可藉由從業者所公知之方法、例如疊氮基與二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne)之反應、或順丁烯二醯亞胺基與巰基之反應等而進行。於利用標記物質進行標記之情形時，本發明之IgG結合肽會與IgG形成複合體，藉此可經由該標記物質進行IgG之檢測或定量。標記物質並無限定，例如包括螢光色素、化學發光色素、放射性同位素(例如放射性碘或放射性同位素金屬離子之螯合物、例如DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)或去鐵胺之螯合物)、以及生物素及GFP(綠色螢光蛋白質)等螢光蛋白質、發光蛋白質、以及過氧化酶等酶，較佳之標記物質之例為螢光素及FITC(Fluorescein Isothiocyanate，異硫氰酸螢光素)等螢光素衍生物、羅丹明及四甲基羅丹明等羅丹明衍生物、以及德克薩斯紅等螢光色素。於利用其他藥劑對本發明之肽進行修飾之情形時，作為藥劑，並無限定，例如可列舉：奧瑞斯他汀E等奧瑞斯他汀、美登素(Maytansine)、Emtansine、阿黴素(Doxorubicin)、博萊黴素(Bleomycin)、或該等之衍生物等抗癌劑；以及能夠與血腦障壁上之受體結合而向中樞神經移動之藥劑、或能夠與癌細胞等結合而使抗體向細胞內移動之藥劑等靶向劑。於連結有藥劑之情形時，本發明之IgG結合肽例如可藉由與用作醫藥抗體之IgG形成複合體而提高疾病之治療效果。

本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽例如可藉由使依據上述<IgG結合肽>之項目中所記載之方法而獲得之IgG結合肽與交聯劑進行反應而製造。於該情形時，需要特異性地對IgG結合肽中之上述Xaa1之胺基酸殘基之側鏈進行修飾，該情況例如可藉由選擇Xaa1之種類與交聯劑之組合而進行。例如，DSS或DSG等包含琥珀醯亞胺基之交聯劑會與離胺酸殘基之側鏈及多肽之N末端所存在之一級胺進行反應，故而藉由將IgG結合肽之N末端封阻，並且使之與DSS或DSG進行反應，可利用DSS或DSG僅對離胺酸殘基之側鏈特異性地進行修飾。只要為從業者，則可適當選擇此種胺基酸殘基與交聯劑之組合。

本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽例如亦可藉由使用經交聯劑修飾之胺基酸殘基進行肽合成而製造。同樣地，於利用標記物質及/或其他藥劑對IgG結合肽進行修飾之情形時，亦可藉由使用附加有該等修飾之胺基酸殘基進行肽合成，而製備經標記物質及/或其他藥劑修飾之IgG結合肽。

<交聯反應>

於一態樣中，本發明係關於一種包括將本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG進行混合之步驟的生產IgG結合肽與IgG之複合體之方法。根據本步驟，可於經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應。交聯反應尤其可於IgG結合肽之上述Xaa1之胺基酸殘基與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間部位特異性地產生。

關於該混合步驟之條件，只要為於在本發明之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應之條件下進行者，則無特別限定。例如，可藉由將本發明之IgG結合肽與IgG於適當之緩衝液中於室溫(例如約15℃~30℃)下進行混合而進行反應。該混合步驟亦可視需要適量添加促進交聯反應之觸媒。

該混合步驟中之本發明之IgG結合肽與IgG之混合比率並無特別限定。本發明之IgG結合肽與IgG之莫耳比率例如可設為1：1~20：1、較佳為2：1~20：1或5：1~10：1。

關於該混合步驟中之混合時間(反應時間)，只要會於本發明之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應，則無限定，例如可設為1分鐘~5小時、較佳為10分鐘~2小時或15分鐘~1小時。

生產本發明之IgG結合肽與IgG之複合體的方法亦可視需要進而包括如下步驟，即自進行過上述步驟之混合物中，將雜質、例如未反應之IgG結合肽、IgG、及試劑等分離，而對該複合體進行精製。該步驟可藉由本領域公知之方法、例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、及HPLC等層析法等而進行。

<複合體>

於一態樣中，本發明係關於一種本發明之IgG結合肽與IgG之複合體。該複合體可藉由上述交聯反應而形成。因此，本發明較佳為關於一種IgG結合肽之上述Xaa1之胺基酸殘基與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間經由交聯劑部位特異性地結合而成之IgG結合肽與IgG之複合體。

本發明之複合體係藉由部位特異性之交聯反應而形成，因此該交聯反應對IgG之活性產生負面影響之可能性較小。又，藉由將經修飾之IgG結合肽連結於IgG，可對IgG附加新的功能性。例如若使經標記物質修飾之IgG結合肽與IgG結合，則可經由該標記物質進行IgG之檢測或定量。標記物質之例如上所述，因此此處省略記載。又，例如若使經藥劑修飾之IgG結合肽與作為醫藥抗體之IgG結合，則可提高IgG之疾病之治療效果。藥劑之例如上所述，因此此處省略記載。

<醫藥組合物或診斷劑>

於一態樣中，本發明係關於一種包含上述IgG結合肽、上述經交聯劑修飾之IgG結合肽、或上述經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG之複合體之醫藥組合物或診斷劑。於包含於醫藥組合物中之情形時，IgG結合肽例如較佳為經上述藥劑修飾，於包含於診斷劑中之情形時， IgG結合肽例如較佳為經上述標記物質修飾。

作為成為本發明之醫藥組合物及診斷劑之對象的疾病，並無限定，例如可列舉可利用抗體進行靶向之疾病或障礙，較佳為癌症、炎症性疾病、感染症、及神經退化性疾病。

本發明之醫藥組合物可利用經口投予或非經口投予(例如靜脈注射、肌肉注射、皮下投予、腹腔內投予、直腸投予、或經黏膜投予等)進行投予。又，本發明之醫藥組合物可根據投予路徑而製成適當之劑型。具體而言，可製備為顆粒劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、靜脈注射、動脈注射、或者肌肉注射用之注射劑、點滴劑、外用劑、或栓劑等各種製劑形態。關於投予方法及劑型，只要為從業者，則可根據患者之性別、年齡、體重、症狀等而適當選擇。

本發明之醫藥組合物可依據常用方法進行製劑化(例如望參照Remington's Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton，美國)，亦可一併包含醫藥上所容許之載體或添加物。

作為可包含於本發明之醫藥組合物中之載體及醫藥添加物之例，可列舉水、醫藥上容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、及容許作為醫藥添加物之界面活性劑等。

實際之添加物係根據本發明之醫藥組合物之劑型而自上述中單獨或適當組合後選擇，但並不限定於該等。例如於用作注射用製劑之情形時，可使用將本發明之IgG結合蛋白質或IgG結合蛋白質與IgG之複合體溶解於溶液、例如生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等中，並向其中添加有容器吸附防止劑、例如Tween 80、Tween 20、明膠、人類血清白蛋白等者。或者，為了製成於使用前溶解並再構成之劑型，亦可為經冷凍乾燥者，作為用於冷凍乾燥之穩定劑，例如可使用甘露糖醇、葡萄糖等糖醇及/或糖類。

