WO2014115229A1 - 抗体結合性ペプチド - Google Patents

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WO2014115229A1
WO2014115229A1 PCT/JP2013/007583 JP2013007583W WO2014115229A1 WO 2014115229 A1 WO2014115229 A1 WO 2014115229A1 JP 2013007583 W JP2013007583 W JP 2013007583W WO 2014115229 A1 WO2014115229 A1 WO 2014115229A1
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seq
polypeptide
amino acid
protein
region
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PCT/JP2013/007583
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渡邊　秀樹
真也 本田
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a peptide showing binding activity to the Fc region of immunoglobulin G, and an antibody, immunoglobulin G or protein containing the immunoglobulin G Fc region, and a method for detecting, purifying, immobilizing or removing the same.
  • the so-called antibody drug which uses monoclonal antibodies for therapeutic purposes, is the largest biopharmaceutical segment with annual sales exceeding $ 30 billion, and the fastest growing segment of the entire pharmaceutical industry. To date, 23 full-size monoclonal antibodies and three fragmented monoclonal antibodies have been launched, some of which are already blockbusters with annual sales of over $ 1 billion. The number of monoclonal antibodies as drug candidates for which clinical trials were started between 1995 and 2007 has increased more than three times, and the number continues to grow (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • Suzuki et al. Identified multiple polypeptides having binding activity to the Fc region of human IgG using a phage library displaying 7- or 12-residue linear peptides on filamentous bacteriophage M13, and bound to the Fc region. The presence or absence of sex was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Patent Document 1). In addition to binding to human IgG, they created peptides by extracting common sequences from the identified sequences, as well as IgG Fc from horses, sheep, rabbits, guinea pigs, goats, cats, dogs, cows, pigs, and mice. Binding activity to the region was confirmed by ELISA.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Verdoliva et al. Screened a synthetic peptide library represented by (Cys Xaa 3 ) 2 Lys Gly (SEQ ID NO: 167) introduced with a branched structure with Lys residues and cyclization with Cys residues against mouse monoclonal IgG, A peptide FcRM showing binding properties in the vicinity of the hinge region was prepared. They further constructed affinity chromatography with this FcRM immobilized, and reported purification of mouse and human IgG (Non-patent Document 9).
  • Non-patent Document 10 Used a phage library displaying a cyclic peptide represented by Cys Xaa 7-10 Cys on a T7 bacteriophage to produce a peptide that binds to the Fc region of human IgG (Non-patent Document 10).
  • the peptides produced by them differ from the above-mentioned IgG-binding peptides produced so far in that they recognize not the natural structure of the Fc region but the non-natural structure produced by acid treatment. Ito et al. Disclosed that this peptide can be used to investigate the content of non-natural structure produced by acid treatment in human antibody drugs, immunoglobulin preparations, and IgG reagents (Patent Document 3).
  • an antibody-binding molecule that has appropriate characteristics in terms of whether it binds to an antibody of an animal species or only to an antibody of a specific animal species, whether it is soluble or stable, and can be mass-produced. is there. Furthermore, in the case of peptides, whether it contains non-natural amino acid residues or only natural amino acid residues, the chemical structure is linear, cyclic or branched, and has a three-dimensional structure that is stable in solution. Whether it is formed or can be used in a reducing environment is also an item of aptitude judgment.
  • short-chain polypeptides are improved in functionality by cyclic stabilization such as intramolecular disulfide bridges, but the cyclization requires complicated chemical reactions, and for example, formation of disulfide bridges under reducing conditions, etc. Under difficult conditions, the binding function cannot be exhibited. Examples of situations where disulfide bridge formation is difficult are as follows: (1) cytoplasmic environment, and (2) thiol groups of cysteine residues in the target IgG or Fc region are released for the purpose of chemical modification, etc. An environment where a reducing agent is added to make a base is assumed.
  • Non-patent document 11 It has been reported that antibody molecules form a non-natural structure called an alternative folded state (AFS) different from a normal natural structure due to various physical or chemical stresses. Such a non-natural structure has been suggested to have a risk of causing a side effect due to the induction of immunogenicity as well as a decrease in the effect of the drug, and a technique for analyzing an antibody having a non-natural structure is required. (Non-patent document 12).
  • AFS alternative folded state
  • Analysis techniques that can clarify the molecular shape or three-dimensional structure of proteins include X-ray crystal structure analysis, nuclear magnetic resonance, electron microscope, analytical ultracentrifugation, isoelectric focusing, dynamic light scattering, circular polarization
  • X-ray crystal structure analysis and nuclear magnetic resonance capable of providing three-dimensional structure information with atomic level accuracy require analysis time on the order of several months.
  • dynamic light scattering or liquid chromatography which can complete the measurement in a few minutes, cannot detect minute changes in molecules or minute amounts of contamination. For this reason, a simple technique that achieves both atomic level accuracy and throughput is required.
  • Non-patent Document 13 an affinity chromatography technique using a molecule having a specific affinity for an antibody as a ligand is indispensable today.
  • natural proteins derived from bacteria such as protein A and protein G are used as ligands for this purpose. These proteins have good antibody affinity, but have disadvantages of low stability and high production costs.
  • JP 2004-187563 A International Publication Number WO / 2001/045746 Specification International Publication Number WO / 2008/054030 Specification
  • the present invention has binding activity to the Fc region of immunoglobulin G, and can be suitably used for detection, purification, immobilization, or removal of an antibody, immunoglobulin G, or a protein containing the Fc region of immunoglobulin G.
  • the purpose is to provide new polypeptides and to expand the molecular diversity of antibody-binding polypeptides available in the industry.
  • a short polypeptide having a specific amino acid sequence pattern exhibits high binding activity to a human IgG antibody. Furthermore, it was also shown that these polypeptides have a low dissociation rate in binding to a human IgG antibody, and that the binding is more easily retained. Furthermore, it was shown that some of these polypeptides bind only to the non-natural structure of human IgG antibody obtained by acid treatment and reduction treatment. The present invention has been completed based on these findings.
  • the terms “peptide”, “polypeptide” and “protein” are used interchangeably.
  • the present invention includes the following.
  • Formula 1 YDPxTGTWRSx- [IL] (SEQ ID NO: 1) (1)
  • x represents any amino acid residue.
  • [] Represents any one of the amino acid residues in [].
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence to which one or several amino acid residues are added in the amino acid sequence, and binding activity to the Fc region of immunoglobulin G
  • a polypeptide showing: [2] SEQ ID NOs: 2 to 6: YDPRTGTWRSSIAYGGG (SEQ ID NO: 2) YDPGTGTWRSYLRFGGG (SEQ ID NO: 3) YDPYTGTWRSSIWVLSG (SEQ ID NO: 4) YDPGTGTWRSWLSFNVG (SEQ ID NO: 5) YDPWTGTWRSFIWGGGG (SEQ ID NO: 6)
  • the polypeptide according to [1] comprising the amino acid sequence represented by any of the following: [3]
  • [] Represents any one of the amino acid residues in [].) Or a polypeptide consisting of an amino acid sequence to which one or several amino acid residues are added in the amino acid sequence, and binding activity to the Fc region of immunoglobulin G
  • polypeptide according to [20] which is a linked polypeptide obtained by extending two polypeptides; [22] Amino terminus or carboxyl of the polypeptide of any one of [1], [3], [5], [7], [9], [12], [14], [16], and [18] A fusion protein in which a protein is bound to one end or both ends, and shows a binding activity to the Fc region of immunoglobulin G; [23] Proteins at the amino terminus, carboxyl terminus, or both terminus of the polypeptide of any of SEQ ID NOs: 2-9, 11-19, 21, 22, 24-55, 57-81, 158-164, and 174-178 A protein according to [22], which is a fusion protein bound with [24] The protein according to [22], comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 82 to 119; [25] A nucleic acid encoding the polypeptide or protein according to any one of [1] to [24]; [26] The nucle
  • the antibody, immunoglobulin G or Fc region-containing protein having a non-natural three-dimensional structure is brought into contact with the immobilized polypeptide or immobilized protein described in the above, and the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or group Binding to a recombinant virus, or an immobilized polypeptide or protein, and (2) A polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or an antibody having an unnatural three-dimensional structure bound to an immobilized polypeptide or immobilized protein, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein Recovering from the sample,
  • a method comprising: [36] A method for removing an antibody having an unnatural three-dimensional structure, an immunoglobulin G or an Fc region-containing protein, (1) The poly
  • the antibody, immunoglobulin G or Fc region-containing protein having a non-natural three-dimensional structure is brought into contact with the immobilized polypeptide or immobilized protein described in the above, and the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or group Binding to a recombinant virus, or an immobilized polypeptide or protein, and (2) A polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or an antibody having an unnatural three-dimensional structure bound to an immobilized polypeptide or immobilized protein, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein Removing from the sample,
  • a method comprising: [37] The method according to any one of [34] to [36], which is carried out in a reducing environment.
  • the polypeptide of the present invention exhibits high binding activity to human IgG antibody and has a slow dissociation rate in binding to human IgG antibody. Furthermore, some of these polypeptides bind only to the non-natural structure of the human IgG antibody obtained by acid treatment and reduction treatment, and do not bind to the natural IgG antibody.
  • the IgG-binding polypeptide of the present invention can be used to immobilize, detect, purify, and remove antibody immunoglobulin G (IgG) or a fusion protein to which the Fc region has been added.
  • Polypeptide 2A1 (SEQ ID NO: 11) ⁇ ⁇ ⁇ having SEQ ID NO: 10 as a common amino acid sequence does not show any binding to natural IgG, unlike normal IgG-binding molecules, and is not caused by acid treatment, reduction treatment, etc. It binds specifically to the native structure. This property can be used for immobilization, detection, purification, and removal of IgG having a non-natural structure.
  • polypeptide 2A1 also exhibits binding activity to the Fc region exposed to reducing conditions.
  • polypeptide 2A1 exhibits high heat inactivation resistance.
  • the IgG-binding polypeptide of the present invention does not depend on stabilization by cyclization, it does not require a complicated chemical reaction accompanying cyclization, and for example, conditions under which disulfide bridge formation is difficult such as under reducing conditions. Even below, the binding function can be expressed.
  • (A) shows the results of measurement of binding activity to the 2A1 human Fc region (Jackson Immunoresearch) by surface plasmon resonance. Represents the binding curve of each human Fc region diluted to a concentration of 600, 500, 400, 300, 200, 100 nM for 2A1 immobilized on the sensor chip.
  • (B) shows the results of measuring the binding activity of 2A1 against natural human monoclonal IgG by surface plasmon resonance. Represents the binding curve of each natural IgG diluted to a concentration of 600, 500, 400, 300, 200, 100 nM for 2A1 immobilized on the sensor chip.
  • (C) shows the results of measuring the binding activity of 2A1 against the natural human Fc region by surface plasmon resonance.
  • D shows the results of measuring the binding activity of 2A1 to acid-denatured human IgG by surface plasmon resonance. The binding curve of each acid-denatured human IgG diluted to a concentration of 250, 125 nM to 2A1 immobilized on the sensor chip is shown.
  • (E) shows the results of measuring the binding activity of 2A1 to the reduced human Fc region by surface plasmon resonance. Represents the binding curve of each reduced human Fc region diluted to a concentration of 600, 400, or 200 nM for 2A1 immobilized on the sensor chip.
  • (F) shows the results of measurement of binding activity to 2A1 AFS-type human IgG by surface plasmon resonance.
  • the detection result of mixed AFS type IgG by surface plasmon resonance is shown. It represents a binding curve for a sample in which AFS-type IgG was mixed at a ratio of 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001% to a natural IgG of a concentration of 6.7 ⁇ M.
  • the detection result of mixed AFS type IgG by size exclusion chromatography is shown.
  • a chromatogram for a sample in which AFS type IgG is mixed at a ratio of 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001% to a natural type IgG with a concentration of 6.7 M is shown.
  • the inset shows an enlarged version of the multimeric fraction.
  • B The result regarding the detection range of AFS type IgG by size exclusion chromatography is shown. Calculate the abundance of the multimeric fraction based on the peak areas of the multimeric and monomeric fractions of IgG obtained from the chromatogram in Fig.
  • the results of electrophoresis of the molecular weight marker (lane 1), the flow-through fraction (lane 2), the elution fraction (lane 3), and the column (lane 4) in the chromatogram of FIG. 5 are shown.
  • purification by affinity chromatography of human IgG using a p17_trx fixed column is shown.
  • the solid line shows a chromatogram obtained by applying human monoclonal IgG to a column and eluting with a pH gradient. The broken line indicates the pH of the buffer. Evaluation of binding specificity using 2A1 peptide-immobilized resin.
  • the present invention relates to a polypeptide showing binding activity to immunoglobulin G and its Fc region, and a method for detecting, fixing, purifying or removing immunoglobulin G and Fc region using the same.
  • amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is YDPxTGTWRSx- [IL] represented by SEQ ID NO: 1 (wherein x represents any amino acid residue. [] Is an amino acid within [ ⁇ ]. Which represents any one of the residues) as a consensus sequence. More preferably, it is a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 6. Like the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 7 to 9 shown in Example 1 below, the polypeptide of the present invention has binding activity to the Fc region of immunoglobulin G based on this common sequence ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 1).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which several, for example, 1 to 6, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acid residues are added, deleted, substituted or inserted as long as they are not impaired. Including. The number of amino acid residues in the polypeptide sequence is not limited as long as it includes the above amino acid sequence.
  • the recombinant phage displaying the polypeptide on the surface layer by transforming with the nucleic acid encoding the polypeptide also has binding activity to the Fc region of immunoglobulin G.
  • this invention includes the transformant which has the nucleic acid which codes the polypeptide which has the said amino acid sequence, the fusion protein containing this, and these polypeptides or fusion protein.
  • R- [QRS] -xx- [GS] -YDPRTGTWRSSIAYGG represented by SEQ ID NO: 10 (wherein x represents any amino acid residue. [] Is within [].
  • a polypeptide comprising a consensus sequence as a consensus sequence more preferably a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 11 to 14.
  • SEQ ID NOS: 15 to 21 shown in Example 1 below the polypeptide of the present invention loses the binding activity to the Fc region of immunoglobulin G based on this common sequence (SEQ ID NO: 10).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3 amino acid residues are added, deleted, substituted or inserted is included.
  • the number of amino acid residues in the polypeptide sequence is not limited as long as it includes the above amino acid sequence.
  • a polypeptide comprising DAAWHLGELVWATYYDPETGT-WxPDWxxM (wherein x represents any amino acid residue) represented by SEQ ID NO: 23 as a common sequence, more preferably SEQ ID NO: 24-54
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by Like the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 shown in Example 2 below, the polypeptide of the present invention has binding activity to the Fc region of immunoglobulin G based on this common sequence (SEQ ID NO: 23).
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3 amino acid residues are added, deleted, substituted or inserted as long as they are not damaged .
  • the number of amino acid residues in the polypeptide sequence is not limited as long as it includes the above amino acid sequence.
  • [RSG]-[AGV] -xYDPETGTWYDAAWHLGELVW-ATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ (wherein x represents any amino acid residue. [] Represents the amino acid residue in [].
