CN112469736A

CN112469736A - 肽融合蛋白质

Info

Publication number: CN112469736A
Application number: CN201980049450.0A
Authority: CN
Inventors: 伊东祐二; 内村诚一; 大仓裕道
Original assignee: Daicel Corp; Kagoshima University NUC
Current assignee: Daicel Corp; Kagoshima University NUC
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2021-03-09
Also published as: US20210332152A1; JP7202577B2; JPWO2020027237A1; EP3831855A4; WO2020027237A1; US11643474B2; EP3831855A1

Abstract

本发明的目的为提供能够以低成本生产可用于靶分子纯化的具有特异性结合能力的肽的方法，具体而言，涉及包含1个以上具有特异性结合能力的肽和支架蛋白质的肽融合蛋白质，其中，所述肽被直接或介由肽接头插入至所述支架蛋白质的氨基酸序列中，以及/或者被连接于所述支架蛋白质的N末端及/或C末端。

Description

肽融合蛋白质

技术领域

本发明涉及例如肽融合蛋白质、包含该肽融合蛋白质的固相担载体、包含该固相担载体的靶分子分离用柱、包含该固相担载体或柱的试剂盒、及使用该固相担载体或柱的靶分子的纯化方法等。

背景技术

包括IgG抗体等抗体在内的蛋白质是目前最受瞩目的生物医药品之一。例如，近年来，以IgG抗体为核心的抗体药物开始应用于医药领域，在工业用途、制药用途中的重要性逐渐提高。抗体的纯化中，蛋白A柱起到核心作用，大多数的抗体药物制造商引入了以该柱为核心的纯化体系。该蛋白A利用基因重组法而在大肠杆菌中大量生产。

另一方面，本申请的发明人迄今为止报道了可利用介由二硫键环化而成的包含特定序列的肽配体(专利文献1)、或介由具有特定结构的接头将肽中的半胱氨酸残基的硫醚基交联而成的IgG结合肽(专利文献2)来纯化IgG。

上述肽配体或IgG结合肽可用于取代蛋白A的新型亲和柱，但另一方面，其是通过化学合成而制造的，存在与蛋白A相比生产成本较高的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/027796号

专利文献2：国际公开第2018/092867号

发明内容

发明所要解决的课题

鉴于上述实际情况，本发明的目的为提供能够以低成本生产具有特异性结合能力的肽的方法，所述肽可用于纯化包括IgG等抗体在内的靶分子。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题而进行了锐意研究，结果发现，将具有特异性结合能力的肽制成与在大肠杆菌等宿主细胞中生产率高的蛋白质形成的融合蛋白质，能够利用与化学合成相比成本更低的基因重组法进行生产。另外，还发现该融合蛋白质可通过包含2个以上具有特异性结合能力的肽，从而利用亲合力效应而使得该融合蛋白质的靶分子结合能力提高，较之具有特异性结合能力的肽单独、或较之包含1个具有特异性结合能力的肽的融合蛋白质而言，与靶分子结合相关的解离速率减慢，从而成为高亲和性，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下内容。

(1)肽融合蛋白质，其包含1个以上具有特异性结合能力的肽和支架蛋白质，其中，所述肽被直接或介由肽接头插入至所述支架蛋白质的氨基酸序列中，以及/或者被连接于所述支架蛋白质的N末端及/或C末端。

(2)如(1)所述的肽融合蛋白质，其中，所述具有特异性结合能力的肽为抗体结合肽。

(3)如(2)所述的肽融合蛋白质，其中，所述抗体结合肽选自由IgG结合肽、IgA结合肽及IgY结合肽组成的组。

(4)如(3)所述的肽融合蛋白质，其中，所述IgG结合肽为具有环状结构的肽。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的肽融合蛋白质，其包含2个以上的所述肽。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的肽融合蛋白质，其中，所述支架蛋白质为具有β桶形结构(β-barrel structure)的蛋白质。

(7)如(6)所述的肽融合蛋白质，其中，所述具有β桶形结构的蛋白质为绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(DsRed)或它们的突变体。

(8)如(7)所述的肽融合蛋白质，其中，所述GFP突变体为超折叠(superfolder)GFP或超折叠黄色荧光蛋白(YFP)。

(9)如(1)～(8)中任一项所述的肽融合蛋白质，其中，所述肽接头包含1段以上的氨基酸序列：GGGGS(序列号35)。

(10)如(1)～(9)中任一项所述的肽融合蛋白质，其中，所述肽接头连接于所述肽的N末端及/或C末端。

(11)固相担载体，其是将(1)～(10)中任一项所述的肽融合蛋白质固定化而得到的。

(12)如(11)所述的固相担载体，其中，在所述肽融合蛋白质与固相之间具有间隔物(spacer)。

(13)靶分子分离用柱，其包含(11)或(12)所述的固相担载体。

(14)肽融合蛋白质的制造方法，其包括对具有编码(1)～(10)中任一项所述的肽融合蛋白质的核酸的细胞进行培养的步骤。

(15)如(14)所述的方法，其中，所述细胞为大肠杆菌。

本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-145323号的公开内容。

发明效果

根据本发明，能够实现可用于靶分子纯化的、具有特异性结合能力的肽的制造的低成本化。

附图说明

[图1-1]示出实施例中制作的IgG结合肽融合蛋白质的氨基酸序列及编码该融合蛋白质的DNA序列。

[图1-2]为图1-1的后续。

[图1-3]为图1-2的后续。

[图1-4]为图1-3的后续。

[图1-5]为图1-4的后续。

[图1-6]为图1-5的后续。

[图1-7]为图1-6的后续。

[图1-8]为图1-7的后续。

[图2]示出实施例1的IgG结合肽融合蛋白质(sfGFP-C-1Opt1)及比较例1的支架蛋白质(sfGFP)的针对IgG的亲和性测定结果。

[图3]示出实施例2的IgG结合肽2价融合蛋白质(sfGFP-N C-2Opt1GSl2、sfGFP-173 C-2Opt1GSl2、sfGFP-173 C-2Opt1GSl3)及比较例2的肽(氨基酸序列：序列号18)的针对IgG的亲和性测定结果。