本發明之醫藥組合物之有效投予量及投予間隔可根據患者之性別、年齡、體重、及症狀等而適當選擇。

投予本發明之醫藥組合物之時期不論是產生上述疾病之臨床症狀之前或之後，均可預防性地投予，亦均可治療性地投予。

<生產半胱胺酸殘基利用連結子連結而成之肽的方法>

於一態樣中，本發明係關於一種生產半胱胺酸殘基利用連結子連結而成之肽的方法。本方法包括如下步驟，即將包含2個以上、較佳為2個半胱胺酸殘基之肽與以下之式：

所表示之化合物(式中，R₁及R₂分別獨立為任意之鹵素原子)進行混合，而獲得2個以上、較佳為2個半胱胺酸殘基中之硫基利用以下之式：

所表示之連結子連結而成之肽。上述式中之虛線部分意指與硫基之鍵結部分。半胱胺酸殘基利用該連結子連結而成之肽對於還原反應等較經通常之二硫鍵連結之肽穩定。

於上述化合物中，R₁及R₂較佳為選自由F、Cl、Br、及I所組成之群中，進而較佳為選自由Cl、Br、及I所組成之群中。R₁及R₂較佳為相同，進而較佳為R₁及R₂均為Cl。

本方法中之混合步驟之條件只要為於肽之半胱胺酸殘基間產生連結反應之條件，則無特別限定。例如可藉由將肽與上述化合物於適當之緩衝液、例如包含氯化胍之緩衝液中於室溫(例如約15℃~30℃)下進行混合而進行反應。該混合步驟亦可視需要適量添加促進連結反應之觸媒而進行。

本方法之混合步驟中之肽與化合物之混合比率並無特別限定。肽與化合物之莫耳比率例如可設為1：0.2~1：10、較佳為1：0.5~1：5或1：1~1：2。

關於該混合步驟中之混合時間(反應時間)，只要會於肽之半胱胺酸殘基間產生連結反應，則無限定，例如可設為1分鐘~5小時、較佳為10分鐘~2小時或15分鐘~1小時。

本發明之方法亦可視需要進而包括如下步驟，即自進行過上述步驟之混合物中，將雜質、例如未反應之肽及化合物等分離，而對連結有半胱胺酸殘基之肽進行精製。該步驟可藉由本領域公知之方法、例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、及HPLC等層析法等而進行。

本方法中所使用之肽之種類只要為半胱胺酸殘基能夠利用上述化合物進行連結者，則無特別限定，例如可列舉本說明書中所記載之IgG結合肽或WO2013/027796之說明書中所記載之肽。作為WO2013/027796之說明書中所記載之肽之例，可列舉將本說明書中所記載之IgG結合肽之Xaa1殘基置換為精胺酸殘基(R)之肽。

[實施例]

[實施例1：IgG結合肽與IgG之複合體之X射線結晶結構解析]

<方法>

(1)IgG結合肽溶液之製作

藉由基於F-moc法之肽固相合成法並依據常用方法而製備具有G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH₂之序列(序列編號31，其中HC為高半胱胺酸，第4號與第14號之2個Cys、第2號與第16號之2個高半胱胺酸分別於分子內形成二硫鍵)之環狀高半胱胺酸肽。將所製備之IgG結合肽0.8mg之粉末溶解於24μL之100%二甲基亞碸(和光純藥)中，而製備IgG結合肽溶液。

(2)Fc與IgG結合肽之複合體之製作

於包含10mM EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)及1mM L-半胱胺酸之20mmol/L磷酸緩衝液(pH值7.0)中於37℃下使用Papain(羅氏公司製造)將人類IgG(中外制藥)之鉸鏈部分切斷。繼而，使用陽離子交換管柱(TSKgel SP5-PW(Tosoh))於流速1mL/min、20mM乙酸鈉緩衝液(pH值5.0)中利用0-0.3M NaCl之梯度進行溶出對人類IgG Fc進行精製。將包含16mg/mL之人類IgG Fc之63μL之溶液(0.1M氯化鈉(和光純藥)、0.04M 2-嗎啉乙磺酸(和光純藥)(pH值6.0))與上述(1)中所製作之IgG結合肽溶液2μL進行混合，而製備Fc與IgG結合肽之複合體溶液。

(3)Fc與IgG結合肽之複合體之結晶之製作

Fc與IgG結合肽之複合體之結晶可藉由沈滴蒸氣擴散法而獲得。即，使用作為結晶化用自動儀之HydoraII+(Matrix公司製造)，將上述(2)中所製作之Fc與IgG結合肽之複合體溶液0.3μL和結晶化劑(20%聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich)、0.2M碘化鉀(和光純藥)(pH值6.9))0.3μL於智能結晶化板(VERITAS公司製造)之S1孔上進行混合，而製成結晶化滴劑。分注上述結晶化劑70μL作為貯備溶液。利用PowerSeal CRISTAL VIEW(Greiner Bio-One公司製造)將板密閉後，於20℃之恆溫槽內靜置約2週，而獲得結晶。

(4)Fc與IgG結合肽之複合體之結晶之X射線繞射強度資料之收集

將上述(3)中所獲得之結晶移動至穩定化母液(22%聚乙二醇3350、0.2M碘化鉀、0.1M氯化鈉、25%甘油(w/v)、0.04M 2-嗎啉乙磺酸(pH值6.0))中，於-170℃之氮氣氣流下急速冷凍，並利用振動法測定X射線繞射資料。於X射線之波長為1埃、振動角為1°/幀下實施。繼而，使用繞射強度資料處理程式HKL2000(HKL Research公司製造)，以分辨率3.0埃對繞射強度資料進行處理。其結果為，結晶之空間群為P21，晶格常數為a=66.1埃、b=60.5埃、c=69.5埃、α=γ=90°、β=101.3°。所獲得之資料之完整性(Completeness)為99.9%，Rmerge為13.8%。

(5)Fc與IgG結合肽之複合體之結晶結構之確定

針對DCAYHRGELVWCT(序列編號33)，利用CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)所包含之程式Phaser對上述(4)中所獲得之繞射強度資料嘗試進行基於分子置換法之相位確定。分子置換法之檢索模型係利用於蛋白質資料庫(PDB、URL：http：//www.rcsb.0rg/pdb/)中以PDB登記碼：1DN2登記之Fc部分之模型。其結果為，於非對稱單位中發現了1分子之模型。繼而反覆實施使用有CCP4所包含之結構精密化程式Refmac5之結構精密化與使用有作為模型構件程式之X-tal view之模型之修正，而獲得Fc與IgG結合肽(DCAYHRGELVWCT(序列編號33))之複合體之結晶結構。於Fc之肽結合部位觀測到相當於IgG結合肽之電子密度。所確定之結晶結構之正確性之指標即R因數為0.216。進而，根據精密化之階段中未加入至計算中之相當於全反射之5%之結構因數而計算之Rfree因數為0.317。

(6)交聯結構模型之製作

基於上述X射線結晶解析之結構，於計算科學軟體MOE(Molecular Operating Environment)上製作交聯結構模型。於將DCAYHRGELVWCT(序列編號33)之第6號胺基酸置換為Lys後，以將該Lys之ε胺基與抗體Fc之第248號Lys之ε胺基之間相連之形式將利用DSG或DSS所獲得之交聯結構進行模型化。