  • the polypeptide of the present invention binds to the Fc region of immunoglobulin G based on this common sequence (SEQ ID NO: 56).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3 amino acid residues are added, deleted, substituted or inserted within a range in which the activity is not impaired including.
  • the number of amino acid residues in the polypeptide sequence is not limited as long as it includes the above amino acid sequence.
  • the polypeptide and protein of the present invention may be labeled. That is, the present invention provides a modified poly- mer in which an organic compound, an inorganic compound, or both an organic compound and an inorganic compound are bound to the above-mentioned polypeptide or fusion protein as long as the binding activity to the Fc region of immunoglobulin G is not impaired. Includes peptides or modified proteins. By binding the above organic compound, etc., it is possible to effectively immobilize, purify, detect, and remove antibodies, immunoglobulin G or proteins containing the Fc region of immunoglobulin G, which are examples of uses of the present invention described in the lower part. It can be carried out.
  • organic compounds used include fluorescent organic compounds such as biotin and fluorescein, stable isotopes, phosphate groups, acyl groups, amide groups, ester groups, epoxy groups, polyethylene glycol (PEG), lipids, sugar chains, nucleic acids, Fluorescent inorganic compounds such as quantum dots and gold colloids are preferred (Basle E, Joubert N, Pucheault M. Protein chemical modification on endogenous amino acids. Chem Biol. 2010, 17 (3), 213-27.) Does not exclude any other technically applicable compounds.
  • fluorescent organic compounds such as biotin and fluorescein, stable isotopes, phosphate groups, acyl groups, amide groups, ester groups, epoxy groups, polyethylene glycol (PEG), lipids, sugar chains, nucleic acids, Fluorescent inorganic compounds such as quantum dots and gold colloids are preferred (Basle E, Joubert N, Pucheault M. Protein chemical modification on endogenous amino acids. Chem Biol. 2010, 17 (3), 213-27.) Does not exclude
  • the use of the polypeptide of the present invention is not limited as long as it uses the binding activity to the Fc region of immunoglobulin G of the molecule.
  • immobilization and purification of antibodies, immunoglobulin G, or proteins containing the Fc region of immunoglobulin G are used for artificially produced immunoglobulin G binding polypeptides or microorganism-derived immunoglobulin G binding proteins.
  • detection and removal There is detection and removal (Non-patent document 14, Non-patent document 15, Patent document 1, Patent document 3, Non-patent document 6, Non-patent document 9). Therefore, uses of the polypeptide of the present invention include all forms that are technically applicable among uses known to those skilled in the art, including uses carried out using the immunoglobulin G-binding molecule. In the examples described later, detection, purification, and removal of immunoglobulin G are mentioned, but other forms of use are not excluded.
  • a polypeptide having SEQ ID NO: 10 as a common amino acid sequence has specific binding activity to immunoglobulin G and Fc regions having a non-natural structure as shown in Example 1 7) below. Therefore, it can be used for immobilization, purification, detection and removal of immunoglobulin G and Fc regions of non-natural structure.
  • a non-natural structure is a general term for a structure group different from a natural structure, which is caused by a physical impact such as acid treatment, heat treatment, modifier treatment, reducing agent treatment, shearing or stirring. is there.
  • the acid treatment is not limited, but preferably means exposure to pH 4.0 or lower, more preferably pH 1.5 to 2.0.
  • immunoglobulin G forms a non-natural structure called Alternative folded state (AFS), which is different from the normal natural structure, by treating with 10 mM Glycine-HCl, 150 mM NaCl, pH 2.0 buffer. It has been reported (Non-patent document 16, Non-patent document 17, Non-patent document 18).
  • Non-patent Document 19 As other chemical treatments and physical treatments, physical impacts such as reducing agent treatment, shearing and stirring are widely known.
  • reducing agent treatment refers to a state where the intramolecular or intermolecular disulfide bond is partially or entirely cleaved.
  • Non-patent document 21 refers to the state in which the disulfide bond is cleaved by the addition of a reducing agent (DTT, ⁇ -mercaptoethanol, 2-mercaptoethylamine, etc.).
  • a reducing agent DTT, ⁇ -mercaptoethanol, 2-mercaptoethylamine, etc.
  • the reduction treatment was performed by treating with 50 mM mM 2-mercaptoethylamine for 90 minutes, but the reagent causing the reduction conditions is not limited thereto.
  • the physical impact such as stirring and shearing is not limited, but for example, by rotating an immunoglobulin G solution at a speed of 700 rpm using a stirring bar, oxidation of amino acid residues, It has been reported that denaturation and resulting protein aggregation occur (Non-patent document 21, Non-patent document 22).
  • Example 1 the results of the measurement of the binding activity to the immunoglobulin G and Fc regions treated with acid and / or heat treatment, reduction treatment, AFS formation conditions with acid are shown.
  • immunoglobulin G and Fc regions bound by the peptide other non-natural structures are not excluded.
  • the immunoglobulin G-binding polypeptide of the present invention does not depend on cyclization by disulfide bridge, and functionalization / stabilization thereby. Accordingly, the binding function can be expressed even under reducing conditions in which formation of disulfide bridges is difficult. Examples of situations where reduction conditions that make disulfide bridge formation difficult are assumed include (1) cytoplasmic environment, (2) thiol group of cysteine residues in the target immunoglobulin G or Fc region, etc. For example, an environment in which a reducing agent is added to form a free radical is assumed.
  • Example 1 the Fc region was treated with reducing agent 2-mercaptoethylamine (Thermo Scientific Pierce) ⁇ ⁇ as the reducing condition, and the reducing condition was maintained in the presence of the chelating agent ethylenediaminetetraacetic acid (non- However, other disulfide non-crosslinking conditions are not excluded.
  • reducing agent 2-mercaptoethylamine Thermo Scientific Pierce
  • the method for synthesizing the polypeptide and the form to be used are not limited.
  • the methods for preparing the identified polypeptide include organic chemical synthesis and genetic recombination methods (Reference: Kenji Samukawa, Peptide and Drug Discovery, Medical Do), and expression in the form of a fusion protein linked to any protein. Numerous synthetic methods have been reported, such as Method IV (reference: Tatsuya Moriyama, Tips for Protein Purification and Handling, Yodosha), and preparation of polypeptides with specified amino acid sequences can be easily performed by applying existing synthesis techniques. Can do.
  • preparation by organic chemical synthesis preparation by cell expression as a fusion protein
  • preparation of the target polypeptide by protease cleavage of the fusion protein preparation of the target polypeptide by protease cleavage of the fusion protein
  • transformation with a nucleic acid encoding the polypeptide An example of a recombinant phage displaying the polypeptide on the surface is shown, but other methods including the above techniques are not excluded.
  • the present invention also relates to a solid phase carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized.
  • suitable solid phase carriers include, but are not limited to, resins such as polystyrene and polyester, biopolymer compounds such as dextran and agarose, and inorganic materials such as metal and glass.
  • the shape of these solid phase carriers may be any shape such as particles, plates, membranes, chips, and test tubes.
  • the immobilization method of the polypeptide to these solid phase carriers can be performed by a covalent bond method, a physical adsorption method, an ion bond method, or an intermolecular interaction method.
  • the surface plasmon resonance measuring device is immobilized on the sensor chip by the covalent bond method, and is immobilized on the polymer particles as the affinity chromatography column.
  • other support carriers are used. Does not exclude immobilization methods.
  • a molecule containing the polypeptide, such as the polypeptide of the present invention and a fusion protein, can be suitably used for immobilizing, purifying, or removing the immunoglobulin G and Fc regions by immobilizing it on a solid phase carrier.
  • Fab G was purified by affinity chromatography using a column to which a fusion protein containing a polypeptide was immobilized, and the Fc region was removed and purified from the product obtained by enzymatic digestion of immunoglobulin G with papain.
  • the form of the solid phase carrier and the immobilization method are not limited thereto, and are suitable for protein purification methods known to those skilled in the art, such as particles such as magnetic particles and filter membranes. Applicable to.
  • the molecule to be purified can be applied to a fusion protein in which an Fc region is linked to any protein such as a cytokine or an enzyme.
  • Methods for measuring polypeptide binding activity include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR), isothermal titration calorimeter (ITC), quartz crystal microbalance (QCM), atomic force Examples thereof include a microscope jar (AFM) (Non-Patent Document 24), a pull-down method (Non-Patent Document 25), an electrophoresis method (Non-Patent Document 26), and a fluorescence polarization degree measuring method (Non-Patent Document 27).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • SPR surface plasmon resonance
  • ITC isothermal titration calorimeter
  • QCM quartz crystal microbalance
  • polypeptide and fusion protein of the present invention it is possible to detect and separate (purify or remove) an antibody having a non-natural three-dimensional structure, immunoglobulin G or Fc region-containing protein in a sample.
  • a method for detecting an antibody having a non-natural three-dimensional structure, immunoglobulin G or Fc region-containing protein in a test sample can comprise the following steps: (1) contacting a test sample with the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or immobilized polypeptide or immobilized protein of the present invention, and (2) A step of determining whether binding has occurred between the test sample and the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or immobilized polypeptide or immobilized protein.
  • the methods used to determine whether or not the above binding has occurred include ELISA, SPR, ITC, QCM, AFM, pull-down method, electrophoresis method, fluorescence polarization measurement method, fluorescence resonance energy transfer method (FRET), column Examples thereof include chromatography and immunochromatography. In the examples described later, an example of the surface plasmon resonance method is shown, but other technically applicable methods including the above technology are not excluded.
  • a method for purifying an antibody having an unnatural conformation, an immunoglobulin G or an Fc region-containing protein may comprise the following steps: (1) A sample containing an antibody having an unnatural type three-dimensional structure, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein, a polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus of the present invention, or an immobilized polypeptide or An antibody having a non-natural three-dimensional structure, immunoglobulin G or Fc region-containing protein is contacted with an immobilized protein, and the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or immobilized polypeptide or Binding to the immobilized protein; and (2) A polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or an antibody having an unnatural three-dimensional structure bound to an immobilized polypeptide or immobilized protein, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein Recover
  • Examples of the method used in the step of recovering from the sample include an affinity chromatography method, an affinity bead method, an affinity filter method, and an immunoprecipitation method.
  • affinity chromatography methods are shown, but other technically applicable methods including the above-described technology are not excluded.
  • a method for removing an antibody having an unnatural conformation, an immunoglobulin G or an Fc region-containing protein may comprise the following steps: (1) A sample containing an antibody having an unnatural type three-dimensional structure, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein, a polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus of the present invention, or an immobilized polypeptide or An antibody having a non-natural three-dimensional structure, immunoglobulin G or Fc region-containing protein is contacted with an immobilized protein, and the polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or immobilized polypeptide or Binding to the immobilized protein; and (2) A polypeptide, protein, transformant, recombinant phage or recombinant virus, or an antibody having an unnatural three-dimensional structure bound to an immobilized polypeptide or immobilized protein, an immunoglobulin G or Fc region-containing protein Remov
  • Examples of the method used in the step of removing from the sample include an affinity chromatography method, an affinity bead method, an affinity filter method, and an immunoprecipitation method.
  • affinity chromatography methods are shown, but other technically applicable methods including the above-described technology are not excluded.
  • amino acid sequences of a number of polypeptides exhibiting antibody binding activity were specified was described, and then amino acids of SEQ ID NOs: 2 to 6 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a common sequence
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 11 to 14 including the sequence and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 as a common sequence, and several amino acids within these amino acid sequences as long as the binding activity to the Fc region of immunoglobulin G (IgG) is not lost
  • Synthetic polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7-9, 15-21, SEQ ID NO: 22 which is part of them, or a fusion protein comprising these amino acid sequences, wherein amino acid substitutions are added, deleted, substituted or inserted
  • an example in which the binding activity of a recombinant phage transformed with a nucleic acid encoding these amino acid sequences was measured is shown.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of Tyr-Asp-Pro-Xaa-Thr-Gly-Thr-Trp- (Xaa) 8 -Gly (SEQ ID NO: 168) (where Xaa represents an arbitrary amino acid residue)
  • Xaa represents an arbitrary amino acid residue
  • a phage library displayed at the C-terminus of the outer protein g10 of T7 phage via a linker consisting of the amino acid sequence of Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 169), and T7Select10-3 Cloning Kit (Novagen) Constructed using. All procedures necessary for construction were in accordance with the attached T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen).
  • phages that bound to the Fc region of human IgG as the target substance were selected.
  • 20 ⁇ g of biotinylated human IgG Fc region Jackson Immunoresearch
  • Streptavidin MagneSphere Trademark
  • Paramagnetic Particles Promega 0.65 ml used as avidin fixed magnetic beads, and Fc region via avidin-biotin bond.
  • the blocking agent SuperBlock (registered trademark) T20 (TBS) Blocking Buffer (Thermo SCIENTIFIC) was added thereto for 1 hour to block the magnetic beads with the Fc region fixed.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • step of bringing the library into contact with the Fc region of human IgG as a target substance and the step of selecting and recovering phages bound to the Fc region of human IgG” are repeated five times to present a polypeptide showing binding activity. The phage was concentrated.
  • Binding activity test by ELISA and identification of binding activity polypeptide by sequence analysis Subsequently, an example in which molecules having binding activity are identified from an enriched phage population by ELISA and DNA analysis is shown.
  • TBS buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4
  • MEDISORP 96 well microplate NaCl, pH 7.4
  • Physical adsorption was performed on the plate.
  • the supernatant was removed, 150 ⁇ l of SuperBlock (registered trademark) T20 (TBS) Blocking Buffer (Thermo SCIENTIFIC) was added for 1 hour to block the plate surface, and the plate was washed 3 times with TBS-T buffer.
  • the top 16 types of phages with high binding activity were analyzed using ABI PRISM (trademark registration) 3100 (Applied BioSystems) as a polypeptide having binding activity as a result of analyzing the DNA sequence of the region encoding the polypeptide by the dideoxy method.
  • ABI PRISM trademark registration
  • 3100 Applied BioSystems
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 9 were identified.
  • Xaa is A polypeptide comprising an amino acid sequence (which represents an arbitrary amino acid residue) via a linker comprising an amino acid sequence of Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 169)
  • the phage library presented in 1 was constructed using the T7Select10-3 Cloning Kit (Novagen). All procedures necessary for construction were in accordance with the attached T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen).
  • Example 2 Using this phage library, following the same procedure as in 1) of Example 1, the process of selecting and recovering phages that contact and bind to the Fc region was repeated 6 times to obtain a polypeptide that exhibits binding activity in the Fc region. The displayed phage was concentrated. Subsequently, according to the same procedure as in 2) of Example 1, molecules having binding activity were confirmed from the enriched phage population by ELISA, and DNA sequence analysis was performed by the dideoxy method. As a result of DNA sequence analysis, a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 11 to 19 in which convergence of the amino acid sequence was confirmed was identified as a binding activity polypeptide.
  • Polypeptides synthesized organically were purchased from bioSYNTHESIS. Biacore T100 (GE Healthcare) was used as a surface plasmon resonance measuring apparatus. A human Fc region manufactured by Jackson Immunoresearch was immobilized on a sensor chip CM5 (GE Healthcare) by an amine coupling method using an Amine Coupling Kit (GE Healthcare). The polypeptide is then 50, 25, 12.5 ⁇ M for H6, 100, 80, 60, 40, 20 nM for 2A1, 40, 30, 20, 10, 5 ⁇ M for 2A1Gly, 200, 100, 50 for RSS.