[图4]示出实施例3的IgG结合肽2价融合蛋白质(sfGFP-173 C-2Opt1GSl2)、及比较例3的肽(氨基酸序列：序列号18)的动态结合载量(DBC)测定结果。

[图5]示出关于实施例4中的、利用实施例3中制作的柱的γ-球蛋白的吸脱附的色谱图。

[图6]示出实施例5的IgG结合肽融合蛋白质及比较例4的支架蛋白质(sfYFP)的针对IgG的亲和性测定结果。

[图7]示出实施例6的IgA结合肽融合蛋白质的针对IgA的亲和性测定结果、及IgY结合肽融合蛋白质的针对IgY的亲和性测定结果。

[图8]示出关于实施例7中的、利用IgA结合肽融合蛋白质的IgA的吸脱附、及利用IgY结合肽融合蛋白质的IgY的吸脱附的色谱图。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明涉及的肽融合蛋白质包含1个以上具有特异性结合能力的肽和支架蛋白质。本发明涉及的肽融合蛋白质可通过基因重组法而非化学合成来制造，能够实现低成本化。

针对本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的具有特异性结合能力的肽，在以下进行详细说明。

本发明中的具有特异性结合能力的肽，是指具有能与靶分子特异性地结合的氨基酸序列的肽。例如，可举出与作为特定靶分子的抗体进行特异性结合的抗体结合肽(例如，IgG结合肽、IgA结合肽、IgY结合肽)等。

本说明书中使用的“IgG”或“IgA”是指哺乳动物、例如人及黑猩猩等灵长类、大鼠、小鼠、及兔等实验动物、猪、牛、马、绵羊、及山羊等家畜动物、以及狗及猫等宠物的IgG或IgA、优选人的IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgA。本说明书中的IgG进一步优选为人IgG1、IgG2、或IgG4、或者兔IgG，特别优选为人IgG1、IgG2、或IgG4。本说明书中使用的“IgY”为来源于鸡的抗体。

本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的IgG结合肽是结合IgG的Fc结构域的肽。

一个方式中，作为本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的IgG结合肽，可举出具有环状结构的肽(环肽)，例如，为包含下式I表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽、且该肽的外侧的2个半胱氨酸残基介由二硫键而结合，

(X_1-3)-C-(X₂)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (I)

[式(I)中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

上述式中，N末端或C末端的X_1-3这一表述表示半胱氨酸(C或Cys)以外的独立且任意的氨基酸残基X连续1～3个，构成其的氨基酸残基是相同或不同的残基，优选由3个并非完全相同的残基的序列组成。同样地，X₂也表示半胱氨酸(C或Cys)以外的独立且任意的氨基酸残基X连续2个，构成其的氨基酸残基是相同或不同的残基，优选由这2个连续的氨基酸残基不是相同残基的序列组成。

在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式I’及式I”表示的肽如下所示。

即，式I’表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-(X₁)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X_1-3) (I’)

[式(I’)中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

Y为酪氨酸残基，

H为组氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

N为天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

式I”表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-A-(X₁)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (I”)

[式(I”)中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

A为丙氨酸残基，

H为组氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

E为谷氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式II表示的肽如下所示。

即，式II表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X_1-3) (II)

[式(II)中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，

W为色氨酸残基，

Xaa3为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且

Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基]。

上述的式I’、式I”及式II的肽的氨基酸序列中，作为17个氨基酸残基的情况下的、自N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽由13个氨基酸长度组成。

本说明书中使用的“作为17个氨基酸残基的情况下的”是出于方便起见，用以表述在以氨基酸编号称呼肽的氨基酸残基时、针对式I的肽而自最大氨基酸长度即17个残基的N末端起依次从第1位编号至第17位的术语。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式III表示的肽如下所示。

即，式III表示的肽包含下式表示的、由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

(X_1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X_1-3) (III)

[式(III)中，

X各自独立地为半胱氨酸以外的任意的氨基酸残基，

C为半胱氨酸残基，

A为丙氨酸残基，

Y为酪氨酸残基，

H为组氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

E为谷氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，并且

W为色氨酸残基]。

上述的式III的肽的氨基酸序列中，作为17个氨基酸残基的情况下的、自N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽可由13个氨基酸长度组成。

此外，上述的各式的肽的氨基酸序列的半胱氨酸(C)以外的氨基酸残基、即、作为17个氨基酸残基的情况下的自N末端起第1～3、5、6、15～17位的各氨基酸残基优选选自以下的氨基酸残基。此处，各大写英文字母为氨基酸的单字母缩写：

第1位的氨基酸残基＝S、G、F、或不存在，

第2位的氨基酸残基＝D、G、A、S、P、或不存在，

第3位的氨基酸残基＝S、D、T、N、E或R，

第15位的氨基酸残基＝S、T或D，

第16位的氨基酸残基＝H、G、Y、T、N、D、F、或不存在，

第17位的氨基酸残基＝Y、F、H、M、或不存在，

第5位的氨基酸残基＝A或T，

第6位的氨基酸残基＝Y或W。

另外，在式I的肽的氨基酸序列中对氨基酸残基X进行进一步限定的式IV表示的肽如下所示。

即，式IV表示的肽包含下式表示的、由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，

D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)