<結果>

如圖1A所示，認為IgG結合肽係結合於與蛋白質A之結合部位重疊之CH2與CH3域之交界區域，並以與已經報告之IgG結合肽Fc-III(DeLano,W.L.et al.,Science,2000,287,pp.1279-1283)類似之形式與IgG結合。IgG結合肽與Fc之特徵性之相互作用在於IgG結合肽之第8號殘基Arg之側鏈之胍基以2.91埃與Fc之Glu380(基於EU編號，以下相同)之側鏈之羧酸鹽結合。該Glu380之側鏈於人類IgG Fc中與Lys248鹽結合而形成分子內之鹽結合之網狀，IgG結合肽之Arg8與Fc之Lys248經由與Fc之Glu380之相互作用而接近。因此，構思出將IgG結合肽之第8號殘基Arg換為Lys，並以類似於該鹽結合之網狀結構之形式利用交聯劑將肽之Lys8與抗體之Lys248之側鏈之胺基進行交聯。實際上，以IgG結合肽與人類IgG Fc之複合體結構為基礎，製作利用DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)或者DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)所形成之交聯結構之模型，結果認為能夠於空間上不伴有抗體之主鏈結構之變形而導入交聯劑(圖1B)。

[實施例2：標記用肽之製備與特性]

<方法>

利用生物素或者5/6TAMURA琥珀醯亞胺酯(AnaSpec,Inc.)(螢光色素)對胺基進行修飾之胺基-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號2)(其中，C末端經醯胺化)係藉由Fmoc固相合成法並依據常用方法而合成。於去除保護基後，於pH值 8.5之水溶液中於氧化條件下形成分子內S-S鍵，使用逆相HPLC並藉由流速1.0ml/min、包含0.1%之TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)之10%至60%之乙腈之梯度進行溶出對具有分子內S-S鍵之肽進行精製。

於將包含1mM之經精製之IgG結合肽的DMF(Dimethylformamide，二甲基甲醯胺)溶液100μL與100mM之DSS或DSG(Thermo Fisher Scientific公司)之乙腈溶液100μL進行混合後，於室溫下反應一晚。利用0.1% TFA將反應物稀釋至2.5倍後，噴射至Waters公司製造之μ Bondasphere 5C18 100埃(直徑3.9mm×150mm)，並以包含0.1% TFA之4%至60%之乙腈之梯度進行溶出。關於交聯劑對所獲得之產物之附加，於連接有BEH300 C18(1.7μm、直徑2.1mm×50mm)管柱之LC-質譜儀(Acquity SQD UPLC system,Waters Corp.)上以包含0.1%甲酸之4%至60%之乙腈之梯度進行溶出，並藉由波峰之分子量之測定而確認。

所獲得之標記化試劑肽之親和性解析係於藉由添加十分之一量之1M Tris-HCl(pH值=7.0)使之反應15min而將NHS基水解後，藉由以下之方法而進行。於將0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺)與0.1M磺基-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide，磺基-N-羥基琥珀醯亞胺)進行等量混合後，向設置於BIAcoreT200(GE healthcare)之CM5感測晶片上以10μl/ml之流速對感測晶片噴射7分鐘，藉此使感測晶片活化，並於pH值4.0(10mM乙酸Na)之條件下以固定化量以RU值計成為4000~5000之方式將IgG固定化。一面使用HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005% Tween 20、3mM EDTA、pH值7.0)，一面以流速50μl/ml噴射10nM至2μM之濃度之肽180秒，藉此監測結合反應，其後利用緩衝液洗淨600sec，藉此測定解離反應。結合參數之解析係使用BIAevalution T100軟體而進行。

<結果>

為了研究交聯結構之導入是否會對IgG結合肽之特異性及親和性產生影響，利用SPR(Surface Plasmon Resonance，表面電漿子共振)解析測定導入有交聯結構之IgG結合肽向IgG之結合力(表1)。將第8殘基之精胺酸置換為離胺酸之IgG結合肽(以下亦稱為I型(R8K))對人類IgG之親和性為131nM(Kd)，與置換前之IgG結合肽(以下亦稱為I型)相比，親和性降低了10倍。於使各交聯劑結合於I型(R8K)肽而成者中，關於對人類IgG之親和性，I型(R8K)-DSG-OH約為330nM(Kd)，I型(R8K)-DSS-OH約為390nM(Kd)，並未發現因結合交聯劑引起之親和性之大幅度減少。不論為何種肽，均具有以Kd值計為μM以下之親和性，因此認為可實現特異性充分之標記化。

[實施例3：利用IgG結合肽之人類IgG-Fc之特異性修飾]

<方法>

藉由與實施例2相同之方法製備利用DSS或DSG對於N末端附加有生物素-PEG4之IgG結合肽(TypeI(R8K))進行修飾之標記化試劑肽，並使之與人類IgG Fc進行反應，研究人類IgG Fc之標記化反應。即，藉由與實施例2相同之方法於逆相管柱中對過剩之與DSS或DSG反應後之IgG結合肽(R8K)(200pmol/5μL in 0.1% TFA)進行精製後，於減壓下將乙腈去除，其後添加約1/8之0.5M Na₂HPO₄進行中和，並立刻以莫耳比10倍量添加至蛋白質樣本(hIgG(中外製藥)、hIgA(Athens Research&Technology)、HSA(Sigma-Aldrich)、或血清(自健康者採血所得者))(各40pmol/5μL，血清係使用利用PBS(Phosphate-buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)稀釋10倍而成者)中，而將最終量製成以PBS計為20μL後，於室溫下放置5分鐘。其後，添加1μl之1M Tris-HCl(pH值=7.0)而使反應停止後，添加4xSDS樣本溶液6.7μl及2-巰基乙醇1.4μl(最終5%)，於95℃下處理10min，其後使用預製凝膠SuperSep^TMAce,5-20%(和光純藥)進行SDS-PAGE。電泳後之凝膠於使用Hoefer Semiphor TE70 Trans-Blot System以35mA、60分鐘轉印至PVDF膜後，利用0.5%BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)進行阻斷。經生物素化肽標記之蛋白質係使用SA偶聯HRP(稀釋1000倍，Vector Laboratories)並藉由化學發光試劑(ImmunoStar(註冊商標)Basic，和光純藥)而檢測。

<結果>

如圖2B所示，於西方墨點法中，僅於與IgG反應之情形時觀察到視為複合體之帶，因此得知與DSG或DSS反應後之IgG結合肽均未與IgA或HAS、血清中之IgG以外之蛋白質結合，而選擇性地與IgG結合。

[實施例4：IgG結合肽對IgG之反應條件之研究]

<方法>

(1)反應莫耳比之研究

於96孔微盤(Nunc(註冊商標)MaxiSorp)之孔中，將包含各蛋白質 (IgG(中外製藥)、IgA(Athens Research & Technology)、或牛明膠(和光純藥))(50ng(0.33pmol)/μl/well)之0.1M NaHCO₃溶液添加至盤中並於室溫下放置一晚，藉此使各蛋白質吸附於盤之表面，並利用0.5% BSA進行阻斷後，向各孔中添加以與實施例2相同之方式製備之經DSG修飾之生物素化IgG結合肽(以莫耳比計為0,1,2,5,10)，經過1小時後添加3μL之1M Tris-HCl(pH值7.0)而使反應停止。添加50μL之利用0.5%BSA稀釋2000倍之SA-HRP(Vector Laboratories)，並於室溫下反應一小時後，利用0.1%PBST(Phosphate-buffered Saline with Tween 20，磷酸鹽緩衝液+Tween20)洗淨5次，其後HRP(Horseradish Peroxidase，辣根過氧化酶)之顯色使用TMB(Tetramethyl benzidine，四甲基聯苯胺)溶液(Wako Chemicals)進行5分鐘之顯色反應後，利用ELISA讀板儀(型號680微盤讀取器(Bio-Rad))測定450nm之吸光度。