  • HBS-T buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 (registered trademark), pH 7.4)
  • the binding activity was measured at a reaction temperature of 25 ° C.
  • the measured data were processed by Biacore T00 Evaluation Software (GE Healthcare) , H6, 2A1, 2A1Gly, RSS avidity bond dissociation trouble K respectively 7.9 ⁇ 10 -5 in the D (M), 2.2 ⁇ 10 -8 ( M), 2.3 ⁇ 10 ⁇ 5 (M), and 1.1 ⁇ 10 ⁇ 4 (M) (Table 1A).
  • DNA encoding the polypeptide of amino acid sequence 2, 11-13 was amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • KOD DNA polymerase TOYOBO
  • the amplified DNA is digested with EcoRI and HindIII, and introduced into the region digested at the EcoRI / HindIII site of pET-48b (Invitrogen), thereby encoding the fusion protein linking the polypeptide to the C-terminus of thioredoxin (
  • these identified polypeptides and thioredoxin fusion proteins are referred to as H6_trx, 2A1_trx, 2A4_trx, 2F12_trx (SEQ ID NOs: 82 to 85)).
  • the cells were sonicated with Astrason Model S3000 (Wakeken) and the intracellular soluble fraction was recovered by centrifugation at 14000 ⁇ g for 20 minutes. This soluble fraction was purified by metal chelate affinity chromatography using Ni Sepharose (registered trademark) 6 Fast Flow (GE Healthcare) to prepare the desired thioredoxin fusion protein.
  • the binding activity of the prepared thioredoxin fusion protein was measured by the surface plasmon resonance method.
  • Biacore T100 GE Healthcare
  • the Fc region manufactured by Jackson Immunoresearch was immobilized on the sensor chip CM5 (GE Healthcare) by the amine coupling method.
  • the prepared thioredoxin fusion proteins H6_trx, 2A1_trx, 2A4_trx, 2F12_trx
  • H6_trx, 2A1_trx, 2A4_trx, 2F12_trx were adjusted to 600, 500, 400, 300, 200, 100 nM with HBS-T buffer, respectively, and the binding activity was measured at 25 ° C.
  • DNAs encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-9 and 11-19 were amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • KOD DNA polymerase TOYOBO
  • the amplified DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII and then ligated to the 3 ′ end of the g10 gene on T7 phage genomic DNA.
  • T7 phage genomic DNA the sample attached to the T7Select10-3 Cloning Kit (Novagen) was used, and the reaction conditions and procedures were in accordance with the attached T7Select (registered trademark) System Manual.
  • T7 phage was packaged in vitro by T7Select Packaging Kit (Novagen). The reaction conditions were in accordance with T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen). Subsequently, phage plaques were formed according to T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen), and a recombinant phage displaying the polypeptide was isolated from each plaque.
  • MICROTEST registered trademark
  • MICROTEST registered trademark
  • 96 BECTON DICKINSON
  • coli BL5403 strain cultured in LB medium to OD 600 1.0 was added, and each of the recombinant phages isolated from plaques was infected and incubated at 37 ° C. The phages were amplified by standing for 12 hours. 10 ⁇ l of the culture solution containing these phages was diluted in 90 ⁇ l of TBS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) to obtain a measurement sample.
  • TBS buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4
  • the measurement sample was placed in a MEDISORP 96 well microplate (Nunc) for 1 hour to physically adsorb the phage onto the plate. The supernatant was removed, 150 ⁇ l of SuperBlock (registered trademark) T20 (TBS) Blocking Buffer (Thermo SCIENTIFIC) was added for 1 hour to block the plate surface, and then TBS-T buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, Washed 3 times with 0.1% Tween20 (registered trademark), pH 7.4).
  • TBS-T buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, Washed 3 times with 0.1% Tween20 (registered trademark), pH 7.4
  • TBS-T buffer containing horseradish peroxidase (HRP) -labeled Fc region (Jackson Immunoresearch) (0.2 ⁇ g / ml) was added and allowed to stand for 1 hour. After washing 3 times with TBS-T buffer, 100 ⁇ l of ABTS One Component HRP Microwell Substrate (BioFX) was added to detect binding activity as a color reaction. For the absorbance measurement, an absorbance microplate reader Sunrise R (TECAN) was used, and the absorbance at 415 nm (OD 415 ) was measured. As a control experiment, non-phage TBS-T buffer was used as a negative control.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Table 2A shows the ELISA results for the recombinant phage displaying the polypeptide containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2-9 and the recombinant phage showing the polypeptide containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 11-19.
  • Table 2B shows. All recombinant phages showed significant binding activity with respect to the control.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 specifically binds to immunoglobulin G and Fc regions having a non-natural structure.
  • An example confirmed to show activity is described.
  • non-natural type structure such as Alternative folded state (AFS) by acid treatment shown in “Best Mode for Carrying Out the Invention” above, non-natural type obtained by acid treatment and reducing agent treatment The binding activity to the immunoglobulin G or Fc region of the structure was measured and compared with the binding activity to the native structure.
  • AFS Alternative folded state
  • the surface plasmon resonance method was used to evaluate the binding activity to the non-natural structure.
  • 2A1 was immobilized on sensor chip CM5 by the amine coupling method, and the binding activity to human IgG or Fc region treated under the following multiple conditions was measured. The following were used as measurement samples.
  • Fc region (3) (FIG. 1A) was reduced with 50 mM 2-mercaptoethylamine (Thermo Scientific Pierce) at 37 ° C. for 90 minutes, and the reducing conditions were maintained in the presence of 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid.
  • 2A1 binds to the human Fc region (Fig. 1A) purchased from Jackson Immunoresearch in (1), but (2) human IgG of natural structure (Fig. 1B), and results therefrom.
  • the Fc region (3) (FIG.
  • polypeptide 2A1 represented by SEQ ID NO: 11 was evaluated in this section.
  • Polypeptide 2A1 synthesized organically was diluted to 27 ⁇ M with HBS-T buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 (registered trademark), pH 7.4) and heated at 98 ° C. for 15 minutes.
  • the heat-treated and non-heat-treated samples were diluted to 100, 50, 25, and 12.5 nM with HBS-T buffer, respectively, and the binding activity was evaluated by surface plasmon resonance.
  • Biacore T100 (GE Healthcare) was used as a surface plasmon resonance measurement device.
  • the human Fc region having a non-natural structure was prepared by dialyzing the natural human Fc region into an acid buffer (10 mM Gly-HCl, 150 mM NaCl, pH 2.0).
  • This non-natural human Fc region was immobilized on the sensor chip CM5 (GE Healthcare) by the amine coupling method using Amine Coupling Kit (GE Healthcare), and the binding activity was measured at a reaction temperature of 25 ° C. Measurement data was processed with Biacore T00 Evaluation Software (GE Healthcare).
  • the binding activity of the heat-treated and non-heat-treated samples was calculated as 2.0 ⁇ 10-8 (M) and 2.2 ⁇ 10-8 (M) as the bond dissociation constant KD, respectively.
  • the total amount of binding response was the same for both. The above results indicate that the binding activity of polypeptide 2A1 is not irreversibly impaired even by heat treatment, and exhibits high heat inactivation resistance.
  • amino acid sequences of a number of polypeptides exhibiting antibody binding activity were specified was described, and then amino acids of SEQ ID NOs: 24-54 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 as a common sequence
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 to 72 containing the sequence and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 as a common sequence, and several amino acid residues in these amino acid sequences as long as the binding activity to the Fc region of IgG is not impaired Added, deleted, substituted or inserted polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55, 73-81, a fusion protein containing these amino acid sequences, or a group transformed with a nucleic acid encoding these amino acid sequences
  • the example which measured the binding activity of the replacement phage is shown.
  • a step of bringing the library into contact with the Fc region of human IgG, which is a target substance, and a step of selecting and recovering a phage bound to the Fc region of human IgG are shown.
  • the Fc region was prepared by affinity chromatography using MabSelect SuRe (GE Healthcare) after human IgG antibody IgG was digested with papain according to the instructions attached to Pierce (registered trademark) Fab Preparation Kit (Thermo SCIENTIFIC Pierce). Purified by gel filtration chromatography using HiTrap DEAE anion exchange chromatography (GE Healthcare) and Superdex200 (GE Healthcare).
  • the prepared Fc region was chemically bonded with biotin via an amino group using D-Biotinoyl- ⁇ -Aminocaproic Acid N-Hydroxysuccinimide Ester (Roche) according to the attached instruction. Subsequently, following the same procedure as in Example 1 1) and 2), the step of contacting the library with the Fc region and selecting and recovering the phage bound thereto, and the phage displaying the polypeptide having binding activity by ELISA The step of confirmation, DNA sequence analysis by dideoxy method was performed. As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 24-55 was identified as a polypeptide showing binding activity.
  • the “step of selecting and collecting phages that contact and bind to the Fc region” was repeated 10 times according to the same procedure as in 1) of Example 2.
  • the binding activity test and DNA sequence analysis by ELISA were carried out in the same manner as in 2) IV of Example 1, and the amino acid sequence consisting of SEQ ID NOs: 57 to 81 was specified as the binding activity polypeptide.
  • This section shows an example in which the binding activity of polypeptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 24-27 (referred to as pep14, pep11, pep21, and pep24, respectively) was measured by surface plasmon resonance.
  • the organically synthesized polypeptide was purchased from bioSYNTHESIS. This was diluted with HBS-T buffer and adjusted to 500, 400, 300, 200, 100 nM. BiacoreT100 (GE Healthcare) was used for the surface plasmon resonance test.
  • the Fc region to be immobilized on the sensor chip was obtained by digesting human monoclonal IgG with papain according to the instructions attached to the Pierce (registered trademark) Fab Preparation Kit (Thermo SCIENTIFIC), followed by affinity chromatography using MabSelect SuRe (GE Healthcare), HiTrap It was prepared by purification by gel filtration chromatography using DEAE anion exchange chromatography (GE Healthcare) and Superdex200 (GE Healthcare). The prepared Fc region was immobilized on a sensor chip CM5 (GE Healthcare) by an amine coupling method. The binding activity was measured using the prepared synthetic peptide, and the binding dissociation constant was measured.
  • p17 the binding activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 (referred to as p17) is measured by surface plasmon resonance.
  • the polypeptide was prepared by cleaving the thioredoxin fusion protein p17_trx consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86 with protease and then removing the thioredoxin moiety.
  • the thioredoxin fusion protein produced by the expression vector pET-48b (Novagen) ⁇ has an HRV 3C protease cleavage site in its amino acid sequence, so that the desired polypeptide linked to the C-terminus can be obtained using this protease. .
  • DNA (SEQ ID NO: 124) encoding thioredoxin fusion protein (SEQ ID NO: 86) containing p17 was synthesized by PCR, and this DNA was introduced into the expression vector pET-48b (Novagen). Using this expression vector, a thioredoxin fusion protein was prepared according to the same procedure as in Example 1, 5). A thioredoxin fusion protein 40 mg was digested at 4 ° C using HRV 3C Protease (Novagen) 100 Unit. Reaction conditions followed the attached manual.
  • the reaction product is diluted in 6M guanidine hydrochloride solution, gel filtration chromatography using Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare), then reverse phase chromatography using ⁇ RPC C2 / C18 ST 4.6 / 100 (GE Healthcare).
  • the polypeptide p17 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 was prepared.
  • This value shows extremely high binding activity as a linear polypeptide.
  • protein protein A or protein G respectively 1.0 ⁇ 10 -8 (M) (Non-patent in the binding activity K D of each domain alone Reference 28) It is about 4.9 ⁇ 10 ⁇ 7 (M) (Non-patent Reference 29).
  • DNAs encoding the polypeptides of SEQ ID NOs: 24, 26-33, 57-81 were amplified by PCR. These are digested with EcoRI and HindIII, and introduced into the regions digested at the EcoRI / HindIII sites of pET-48b (Invitrogen), respectively, so that a fusion protein (SEQ ID NO: 87 to 95, SEQ ID NOS: 87 to 95, DNA coding for 86, 98, 99, 101, 102, 106-113, 116-118, 96, 97, 100, 103-105, 114, 115, 119 (SEQ ID NOs: 125-133, 124, 136, 137) , 139, 140, 144-151, 154-156, 134, 135, 138, 141-143, 152, 153, 157) were constructed. Using this expression vector, a thioredoxin fusion protein was prepared according to the same procedure as in Example 1, 5).
  • the binding activity of the prepared thioredoxin fusion protein was measured by the surface plasmon resonance method.
  • Biacore T100 GE Healthcare
  • the Fc region was immobilized on the sensor chip CM5 (GE Healthcare) by the amine coupling method according to the same procedure as in Example 2, 3).
  • the prepared thioredoxin fusion protein was adjusted to 600, 500, 400, 300, 200, and 100 nM with HBS-T buffer, and the binding activity was measured at 25 ° C. Data were processed with Biacore T00 Evaluation Software (GE Healthcare). The calculated K D shown in Table 4.
  • DNAs encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27, 30 to 55, 57, 63 to 72, and 79 to 81 were amplified by polymerase chain reaction.
  • KOD DNA polymerase TOYOBO
  • the amplified DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII and then ligated to the 3 ′ end of the g10 gene on T7 phage genomic DNA.
  • T7 phage genomic DNA the sample attached to the T7Select10-3 Cloning Kit (Novagen) was used, and the reaction conditions and procedures were in accordance with the attached T7Select (registered trademark) System Manual.
  • T7 phage was packaged in vitro by T7Select Packaging Kit (Novagen). The reaction conditions were in accordance with T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen). Subsequently, phage plaques were formed according to T7Select (registered trademark) System Manual (Novagen), and a recombinant phage displaying the polypeptide was isolated from each plaque.
  • MICROTEST registered trademark
  • MICROTEST registered trademark
  • 96 BECTON DICKINSON
  • coli BL5403 strain cultured in LB medium to OD 600 1.0 was added, and each of the recombinant phages isolated from plaques was infected and incubated at 37 ° C. The phages were amplified by standing for 12 hours. 10 ⁇ l of the culture solution containing these phages was diluted in 90 ⁇ l of TBS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) to obtain a measurement sample.
  • TBS buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4
  • the measurement sample was placed in a MEDISORP 96 well microplate (Nunc) for 1 hour to physically adsorb the phage onto the plate. The supernatant was removed, 150 ⁇ l of SuperBlock (registered trademark) T20 (TBS) Blocking Buffer (Thermo SCIENTIFIC) was added for 1 hour to block the plate surface, and then TBS-T buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, Washed three times with 0.1% Tween20 (registered trademark), pH 7.4).
  • TBS-T buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, Washed three times with 0.1% Tween20 (registered trademark), pH 7.4
  • TBS-T buffer containing horseradish peroxidase (HRP) -labeled Fc region (Jackson Immunoresearch) (0.2 ⁇ g / ml) was added and allowed to stand for 1 hour. After washing 3 times with TBS-T buffer, 100 ⁇ l of ABTS One Component HRP Microwell Substrate (BioFX) was added to detect binding activity as a color reaction. For the absorbance measurement, an absorbance microplate reader Sunrise R (TECAN) was used, and the absorbance at 415 nm (OD 415 ) was measured. As a control experiment, non-phage TBS-T buffer was used as a negative control.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Recombinant phage presenting a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, 27, 30 to 55
  • the results of ELISA for the phage are shown in Table 5A and Table 5B, respectively. All recombinant phages showed significant binding activity with respect to the control.