[式(IV)中，

D为天冬氨酸残基，

C为半胱氨酸残基，

H为组氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，

L为亮氨酸残基，

V为缬氨酸残基，

W为色氨酸残基，

T为苏氨酸残基，

Xaa3为丙氨酸残基或苏氨酸残基，并且

Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基]。

以下的1)～17)中列举了式I的肽的几个具体例，但当然不限于这些具体例。

1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列号1)；

2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2)；

3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列号3)；

4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号4)；

5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号5)；

6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号6)；

7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号7)；

8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号8)；

9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列号9)；

10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号10)；

11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号11)；

12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列号12)；

13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列号13)；

14)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号14)；

15)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号15)；

16)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(序列号16)；及

17)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(序列号17)

(式中，Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基)。

作为式I的肽的优选具体例，可举出：

1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列号1，其中，Xaa1为R)；

2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列号2，其中，Xaa1为R、L或K)；及

4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列号4，其中，Xaa1为R)，

作为特别优选的例子，可举出GPDCAYHRGELVWCTFH(序列号18)。

另外，一个方式中，本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的IgG结合肽是包含下式V表示的、由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽作为广义的一级结构，且该肽的外侧的2个半胱氨酸残基介由二硫键而结合，

D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)

[式(V)中，

D为天冬氨酸残基，

C为半胱氨酸残基，

G为甘氨酸残基，

L为亮氨酸残基，

W为色氨酸残基，

T为苏氨酸残基，

Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，

Xaa3为色氨酸残基或酪氨酸残基，

Xaa4为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，

Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基、或天冬氨酸残基，并且

Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基]。

以下的18)～29)中列举了式V的肽的几个具体例，但当然不限于这些具体例。

18)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号19)；

19)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号20)；

20)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号21)；

21)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(序列号22)；

22)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(序列号23)；

23)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(序列号24)；

24)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(序列号25)；

25)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(序列号26)；

26)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(序列号27)；

27)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(序列号28)；

28)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(序列号29)；及

29)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(序列号30)

(式中，Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、或天冬酰胺残基)。

如上所述，本发明中的IgG结合肽中，Xaa1为精氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基或天冬酰胺残基，优选为精氨酸残基、赖氨酸残基或亮氨酸残基。

对于本发明中的IgG结合肽而言，与人IgG的结合亲和性可以较之其他的人免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)高约10倍以上、优选高约50倍以上、更优选高约200倍以上。与IgG结合肽和人IgG的结合相关的解离常数(Kd)可通过表面等离子共振谱分析(例如使用BIACORE系统)来确定，例如小于1×10^-1M、小于1×10^-3M，优选小于1×10^-4M、更优选小于1×10^-5M。本发明中的IgG结合肽能与IgG的Fc结构域结合。

作为本发明中的IgA结合肽，可举出例如由序列号50记载的氨基酸序列组成的肽等记载于WO 11/148952、WO 13/081037中的IgA结合肽。

作为本发明中的IgY结合肽，可举出例如由序列号51记载的氨基酸序列组成的肽等记载于日本专利第6245688号公报中的IgY结合肽。

此外，作为本发明中的具有特异性结合能力的肽，可举出例如Yu-Ming Fang等，Journal of Chromatography A,1571(2018)1-15的表1中记载的肽(例如由序列号62～81中记载的氨基酸序列组成的肽)。由序列号62～81中记载的氨基酸序列组成的肽各自的靶分子如下(肽的氨基酸序列的序列号：靶分子)：

序列号62：人血清白蛋白(HSA)；

序列号63：IgG；

序列号64：组织纤溶酶原激活因子(t-PA)；

序列号65：抗GM-CSF Mab；

序列号66：人前列腺特异抗体(PSA)；

序列号67：热激组织蛋白质(Heat shock organizing protein)；

序列号68：纤维蛋白原；

序列号69：IgG；

序列号70：IgG；

序列号71：IgG；

序列号72：α-淀粉酶；

序列号73：α-乳白蛋白；

序列号74：金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)；

序列号75：血管性血友病因子(vWF，Von Willebrand Factor)；

序列号76：IgG；

序列号77：IgG；

序列号78：IgG；

序列号79：IgG；

序列号80：小鼠IgG；

序列号81：IgG-Fc(人IgG-Fc)。

另一方面，本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的支架蛋白质只要是与具有特异性结合能力的肽融合、适合利用基因重组法制造的蛋白质即可，没有特别限定，可举出例如大肠杆菌中的生产率高的蛋白质。作为大肠杆菌中的生产率高的蛋白质，可举出具有β桶形结构的蛋白质。已知具有β桶形结构的蛋白质由于形成氢键的网络、结构稳定性高，因此通常大肠杆菌生产率高。

另外，作为具有β桶形结构的蛋白质，可举出具有β桶形结构的荧光蛋白，作为具有β桶形结构的荧光蛋白的例子，可举出绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(DsRed)或它们的突变体。