(2)反應時間之研究

向藉由50ng/50μL之溶液於4℃下固定化一晚而獲得之hIgG(50ng)中以莫耳比2添加經DSG修飾之生物素化IgG結合肽，並於各反應時間(0~60分鐘)內添加3μL之1M Tris-HCl(pH值7.0)而使反應停止。結合之檢測係與(A)同樣地進行。

<結果>

使用DSS標記化IgG結合肽，並利用ELISA對取決於與抗體反應之莫耳數及反應時間之差異之反應效率進行研究(圖3)。即，使固定於塑膠板之IgG結合肽之莫耳比自1變化至10並使其與hIgG反應，結果於大致莫耳比5時發現飽和，因此認為若添加莫耳比5左右之肽試劑，則抗體之標記化充分(圖3A)。於未經DSS修飾之生物素化IgG結合(R8K)肽(NO DSS R8K)中雖發現極弱之結合，但認為係藉由利用非共價鍵結合之肽所形成之結合活性。進而，即便過量添加標記化IgG結合肽試劑，亦完全未檢測到對其他蛋白質(hIgA、牛明膠或者用作阻斷劑之BSA)之結合。

其次，對於以莫耳比1：2使IgG與IgG結合肽反應時之反應時間進行研究。其結果為，於約15分鐘時發現飽和，因此認為反應於15分鐘時幾乎結束(圖3B)。

根據以上結果，顯示出經交聯劑修飾後之本發明之IgG結合肽於短時間內特異性地與IgG結合。

[實施例5：利用螢光IgG結合肽之Fc之標記化]

<方法>

使IgG(中外製藥)、IgA(Athens Research & Technology)、或BSA(Sigma-Aldrich)(15μg：以IgG換算計為100pmol)與依據實施例2所製備之DSG交聯肽或DSS交聯肽(500pmol)於200μL中於室溫下反應60min，添加10μL之1M Tris-HCl(pH值=7.0)而使反應停止。其後，於SuperdexTM200 10/30GL直徑1.0cm×30cm(GE Healthcare)；流速：0.3ml/min；電泳緩衝液：PBS pH值7.4之條件下進行尺寸排除層析法，並使用螢光檢測器RF-10A(島津製作所)(激發光：541nm螢光：565nm)進行測定。

<結果>

使與DSS或DSG反應後之標記化IgG結合肽以相對於各蛋白質之莫耳比1：5於室溫下與蛋白質反應60min，並利用尺寸排除層析法進行分析。不論使用何種標記化IgG結合肽(DSS或DSG)，對IgG之反應性之特異性均為相同程度，且均完全未檢測到hIgA或BSA等對其他蛋白質之螢光標記化(圖4)。根據以上情況得知，不論使用所製作之何種IgG結合肽，均具有較高之特異性，而可對人類IgG進行螢光標記。

[實施例6：利用IgG結合肽之Fc之修飾物之解析(pH值4.5)]

<方法>

添加0.5、1.0、2.0、5.0μL(以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、5.0)之人類IgG(中外製藥)之Fc溶液(20μM、0.1M乙酸緩衝液pH值4.5)200μL與溶解於DMF中之藉由與實施例2相同之方法進行過DSG修飾之IgG結合肽(RGNCAYHXGQLVWCTYH(序列編號35)、X為離胺酸)(4mM)，並快速攪拌後，於室溫下反應15分鐘，添加10μL之1M Tris-HCl(pH值7.0)而使反應停止。將反應物50μL噴射至連接有Shodex IEC SP-825管柱之NGC層析系統(Bio-Rad)，進行25mM乙酸鹽緩衝液(Acetate buffer)(pH值4.5)向包含1M NaCl之25mM乙酸鹽緩衝液(pH值4.5)之梯度進行溶出，以215nm之吸光度監測蛋白質之溶出。分取所獲得之各波峰，並供於利用LC/MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，液相色譜-質譜)而進行之分子量測定。

將20μL所獲得之波峰之餾分注射至連接有Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm2.1mm×100mm)管柱之Shimadzu LCMS-8030後，進行包含0.1%甲酸之4%乙腈至包含0.1%甲酸之60%乙腈之梯度進行溶出。進行所溶出之波峰之質譜分析，並藉由自使用解析軟體之多價離子波峰之反捲積(deconvolution)而計算質量。

<結果>

使人類IgG11-Fc與經DSG修飾之IgG結合肽(4mM、生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH₂；分子量2760，X為經DSG化之離胺酸，2個Cys形成分子內SS鍵)以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、或5.0反應，結果如圖5A所示，出現了原本之人類IgG11-Fc之溶出位置之波峰(波峰2)與2個波峰3、4(認為波峰1係經DSG化之IgG結合肽)。為了鑑定該等之分子種類，而進行LCMS解析。反應前之IgG1-Fc於離子交換層析圖中於波峰1之位置溶出，且於LCMS解析中獲得55084之值。進行反應後之2、3、4之波峰之LCMS解析，結果分別獲得55087、 57735(55087+2648)、60384(55087+5297)之值。根據該情況得知，反應後之波峰2為未反應之Fc，波峰3與4為於Fc分別結合有1個及2個肽者。

圖5B係將以各莫耳比進行反應之情形時之未反應(波峰2)、1個肽之附加物(波峰3)、2個肽之附加物(波峰4)之產生量之變化進行圖表化而成者。例如可知，於以莫耳比1：1進行反應之情形時，未反應物亦變成20%以下，若為莫耳比1：2，則未反應物為10%以下而產量極高。又，於過度之莫耳比1：5之情形時，2個肽之附加物之產生比率亦相對增加，但於離子交換層析圖上並未檢測到附加有2個以上之肽之Fc，因此得知該標記反應極具特異性。

[實施例7：pH值與反應時間對利用IgG結合肽之Fc之反應的影響]

<方法>

向以pH值4.0(25mM乙酸緩衝液)、pH值5.5(25mM乙酸緩衝液)、或pH值7.0(PBS)製備之人類IgG之Fc溶液200μL中添加1.0μL(以莫耳比計為1.0)之實施例5中所製備之溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽(4mM)，並快速攪拌後，於室溫下進行反應。於反應後1、5、10、或30分鐘時添加10μL之1M Tris-HCl(pH值7.0)而使反應停止，將反應物50μL噴射至連接有Shodex IEC SP-825管柱之NGC層析系統(Bio-Rad)，進行25mM乙酸鹽緩衝液(pH值4.5)至包含1M NaCl之25mM乙酸鹽緩衝液(pH值4.5)之梯度進行溶出，利用215nm之吸光度監測蛋白質之溶出。基於所獲得之層析圖而計算各波峰之比率。

<結果>

如圖6所示，得知於已試驗之pH值4.0、pH值5.5、及pH值7.0之任一種情況下，標記化反應均較早，反應之90%以上均於1分鐘以內結束。又，於pH值4.0之情況下，未反應物之殘量超過40%而反應產率較低，尤其是2個肽之附加物(波峰4)之產量為15%左右，與其他pH值之情形時(35-40%)相比較低。於pH值5.5及7.0之情況下，未反應物之產量亦較低為10%~未達20%，得知高效率地進行反應。作為pH值5.5與7.0之差異，可見波峰4之產量於pH值7.0之情況下有若干降低之傾向。

[實施例8：使用IgG結合肽之單鏈Fv-Fc抗體之利用螢光標記所進行之FACS解析]