  • This example shows an example in which non-natural IgG mixed in a trace amount in a natural IgG sample is quantitatively detected by using the synthetic peptide 2A1 represented by SEQ ID NO: 11.
  • chromatography techniques such as size exclusion chromatography are widely used as one of quick and simple heterogeneity evaluations (Non-patent Document 30).
  • the usefulness of the detection technique using the polypeptide of the present invention was verified by comparison with size exclusion chromatography, which is a general-purpose technique.
  • Non-natural IgG was obtained by dialysis of human monoclonal antibody against 10 mM Glycine-HCl, 150 mM NaCl, pH 2.0, which is known to produce AFS for 18 hours.
  • the prepared non-natural IgG is neutralized with Tris-HCl (pH 8.0) and then diluted to a natural IgG (6.7 ⁇ M) diluted in HBS-T buffer (10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001). %) was mixed with non-natural IgG and used as a measurement sample.
  • the measurement sample was analyzed using surface plasmon resonance and size exclusion chromatography, and the detection sensitivity of non-natural IgG was compared.
  • the measuring apparatus and sensor chip described in 7) of Example 1 were used.
  • the measurement data of the prepared sample was analyzed using Bicore T100 Evaluation Software (GE Healthcare), and the amount of unnatural IgG mixed was quantified as a binding response (FIG. 2).
  • AKTA purifier GE Healthcare
  • Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare
  • the measurement data is processed using UNICORN version 4.12 (GE Healthcare), and the amount of unnatural IgG is quantified using the peak areas detected as the monomeric and multimeric fractions of IgG ( Figure 3). did.
  • FIG. 4 is a graph comparing the logarithm plots of the detected amount of AFS type IgG obtained by the surface plasmon resonance method and size exclusion chromatography with respect to the concentration of AFS type IgG.
  • the size exclusion chromatography can show a significant detection sensitivity up to a contamination rate of 0.1%.
  • non-natural IgG can be detected due to the high binding activity of the polypeptide. Since it was possible to detect with high sensitivity, it was revealed that sufficient detection sensitivity was exhibited even at a contamination rate of 0.01%. That is, the results of this example show that non-natural IgG mixed in a trace amount of natural IgG such as antibody drugs can be detected with higher accuracy than existing methods by using non-natural IgG binding polypeptide. It is shown.
  • an affinity column was prepared by immobilizing a thioredoxin fusion protein p17_trx (SEQ ID NO: 86) ⁇ ⁇ fused with an IgG binding polypeptide, and this was used to remove and purify the Fc region, and human An example applied to the purification of IgG is shown.
  • the polypeptide of the present invention binds to the Fc region of IgG with a binding dissociation constant in the nM order, and is comparable to an existing IgG-binding protein, IgG-binding polypeptide, or these. Has superior binding activity. Based on this high binding activity, it was applied as an affinity column that can be suitably used for selective removal of Fc region or IgG purification.
  • mutants in which a single amino acid residue mutation is introduced into the amino acid sequence of polypeptide 2A1 represented by SEQ ID NO: 11 SEQ ID NOs: 158 to 164.
  • SEQ ID NOs: 158 to 164 An example in which the binding activity of each amino acid residue was measured by surface plasmon resonance and the influence of each amino acid residue on binding was evaluated.
  • 2A1_Q5R (SEQ ID NO: 158), 2A1_W6A (SEQ ID NO: 159), 2A1_S7A (SEQ ID NO: 160), 2A1_R17A (SEQ ID NO: 161), 2A1_S18A (SEQ ID NO: 162), 2A1_S19A (SEQ ID NO: 163) and 2A1_I20A (SEQ ID NO: 164) were purchased from bioSYNTHESIS. Biacore T100 (GE Healthcare) was used as a surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • the human Fc region having a non-natural structure was prepared by dialyzing the natural human Fc region into an acid buffer (10 mM Gly-HCl, 150 mM NaCl, pH 2.0). This non-natural human Fc region was immobilized by the amine coupling method using Amine Coupling Kit (GE Healthcare) on sensor chip CM5 (GE Healthcare).
  • the polypeptide is then 62.5, 31.3, 15.6 nM for Q5R, 500, 250, 125 nM, W7A for 1000, 500, 250 nM, R17A, 500, 250, 125 nM, 125 for S18A, 125, 62.5, 31.3 nM, S19A 1000, 500, 250 nM, I20A 500, 250, 125 nM up to HBS-T buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 (trademark registration), pH 7.4 ), And the binding activity was measured at a reaction temperature of 25 ° C.
  • the measurement data Biacore T00 Evaluation was treated with Software (GE Healthcare), it was calculated Q5R, W6A, S7A, R17A, S18A, S19A, and the respective binding dissociation constant, K D, of I20A (Table 6). As a result, it was found that the binding activity increased 2.5-fold by mutating the glutamine residue at position 5 to an arginine residue.
  • the tryptophan residue at position 6 was approximately 1/8
  • the serine residue at position 7 was approximately 1/5
  • position 17, respectively The arginine residue was reduced by about 1/16
  • the serine residue at position 19 was reduced by about 1/10
  • the isoleucine residue at position 20 was reduced by about 1/50. This result indicates that these residues are greatly involved in the expression of binding activity.
  • the Fc region of the target human IgG is recovered from a solution containing a contaminating protein.
  • polypeptide 2A1 0.5 mg was dissolved in 1.5 ml of sodium carbonate buffer (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3), and this was added to 0.1 ml of NHS-activated Sepharose (registered trademark) (GE Healthcare) in an amine cup. Immobilized by the ring method. The immobilization procedure followed the attached package insert. The immobilization reaction rate was 42%.
  • 1 ml of TBS-T buffer solution 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% (w / v) Tween20 (registered trademark) was used for E. coli BLT5403 strain cultured in 1 ml of LB medium.
  • the human Fc region having a non-natural structure was prepared by dialysis of the natural human Fc region against glycine hydrochloride buffer (10 mM Glycine-HCl, 150 mM NaCl, pH 2.0). A solution obtained by adding 5 ⁇ g of this non-natural Fc region to 62 ⁇ l of the above E. coli disruption solution and diluting it to 1 ml with TBS-T buffer was used as a sample solution for binding specificity evaluation. As a control solution for a comparative test, an E. coli disruption solution containing no non-natural Fc region was prepared.
  • the prepared sample solution and Sepharose to which 2A1 peptide was immobilized were mixed for 20 minutes. Thereafter, the plate was washed 5 times with 0.5 ml of TBS-T buffer and eluted with 0.2 ml of 50 mM NaOH. The eluate was neutralized with 10 ⁇ l of 3M sodium acetate (pH 5.2). The eluate and sample solution were analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (FIG. 8). Only a band corresponding to the Fc region was significantly present in the eluate as compared with other contaminating proteins. This result indicates that polypeptide 2A1 specifically recognizes the target Fc region among a number of contaminating proteins, and the molecule obtained by the present invention is high in normal protein-protein interactions. It shows that it has target specificity.
  • polypeptide p17 followed the same procedure as in Example 2, 4).
  • the Fc region of human IgG was prepared according to the same procedure as in Example 2 1).
  • the complex of polypeptide p17 and Fc region was dialyzed against a buffer solution (20 mM Tris-HCl, 10% (v / v) dimethyl sulfoxide, pH 7.4), and concentrated to a concentration of 10 mg / ml by ultrafiltration. Crystals were obtained by a sitting-drop vapor diffusion method using 40% polyethylene glycol 4000, 0.1 M sodium citrate (pH 5.6), 0.2 M ammonium acetate as a crystallization precipitant / buffer solution.
  • Polypeptide p17 was formed of 4 ⁇ strands, 3 ⁇ hairpins, 1 short ⁇ helix, and 1 loop structure (FIG. 9).
  • PDB code, 1DN2 the binding site to the Fc region was recognized as an equivalent site (FIG. 11). This indicates that the enhancement of the function of the peptide according to the present invention can be enhanced without impairing the characteristics of the original function.
  • the region derived from signoline introduced into the library formed a ⁇ hairpin as in the case of signoline, and was responsible for arranging the region extended as a random amino acid sequence in the vicinity of Fc-III Ala. This indicates that the use of microproteins that form ⁇ hairpins is responsible for effectively bringing the two segments in close proximity.
  • the two regions extended as random amino acid sequences formed completely different three-dimensional structures.
  • the C-terminal region formed a short ⁇ -helix, and the side chain protruding from the helix surface was in contact with the amino acid residue of Fc-III Ala, supporting a conformation favorable for binding (FIG. 12).
  • Non-patent Documents 3 and 4 which corresponds to Fc-III Ala.
  • the aromatic ring residue of Trp33 was directly supported by the side chain of Met51 present in the ⁇ helix (Fig. 12).
  • the N-terminal formed a loop structure and supported this foundation by contacting the introduced signoline part, which is the foundation of Fc-III Ala (Fig. 12).
  • a mutant in which the amino acid residue present in the C-terminal segment of p17 polypeptide (SEQ ID NO: 57) ⁇ is substituted with alanine is prepared, and the binding activity is measured, so that the amino acid residue becomes binding activity.
  • An example is shown in which the role of these amino acid residues is analyzed in detail by evaluating the influence of the amino acid residues and comparing the three-dimensional structure information obtained in Example 7.
  • DNAs (SEQ ID NOs: 179 to 183) encoding amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 174 to 178 were designed and synthesized by PCR. According to the same procedure as in Example 2, 4), a mutant polypeptide was prepared by expression of thioredoxin fusion protein and protease treatment and named as follows: p17_P46A (SEQ ID NO: 174), p17_D47A (SEQ ID NO: 175), p17_W48A (SEQ ID NO: 176), p17_R50A (SEQ ID NO: 177), p17_M51A (SEQ ID NO: 178).
  • the site where the alanine substitution was introduced was considered from a structural viewpoint.
  • the main chain of the polypeptide changes direction due to the structural orientation characteristic of the proline residue, and plays a role in fine-tuning the ⁇ -helix that occurs ahead to the appropriate position.
  • Figure 13A Asp47 is hydrogen-bonded with nearby Arg50 (FIG. 13B), and finely adjusts the orientation of the ⁇ helix as in Pro46.
  • Arg50 present in the ⁇ -helix assisted cross-linking between ⁇ -strands at positions 23 to 35 forming a binding site by contacting the side chain with Ala24 (FIG. 13C).
  • Trp48 and Met51 present in the ⁇ helix are in contact with each other at these hydrophobic residues centering on Met51, and directly stabilized the aromatic ring of Trp33 present in the binding site (FIG. 13D).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 it is shown that the orientation of the aromatic ring side chain of Trp33 greatly affects the binding to the Fc region.
  • substitution of alanine in Met51 leads to a binding affinity decrease of 100 times or more. From these two facts, it is considered that the binding involvement of Met51 enhances the binding activity by supporting the aromatic ring of Trp33.
  • the present invention is useful for detection, purification, immobilization or removal of proteins including antibodies.