编码GFP的cDNA由例如序列号31中记载的碱基序列组成，另外，GFP由例如序列号32中记载的氨基酸序列组成。作为GFP的突变体，可举出例如由与序列号32中记载的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有与GFP同样的荧光活性的蛋白质。作为具体的GFP的突变体，可举出例如超折叠GFP(sfGFP；例如，cDNA：序列号33中记载的碱基序列，氨基酸序列：序列号34中记载的氨基酸序列)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、sfBFP、sfCFP、sfYFP(cDNA：序列号52中记载的碱基序列，氨基酸序列：序列号53中记载的氨基酸序列)(Pedelacq J.D.等，Nature Biotechnology,2006年，第24卷，第1期，第79-88页)。sfGFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有以下的氨基酸取代(以“取代前的氨基酸/氨基酸位置/取代后的氨基酸”示出)的氨基酸序列组成的GFP突变体：S30R、Y39N、F64L、S65T、F99S、N105T、Y145F、M153T、V163A、I171V、A206V、或者除了这些氨基酸取代以外还具有S2R及/或S72A。BFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有以下的氨基酸取代(以“取代前的氨基酸/氨基酸位置/取代后的氨基酸”示出)的氨基酸序列组成的GFP突变体：Y66H。CFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有以下的氨基酸取代(以“取代前的氨基酸/氨基酸位置/取代后的氨基酸”示出)的氨基酸序列组成的GFP突变体：Y66W。YFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有以下的氨基酸取代(以“取代前的氨基酸/氨基酸位置/取代后的氨基酸”示出)的氨基酸序列组成的GFP突变体：T203Y。sfBFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有上述的sfGFP及BFP的氨基酸取代的氨基酸序列组成的GFP突变体。sfCFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有上述的sfGFP及CFP的氨基酸取代的氨基酸序列组成的GFP突变体。sfYFP是由在序列号32中记载的氨基酸序列中具有上述的sfGFP及YFP的氨基酸取代的氨基酸序列组成的GFP突变体。

另外，作为具有β桶形结构的荧光蛋白的例子，也可举出上述的黄色荧光蛋白(YFP)的突变体，作为YFP的突变体，可举出例如由与上述的YFP的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有与YFP同样的荧光活性的蛋白质。

此外，作为具有β桶形结构的荧光蛋白的例子，可举出红色荧光蛋白(DsRed)或其突变体。编码DsRed的cDNA由例如序列号60中记载的碱基序列组成，另外，DsRed由例如序列号61中记载的氨基酸序列组成。作为DsRed的突变体，可举出例如由与序列号61中记载的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有与DsRed同样的荧光活性的蛋白质。

本发明涉及的肽融合蛋白质包含以上说明的具有特异性结合能力的肽和支架蛋白质作为融合蛋白质。特别地，本发明涉及的肽融合蛋白质可通过包含2个以上(例如2～5个，优选2～3个)具有相同或不同的特异性结合能力的肽，从而利用亲合力效应而使得该融合蛋白质的靶分子结合能力提高，较之具有特异性结合能力的肽单独、或较之包含1个具有特异性结合能力的肽的融合蛋白质而言，与靶分子结合相关的解离速率减慢，从而成为高亲和性。另外，如上所述，本发明涉及的肽融合蛋白质通过包含2个以上具有特异性结合能力的肽而与靶分子呈高亲和性，因此能够减少针对以下所说明的固相担载体或靶分子分离用柱的固定化量，能够实现低成本化。

本发明涉及的肽融合蛋白质中，具有特异性结合能力的肽被直接或介由肽接头插入至支架蛋白质的氨基酸序列中，以及/或者被连接于支架蛋白质的N末端及/或C末端。

尤其在支架蛋白质为GFP或其突变体的情况下，优选具有特异性结合能力的肽被直接或介由肽接头插入至GFP的序列号32记载的氨基酸序列或GFP突变体的对应的氨基酸序列中的第1位的氨基酸与第2位的氨基酸之间、第155位～第160位的氨基酸序列内(尤其是第156位的氨基酸与第157位的氨基酸之间)、及/或第170位～第176位的氨基酸序列内(尤其是第172位的氨基酸与第173位的氨基酸之间)，以及/或者被连接于GFP或其突变体的C末端。上述氨基酸的位置编号(残基编号)为GFP的序列号32记载的氨基酸序列中的氨基酸的位置编号。与GFP的序列号32记载的氨基酸序列中的各氨基酸位置对应的、GFP突变体的氨基酸序列中的各氨基酸位置可通过例如以往已知的方法通过对GFP的序列号32记载的氨基酸序列与GFP突变体的氨基酸序列的比对进行比较来确定。这一点对于以下的YFP或其突变体及DsRed或其突变体而言也是同样的。

另外，支架蛋白质为YFP或其突变体时，与GFP或其突变体同样地，优选具有特异性结合能力的肽被直接或介由肽接头插入至在序列号32记载的氨基酸序列中具有氨基酸取代T203Y的YFP的氨基酸序列或YFP突变体的对应氨基酸序列中的第1位的氨基酸与第2位的氨基酸之间、第155位～第160位的氨基酸序列内(尤其是第156位的氨基酸与第157位的氨基酸之间)、及/或第170位～第176位的氨基酸序列内(尤其是第172位的氨基酸与第173位的氨基酸之间)，以及/或者被连接于YFP或其突变体的C末端。

此外，支架蛋白质为DsRed或其突变体时，根据GFP与DsRed的结构比较，优选具有特异性结合能力的肽被直接或介由肽接头插入至DsRed的序列号61记载的氨基酸序列或DsRed突变体的对应氨基酸序列中的第1位的氨基酸与第2位的氨基酸之间、第153位～第158位的氨基酸序列内(尤其是第154位的氨基酸与第155位的氨基酸之间)、及/或第166位～第172位的氨基酸序列内(尤其是第168位的氨基酸与第169位的氨基酸之间)，以及/或者被连接于DsRed或其突变体的C末端。