<方法>

使用Lipofectamine 2000將保有將針對Her2之scFv(4D5)與Fc基因連結而成之scFv-Fc的pcDNA3.1/Zeo(+)轉染至HEK293細胞中，並培養5天後，利用蛋白質A管柱對分泌至培養液中之scFv-Fc進行精製，而製備4D5-Fc抗體(具有對HER2之特異性的單鏈Fv純系4D5與Fc之融合蛋白質)。繼而，使將所製備之4D5-Fc抗體1.0μg於包含3%BSA之PBS 10μL中進行稀釋而成者與藉由與實施例2相同之方法進行DSG修飾之N末端生物素化IgG結合肽(生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(序列編號35)，X為經DSG化之離胺酸，2個Cys形成分子內SS鍵)0.16μg(20pmol)混合並反應10分鐘。將該反應物添加至分散於包含10%FBS之PBS 100μL之乳腺癌細胞株SK-BR3(自ATCC購買)(5.0×10⁵細胞)，並於4℃下放置30分鐘。利用包含3%BSA之PBS洗淨1次，並於懸浮於包含3%BSA之PBS 100μL中後，添加PE標記鏈黴親和素(Vector Laboratories)0.01μg(0.2pmol)，於4℃下放置30分鐘。再次利用包含3%BSA之PBS洗淨1次後，將其分散至包含3%BSA之PBS100μL中，並於添加10μL之7-AAD活性染料(Beckman Coulter)後，放置15分鐘。添加PBS 400μL使之分散，並於通過35μm之篩網(Corning)後，於S3e^TM細胞分選儀(Bio-Rad)上進行分析。

<結果>

將藉由經DSG修飾之生物素化IgG結合肽與PE標記鏈黴親和素對4D5-Fc抗體向乳腺癌細胞株SK-BR3上之HER2抗原之結合進行檢測所獲得之結果示於圖7A。作為對照，亦一併表示使用生物素化抗人類IgG小鼠抗體(抗hIgG mAb-生物素標記)(0.01μg)代替經DSG修飾之生物素化IgG結合肽(生物素化IgG結合肽)之情形時之流式細胞儀解析之結果(於任一情形時，均僅使用除藉由7-AAD染色進行染色之死細胞以外之細胞組分進行分析)。於2個體系中，螢光強度均幾乎無差異，因此得知經DSG修飾之生物素化IgG結合肽可藉由特異性地對人Fc進行標記而利用於單鏈Fv-Fc等之FACS染色。另一方面，亦對未添加4D5-Fc之體系進行了研究作為陰性對照(圖7B)，與未添加DSG修飾生物素化IgG結合肽之體系(抗hIgG mAb-生物素標記+SA-PE標記、及抗hIgG mAb-PE標記)同樣地，完全未觀察到螢光強度之偏移，因此得知於為單獨之經DSG修飾之生物素化IgG結合肽之情況下不會產生對細胞之非特異性之修飾。

[實施例9：利用IgG結合肽之抗IgA受體VHH與人類IgG抗體之偶聯物形成]

<方法>

經DSG修飾之N末端疊氮化IgG結合肽(疊氮化-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號2)，X為經DSG化之離胺酸，2個Cys形成分子內SS鍵，C末端醯胺化)係藉由與實施例2相同之方法製備。將該肽以10mM之濃度溶解於DMSO中，將該溶液20μL添加至溶解於25mM乙酸緩衝液(pH值5.0)中之16.6μM之抗HER2人類IgG抗體(中外製藥)溶液8mL中(肽與抗體之莫耳比=1：1.5)，並於室溫下使其等反應5小時。反應後，於CIMmultus^TM SO3-1(SHOWA DENKO)之管柱(1mL)上利用25mM乙酸緩衝液(pH值5.0)之0至1M之NaCl梯度溶出對疊氮化肽抗HER2人類IgG抗體(1價疊氮化肽抗體、2價疊氮化肽抗體之混合物)進行精製。

源自羊駝之抗IgA受體VHH抗體純系2b1-L9(C末端附加有HIS標籤)係使用附加至C末端之HIS標籤對利用大腸桿菌HB2151所分泌表現者進行親和精製。具體而言，於將具有VHH基因之噬菌粒載體pKSTV03導入至大腸桿菌HB2151中之後，於2TYAG培養盤中進行選擇，並於2TYA液體培養基中於37℃下培養一晚。於將該培養液10mL添加至2TYA 500mL中並於37℃下培養1小時後，添加500μL之1M IPTG，並振盪培養16小時。使離心後之菌體懸浮於TES緩衝液(0.2M Tris-base、0.5mM EDTA、0.5M蔗糖)10mL中，並於冰上靜置2小時。添加20mL稀釋至4倍之TES緩衝液使之再懸浮，並於冰上靜置1h後進行離心，對上清液組分(同質組分)進行回收。上清液係於親和管柱(His trap excel、GE Healthcare)中使用Profinia(BioRad)之精製系統對VHH進行精製而成者(關於流速，結合、溶出2mL/min，洗淨2mL/min，關於緩衝液(Buffer)，平衡化緩衝液係使用0.5M NaCl、20mM磷酸鈉，洗淨緩衝液係使用0.5M NaCl、20mM磷酸鈉，溶出緩衝液係使用500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM磷酸鈉)。繼而，於PBS(pH值7.4)中，於0.1mM之DTT(Dithiothreitol，二硫蘇糖醇)之存在下於室溫下進行1小時還原處理後，於IEC SP-825(Shodex)管柱(8.0mm×75mm)上利用10mM乙酸緩衝液(pH值4.5)之0至1M之NaCl梯度溶出進行精製。將經還原處理之VHH溶液(41.2μM、pH值4.5)200μL與溶解於10mM乙酸緩衝液(pH值4.5)中之870μM之二苯并環辛炔(DBCO)-順丁烯二醯亞胺(Click Chemistry Tools)42μL進行混合(以莫耳比計為1：4.4)，並於室溫下使其等反應1小時。將藉由上述方式所製備之二苯并環辛炔-順丁烯二醯亞胺化VHH(22μM)290μL與藉由上述方式所製備之疊氮化肽抗體溶液(17μM、pH值4.5)116μL進行混合(以莫耳比計為3.3：1)，並使其等於4℃下反應14小時。反應物係於 IEC SP-825(Shodex)管柱(8.0mm×75mm)上，於10mM乙酸緩衝液(pH值4.5)中利用0至1M之NaCl之梯度進行溶出而精製。經精製之組分於還原後，於5-20%之梯度凝膠Super Sep Ace(WAKO)上藉由SDS-PAGE進行分離，然後藉由CBB進行蛋白質染色。

<結果>

藉由疊氮化肽抗體與二苯并環辛炔-順丁烯二醯亞胺化VHH之點擊反應所進行之連結後之離子交換層析法之結果為獲得3個(a、b、及c)主要波峰(圖8A)。將於還原狀態下利用SDS-PAGE對各者進行分析所獲得之結果示於圖8B。於a(區帶3)中觀察到與原本之IgG(區帶1)相同之源自H鏈之50kDa及源自L鏈之25kDa之帶。於b(區帶4)中，L鏈之帶雖無變化，但除原本之IgG抗體之重鏈(約50kDa)(區帶1)以外，亦觀察到大致相同濃度之約80kDa之位置之新的帶。於c(區帶5)中，L鏈之帶雖無變化，但原本之重鏈(約50kDa)之帶消失，而僅觀察到約80kDa之帶。根據該等情況得知，a係未附加VHH之IgG抗體，b係連結有1個VHH之IgG抗體(抗HER2人類抗體-1價VHH)，c係連結有2個VHH之IgG抗體(抗HER2人類抗體-2價VHH)。