  • SEQ ID NO: 1 IgG binding peptide
  • SEQ ID NO: 2 IgG binding peptide
  • H6 SEQ ID NO: 3 IgG binding peptide
  • H3 SEQ ID NO: 4 IgG binding peptide
  • D5 SEQ ID NO: 5 IgG binding peptide
  • E7 SEQ ID NO: 6 IgG binding peptide
  • sC12 SEQ ID NO: 7 IgG binding peptide
  • G3 SEQ ID NO: 8 IgG binding peptide
  • sA7 SEQ ID NO: 10 IgG binding peptide
  • SEQ ID NO: 11 IgG binding peptide
  • 2A1 SEQ ID NO: 12 IgG binding peptide
  • 2A4 SEQ ID NO: 13 IgG binding peptide
  • 2F12 SEQ ID NO: 14 IgG binding peptide
  • 2H1 SEQ ID NO: 15 IgG binding peptid

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Abstract

　免疫グロブリンGのFc領域に対し結合活性を有し、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質の検出、精製、固定化、又は除去に好適に使用可能な、下記式1～4で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。　Y-D-P-x-T-G-T-W-R-S-x-[IL]（配列番号1）　（1）　R-[QRS]-x-x-[GS]-Y-D-P-R-T-G-T-W-R-S-S-I-A-Y-G-G（配列番号10）　（2）　G-V-V-R-Q-W-S-G-x-x-x-x-x-x-x-x-R-S-S-I-A-Y-G-G（配列番号20）　（3）　D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-x-P-D-W-x-x-M（配列番号23）　（4） （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。 [ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す）

Description

抗体結合性ペプチド
　本発明は、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すペプチド、及びそれを用いる抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質の検出、精製、固定化又は除去方法に関する。
　モノクローナル抗体を治療用途に利用する、いわゆる抗体医薬品は、年間売り上げが300億ドルを超え、バイオ医薬品のなかで最大規模、医薬品産業全体の中でも最も急速な成長を遂げているセグメントである。現在まで、23種のフルサイズのモノクローナル抗体と三つの断片型モノクローナル抗体が上市され、その中のいくつかはすでに年間売上10億ドル超のブロックバスターとなっている。1995年から2007年までの間に治験が開始された医薬品候補のモノクローナル抗体は3倍以上に増加しており、その数はさらに伸び続けている（非特許文献1）。
　このような抗体医薬品市場の成長と拡大に伴って、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質（以下、抗体等とも表記する）に対して結合性を有する分子の創製、改良に関する研究開発が盛んに行われている。これは、このような分子が、抗体等の研究及び生産に有用であるからで、特に抗体医薬品製造の際の回収精製工程で用いられるアフィニティクロマトグラフィで大きな需要が見込まれるからである。また、抗体等の回収精製目的で現在多用されているブドウ球菌由来のプロテインAが安定性や製造コストの点で不十分と認識されていることもその理由である。現在、抗体等に結合する分子に関して様々なアプローチの研究開発が行われているが（非特許文献2）、そのうちのひとつが抗体結合性ペプチドの開発である。以下にそのいくつかを例示する。
　鈴木らは、7残基若しくは12残基の線状ペプチドを繊維状バクテリオファージM13に提示したファージライブラリを用い、ヒトIgGのFc領域に結合活性を有するポリペプチドを複数同定し、Fc領域に対する結合性の有無を酵素結合免疫吸着法 (ELISA) によって測定した (特許文献1)。彼らは同定した複数の配列から共通配列を抽出したペプチドを作製し、ヒトIgGに対する結合のほか、ウマ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、マウスに由来するIgGのFc領域に対する結合活性をELISAによって確認した。
　DeLanoらは、ジスルフィド結合によって環状化したXaai　Cys　Xaaj　Cys　Xaak　(式中i　j　kはi+j+k=18をみたす整数)　で表される環状ペプチドを繊維状バクテリオファージM13に提示したファージライブラリを用い、ヒトIgGに対する結合について黄色ブドウ球菌由来プロテインAと競合反応する20残基の環状ペプチドを複数取得した。彼らはさらに、これらのペプチドから共通配列を抽出した13残基の環状ペプチドFc-III　(Asp　Cys　Ala　Trp　His　Leu　Gly　Glu　Leu　Val　Trp　Cys　Thr)　（配列番号165）を作製し、プロテインAとの競合反応においてKi=100　nMの競合阻害能を示すことを見出した。IgGの抗原結合部位であるFab断片とFc-IIIを融合化することにより、ラビットを用いた実験においてin　vivoでのFab半減期を改善できることを開示した　(特許文献2、非特許文献3)。またDiasらは、この環状ペプチドFc-IIIにD体及びL体のPro残基を用いてさらなる環状化を導入したFcBP-2を作製し、IgGに対する結合性　(Fc-IIIの結合解離定数KD　=　185　nM)　をKD　=　2　nMまで高めることに成功した　(非特許文献4)。
　Fassinaらは、Lys残基による枝分かれ構造を有する　(Arg　Thr　Xaa)4　Lys2　Lys　Gly（配列番号166）で表される合成テトラポリペプチドライブラリをスクリーニングし、プロテインAと競合するペプチドTG19318を作製した　(非特許文献5)。TG19318はラビットIgGに対してKD　=　300　nMの結合性を有しており、さらにこれを固定化したアフィニティクロマトグラフィによって、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジの血清中に含まれるIgGを精製できることを示した　(非特許文献6)。
　Ehrlichらは、鈴木らの手法と同様に、7残基若しくは12残基の線状ペプチドを繊維状バクテリオファージM13に提示したファージライブラリを用い、ヒト型化IgGをペプシン消化して得られるpFc’断片に結合性を示すペプチドを単離した (非特許文献7)。
　Krookらは、10残基長の線状ペプチドを繊維状バクテリオファージM13に提示したファージライブラリを用い、ヒトIgGのFc領域に結合性を示すペプチドを作製した。彼らはELISAによってこのペプチドがヒト及びブタ由来のIgGに対して強い結合性を示すことを確認した (非特許文献8)。
　Verdolivaらは、Lys残基による枝分かれ構造とCys残基による環状化を導入した(Cys　Xaa3)2　Lys　Gly　（配列番号167）によって表される合成ペプチドライブラリをマウスモノクローナルIgGに対してスクリーニングし、ヒンジ領域近傍に結合性を示すペプチドFcRMを作製した。彼らはさらにこのFcRMを固定化したアフィニティクロマトグラフィを構築し、マウス及びヒト由来IgGの精製を報告した　(非特許文献9)。
　坂本らは、Cys　Xaa7-10　Cysで表される環状ペプチドをT7バクテリオファージに提示したファージライブラリを用い、ヒトIgGのFc領域に結合性を示すペプチドを作製した　(非特許文献10)。彼らが作製したペプチドは、Fc領域の天然型構造ではなく、酸処理によって生じた非天然型構造を認識する点において、これまで作製された上記のIgG結合性ペプチドと異なっている。伊藤らは、このペプチドを用いてヒト抗体医薬、免疫グロブリン製剤、IgG試薬に含まれる酸処理によって生じた非天然型構造の含有率を調査できることを開示した　(特許文献3)。
　以上のように、複数の抗体結合性ペプチドが開発されているが、それらの分子多様性は十分とは言えない。なぜなら、上述の治療用途に加えて、抗体は産業の様々な領域で、様々な用途に利用されているので、抗体結合性分子に求められる分子特性は一様ではないからである。抗体等の検出、精製、固定化又は除去等の実施には、それぞれの利用状況に適する特性を有する抗体結合性分子が必要である。具体的には、抗体等のどの部位に結合するか、分子認識の特異性はどの程度か、親和性の強度はどの程度か、溶液条件の変化等で結合/解離を制御できるか、複数の動物種の抗体に結合するのか、あるいは特定の動物種の抗体のみに結合するのか、溶解性や安定性はどうか、大量生産可能か、など点において適切な特性を有する抗体結合性分子が必要である。さらにはペプチドの場合、非天然型アミノ酸残基を含むのか天然型アミノ酸残基のみで構成されるのか、化学構造は線状型か環状型か分岐型か、溶液中で安定な三次元構造を形成するのか、還元的環境下において利用可能か、なども適性判断の項目となる。
　通常、短鎖のポリペプチドは分子内ジスルフィド架橋など環状安定化によって高機能化を図るが、環状化には煩雑な化学反応が必要であり、また例えば、還元条件下などのジスルフィド架橋の形成が困難な条件下においては結合機能を発揮できない。ジスルフィド架橋形成が困難な還元条件として想定される状況例としては、(1) 細胞質内環境、(2) 標的となるIgG或いはFc領域のシステイン残基のチオール基を、化学修飾などを目的として遊離基にするために還元剤が添加された環境などが想定される。
　さらに、抗体医薬品市場の拡大に伴って、抗体分子を対象とした分離精製技術及び分析技術のさらなる高度化が近年強く望まれるようになってきている。
　分析技術に関しては、特に（１）糖鎖付加を含む各種の翻訳後修飾に伴う分子不均一性に関する分析技術、（２）抗体の立体構造の変化に伴う分子不均一性に関する分析技術、（３）会合体・凝集体形成に伴う分子不均一性に関する分析技術、の３つの開発が期待されている。(非特許文献11）。抗体分子は各種の物理的あるいは化学的ストレスによって、通常の天然型構造とは異なるalternatively　folded　state　(AFS)　と呼ばれる非天然型構造を形成することが報告されている。このような非天然型構造は、薬剤の効果の減少のみならず免疫原性の惹起による副作用の原因となるリスクが示唆されており、非天然型構造を持つ抗体の分析技術が求められている（非特許文献12）。
　タンパク質の分子形状あるいは立体構造を明らかにすることのできる分析技術としては、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、電子顕微鏡、分析超遠心、等電点電気泳動、動的光散乱、円偏光二色性スペクトル、液体クロマトグラフィーなどが挙げられるが、原子レベル精度とスループットをともに満足する方法はない。例えば、原子レベル精度の立体構造情報を与えることのできるＸ線結晶構造解析や核磁気共鳴では数か月オーダーの解析時間を必要とする。また、数分で測定が完了できる動的光散乱や液体クロマトグラフィーでは分子の微細な変化や微量の混入が検出できない。このため、原子レベル精度とスループットを両立する簡便な技術が求められている。
　一方、分離精製技術としては、抗体に特異的な親和性を有する分子をリガンドとして用いるアフィニティクロマトグラフィー技術が今日不可欠である（非特許文献13）。現在、この用途のリガンドとしては、プロテインAやプロテインGなどの細菌由来の天然タンパク質が利用されている。これらのタンパク質は良好な抗体親和性を有しているが、安定性が低いことや、製造コストが高いことが欠点である。
特開2004-187563号公報 国際公開番号WO/2001/045746号明細書 国際公開番号WO/2008/054030号明細書
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　本発明は、免疫グロブリンGのFc領域に対し結合活性を有し、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質の検出、精製、固定化、又は除去に好適に使用可能な新規なポリペプチドを提供し、産業で利用可能な抗体結合性ポリペプチドの分子多様性を拡大することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ある特定のアミノ酸配列パターンを有する短いポリペプチドが、ヒトIgG抗体に対し高い結合活性を示すことを見出した。さらにこれらのポリペプチドは、ヒトIgG抗体との結合における解離速度が遅く、その結合をより保持しやすいことも示された。さらに、これらのポリペプチドの一部は、酸処理、還元処理によって得られたヒトIgG抗体の非天然型構造にのみ結合することが示された。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。なお、本明細書においては、「ペプチド」と「ポリペプチド」と「タンパク質」との用語は互換的に用いられる。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［1］　下記式1：
　Y-D-P-x-T-G-T-W-R-S-x-[IL]　（配列番号1）　　　（1）
（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。 [ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［2］　配列番号2～6：
YDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号2）
YDPGTGTWRSYLRFGGG　(配列番号3）
YDPYTGTWRSSIWVLSG　(配列番号4）
YDPGTGTWRSWLSFNVG　(配列番号5）
YDPWTGTWRSFIWGGGG　(配列番号6）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［1］に記載のポリペプチド；
［3］　配列番号2～6のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［4］　配列番号7～9：
YDPRTGTWLLYASRLLG　(配列番号7）
YDPVTGTWTSSIASWMG　(配列番号8）
YDPRTGTWRRSSLSYSG　(配列番号9）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［3］に記載のポリペプチド；
［5］　下記式2：
　R-[QRS]-x-x-[GS]-Y-D-P-R-T-G-T-W-R-S-S-I-A-Y-G-G　（配列番号10）　　　（2）
（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［6］　配列番号11～14：
GVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号11）
AGSRRAHGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号12）
ASVRSWSSYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号13）
SWRRRGSSYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号14）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［5］に記載のポリペプチド；
［7］　配列番号11～14のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［8］　配列番号15～19、及び158～164：
TGRGRSARYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号15）
HWVNGRSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号16）
ERWITWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号17）
GSVVRWRGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号18）
GAVYRRSFYDPRTGTWRSSIAYRGG　(配列番号19）
GVVRRWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号158）
GVVRQAQSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号159）
GVVRQWAGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号160）
GVVRQWSGYDPRTGTWASSIAYGGG　(配列番号161）
GVVRQWSGYDPRTGTWRASIAYGGG　(配列番号162）
GVVRQWSGYDPRTGTWRSAIAYGGG　(配列番号163）
GVVRQWSGYDPRTGTWRSSAAYGGG　(配列番号164）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［7］に記載のポリペプチド；
［9］　下記式3：
　G-V-V-R-Q-W-S-G-x-x-x-x-x-x-x-x-R-S-S-I-A-Y-G-G　（配列番号20）　　　（3）
（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す）
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［10］　配列番号21：
GVVRQWSGGGGSGGGGRSSIAYGGG　（配列番号21）
で表されるアミノ酸配列からなる、［9］に記載のポリペプチド；
［11］　配列番号22：
RSSIAYGGG　（配列番号22）
で表されるアミノ酸配列からなる、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［12］　下記式4：
　D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-x-P-D-W-x-x-M
　（配列番号23）　　　（4）
（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す）
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［13］　配列番号24～54：
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWLYMTTR　(配列番号24）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWRLMQGQ　(配列番号25）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWQTMAQK　(配列番号26）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号27）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWRAMSGR　(配列番号28）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWKWMSTH　(配列番号29）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWKLMQRP　(配列番号30）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWDIMAGH　(配列番号31）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDVMVRQ　(配列番号32）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWERMKQH　(配列番号33）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWSKMRPQ　(配列番号34）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWAVMATP　(配列番号35）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWRMMGVP　(配列番号36）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDYMSSK　(配列番号37）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWMPDWDRMLRR　(配列番号38）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWTPDWNAMSQR　(配列番号39）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWKRMTSR　(配列番号40）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWGRMNSK　(配列番号41）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWNRMRDFNRSFREV　(配列番号42）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWDAMSSR　(配列番号43）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWIPDWTRMQTW　(配列番号44）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWQRMKLH　(配列番号45）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWSQMRPQ　(配列番号46）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDTMTPR　(配列番号47）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWSVMKSL　(配列番号48）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWDTMHAAINRSFREV　(配列番号49）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWIPDWRAMSQF　(配列番号50）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWNLMGQH　(配列番号51）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWARMEPM　(配列番号52）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWQVMSPVSNRSFREV　(配列番号53）
DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWEIMRPF　(配列番号54）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［12］に記載のポリペプチド；
［14］　配列番号24～54のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［15］　配列番号55：
EAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWSRMSGR　(配列番号55）
で表されるアミノ酸配列からなる、［14］に記載のポリペプチド；
［16］　下記式5：
[RSG]-[AGV]-x-Y-D-P-E-T-G-T-W-Y-D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-E-P-D-W-Q-R-M-L-G-Q　（配列番号56）　　　（5）
（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［17］　配列番号57～72：
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号57）
VISLGSDRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号58）
IMSVDGSSARYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号59）
VDLRAHGGAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号60）
WSRFSSRSVAYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号61）
GNPSDSASAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号62）
SNFVRSPSAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号63）
IPYGFPGRGEYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号64）
GPYNIPDSAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号65）
WPLNAPSSAFYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号66）
VPPRFSSSAQYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号67）
FLVGLHAGAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号68）
VVRVDHSSAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号69）
WMEFYPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号70）
DGVGPGSRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号71）
FVSSLPNSAMYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号72）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［16］に記載のポリペプチド；
［18］　配列番号57～72のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［19］　配列番号73～81、及び174～178：
GRAFSGSRRWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWRLMQGQ　(配列番号73）
VMATEVVRGVYDPETGTWYDATWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号74）
MMVRPPRLGVYDPEPGTWYDATWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号75）
ERHLVSDYLHYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号76）
FSDLDSFGVSYDPETGTWYDAAWHRGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号77）
LFDNKLKHASYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号78）
GSCKFSSSCHYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号79）
LIPPGGISPWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号80）
LNDFLTPTAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWQTMAQK　(配列番号81）
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEADWQRMLGQ　(配列番号174）
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPAWQRMLGQ　(配列番号175）
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDAQRMLGQ　(配列番号176）
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQAMLGQ　(配列番号177）
GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRALGQ　(配列番号178）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［18］に記載のポリペプチド；
［20］　［1］、［3］、［5］、［7］、［9］、［12］、［14］、［16］、及び［18］のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端に第２のポリペプチドを伸張した連結型ポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド；
［21］　配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端に第２のポリペプチドを伸張した連結型ポリペプチドであることを特徴とする、［20］に記載のポリペプチド；
［22］　［1］、［3］、［5］、［7］、［9］、［12］、［14］、［16］、及び［18］のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端にタンパク質を結合した融合タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すタンパク質；
［23］　配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端にタンパク質を結合した融合タンパク質であることを特徴とする、［22］に記載のタンパク質；
［24］　配列番号82～119のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、［22］に記載のタンパク質；
［25］　［1］～［24］のいずれかに記載のポリペプチドあるいはタンパク質をコードする核酸；
［26］　配列番号120～157、及び179～183のいずれかで表される塩基配列からなる、［25］に記載の核酸；
［27］　［25］又は［26］に記載の核酸を含有する組換えベクター；
［28］　［27］に記載の組換えベクターが導入された形質転換体；
［29］　［25］又は［26］に記載の核酸を含有する組換えファージ又は組換えウイルス；
［30］　［1］、［3］、［5］、［7］、［9］、［12］、［14］、［16］、及び［18］のポリペプチド、［20］の連結型ポリペプチド、並びに［22］の融合タンパク質のいずれかに有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方が結合した修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド又はタンパク質；
［31］　配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のポリペプチド、並びに配列番号82～119の融合タンパク質のいずれかに有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方が結合した修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド又はタンパク質；
［32］　［1］～［21］のいずれかに記載のポリペプチド、［22］～［24］のいずれかに記載のタンパク質、又は［30］～［31］のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化ポリペプチド又は固定化タンパク質；
［33］　［1］～［21］のいずれかに記載のポリペプチド、［22］～［24］のいずれかに記載のタンパク質、［25］～［26］のいずれかに記載の核酸、［27］に記載の組換えベクター、［28］に記載の形質転換体、［29］に記載の組換えファージ又は組換えウイルス、［30］～［31］のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質、及び［32］に記載の固定化ポリペプチド又は固定化タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つを含む、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質を検出、精製、固定化又は除去するためのキット；
［34］　被検試料中の非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を検出するための方法であって、
(1)　被検試料を、［1］～［21］のいずれかに記載のポリペプチド、［22］～［24］のいずれかに記載のタンパク質、［28］に記載の形質転換体、［29］に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、［30］～［31］のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は［32］に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させる工程、及び
(2)　被検試料と、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質との間で結合が生じたか否かを判定する工程、
を含む方法；
［35］　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を精製するための方法であって、
(1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を［1］～［21］のいずれかに記載のポリペプチド、［22］～［24］のいずれかに記載のタンパク質、［28］に記載の形質転換体、［29］に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、［30］～［31］のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は［32］に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
(2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から回収する工程、
を含む方法；
［36］　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を除去するための方法であって、
(1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を［1］～［21］のいずれかに記載のポリペプチド、［22］～［24］のいずれかに記載のタンパク質、［28］に記載の形質転換体、［29］に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、［30］～［31］のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は［32］に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
(2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から除去する工程、
を含む方法；
［37］　還元的環境下において実施される、［34］～［36］のいずれかに記載の方法。
　本発明のポリペプチドは、ヒトIgG抗体に対し高い結合活性を示し、かつヒトIgG抗体との結合における解離速度が遅い。さらに、これらのポリペプチドの一部は、酸処理、還元処理によって得られたヒトIgG抗体の非天然型構造にのみ結合し、天然型のIgG抗体には結合しない。本発明のIgG結合性ポリペプチドを利用して、抗体免疫グロブリンG　(IgG)　若しくはそのFc領域を付加した融合タンパク質の固定化、検出、精製、除去などが可能となる。
　配列番号10を共通アミノ酸配列として有するポリペプチド2A1 (配列番号11) は、通常のIgG結合性分子と異なり、天然型のIgGには全く結合を示さず、酸処理、還元処理などによって生じた非天然型の構造に特異的に結合する。この性質は、非天然型構造を有するIgGの固定化、検出、精製、除去に使用できる。後記実施例1の4)で示すように、ポリペプチド2A1は、還元条件下に曝された状態のFc領域に対しても結合活性を示す。さらに、後記実施例1の8)で示すように、ポリペプチド2A1は、高い熱失活耐性を示す。
　配列番号56を共通アミノ酸配列として有するポリペプチドp17　(配列番号57)　は、Fc領域に対して結合解離定数KD　=　1.6　nMで結合することができる。この値は線状のポリペプチドとしては極めて高い結合活性を示すものであり、一般に結合活性が線状より高い環状ペプチドと比較しても、既報の高結合活性化環状ペプチドFcBP-2　(KD　=　2.2　nM)(Diasら、非特許文献4)　を上回る、最上位に属する高結合活性を有している。こうした既存のIgG結合性タンパク質、IgG結合性ペプチドに比較して高い結合活性を有するポリペプチドは、IgGやFc領域融合タンパク質の固定化、検出、精製、除去に好適に使用できる。
　さらに、本発明のIgG結合性ポリペプチドは環状化による安定化に依存しないため、環状化に伴う煩雑な化学反応を必要とせず、また例えば、還元条件下などのジスルフィド架橋の形成が困難な条件下においても、結合機能の発現が可能である。
(A)　表面プラズモン共鳴による、2A1のヒトFc領域　(Jackson　Immunoresearch社)に対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度600,　500,　400,　300,　200,　100　nMに希釈したそれぞれのヒトFc領域の結合曲線を表す。(B)　表面プラズモン共鳴による、2A1の天然型ヒトモノクローナルIgGに対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度600,　500,　400,　300,　200,　100　nMに希釈したそれぞれの天然型IgGの結合曲線を表す。(C)　表面プラズモン共鳴による、2A1の天然型ヒトFc領域に対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度600,　500,　400,　300,　200,　100　nMに希釈したそれぞれの天然型ヒトFc領域の結合曲線を表す。(D)　表面プラズモン共鳴による、2A1の酸変性型ヒトIgGに対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度250,　125　nMに希釈したそれぞれの酸変性型ヒトIgGの結合曲線を表す。(E)　表面プラズモン共鳴による、2A1の還元処理ヒトFc領域に対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度600,　400,　200　nMに希釈したそれぞれの還元処理ヒトFc領域の結合曲線を表す。(F)　表面プラズモン共鳴による、2A1のAFS型ヒトIgGに対する結合活性測定の結果を示す。センサーチップ上に固定化した2A1に対し、濃度25,　12.5,　2.5,　1.25　nMに希釈したそれぞれのAFS型ヒトIgGの結合曲線を表す。 表面プラズモン共鳴による、混入したAFS型IgGの検出結果を示す。濃度6.7μMの天然型IgGに、10,　5,　1,　0.1,　0.01,　0.001%の割合でAFS型IgGを混入したサンプルに対する結合曲線を表す。 サイズ排除クロマトグラフィーによる、混入したAFS型IgGの検出結果を示す。濃度6.7　Mの天然型IgGに、10,　5,　1,　0.1,　0.01,　0.001%の割合でAFS型IgGを混入したサンプルに対するクロマトグラムを表す。差し込み図は、多量体画分を拡大したものを表す。 (A)　表面プラズモン共鳴による、AFS型IgGの検出範囲に関する結果を示す。図2の結果から得られた結合レスポンスと混入したAFS型IgG濃度を両対数プロットした。(B)　サイズ排除クロマトグラフィーによる、AFS型IgGの検出範囲に関する結果を示す。図3のクロマトグラムから得られたIgGの多量体画分と単量体画分のピーク面積を基に多量体画分の存在率を算出し、これと混入したAFS型IgG濃度を両対数プロットした。 p17＿trx固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製の結果を示す。実線はヒトモノクローナルIgGのパパイン消化産物をカラムにアプライしたクロマトグラムを示し、破線は緩衝液のpHを示す。前半のピークは素通り画分、後半のピークは酸緩衝液による溶出画分に対応する。 p17＿trx固定化カラムによるアフィニティークロマトグラフィーによって分画したサンプルの精製度をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結果を示す。分子量マーカー(レーン1)、図5のクロマトグラムにおける素通り画分(レーン2)、溶出画分(レーン3)、カラム前(レーン4)の泳動結果を示す。 p17＿trx固定化カラムを用いたヒトIgGのアフィニティークロマトグラフィーによる精製の結果を示す。実線は、ヒトモノクローナルIgGをカラムにアプライし、pH勾配により溶出したクロマトグラムを示す。破線は緩衝液のpHを示す。 2A1ペプチド固定化樹脂を用いた結合特異性評価。非天然型Fc領域の存在　(Fc(+))・非存在下　(Fc(-))　での、サンプル溶液　(lysate)　および溶出液　(elute)　のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。コントロールはFc領域のバンドを示す。 ポリペプチドp17全体構造のリボンモデル ポリペプチドp17とFc　IIIの構造重ね合わせ。 (A)　Fc　IIIとFc領域の複合体構造、(B)　ポリペプチドp17とFc領域の複合体構造。 (A)　C末端セグメントが形成するαヘリックス、(B)　N末端セグメントが形成するループ構造。 (A)　Pro46周辺の電子密度マップ、(B)　Asp47周辺の電子密度マップ、(C)　Arg50周辺の電子密度マップ、(D)　Trp48,　Met51周辺の電子密度マップ。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１３－１３２１７号の明細書に記載された内容を包含する。
　本発明は、免疫グロブリンG及びそのFc領域に対して結合活性を示すポリペプチドと、それを利用した免疫グロブリンG及びFc領域の検出、固定、精製又は除去方法に関する。
　本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の好適な形態の一つは、配列番号1で示されるY-D-P-x-T-G-T-W-R-S-x-[IL]（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す）を共通配列として含むポリペプチドである。より好ましくは、配列番号2～6で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。後記実施例1に示す配列番号7～9で表されるポリペプチドのように、本発明のポリペプチドは、この共通配列 (配列番号1) を基に、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性が損なわれない範囲で数個、例えば１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸残基が付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。上記のアミノ酸配列を含むものであれば、ポリペプチド配列のアミノ酸残基数に制限は無い。後記実施例1の6)に示すように、該ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されることにより該ポリペプチドを表層に提示した組換えファージも免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有する。すなわち本発明は、上記アミノ酸配列を有するポリペプチド、これを含む融合タンパク質、これらポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体を含む。
　また、更に別の好ましい様態としては、配列番号10で示されるR-[QRS]-x-x-[GS]-Y-D-P-R-T-G-T-W-R-S-S-I-A-Y-G-G（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す）を共通配列として含むポリペプチド、より好ましくは、配列番号11～14で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。後記実施例1に示す配列番号15～21で示されるポリペプチドのように、本発明のポリペプチドは、この共通配列 (配列番号10) を基に、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性が損なわれない範囲で数個、例えば１～１０個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個のアミノ酸残基が付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。上記のアミノ酸配列を含むものであれば、ポリペプチド配列のアミノ酸残基数に制限は無い。後記実施例1の5)と6)に示すように、該ポリペプチドを付加した融合タンパク質、該ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されることにより該ポリペプチドを表層に提示した組換えファージも結合活性を有する。すなわち本発明は、上記アミノ酸配列を有するポリペプチド、これを含む融合タンパク質、これらポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体を含む。