作为肽接头，可举出包含1段以上(例如2段或3段)的氨基酸序列：GGGGS(序列号35)的接头。肽接头可在本发明涉及的肽融合蛋白质中连接于具有特异性结合能力的肽的N末端及/或C末端。

另外，本发明涉及的肽融合蛋白质可还包含标签。作为标签，可举出例如组氨酸标签(氨基酸序列：HHHHHH(序列号37))、FLAG-tag(氨基酸序列：DYKDDDDK(序列号38))、Strep-tag(氨基酸序列：WSHPQFEK(序列号39))等用于蛋白质分离/纯化的肽标签。标签可例如直接或介由肽接头(例如，氨基酸序列：GGG(序列号36))连接于本发明涉及的肽融合蛋白质的N末端及/或C末端。

本发明涉及的肽融合蛋白质可利用基因重组法来制造。具体而言，可通过对具有编码本发明涉及的肽融合蛋白质的核酸(DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA))的细胞进行培养来制造肽融合蛋白质。

利用基因重组法的制造例如可通过包括下述步骤的方法来进行：将编码本发明涉及的肽融合蛋白质的DNA(基因)插入合适的表达载体中，将载体导入合适的宿主细胞，对得到的细胞(转化体)进行培养，从该细胞内或细胞外液中回收目标肽融合蛋白质。

编码本发明涉及的肽融合蛋白质的DNA可通过例如下述方法来得到：通过使用合适的引物的PCR法合成编码各结构元件(具有特异性结合能力的肽、支架蛋白质、肽接头、肽标签)的DNA，通过常规方法将所述DNA使用连接酶连接。另外，在将具有特异性结合能力的肽插入至支架蛋白质的氨基酸序列中的情况下，例如，可通过下述方法来得到编码本发明涉及的肽融合蛋白质的DNA：通过使用合适的引物的PCR法合成编码插入位置前后的支架蛋白质的N末端片段及C末端片段的2个DNA片段，与编码各结构元件(具有特异性结合能力的肽、肽接头、肽标签等)的DNA一同通过常规方法使用连接酶进行连接。

或者，编码本发明涉及的肽融合蛋白质的DNA也可通过常规方法进行化学合成。

载体没有限定，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、及病毒等载体。作为质粒载体，没有限定，可举出来源于大肠杆菌的质粒(例如pET17b、pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)、及来源于酵母的质粒(例如YEp13、YCp50等)等。作为噬菌体载体，没有限定，可举出T7噬菌体展示载体(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及λ噬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作为病毒载体，没有限定，可举出例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、及仙台病毒等动物病毒、以及杆状病毒等昆虫病毒等。作为粘粒载体，没有限定，可举出Lorist 6、Charomid9-20、及Charomid9-42等。作为噬菌粒载体，没有限定，例如pSKAN、pBluescript、pBK、及pComb3H等是已知的。

载体中可以以能表达目标DNA的方式包含调控序列、用于筛选含有目标DNA的载体的筛选标记、用于插入目标DNA的多克隆位点等。这样的调控序列中包括启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起点、及多聚A位点等。另外，筛选标记可以使用例如氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、及二氢叶酸还原酶基因等。

作为用于导入载体的宿主细胞，可举出例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如，哺乳动物细胞)、及植物细胞等，本发明中，优选使用大肠杆菌中的生产率高的蛋白质(例如GFP、YFP或DsRed或它们的突变体)作为本发明涉及的肽融合蛋白质所包含的支架蛋白质，因此优选使用大肠杆菌作为宿主细胞。向这些宿主细胞的转化或转染包括例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法、粒子轰击(particle gun)法、及PEG法等。

转化细胞的培养按照用于培养宿主细胞的常规方法进行。例如，大肠杆菌、酵母细胞等微生物的培养液含有宿主微生物能同化的碳源、氮源、及无机盐类等。为了使本发明涉及的肽融合蛋白质的回收变得容易，优选使通过表达而生成的该肽融合蛋白质分泌至细胞外。这可以通过将编码能实现肽融合蛋白质从该细胞中的分泌的肽序列的DNA结合于编码该融合蛋白质的DNA的5’末端侧来进行。转移至细胞膜的融合肽经信号肽酶切割，将目标肽融合蛋白质分泌释放至培养基中。或者，也可以回收集聚在细胞内的肽融合蛋白质。这种情况下，将细胞物理性或化学性地破坏，使用蛋白质纯化技术回收目标肽融合蛋白质。

另外，制得的肽融合蛋白质可以通过常规方法、例如凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、亲和色谱、反相柱色谱、HPLC等色谱、硫酸铵分级、超滤、及免疫吸附法等来进行回收或纯化。如上所述，本发明涉及的肽融合蛋白质具有组氨酸标签等纯化用标签时，可利用该纯化用标签从细胞或培养基中纯化肽融合蛋白质。例如，肽融合蛋白质具有组氨酸标签时，可利用固定化金属亲和色谱(IMAC)来纯化肽融合蛋白质。

此外，本发明涉及将上述的本发明涉及的肽融合蛋白质固定化而得的固相担载体。作为“固相担载体”，没有限定，可举出玻璃珠、硅胶等无机担载体、由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类形成的有机担载体、以及通过它们的组合而得到的有机-有机、有机-无机等的复合担载体等，其中，亲水性担载体的非特异吸附较少，肽融合蛋白质的选择性良好，因此是优选的。此处所谓亲水性担载体，表示使构成担载体的化合物成为平板状时的与水的接触角为60度以下的担载体。作为这样的担载体，可举出由纤维素、脱乙酰壳多糖、葡聚糖等多糖类、聚乙烯醇、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝聚乙烯、玻璃等形成的担载体作为代表例。