根據以上情況得知，藉由使用IgG結合肽試劑而導入至IgG抗體上之疊氮基與導入至VHH低分子抗體之二苯并環辛炔基間之點擊反應，可將低分子抗體(VHH等)連結於IgG抗體。

[實施例10：抗IgA受體VHH與抗HER2人類IgG抗體經由IgG結合肽而成之偶聯物之藉由FACS所進行之抗原結合解析]

<方法>

HL60細胞(自JCRB獲取)係於包含10%FBS以及100units/mL青黴素G及100μg/mL鏈黴素硫酸鹽之RPMI1640培養基(Life Technologies公司)中添加1.3%DMSO並分化誘導6天。關於SK-BR3細胞(自ATCC購買)，於包含10%FBS、100units/mL青黴素G、及100μg/mL鏈黴素硫酸鹽之McCoy's 5A(Life Technologies公司)培養基中於37℃下於5%CO₂培養箱中培養後，利用胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies公司)將細胞剝離並回收。使各2×10⁵之細胞分散於200μL之包含3%BSA之PBS中，以最終濃度成為200nM之方式添加1次抗體(抗HER2人類IgG抗體、實施例9中所製備之抗IgA受體VHH(C末端附加HIS標籤)、或實施例9中所製備之抗HER2人類抗體-1價VHH(C末端附加HIS標籤))，並於4℃下放置30分鐘。於洗淨1次後，向分散於包含3%BSA之PBS中之細胞液200μL中添加1)生物素化抗HIS標籤抗體(MBL Life Science)+經PE標記之SA(最終濃度50nM)(Vector Laboratories)、或2)經PE標記之抗人類IgG多株抗體(Affimetrix eBioscience)(最終濃度13nM)作為2次抗體，並於4℃下放置30分鐘。於洗淨1次後，向分散於包含3%BSA之PBS中之細胞液200μL中添加7-AAD活性染料(Beckman Coulter)10μL並放置15分鐘後，添加800μL之PBS，使之通過35μm之篩網(Corning)後於S3e^TM細胞分選儀(Bio-Rad)上進行分析。

<結果>

使用藉由7-AAD染色而去除死細胞之細胞組分，並使用抗HER2人類IgG抗體(圖9A)、抗IgA受體VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9B)、抗HER2人類抗體-1價VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9C)作為1次抗體，使用最終濃度50nM之生物素化抗HIS抗體+經PE標記之SA之混合物作為2次抗體對高表現HER2之SK-BR3細胞進行FACS解析，將所獲得之結果示於圖9A~C。於圖9C之情形時，觀察到較大之螢光偏移，因此得知所製備之抗HER2人類抗體-1價VHH中之抗HER2抗體具有對SKBR-3細胞之結合活性。

另一方面，使用抗HER2人類抗體(圖9D)、抗IgA受體VHH(C末端附加HIS標籤)(圖9E)、抗HER2人類抗體-1價VHH(圖9F)作為1次抗體，並使用PE標記抗人類IgG多株抗體作為2次抗體對在藉由 DMSO1.3%而進行之分化誘導中向高表現IgA受體之HL60細胞之結合進行檢測，將所獲得之結果示於圖9D~F。即便於該等中，亦僅於圖9F之抗HER2人類抗體-1價VHH中觀察到對HL60之結合，因此得知抗HER2人類抗體-1價VHH中之VHH保持有對IgA受體之抗原結合活性。再者，圖9D中之若干螢光偏移表示少量HER2於經分化之HL60細胞上表現，但與基於該結合之螢光強度相比，圖9F中之螢光強度遠大於其，因此認為可忽略對HER2之結合所產生之影響。

[實施例11：利用IgG結合肽之抗體藥物複合體之細胞增殖抑制]

<方法>

利用順丁烯二醯亞胺乙醯氧基琥珀醯亞胺酯對N末端之胺基進行修飾之順丁烯二醯亞胺-PEG4化合成肽RRGPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號37：於序列編號2之肽之N末端附加有2個Arg而成者，X為離胺酸，C末端醯亞胺化)係藉由Fmoc固相合成法並依據常用方法而合成。於將保護基去除後，於pH值8.5之水溶液中於氧化條件下形成分子內S-S鍵，使用逆相HPLC並藉由流速1.0ml/min、包含0.1%TFA之10%至60%之乙腈之梯度進行溶出對具有分子內S-S鍵之肽進行精製。向溶解於DMSO中之肽(18.5mM)40μL中添加同樣地溶解於DMSO中之DM-1(emtansine(XDCExplorer公司)，50mM)24μL(肽與DM-1之莫耳比=1：1.6)，進而添加吡啶3.4μL(最終濃度5%)，於50℃下使其等反應3小時。繼而，添加溶解於乙腈中之DSG(500mM)80μL，並於50℃下使之反應3小時，而於IgG結合肽之順丁烯二醯亞胺基與DM-1之巰基之間形成交聯結構。將全部量於包含0.1%TFA之10%乙腈10ml中進行稀釋，將離心後之上清液注射至Inertsustain C18管柱(7.6mm 1×250mm，GL Science)，以包含0.1%TFA之10%至70%之乙腈之梯度進行溶出。進行溶出物之質量分析，並回收目標物質，其後於去除溶劑後進行冷凍乾燥。

將連結有溶解於DMSO中之12.0mM之DM-1的DSG修飾順丁烯二醯亞胺-PEG4化IgG結合肽試劑0.56μL與溶解於10mM乙酸緩衝液(pH值5.5)中之6.8μM之抗HER2人類抗體(中外製藥)1mL進行混合，並於室溫下使其等反應30分鐘(肽與抗體之莫耳比=1：1)。藉由上述方式所製備之DM-1修飾人類抗體(抗體藥物複合體、ADC)係於陽離子之離子交換管柱Shodex SP825(8.0mm×75mm，Shodex)中利用包含10mM乙酸緩衝液(pH值5.5)之0M至1.0M之NaCl之梯度進行溶出而精製。於分取未反應之抗體以外之2個波峰(波峰A、B)後，於Vivaspin(10000Da臨界，Sartorius)上藉由3000g之離心操作進行脫鹽濃縮。所獲得之樣本係利用MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)測定質量，波峰A與原本之抗HER2人類抗體相比增加3553(理論值3535)，波峰B與原本之抗HER2人類抗體相比增加7092(理論值7070)，因此確認連結有DM-1之順丁烯二醯亞胺-PEG4化IgG結合肽分別導入有1個(抗HER2抗體-DM1* 1)、及2個(抗HER2抗體-DM1* 2)。

於96孔之細胞培養盤之各孔中以成為10000cell/100μL之方式將SK-BR3細胞(自ATCC購買)或C6細胞(自JCRB獲取)接種至包含10%FBS、100units/mL青黴素G及100μg/mL鏈黴素硫酸鹽之McCoy's 5A(Life Technologies公司)培養基中。於37℃下於5%CO₂培養箱中培養24小時後，添加各濃度之包含藉由上述方式所製備之抗體藥物複合體(ADC)之培養基100μL，進而於37℃之CO₂培養箱中培養72小時。向各孔中逐次添加10μL之細胞計數Kit-8(同人化學)，並於37℃之CO₂培養箱中保溫2小時，其後利用讀板儀測定450nm之吸光度。