　また、更に別の好ましい様態としては、配列番号23で示されるD-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-x-P-D-W-x-x-M（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す）を共通配列として含むポリペプチド、より好ましくは、配列番号24～54で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。後記実施例2に示す配列番号55のアミノ酸配列で示されるポリペプチドのように、本発明のポリペプチドは、この共通配列 (配列番号23) を基に、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性が損なわれない範囲で数個、例えば１～１０個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個のアミノ酸残基が付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。上記のアミノ酸配列を含むものであれば、ポリペプチド配列のアミノ酸残基数に制限は無い。後記実施例2の5)と6)に示すように、該ポリペプチドを付加した融合タンパク質、該ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されることにより該ポリペプチドを表層に提示した組換えファージも結合活性を有する。すなわち本発明は、上記アミノ酸配列を有するポリペプチド、融合タンパク質、これらポリペプチド及び/又は融合タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体を含む。
　また、更に別の好ましい様態としては、配列番号56で示される[RSG]-[AGV]-x-Y-D-P-E-T-G-T-W-Y-D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-E-P-D-W-Q-R-M-L-G-Q（式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す）を共通配列として含むポリペプチド、より好ましくは、配列番号57～72で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。後記実施例2に示す配列番号73～81のアミノ酸配列で示されるポリペプチドのように、本発明のポリペプチドは、この共通配列 (配列番号56) を基に、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性が損なわれない範囲で数個、例えば１～１０個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個のアミノ酸残基が付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。上記のアミノ酸配列を含むものであれば、ポリペプチド配列のアミノ酸残基数に制限は無い。後記実施例2の5)と6)に示すように、該ポリペプチドを付加した融合タンパク質、該ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されることにより該ポリペプチドを表層に提示した組換えファージも結合活性を有する。すなわち本発明は、Fc領域に結合活性を示す上記アミノ酸配列を有するポリペプチド、融合タンパク質、これらポリペプチド及び/又は融合タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体を含む。
　さらに、本発明ポリペプチド及びタンパク質は標識されていてもよい。すなわち本発明は、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性が損なわれない範囲で、上記のポリペプチド又は融合タンパク質に対し、有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方を結合させた修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質を含む。上記有機化合物等を結合することで、下段に記す本発明の用途の一例である抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質の固定化、精製、検出、除去を効果的に行うことができる。用いる有機化合物等としては、ビオチン、フルオレセイン等の蛍光性有機化合物、安定同位体、リン酸基、アシル基、アミド基、エステル基、エポキシ基、ポリエチレングリコール(PEG)、脂質、糖鎖、核酸、量子ドット等の蛍光性無機化合物、金コロイドなどが好適（Basle　E,　Joubert　N,　Pucheault　M.　Protein　chemical　modification　on　endogenous　amino　acids.　Chem　Biol.　2010,　17(3),　213-27.）であるが、技術的に適用可能な他のいかなる化合物も排除しない。
　本発明のポリペプチドの用途は、その分子が有する免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を利用する限りにおいて制限は無い。一般に、人工的に作製した免疫グロブリンG結合性ポリペプチド、あるいは微生物由来の免疫グロブリンG結合性タンパク質の用途として、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質の固定化、精製、検出、除去がある (非特許文献14、非特許文献15、特許文献1、特許文献3、非特許文献6、非特許文献9)。したがって、本発明のポリペプチドの用途として、上記免疫グロブリンG結合性分子を用いて実施されている用途を含む当業者に公知の用途の内、技術的に適用可能な全ての形態を含む。後記実施例では免疫グロブリンGの検出、精製、除去を挙げているが、これ以外の利用形態も排除しない。
　本発明のポリペプチドの内、配列番号10を共通アミノ酸配列として有するポリペプチドは、後記実施例1の7)に示すように非天然型構造を有する免疫グロブリンG及びFc領域に特異的な結合活性を示すことから、非天然型構造の免疫グロブリンG及びFc領域の固定化、精製、検出、除去に利用できる。本明細書において用いる場合、非天然型構造とは、酸処理、熱処理、変性剤処理、還元剤処理、せん断や撹拌などの物理的衝撃などによって生じる、天然型構造とは異なる構造群の総称である。
　ここで酸処理とは、限定するものではないが、好ましくはpH4.0以下、より好ましくはpH　1.5　～　2.0の条件下に曝露されることを意味する。例えば、免疫グロブリンGは、10　mM　Glycine-HCl,　150　mM　NaCl,　pH2.0の緩衝液で処理することによって通常の天然型構造とは異なるAlternatively　folded　state　(AFS)　と呼ばれる非天然型構造を形成することが報告されている　(非特許文献16、非特許文献17、非特許文献18）。
　また、一般にタンパク質は、酸処理によって生じることに加えて、他の化学的処理或いは物理的処理によっても立体構造の変性が生じることが知られている。最も一般的には、熱による変性、あるいは塩酸グアニジンなどの変性剤によって容易に立体構造の変性が生じることが知られており (非特許文献19)、例えば免疫グロブリンGのFc領域においては、75℃近辺で熱変性によるAFSの形成が報告されている(非特許文献20)。その他の化学的処理及び物理的処理として、還元剤処理、せん断や撹拌などの物理的衝撃が広く知られている。ここでの還元剤処理とは、分子内あるいは分子間のジスルフィド結合が部分的或いは全てにわたって開裂されている状態を指す。より具体的には、還元剤 (DTT、βメルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミンなど) の添加によってジスルフィド結合が開裂した状態を指す。後記実施例では50 mM の2-メルカプトエチルアミンによって90分処理することにより還元処理を施したが、還元条件を引き起こす試薬はこれに限定されるものではない。また、撹拌・せん断などの物理的衝撃とは、限定するものではないが、例えば免疫グロブリンG溶液を撹拌子を用いて700 rpmの速度で回転させることによってアミノ酸残基の酸化、タンパク質立体構造の変性、それによるタンパク質凝集を生じることが報告されている（非特許文献21、非特許文献22）。後記実施例1の7)では、酸及び/又は熱処理、還元処理、酸によるAFSの生成条件にて処理した免疫グロブリンG及びFc領域に対する結合活性測定の結果を示しているが、本発明のポリペプチドによって結合される非天然型構造の免疫グロブリンG及びFc領域の内、これ以外の非天然型構造も排除しない。
　本発明にしたがうポリペプチドの用途の一つとして、還元条件下などにおける免疫グロブリン及びFc領域の固定化、精製、検出、除去などが想定される。本発明の免疫グロブリンG結合性ポリペプチドはジスルフィド架橋による環状化、それによる機能化・安定化に依存しない。従って、ジスルフィド架橋の形成が困難な還元条件下においても結合機能の発現が可能である。ジスルフィド架橋の形成が困難である還元条件の想定される状況例としては、(1) 細胞質内環境、(2) 標的となる免疫グロブリンG或いはFc領域のシステイン残基のチオール基を、化学修飾などを目的として遊離基にするために還元剤が添加された環境などが想定される。後記実施例1の7)では、還元条件下として、還元剤2-メルカプトエチルアミン (Thermo　Scientific　Pierce) を用いてFc領域を処理し、キレート剤エチレンジアミン四酢酸の存在下でその還元条件を維持(非特許文献23）した状況下で実施したが、これ以外のジスルフィド非架橋条件も排除しない。
　本発明においては、ポリペプチドの合成方法、及び利用される形態に制限は無い。同定したポリペプチドの調製方法として、有機化学的に合成する方法や遺伝子組換えに基づく方法 (参照文献　寒川賢治、ペプチドと創薬　メディカルドゥ)、任意のタンパク質と連結した融合タンパク質の形態として発現させる方法 (参照文献　森山達哉、タンパク質精製と取り扱いのコツ　羊土社) など多数の合成方法が報告されており、アミノ酸配列の特定されたポリペプチドの調製は既存の合成技術の適用によって容易に行う事ができる。後記実施例では有機化学的な合成による調製、融合タンパク質としての細胞発現による調製、及び融合タンパク質のプロテアーゼ切断による目的ポリペプチドの調製、該ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換されることにより該ポリペプチドを表層に提示した組換えファージの例を示しているが、上記技術を含む他の方法も排除しない。
　本発明は、本発明のポリペプチドを固定化した固相担体にも関する。ここで好適な固相担体の例としては、限定するものではないが、ポリスチレンやポリエステルなどの樹脂、デキストランやアガロースなどの生体高分子化合物、金属やガラスなどの無機材料が挙げられる。これらの固相担体の形状は、粒子、プレート、膜、チップ、試験管など任意の形状で良い。またそれら固相担体へのポリペプチドの固定化方法は、共有結合法、物理吸着法、イオン結合法、分子間相互作用法によって行うことができる。後記実施例では共有結合法による表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップへの固定化、アフィニティークロマトグラフィーカラムとしての高分子粒子への固定化を挙げているが、上に述べる通り、これ以外の支持担体、固定化方法も排除しない。本発明のポリペプチド、及び融合タンパク質など該ポリペプチドを含む分子は、固相担体へ固定化することにより、免疫グロブリンG及びFc領域の固定化、精製、或いは除去として好適に使用できる。後記実施例では、ポリペプチドを含む融合タンパク質を固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、免疫グロブリンGの精製、及び免疫グロブリンGをパパインによって酵素消化した産物からFc領域を除去・精製しFabを精製した実施例を記載するが、固相担体の形態、固定化方法はこれに限定されるものではなく、磁性粒子などの粒子類、フィルター膜など、当業者に公知なタンパク質精製方法に好適に適用できる。また、精製の対象とする分子は、免疫グロブリンGのほか、サイトカインや酵素など任意のタンパク質とFc領域を連結した融合タンパク質に適用することもできる。
　ポリペプチドの結合活性を測定する方法としては、酵素結合免疫吸着法 (ELISA)、表面プラズモン共鳴法 (SPR)、等温滴定型熱量計 (ITC)、水晶振動子マイクロバランス (QCM)、原子間力顕微鏡 (AFM)（以上、非特許文献24）、プルダウン法（非特許文献25）、電気泳動法（非特許文献26）、蛍光偏光度測定法（非特許文献27）などが挙げられる。後記実施例では酵素結合免疫吸着法、表面プラズモン共鳴法の例を示しているが、上記技術を含む他の方法も排除しない。
　本発明のポリペプチド及び融合タンパク質を用いて、試料中の非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を検出及び分離（精製または除去）することができる。
　被検試料中の非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を検出するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)　被検試料を、本発明のポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させる工程、及び
(2)　被検試料と、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質との間で結合が生じたか否かを判定する工程。
　上記結合が生じたか否かを判定する工程に用いる方法としては、ELISA、SPR、ITC、QCM、AFM、プルダウン法、電気泳動法、蛍光偏光度測定法、蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)、カラムクロマトグラフィー、イムノクロマトグラフィー法などが挙げられる。後記実施例では表面プラズモン共鳴法の例を示しているが、上記技術を含む技術的に適用可能な他の方法も排除しない。
　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を精製するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を本発明のポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
(2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から回収する工程。
　上記試料から回収する工程に用いる方法としては、アフィニティクロマトグラフィー法、アフィニティビーズ法、アフィニティフィルター法、免疫沈降法などが挙げられる。後記実施例ではアフィニティクロマトグラフィー法の例を示しているが、上記技術を含む技術的に適用可能な他の方法も排除しない。
　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を除去するための方法は、次の工程を含むことができる：
(1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を本発明のポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
(2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から除去する工程。
　上記試料から除去する工程に用いる方法としては、アフィニティクロマトグラフィー法、アフィニティビーズ法、アフィニティフィルター法、免疫沈降法などが挙げられる。後記実施例ではアフィニティクロマトグラフィー法の例を示しているが、上記技術を含む技術的に適用可能な他の方法も排除しない。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　本実施例においては、まず、抗体結合活性を示す多数のポリペプチドのアミノ酸配列をどのように特定したかを記し、次いで、配列番号1のアミノ酸配列を共通配列として含む配列番号2～6のアミノ酸配列、及び配列番号10のアミノ酸配列を共通配列として含む配列番号11～14のアミノ酸配列、またこれらのアミノ酸配列に免疫グロブリンG (IgG) のFc領域への結合活性を失わない範囲で数個のアミノ酸置換が、付加、削除、置換又は挿入された配列番号7～9, 15～21、それらの一部である配列番号22のアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド、あるいはこれらのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、あるいはこれらのアミノ酸配列をコードする核酸によって形質転換された組換えファージの結合活性を測定した例を示す。
　1) ポリペプチドライブラリの構築とヒトIgGの Fc領域に対する選択
　抗体結合活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列は、T7ファージを用いたファージ提示法によって特定した。
　まず、Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Xaa　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　(Xaa)8　-　Gly　（配列番号168）(ここでXaaは任意のアミノ酸残基を示す)　のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、Gly　-　Gly　-　Gly　-　Gly　-　Ser（配列番号169）のアミノ酸配列からなるリンカーを介してT7ファージの外殻タンパク質g10のC末端に提示したファージライブラリを、T7Select10-3　Cloning　Kit　(Novagen)　を用いて構築した。構築に必要な手順は全て付属のT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。
　次いで、構築したT7ファージ提示ライブラリを用いて、標的物質であるヒトIgGのFc領域に結合したファージを選択した。まず、アビジン固定磁気ビーズとして用いた　Streptavidin　MagneSphere　(商標登録)　Paramagnetic　Particles　(Promega)　0.65　mlに、ビオチン標識したヒトIgGのFc領域　(Jackson　Immunoresearch)　を20μg混合し、アビジン-ビオチン結合を介してFc領域を磁気ビーズに固定化した。これにブロッキング剤SuperBlock(商標登録)　T20　(TBS)　Blocking　Buffer　(Thermo　SCIENTIFIC)　を1時間添加することでFc領域を固定した磁気ビーズをブロッキングした。これにT7ファージ提示ライブラリ溶液　1　ml　(5×1012　plaque　forming　units)　とFc領域固定磁気ビーズを1時間接触させることにより、Fc領域に結合活性を示すポリペプチド提示ファージをFc領域固定磁気ビーズに結合させた。次に、MagneSphere　(商標登録)　Technology　Magnetic　Separation　Stand　(Promega)　を用いた磁気分離によりポリペプチド提示ファージとFc領域固定磁気ビーズとの複合体を回収した。回収した複合体にSuperBlock(商標登録)　T20　(TBS)　Blocking　Buffer　(Thermo　SCIENTIFIC)　を1　ml添加し、10分間混合して再度磁気分離によって上清を除去し、複合体を回収した。この洗浄操作を10回行った。洗浄後、磁気分離によって回収した複合体に1%　(w/v)　ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含むTBS-T緩衝液を1　ml添加して10分間混合し、Fc領域固定磁気ビーズから結合活性ポリペプチドを提示したファージを溶出した。溶出したファージを、200　ml　LB培地にてO.D.600　=　1.0まで培養した大腸菌BLT5403株　(Novagen)　に感染させ、4時間振とう培養した。培養液を5000×gで20分間の遠心分離により、増幅したファージを含む培地上清を回収した。この上清に対し、20　mlの5　M　NaCl　(和光純薬工業)　と35　mlの50%　ポリエチレングリコール　(PEG)　8000　(Sigma-Aldrich)　を添加し、4℃にて12時間撹拌した。これを14000×gで20分間の遠心分離にかけ、沈殿物を2　mlのTBS-T緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　0.01%　(w/v)　　Tween20(商標登録)　pH　7.4)　にて懸濁し、0.22μm径フィルターを用いたろ過操作によって凝集物を除去することで、T7ファージ溶液を得た。以上の「該ライブラリを標的物質であるヒトIgGのFc領域に接触させる工程、及びヒトIgGのFc領域と結合したファージを選択し回収する工程」を5回繰り返し、結合活性を示すポリペプチドを提示したファージを濃縮した。
　2)　ELISAによる結合活性試験及び配列解析による結合活性ポリペプチドの特定
　続いて、濃縮したファージ集団から、結合活性を有する分子をELISAとDNA解析によって特定した例を示す。
　実施例1の1)にて濃縮された、結合活性を示すポリペプチドを提示したファージの集団から、T7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従ってファージプラークを形成させ、この各々のプラークから単一のポリペプチドを提示したファージを単離した。96穴プレートとして用いたMICROTEST　(商標登録)　96　(BECTON　DICKINSON)　に、LB培地でO.D.600　=　1.0まで培養した大腸菌BL5403株の培養液0.2　mlを投入し、プラークからそれぞれ単離した96種のファージを感染させ、37℃にて12時間静置することでファージを増幅した。これらファージを含む培養液10μlを90μlのTBS緩衝液(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　7.4)に希釈し、これらをMEDISORP　96　wellマイクロプレート　(Nunc)　に1時間投入することでファージをプレートに物理吸着させた。上清を取り除き、SuperBlock(商標登録)　T20　(TBS)　Blocking　Buffer　(Thermo　SCIENTIFIC)　150μlを1時間投入してプレート表面をブロッキングした後、TBS-T緩衝液にて3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ　(HRP)　標識したFc領域　(Jackson　Immunoresearch)(0.2μg/ml)　を含むTBS-T緩衝液を100μl添加し1時間静置した。TBS-T緩衝液で3回洗浄後、ABTS　One　Component　HRP　Microwell　Substrate　(BioFX)　を100μl投入し、結合性を発色反応として検出した。吸光度測定には、吸光マイクロプレートリーダーSunrise　R　(TECAN)　を用い、415　nmの吸光度を測定した。結合活性の高い上位16種のファージについて、ポリペプチドをコードする領域のDNA配列をダイデオキシ法によりABI　PRISM　(商標登録)　3100　(Applied　BioSystems)　を用いて解析した結果、結合活性を有するポリペプチドとして、配列番号2～9で示されるアミノ酸配列を特定した。
　3) ポリペプチド伸長ライブラリの構築とヒトIgG のFc領域に対する選択