作为固相担载体的形态，可以是珠状、纤维状、粒子条、膜状(也包括中空纤维)、凝胶状等中的任何，可选择任意的形态。从制作具有特定排阻极限分子量的担载体的容易程度考虑，特别优选使用珠状。对于珠状的平均粒径而言，10～2500μm的平均粒径容易使用，尤其从容易进行肽融合蛋白质固定化反应的方面考虑，优选25μm至800μm的范围。作为固相担载体，具体而言，可举出例如磁珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、硅胶珠、及多糖类珠等。

此外，在固相担载体表面存在可用于肽融合蛋白质的固定化反应的官能团时，有利于肽融合蛋白质的固定化。作为这些官能团的代表例，可举出羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、环氧基、琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基等、酸酐基、碘代乙酰基等。

作为固相担载体，也可使用市售品。作为市售品，可示例作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、GC700、将烯丙基葡聚糖与亚甲基双丙烯酰胺通过共价键交联而得的SephacrylS-1000、作为丙烯酸酯系担载体的Toyopearl、作为琼脂糖系交联担载体的SepharoseCL4B、作为被环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的Eupergit C250L、包含被NHS基活化的Sepharose担载体的NHS活化预装柱等。但是，本实施方式中，并不仅限于这些担载体、活化担载体。

上述的固相担载体可各自单独使用，也可将任意的2种以上混合。另外，作为固相担载体，从其使用目的及方法考虑，期望表面积较大，优选具有许多大小合适的细孔、即为多孔质。

本发明涉及的肽融合蛋白质向固相担载体的固定化可使用本领域技术人员公知的方法来进行，例如可通过物理吸附法、共价结合法、离子结合法等来进行。固定化优选通过例如使肽融合蛋白质的N末端的氨基直接或介由间隔物与固相担载体共价结合来进行。为了通过使肽融合蛋白质的空间位阻较小从而提高分离效率、进而抑制非特异性的结合，更优选介由亲水性间隔物进行固定化。亲水性间隔物没有特别限定，例如，优选使用将两个末端用羧基、氨基、醛基、环氧基等取代而得的聚环氧烷烃的衍生物。

被导入至固相担载体的肽融合蛋白质及作为间隔物使用的有机化合物的固定化方法及条件没有特别限定，可示例通常在将蛋白质、肽固定于担载体时采用的方法。例如，可举出下述方法：使担载体与含有氨基的化合物、含有N-羟基琥珀酰亚胺基的化合物、溴化氰、表氯醇、二缩水甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼等进行反应而活化(变成与担载体原本具有的官能团相比容易与肽融合蛋白质反应的官能团)，与肽融合蛋白质进行反应、固定化的方法；以及，向存在担载体和肽融合蛋白质的体系中加入碳二亚胺这样的缩合试剂、或如戊二醛这样在分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联来进行固定化的方法，更优选应用在固相担载体的灭菌时或利用时肽融合蛋白质不会容易地从固相担载体脱离的固定化方法。

包含本发明涉及的肽融合蛋白质的固相担载体可填充至色谱柱等中，用于纯化或分离靶分子。

另外，本发明涉及靶分子分离用柱，其包含将上述的肽融合蛋白质固定化而得的固相担载体。

靶分子分离用柱包括用于纯化或分离靶分子的、色谱柱、高效液相色谱(HPLC)柱等柱。柱的大小没有特别限定，可根据分析用途、纯化用途、分选用途等用途、施加(apply)(装载)或注入的量、柱的长度或内径等而改变。另外，柱的材质可以是金属、塑料、玻璃等通常作为柱使用的材质。

上述的柱可通过将上述的本发明涉及的固相担载体(可以是干燥或湿润状态中的任何)密实地填充至柱中来制造。

此外，本发明涉及用于纯化靶分子的试剂盒，其包含将上述的肽融合蛋白质固定化而得的固相担载体、或包含该固相担载体的靶分子分离用柱。

该试剂盒可除了固相担载体或靶分子分离用柱以外还包含记载了靶分子的分析步骤、纯化步骤的使用说明书、纯化所需要的试剂、缓冲液、固相担载体的填充用柱中的至少一者。

另外，本发明涉及靶分子的纯化方法，其包括使靶分子与上述固相担载体或靶分子分离用柱结合的步骤、及将结合后的靶分子洗脱并回收靶分子的步骤。

结合步骤可通过本领域技术人员已知的方法来实施。例如，将上述固相担载体或靶分子分离用柱用合适的缓冲液平衡，于0℃～室温(优选0℃～约10℃、更优选约4℃的低温)施加含有靶分子的液体，使靶分子与固相担载体上的肽融合蛋白质结合。例如分离血清中的靶分子时，可使用中性区域的pH(例如pH6.0～7.5)的缓冲液施加至柱中，实施结合步骤。