<結果>

為了對所製備之ADC對乳腺癌細胞株SK-BR3之細胞增殖抑制效果進行評價，於0-10nM之ADC之存在下培養SK-BR3細胞，並利用細胞測定套組對72小時後之細胞數進行評價(圖10)。本次製備之抗HER2抗體-DM1* 1、抗HER2抗體-DM1* 2對於高表現HER2之SK-BR3，均以0.4nM以上之濃度顯示出顯著之細胞增殖抑制活性。另一方面，關於未表現HER2之C6細胞，於所使用之抗體藥物複合體之濃度範圍內未觀察到細胞增殖抑制。根據以上情況得知，藉由經由IgG結合肽之共價鍵結之抗體藥物複合體可對癌細胞株表現出有效之細胞增殖抑制活性。

[實施例12：藉由具有利用二氯丙酮所獲得之SS交聯結構的IgG結合肽所進行之抗體藥物複合體之細胞增殖抑制]

<方法>

N末端乙醯化RRC(Acm保護)-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號2，X為離胺酸，C末端醯胺化)係於肽合成珠粒(Rink-amide-Chemmatrix resin，Biotage)上藉由Fmoc固相合成法並依據常用方法而合成。於自樹脂切出肽並脫保護後，獲得肽(圖11、a)。將所獲得之肽65mg(15.6μmol)溶解於包含6M Gn‧HCl之磷酸緩衝液(pH值=7.3)5mL中，並向其中添加溶解於乙腈120μL中之1,3-二氯-2-丙酮(2.9mg，23.4μmol，1.5等量莫耳)，於室溫下進行攪拌。1小時後，藉由HPLC分析確認反應結束，並直接利用HPLC對反應溶液進行精製，藉此獲得環化肽(圖11、b、33mg、7.8μmol、產率50%)。向該環化肽中添加懸浮於90%乙酸水溶液(8.8mL)中之乙酸銀(30.8mg，184.5μmol)，並於室溫下且於遮光下攪拌5小時。添加二硫蘇糖醇(DTT：352mg，2.3mmol)，藉由離心分離將所產生之沈澱物去除，利用HPLC對所獲得之上清液進行精製，藉此獲得環化肽(圖11、c、20.5mg、5.2μmol、產率67%)。

將藉由上述方式所製備之環化肽及同樣地溶解於DMSO中之27mM之VcMMAE(順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲醯氧基羰基-單甲基澳瑞他汀(auristatin)E，MedChem Express)18μL(肽與VcMMAE之莫耳比=1：1.4)添加至溶解於DMSO中之溶液(60mM)6μL中，進而添加吡啶1.2μL(最終濃度5%)，於50℃下使其等反應3小時。繼而，添加溶解於乙腈中之DSG(500mM)25μL，於50℃下使之反應3小時。將全部量於包含0.1%TFA之10%乙腈10ml中進行稀釋，將離心後之上清液注射至Inertsustain C18管柱(7.6mm×250mm，GL Science)，以包含0.1%TFA之10%至80%之乙腈之梯度進行溶出。進行溶出物之質量分析並回收目標物質，其後將溶劑去除後進行冷凍乾燥。

將溶解於DMSO中之5.0mM之DSG修飾N末端乙醯化RRC-PEG4化IgG結合肽試劑(R8K)5.4μL與溶解於10mM乙酸緩衝液(pH值5.5)中之6.8μM之抗HER2人類IgG抗體(中外製藥)1mL進行混合，並於室溫下使其等反應15小時(肽與抗體之莫耳比=1：4)。藉由上述方式所製備之VcMMAE修飾人類IgG抗體(抗體藥物複合體，ADC)係於陽離子之離子交換管柱Shodex SP825(8.0mm×75mm，Shodex)中利用包含10mM乙酸緩衝液(pH值4.5)之0M至1.0M之NaCl之梯度進行溶出而精製。分取未反應之抗體以外之主要之1個波峰後，於Vivaspin(10000Da臨界，Sartorius)上藉由3000g之離心操作進行脫鹽濃縮。所獲得之樣本係利用MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)測定質量，與原本之抗HER2人類抗體相比增加3941(理論值4178)，因此確認導入有1個附加有VcMMAE之N末端乙醯基-RRC-PEG4化IgG結合肽(R8K)。

於96孔之細胞培養盤之各孔中以成為10000cell/100μL之方式將SK-BR3細胞(自ATCC購買)或者C6細胞(自JCRB獲取)接種至包含10%FBS、100units/mL青黴素G及100μg/mL鏈黴素硫酸鹽之McCoy's 5A(Life Technologies公司)培養基中。於37℃下於5%CO₂培養箱中培養24小時後，添加各濃度之包含抗體藥物複合體(ADC)之培養基100μL，進而於37℃之CO₂培養箱中培養72小時。向各孔中逐次添加10μL之細胞計數Kit-8(同人化學)，並於37℃之CO₂培養箱中保溫2小時後，利用讀板儀測定450nm之吸光度。

<結果>

為了對所製備之ADC對乳腺癌細胞株SK-BR3之細胞增殖抑制效果進行評價，於0-500nM ADC之存在下培養SK-BR3細胞，並利用細胞測定套組對72小時後之細胞數進行評價(圖12)。關於所使用之抗癌劑VcMMAE本身，僅於250nM以上之情況下觀察到增殖抑制(圖12A)，於本次所製備之ADC中，對於高表現HER2之SK-BR3，以0.4nM以上之濃度顯示出顯著之細胞增殖抑制活性(圖12B)，藉由與抗體之偶聯物而細胞增殖抑制活性增強500倍左右。另一方面，僅於原本之抗HER2人類抗體中未觀察到此種細胞增殖抑制。根據以上情況得知，藉由經由IgG結合肽之共價鍵結之抗體藥物複合體可對癌細胞株發揮出有效之細胞增殖抑制活性。

[實施例13：針對各種IgG之利用IgG結合肽所進行之標記評價]

<方法>

向人類、小鼠、兔、及大鼠之各種抗體溶液(14μM)1.25μL(相當於抗體2.5μg)中添加PBS 3.15μL，並混合藉由與實施例2相同之方法進行過DSG修飾之N末端生物素化IgG結合肽生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(序列編號35，X為經DSG化之離胺酸，2個Cys形成分子內SS鍵)之DMSO溶液(118μM)0.65μL後，於室溫下使其等反應30分鐘(抗體與肽之莫耳比=1：4)。向該反應液(5.0μL)中添加SDS-PAGE之樣本緩衝液(4×)5.0μL、2-巰基乙醇0.6μL、超純水9.35μL並進行混合後，於95℃下加熱10分鐘，並於梯度凝膠(Super Sep^TM Ace 5-20%，Wako Chemicals)上進行SDS-PAGE。凝膠係利用 CBB(Coomassie brilliant blue，考馬斯亮藍)進行蛋白質染色，又，自凝膠轉印至PVDF膜之蛋白質係供於西方墨點法(Western Blot)。即，利用0.5%BSA對轉印後之PVDF(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯)膜進行阻斷，使HRP標記抗生蛋白鏈菌素(Vector Laboratories)於室溫下反應1小時，使用化學發光檢測試劑Chemi-Lumi One(NACALAI TESQUE)並利用化學發光成像器ChemDock(BioRad)進行檢測。用作標記之抗體如下所述。人類IgG1(Clone ID：CB1)、人類IgG2(Clone ID：CB2)、人類IgG3(Clone ID：CB3)、人類IgG4(Clone ID：CB4)、小鼠IgG1(Clone ID：CB5)、小鼠IgG2b(Clone ID：CB8)、及小鼠IgG3(Clone ID：CB9)係自Crown Bioscience Inc.購買。大鼠IgG1(Clone #：43414)與IgG2b(Clone #：141945)係自R&D公司購買，IgG2c(Clone Name：SB68b)係自LifeSpan BioScience公司購買，兔IgG係自Thermo Scientific公司購買。