洗脱步骤也可通过本领域技术人员已知的方法来实施。例如，可以使酸性区域的pH(例如pH2～4)的缓冲液(例如含有0.3M的NaCl的pH3.5至pH2.5的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液或20mM柠檬酸缓冲液)流过柱来进行，也可以使用上述的肽融合蛋白质通过竞争洗脱来进行洗脱。尤其从成本的观点考虑，优选利用酸进行洗脱。这种情况下，通过将固相担载体或柱使用氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、及氢氧化钾溶液等碱性的溶液(例如，0.1M氢氧化钠溶液)洗涤，从而可将固相担载体或柱再生，再次用于结合步骤。溶液的碱性的程度可由本领域技术人员容易地决定。因此，本发明涉及的靶分子的纯化方法可任意地包括通过利用碱性的溶液洗涤来使固相担载体或柱再生的步骤。

关于靶分子是否已被回收，可通过例如利用电泳的分子量确认、及任意地在其后的使用抗靶分子抗体的Western印迹法来进行判定。例如，电泳可通过使用了5～20％丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-PAGE来实施，另外，Western印迹法可将电泳后的蛋白质转印至PVDF膜，用脱脂奶封闭后，使用抗靶分子山羊抗体和HRP标记抗山羊IgG小鼠抗体进行检测。

本发明涉及的靶分子的纯化方法可用于在从通过各种方法生产的含有靶分子的生产物中纯化靶分子的步骤中得到富含靶分子的组分的情况。因此，优选在亲和色谱、HPLC等柱色谱中使用本发明涉及的靶分子的纯化方法。在纯化靶分子时，除了这样的色谱法以外，还可适当组合蛋白质的惯用纯化技术、例如凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、反相柱色谱等色谱、硫酸铵分级、超滤等。

实施例

以下，使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围不限于这些实施例。

需要说明的是，图1示出本实施例中制作的IgG结合肽融合蛋白质、IgA结合肽融合蛋白质及IgY结合肽融合蛋白质的氨基酸序列以及编码这些融合蛋白质的DNA序列。

〔实施例1：IgG结合肽融合蛋白质的亲和性测定〕

将编码由序列号43表示的氨基酸序列组成的蛋白质(sfGFP-C-1Opt1)的DNA(序列号42)插入pET17b载体的NdeI/HindIII位点，构建表达质粒。

使用构建的表达质粒，将大肠杆菌株SHuffle T7 Express(New EnglandBiolabs)或OverExpress C43(DE3)(Lucigen)转化，在LB琼脂平板(50μg/mL氨苄青霉素)上培养。将得到的单菌落在LB培养基10mL(50μg/mL氨苄青霉素，0.5％葡萄糖)、37℃、200rpm的条件下预培养一夜。将得到的培养液以成为OD₆₀₀＝0.1的方式接种于新的LB培养基500mL(50μg/mL氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm的条件下开始主培养。在OD₆₀₀＝0.5-1.5期间添加1mM IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在25℃、200rpm的条件下实施一夜表达诱导。将得到的培养液离心分离(20k x g，4℃，5分钟)，回收蛋白质表达大肠杆菌。

对于回收的菌体，通过使用BugBuster(Merck Millipore)处理来溶菌。通过离心分离得到可溶性组分后，使用HiTrap TALON crude(GE Healthcare)将包含组氨酸标签的目标蛋白质纯化。将纯化的蛋白质溶液的溶剂置换为保存液(25mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)，用于后述的分析实验。

亲和性分析通过以下的方法实施。首先，向安装于BIAcoreT200(GE healthcare)的CM5传感芯片上，以10μl/ml的流速将等量混合的0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺))和0.1Msulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide，磺基-N-羟基琥珀酰亚胺))溶液注入传感芯片，由此将传感芯片激活。然后，在pH 5.5(10mM乙酸Na)的条件下，将上述的纯化的蛋白质(sfGFP-C-1Opt1)固定化于传感芯片上。测定使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，3mM EDTA，pH 7.4)，以流速50μl/ml将6.25、12.5、25、50、100、200、400nM的人IgG注入180秒，由此对结合反应进行监控。解离反应测定时，仅将缓冲液注入600秒。相互作用参数的分析使用BIAevalution T100软件实施。

〔比较例1〕

作为比较例1，将IgG结合肽未融合的支架蛋白质(具有His标签的sfGFP；DNA序列：序列号40，氨基酸序列：序列号41)使用与实施例1同样的方法表达·纯化，实施亲和性的测定。

实施例1及比较例1的结果示于图2。如图2所示，可见与支架蛋白质融合的肽具有IgG结合功能，可用于IgG纯化。

〔实施例2：IgG结合肽2价融合蛋白质的亲和性测定〕

将包含2个IgG结合肽的、分别由序列号45、序列号47、序列号49表示的氨基酸序列组成的蛋白质(sfGFP-N C-2Opt1GSl2(DNA序列：序列号44)、sfGFP-173 C-2Opt1GSl2(DNA序列：序列号46)、sfGFP-173 C-20pt1GSl3(DNA序列：序列号48))使用与实施例1同样的方法表达·纯化，实施亲和性的测定。

〔比较例2〕

作为比较例2，使用与实施例1同样的方法实施通过化学合成制作的肽(氨基酸序列：序列号18)的亲和性测定。

实施例2及比较例2的结果示于图3，相互作用参数示于表1。

[表1]

	IgG结合肽融合蛋白质	k<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	k<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(M)
					比较例2		3.3x10<sup>5</sup>	4.8x10<sup>-3</sup>	1.4x10<sup>-8</sup>
实施例1	sfGFP-C-1Opt1	7.2x10<sup>5</sup>	2.1x10<sup>-3</sup>	2.8x10<sup>-8</sup>
					实施例2	sfGFP-N C-2Opt1GSl2	3.6x10<sup>5</sup>	8.0x10<sup>-4</sup>	2.2x10<sup>-9</sup>
实施例2	sfGFP-173 C-2Opt1GSl2	3.1x10<sup>5</sup>	5.4x10<sup>-4</sup>	1.8x10<sup>-9</sup>
					实施例2	sfGFP-173 C-2Opt1GSl3	1.9x10<sup>5</sup>	4.8x10<sup>-4</sup>	5.4x10<sup>-9</sup>