<結果>

如圖13所示，與曲妥珠單抗(抗HER2人類化IgG1抗體)相同程度地對於人類單株IgG1、人類IgG2、及人類IgG4確認到深色之帶。又，所使用之動物抗體中，兔多株IgG抗體尤其明顯地被染色。根據以上情況得知，使用本IgG結合肽之標記可高效率地對人類IgG1、2、及4以及兔IgG抗體進行標記。

[產業上之可利用性]

使用本發明之IgG結合肽，可將與IgG結合肽連結之各種化合物以短時間且幾乎無副反應地附加至IgG之Fc。藉此，可利用各種化合物特異性地且簡便地對用作檢測試劑、診斷藥、及醫藥等之IgG進行修飾。

本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請係直接藉由引用而組入至本說明書中。

<110> 鹿兒島大學(Kagoshima University)

<120> 藉山IgG結合肽之抗體之特異性修飾

<160> 37

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<400> 2

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、 2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

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<223> IgG結合肽

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<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<400> 4

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<223> IgG結合肽

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<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<400> 5

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<223> IgG結合肽

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<221> 未歸類特性

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<400> 7

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<223> IgG結合肽

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<222> (6)..(6)

<400> 16

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 17

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 18

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 20

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 21

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 22

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 23

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 24

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 25

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 26

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 27

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 28

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (6)..(6)

<400> 29

<210> 30

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為高絲胺酸

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (16)..(16)

<223> Xaa為高絲胺酸

<400> 31

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<400> 32

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<400> 33

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<400> 34

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<400> 35

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為高絲胺酸

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (8)..(8)

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (16)..(16)

<223> Xaa為高絲胺酸

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> IgG結合肽

<220>

<221> 未歸類特性

<222> (10)..(10)

<400> 37

Claims

一種肽，其係由下述式III：(X_1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (III)(式中，X之各者獨立為半胱胺酸以外之任意之胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，A為丙胺酸殘基，Y為酪胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基，G為甘胺酸殘基，E為麩胺酸殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，且W為色胺酸殘基)所表示之由13~17個胺基酸殘基所組成之胺基酸序列所構成，且經由經Xaa1修飾之交聯劑而能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。
如請求項1之肽，其中於設為17個胺基酸殘基之情形時自N末端起第1~3、15~17號之各胺基酸殘基為第1號胺基酸殘基=S、G、F或無，第2號胺基酸殘基=D、G、A、S、P、高半胱胺酸或無，第3號胺基酸殘基=S、D、T、N、E或R，第15號胺基酸殘基=S、T或D，第16號胺基酸殘基=H、G、Y、T、N、D、F、高半胱胺酸或無，第17號胺基酸殘基=Y、F、H、M或無。
一種肽，其係由以下1)~15)中之任一胺基酸序列所組成，其中Xaa1為離胺酸殘基，Xaa2為高半胱胺酸，且經由經Xaa1修飾之交聯劑而能夠與人類IgG及/或兔IgG結合，1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號1)2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號2)3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列編號3)4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號4)5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號5)6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號6)7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號7)8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號8)9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列編號9)10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號10)11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號11)12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號12)13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列編號13)14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(序列編號36)15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號37)。
如請求項1之肽，其係由下述式IV：D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基， G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基或天冬醯胺殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa3為丙胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基)所表示之由13個胺基酸殘基所組成之胺基酸序列所構成，且經由經Xaa1修飾之交聯劑而能夠與人類IgG及/或兔IgG結合。
如請求項4之肽，其係由以下1)~4)中之任一胺基酸序列所組成，其中Xaa1為離胺酸殘基，且經由經Xaa1修飾之交聯劑而能夠與人類IgG及/或兔IgG結合，1)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號14)2)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(序列編號15)3)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號16)4)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(序列編號17)。
如請求項1至5中任一項之肽，其中肽於外側之2個半胱胺酸(C)殘基間形成二硫鍵，或肽之外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基利用以下之式：
所表示之連結子而連結。
如請求項1至5中任一項之肽，其係利用標記物質進行標記。
如請求項1至5中任一項之肽，其結合有藥劑。
如請求項1之肽，其中Xaa1為離胺酸殘基。
如請求項1至5中任一項之肽，其中Xaa1經交聯劑修飾。
如請求項10之肽，其中上述交聯劑為選自由DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)、DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)、DMA(己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMS(辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DSP(二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸)所組成之群中。
如請求項11之肽，其中上述交聯劑為DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)或DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)。
一種複合體，其係如請求項10至12中任一項之肽與IgG之複合體，並且係藉由經交聯劑修飾之肽與IgG之交聯反應而形成。
如請求項13之複合體，其中上述肽係藉由放射性同位素進行修飾，以及IgG為人類IgG。
如請求項14之複合體，其中上述肽係藉由放射性同位素金屬離子之螯合物進行修飾。
如請求項15之複合體，其中上述螯合物為DOTA之螯合物。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中藉由上述放射性同位素進行之上述肽之修飾係藉由疊氮基與二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne)之反應而進行者。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中上述IgG為醫藥抗體或診斷用抗體。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中上述IgG為抗HER2人類IgG抗體。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中上述肽為如請求項3之肽。
如請求項20之複合體，其中上述肽為如請求項6之肽。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中於上述肽中Xaa1為離胺酸殘基。
如請求項14至16中任一項之複合體，其中上述肽之Xaa1係與上述IgG之Fc之間形成交聯結構。
如請求項23之複合體，其中上述肽之Xaa1係上述與IgG之Fc之Lys248或Lys246之間形成交聯結構。
如請求項21之複合體，其中上述交聯劑為選自由DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)、DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)、DMA(己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMS(辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DSP(二硫代雙琥珀醯亞胺基丙酸)所組成之群中。
如請求項25之複合體，其中上述交聯劑為DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)或DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)。
如請求項26之複合體，其中上述交聯劑為DSG(二琥珀醯亞胺基戊二酸鹽)。
如請求項27之複合體，其中藉由上述放射性同位素進行之上述肽之修飾係藉由疊氮基與二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne)之反應而進行者。
如請求項28之複合體，其中上述IgG為抗HER2人類IgG抗體。
一種生產肽與IgG之複合體之方法，其包括將如請求項10至12中任一項之肽與IgG混合而使經交聯劑修飾Xaa1之肽與IgG進行交聯反應之步驟。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之肽或如請求項13至29中任一項之複合體。
一種生產2個以上之半胱胺酸殘基利用連結子連結而成之肽的方法，其包括將包含2個以上之半胱胺酸殘基之如請求項1至5中任一項之肽與以下之式：
所表示之化合物(式中，R₁及R₂分別獨立為任意之鹵素原子)混合，而獲得2個以上之半胱胺酸殘基中之硫基利用以下之式：
所表示之連結子連結而成之肽的步驟。
如請求項32之方法，其中於上述化合物中，R₁及R₂相同，且為Cl、Br、或I。
如請求項32或33之方法，其中上述肽係如請求項1至5及7至12中之任一項所規定之肽。