如图3及表1所示，可见肽2价融合蛋白质与肽单独、或者肽1价融合蛋白质相比解离速率慢，为高亲和性。

〔实施例3：动态结合载量(DBC)测定〕

针对IgG结合肽2价融合蛋白质是否可用作人抗体纯化亲和性配体，将实施例2中制作的蛋白质(sfGFP-173 C-2Opt1GSl2)固定化于NHS活化预装柱(GE Healthcare)，实施吸附性能评价。蛋白质固定化柱通过以下的方法制作。需要说明的是，溶液的输送使用了注射器。

向1mL容量的NHS活化预装柱输送1mM盐酸5mL，除去柱内的异丙醇溶液。然后，输送含有7.3mg的IgG结合肽融合蛋白质的偶联溶液(200mM碳酸缓冲液，500mM氯化钠，pH 8.3)1mL，于室温固定化1小时。对于未反应的NHS酯，加入三羟基甲基氨基甲烷从而进行封闭。最后，输送吸附溶液(20mM磷酸缓冲液，150mM氯化钠，pH7.4)5mL，用于DBC测定。

DBC测定使用液相色谱装置AKTAexplore(GE Healthcare)实施。将制作的柱使用吸附溶液进行平衡后，以1mL/min的流速输送溶解于吸附溶液的1mg/mL来源于人血清的γ-球蛋白(Sigma-Aldrich)。关于DBC，通过在280nm吸光度处、除去非吸附成分后的值达到样品总体吸光度的10％时所输送的试样量来求出。

〔比较例3〕

作为比较例3，制作将通过化学合成制作的肽(氨基酸序列：序列号18)以与实施例3的蛋白质等摩尔(0.5mg)的量固定化而得的柱，实施DBC测定。

图4示出色谱图。基于图4的色谱图算出的DBC为实施例3(IgG结合肽2价融合蛋白质)：8.9mg/mL柱、比较例3(合成肽)：6.9mg/mL柱，可见将肽2价融合蛋白质固定化而得的柱与合成肽固定化柱相比吸附性能提高。

〔实施例4：γ-球蛋白的吸脱附〕

使用实施例3中制作的柱，研究了IgG能否吸脱附。将柱安装于液相色谱装置AKTApure 25(GE Healthcare)，使用吸附溶液平衡后，以1mL/min的流速输送1mg/mL来源于人血清的γ-球蛋白500μL。用5mL的吸附溶液洗涤柱后，使洗脱溶液(20mM柠檬酸，pH2.5)通过，由此洗脱吸附成分。色谱图示于图5。

通过pH的降低，确认到吸附的来源于人血清的γ-球蛋白的洗脱，可见该肽可用作亲和柱的配体。

〔实施例5：IgG结合肽融合黄色荧光蛋白的亲和性测定〕

为了验证IgG结合肽在其他支架蛋白质中是否也发挥功能，设计IgG结合肽融合至黄色荧光蛋白(sfYFP)而得的分子(DNA序列：序列号54，氨基酸序列：序列号55)，与实施例1同样地实施了蛋白质的表达·纯化以及亲和性分析。亲和性测定装置、分析软件分别使用了Biacore X100、Biacore X100 Evalution Software。

〔比较例4〕

作为比较例4，将IgG结合肽未融合的黄色荧光蛋白(sfYFP，DNA序列：序列号52，氨基酸序列：序列号53)使用与实施例5同样的方法表达·纯化，实施亲和性的测定。实施例5及比较例4的结果示于图6。

如图6所示，可见融合至黄色荧光蛋白中的肽具有IgG结合功能。

〔实施例6：IgA、IgY结合肽融合蛋白质的亲和性测定〕

为了验证在其他具有特异性结合能力的肽中是否也与IgG结合肽同样地发挥功能，设计IgA、IgY结合肽融合至绿色荧光蛋白(sfGFP)而得的分子(分别为DNA序列：序列号56及氨基酸序列：序列号57；DNA序列：序列号58及氨基酸序列：序列号59)，与实施例5同样地实施了蛋白质的表达·纯化以及亲和性分析。

如图7所示，可见融合至绿色荧光蛋白中的IgA、IgY结合肽具有结合功能，表明具有特异性结合能力的肽即使在融合至支架蛋白质中的情况下仍然能保持其结合功能。

〔实施例7：IgA、IgY的吸脱附〕

使用将实施例6中制作的绿色荧光蛋白(sfGFP)与IgA、IgY结合肽融合而成的分子10mg固定化而得的柱，研究了IgA、IgY能否吸脱附。将柱安装于液相色谱装置AKTA pure 25(GE Healthcare)，使用吸附溶液平衡后，以1mL/min的流速输送500μL的0.2mg/mL的来源于人血清的IgA、或鸡IgY。用5mL的吸附溶液洗涤柱后，使洗脱溶液(20mM柠檬酸，pH2.5)通过，由此洗脱吸附成分。色谱图示于图8。

通过pH的降低，确认到吸附的IgA、或IgY的洗脱，可见该肽可用作亲和柱的配体。

本说明书引用的所有出版物、专利及专利申请均通过引用而原样并入本说明书。