　実施例1の2)で特定された分子の高機能化を目的として、アミノ酸配列 (配列番号2) のN末端側に8残基長のランダム配列(Xaa)8を伸長したライブラリを用いた選択を行った。
　まず、(Xaa)8　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Arg　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　Arg　-　Ser　-　Ser　-　Ile　-　Ala　-　Tyr　-　Gly　-　Gly　-　Gly（配列番号170）　(ここでXaaは任意のアミノ酸残基を示す)　のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、Gly　-　Gly　-　Gly　-　Gly　-　Ser（配列番号169）のアミノ酸配列からなるリンカーを介してT7ファージの外殻タンパク質g10のC末端に提示したファージライブラリを、T7Select10-3　Cloning　Kit　(Novagen)　を用いて構築した。構築に必要な手順は全て付属のT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。
　このファージライブラリを用いて実施例1の1)と同様の手順に従い「Fc領域に接触及びこれと結合したファージを選択し回収する工程」を6回繰り返し、Fc領域に結合活性を示すポリペプチドを提示したファージを濃縮した。続いて実施例1の2)と同様の手順に従い、濃縮したファージ集団の中から結合活性を有する分子をELISAによって確認し、ダイデオキシ法によるDNA配列解析を行った。DNA配列解析の結果、アミノ酸配列の収束が確認された配列番号11～19で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合活性ポリペプチドとして特定した。
　4)　本節においては、配列番号2,　11,　21,　22で示されるアミノ酸配列　(それぞれ、H6,　2A1,　2A1Gly,　RSSと呼ぶ)　からなるポリペプチドの結合活性を表面プラズモン共鳴法によって測定した例を示す。
　有機化学的に合成したポリペプチドはbioSYNTHESISより購入した。表面プラズモン共鳴測定装置としてBiacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。Jackson　Immunoresearch社製のヒトFc領域を、センサーチップCM5　(GE　Healthcare)　にAmine　Coupling　Kit　(GE　Healthcare)　を用いたアミンカップリング法により固定化した。次いで、ポリペプチドをH6については50,　25,　12.5μM、2A1については100,　80,　60,　40,　20　nM、2A1Glyについては40,　30,　20,　10,　5μM、RSSについては200,　100,　50,　25,　12.5μMまでそれぞれHBS-T緩衝液　(10　mM　HEPES,　150　mM　NaCl,　0.05%　Tween20　(商標登録),　pH　7.4)　にて希釈し、反応温度25℃で結合活性測定を行った。測定データはBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　にて処理し、H6,　2A1,　2A1Gly,　RSSの結合活性は結合解離手数KDにしてそれぞれ7.9×10-5　(M),　2.2×10-8　(M),　2.3×10-5　(M),　1.1×10-4　(M)と算出された　(表1A)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　5) 本節では、配列番号2, 11～13で示されるアミノ酸配列を含むチオレドキシン融合タンパク質を作製し、その結合活性を表面プラズモン共鳴法によって測定した例を示す。
　アミノ酸配列2,　11～13のポリペプチドをコードするDNAをポリメラーゼ連鎖反応　(PCR)　によって増幅した。PCRはKOD　DNAポリメラーゼ　(TOYOBO)　を用い、反応条件は添付のマニュアルに従った。増幅したDNAをEcoRIとHindIIIで消化し、pET-48b　(Invitrogen)　のEcoRI　/　HindIII　部位で消化した領域にそれぞれ導入することで、ポリペプチドをチオレドキシンのC末端に連結した融合タンパク質をコードするDNA　(配列番号120～123)　を含む発現ベクターを構築した　(以下、これら同定したポリペプチドとチオレドキシンとの融合タンパク質を、H6＿trx,　2A1＿trx,　2A4＿trx,　2F12＿trx　　(配列番号82～85)　と呼ぶ)。構築した発現ベクターを用いて大腸菌BL21　(DE3)　株　(Novagen)　を形質転換した。これを200　ml　の2×YT培地に継代し、O.D.600　=　0.8付近まで振とう培養し、終濃度1　mMのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド　(IPTG)　によって発現誘導を行い、37℃で12時間培養した。5000×gで20分間の遠心分離で菌体を回収し、20　mM　Tris-HCl　500　mM　NaCl　pH　7.4からなる緩衝液によって懸濁した。菌体をアストラソン　Model　S3000　(和研薬)　によって超音波破砕し、14000×gで20分間の遠心分離によって細胞内可溶性画分を回収した。この可溶性画分をNi　Sepharose(商標登録)　6　Fast　Flow　(GE　Healthcare)を用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、目的のチオレドキシン融合タンパク質を調製した。
　続いて、調製したチオレドキシン融合タンパク質の結合活性を表面プラズモン共鳴法によって測定した。測定装置として、Biacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。実施例1の4)と同様の手順に従い、Jackson　Immunoresearch社製Fc領域をセンサーチップCM5　(GE　Healthcare)　にアミンカップリング法により固定化した。次いで、調製したチオレドキシン融合タンパク質　(H6＿trx,　2A1＿trx,　2A4＿trx,　2F12＿trx)　をHBS-T緩衝液によって600,　500,　400,　300,　200,　100　nMにそれぞれ調整し、25℃で結合活性測定を行った。データはBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　にて処理した。H6＿trx,　2A1＿trx,　2A4＿trx,　2F12＿trxの結合解離定数KDはそれぞれ、1.8×10-7　(M),　4.2×10-8　(M),　2.0×10-7　(M),　6.8×10-8　(M)と算出された　(表1B)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　6) 本節では、配列番号2～9,　11～19で示されるアミノ酸配列をコードする核酸によって形質転換された組換えファージの結合活性を酵素結合免疫吸着法 (ELISA) を用いて測定した例を示す。
　配列番号2～9,　11～19のアミノ酸配列をコードするDNAをポリメラーゼ連鎖反応　(PCR)　によって増幅した。PCRはKOD　DNAポリメラーゼ　(TOYOBO)　を用い、反応条件は添付のマニュアルに従った。増幅したDNAを制限酵素EcoRI及びHindIIIによって消化後、T7ファージゲノムDNA上のg10遺伝子3’末端に連結した。T7ファージゲノムDNAは、T7Select10-3　Cloning　Kit　(Novagen)に添付の試料を用い、反応条件と手順は付属のT7Select(商標登録)　System　Manualに従った。連結したT7ファージゲノムDNAを用い、T7Select　Packaging　Kit　(Novagen)　によってT7ファージの試験管内パッケージングを行った。反応条件はT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。続いてT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従ってファージプラークを形成させ、この各々のプラークから該ポリペプチドを提示した組換えファージを単離した。MICROTEST　(商標登録)　96　(BECTON　DICKINSON)　に、LB培地でO.D.600　=　1.0まで培養した大腸菌BL5403株の培養液0.2　mlを投入し、プラークからそれぞれ単離した組換えファージを感染させ、37℃にて12時間静置することでファージを増幅した。これらファージを含む培養液10μlを90μlのTBS緩衝液(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　7.4)に希釈し、測定サンプルとした。
　測定サンプルをMEDISORP　96　wellマイクロプレート　(Nunc)　に1時間投入することでファージをプレートに物理吸着させた。上清を取り除き、SuperBlock(商標登録)　T20　(TBS)　Blocking　Buffer　(Thermo　SCIENTIFIC)　150μlを1時間投入してプレート表面をブロッキングした後、TBS-T緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　0.1%　Tween20　(商標登録),　pH　7.4)　にて3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ　(HRP)　標識したFc領域　(Jackson　Immunoresearch)(0.2μg/ml)　を含むTBS-T緩衝液を100μl添加し1時間静置した。TBS-T緩衝液で3回洗浄後、ABTS　One　Component　HRP　Microwell　Substrate　(BioFX)　を100μl投入し、結合活性を発色反応として検出した。吸光度測定には、吸光マイクロプレートリーダーSunrise　R　(TECAN)　を用い、415　nmの吸光度　(O.D.415)　を測定した。対照実験として、非ファージ存在のTBS-T緩衝液をネガティブコントロールとして用いた。
　配列番号2～9で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示した組換えファージ、及び配列番号11～19で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示した組換えファージについて、ELISAの結果を表2A、表2Bに示す。いずれの組換えファージもコントロールに対して有意な結合活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　7)　本節では、配列番号10で示されるアミノ酸配列の一例として、配列番号11のアミノ酸配列からなるポリペプチド　(2A1と呼ぶ)　が非天然型構造を有する免疫グロブリンG及びFc領域に特異的な結合活性を示すことを確認した例を記述する。本節では、前記「発明を実施するための最良の形態」で示した酸処理によるAlternatively　folded　state　(AFS)　などの非天然型構造の例として、酸処理、還元剤処理によって得られた非天然型構造の免疫グロブリンGあるいはFc領域に対する結合活性を測定し、これと天然型構造に対する結合活性と比較した。
　非天然型構造に対する結合活性の評価には、表面プラズモン共鳴法を用いた。2A1をアミンカップリング法によりセンサーチップCM5に固定化し、以下に示す複数の条件下で処理したヒトIgGあるいはFc領域に対する結合活性を測定した。測定サンプルとして以下の物を用いた。(1)　Jackson　Immunoresearch社製ヒトFc領域、(2)　変性処理を施さない、天然型構造のヒトモノクローナルIgG、(3)　(2)のIgGから調製したFc領域　(Fc領域は、IgGをPierce（登録商標）Fab　Preparation　Kit　(Thermo　SCIENTIFIC)　に添付の使用書に従ってパパイン消化後、MabSelect　SuRe　(GE　Healthcare)　を用いたアフィニティークロマトグラフィー、HiTrap　DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー　(GE　Healthcare)、Superdex200　(GE　Healthcare)　を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製することで調製した)、(4)　(2)のIgGを酸性緩衝液　(20　mM　酢酸ナトリウム　pH　4.5)　にて50℃で10日間処理した酸変性型IgG、(5)　(3)のFc領域を50　mMの2-メルカプトエチルアミン　(Thermo　Scientific　Pierce)　によって37℃、90分の還元処理を施し、10　mMエチレンジアミン四酢酸の存在下でその還元条件を維持させたFc領域、(6)　(2)のIgGを、AFSを取ることが知られている条件　(10　mM　Gly-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　2.0)　にて処理したAFS型IgG。表面プラズモン共鳴試験の結果、2A1は(1)のJackson　Immunoresearch社より購入したヒトFc領域　(図1A)　には結合するものの、(2)の天然型構造のヒトIgG　(図1B)、及びそれから生じる(3)のFc領域　(図1C)　には結合を示さない。一方、(4)の酸変性型IgG　(図1D)に対してはKD　=　2.2×10-9　(M)　で、(5)の還元処理を施したFc領域　(図1E)　に対しては、KD　=　1.0×10-7　(M)　で、(6)のAFS型IgG　(図1F)　に対しては、KD　=　5.0×10-10　(M)　でそれぞれ結合した。以上の結果から、配列番号11のアミノ酸配列からなる2A1はFc領域の天然型構造を認識しているのではなく、様々な条件下で生じる非天然型構造を特異的に認識することが示された。
　8)　本節では、配列番号11で示されるポリペプチド2A1の熱失活耐性を評価した例を示す。有機合成したポリペプチド2A1をHBS-T緩衝液　(10　mM　HEPES,　150　mM　NaCl,　0.05%　Tween20　(商標登録),　pH　7.4)　にて27μMに希釈し、これを98℃、15分間加熱した。加熱処理と非加熱処理のサンプルをそれぞれHBS-T緩衝液によって100,　50,　25,　12.5　nMに希釈し、表面プラズモン共鳴によって結合活性を評価した。
　表面プラズモン共鳴測定装置としてBiacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。非天然型構造を有するヒトFc領域は、天然型ヒトFc領域を酸緩衝液　(10　mM　Gly-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　2.0)　に透析したものを用いた。この非天然型ヒトFc領域を、センサーチップCM5　(GE　Healthcare)　にAmine　Coupling　Kit　(GE　Healthcare)　を用いたアミンカップリング法により固定化し、反応温度25℃で結合活性測定を行った。測定データはBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　にて処理した。加熱処理後及び非加熱処理のサンプルの結合活性は結合解離定数KDにしてそれぞれ2.0×10-8　(M),　2.2×10-8　(M)と算出された。結合レスポンスの総量も両者で同一であった。以上の結果は、ポリペプチド2A1の結合活性は加熱処理によっても不可逆的には損なわれないことを示しており、高い熱失活耐性を示すものである。
　本実施例においては、まず、抗体結合活性を示す多数のポリペプチドのアミノ酸配列をどのように特定したかを記し、次いで、配列番号23のアミノ酸配列を共通配列として含む配列番号24～54のアミノ酸配列、及び配列番号56のアミノ酸配列を共通配列として含む配列番号57～72のアミノ酸配列、またこれらのアミノ酸配列にIgGのFc領域への結合活性が損なわれない範囲で数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入された配列番号55, 73～81のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、あるいはこれらのアミノ酸配列をコードする核酸によって形質転換された組換えファージの結合活性を測定した例を示す。
　1)　ポリペプチドライブラリの構築とヒトIgGのFc領域に対する選択
　抗体結合活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列は、T7ファージを用いたファージ提示法によって特定した。
　まず、Asp　-　Ala　-　Ala　-　Trp　-　His　-　Leu　-　Gly　-　Glu　-　Leu　-　Val　-　Trp　-　Ala　-　Thr　-　Tyr　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Glu　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　(Xaa)10　（配列番号171）　(ここでXaaは任意のアミノ酸残基を示す)　のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、Gly　-　Gly　-　Gly　-　Gly　-　Ser（配列番号169）のアミノ酸配列からなるリンカーを介してT7ファージの外殻タンパク質g10のC末端に提示したファージライブラリを、T7Select10-3　Cloning　Kit　(Novagen)　を用いて構築した。構築に必要な手順は全て付属のT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。
　続いて構築したT7ファージ提示ライブラリを用いて、該ライブラリを標的物質であるヒトIgGのFc領域に接触させる工程、及びヒトIgGのFc領域と結合したファージを選択し回収する工程を示す。Fc領域の調製は、ヒトモノクローナル抗体IgGをPierce（登録商標）Fab　Preparation　Kit　(Thermo　SCIENTIFIC　Pierce)　に添付の使用書に従い、IgGをパパイン消化後、MabSelect　SuRe　(GE　Healthcare)　を用いたアフィニティークロマトグラフィー、HiTrap　DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー　(GE　Healthcare)、Superdex200　(GE　Healthcare)　を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。調製したFc領域を、D-Biotinoyl-ε-Aminocaproic　Acid　N-Hydroxysuccinimide　Ester　(Roche)を用いて添付使用書に従いアミノ基を介してビオチンを化学結合させた。続いて実施例1の1)及び2)と同様の手順に従い、該ライブラリをFc領域に接触及びこれと結合したファージを選択し回収する工程、結合活性を有するポリペプチドを提示したファージをELISAによって確認する工程、ダイデオキシ法によるDNA配列解析を行った。この結果、結合活性を示すポリペプチドとして、配列番号24～55で示されるアミノ酸配列を特定した。
　2)　ポリペプチド伸長ライブラリの構築とヒトIgGのFc領域に対する選択
　実施例2の1)で特定された結合活性ポリペプチドの高機能化を目的として、それぞれ2種類のアミノ酸配列　(配列番号26或いは27)　のN末端側を伸長したポリペプチドのファージ提示ライブラリを用いた選択を行った。まず、(Xaa)10　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Glu　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　Tyr　-　Asp　-　Ala　-　Ala　-　Trp　-　His　-　Leu　-　Gly　-　Glu　-　Leu　-　Val　-　Trp　-　Ala　-　Thr　-　Tyr　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Glu　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　Leu　-　Pro　-　Asp　-　Trp　-　Gln　-　Thr　-　Met　-　Ala　-　Gln　-　Lys（配列番号172)　、或いは、　(Xaa)10　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Glu　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　Tyr　-　Asp　-　Ala　-　Ala　-　Trp　-　His　-　Leu　-　Gly　-　Glu　-　Leu　-　Val　-　Trp　-　Ala　-　Thr　-　Tyr　-　Tyr　-　Asp　-　Pro　-　Glu　-　Thr　-　Gly　-　Thr　-　Trp　-　Glu　-　Pro　-　Asp　-　Trp　-　Gln　-　Arg　-　Met　-　Leu　-　Gly　-　Gln（配列番号173）　(ここでXaaは任意のアミノ酸残基を示す)　のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、Gly　-　Gly　-　Gly　-　Gly　-　Ser（配列番号169）のアミノ酸配列からなるリンカーを介してT7ファージの外殻タンパク質g10のC末端に提示したファージライブラリを、T7Select1-1　Cloning　Kit　(Novagen)　を用いて構築した。構築に必要な手順は全て付属のT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。
　構築したファージライブラリを用いて、「Fc領域に接触及びこれと結合したファージを選択し回収する工程」を実施例2の1)と同様の手順に従い、この工程を10回繰り返し行った。ELISAによる結合活性試験とDNA配列解析は実施例1の2) と同様の手順に従い、配列番号57～81からなるアミノ酸配列を結合活性ポリペプチドとして特定した。
　3)　本節では、配列番号24～27のアミノ酸配列からなるポリペプチド　(それぞれpep14,　pep11,　pep21,　pep24と呼ぶ)　の結合活性を表面プラズモン共鳴によって測定した例を示す。有機合成したポリペプチドはbioSYNTHESISより購入した。これをHBS-T緩衝液にて希釈し、500,　400,　300,　200,　100　nMに調整した。表面プラズモン共鳴試験にはBiacoreT100　(GE　Healthcare)　を用いた。センサーチップに固定化するFc領域は、ヒトモノクローナルIgGをPierce（登録商標）Fab　Preparation　Kit　(Thermo　SCIENTIFIC)　に添付の使用書に従ってパパイン消化後、MabSelect　SuRe　(GE　Healthcare)　を用いたアフィニティークロマトグラフィー、HiTrap　DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー　(GE　Healthcare)、Superdex200　(GE　Healthcare)　を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製することで調製した。調製したFc領域をアミンカップリング法によってセンサーチップCM5　(GE　Healthcare)　に固定化した。調製した合成ペプチドを用いて結合活性測定を行い、結合解離定数を測定した。データ処理はBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　を用いて行い、pep14,　pep11,　pep21,　pep24の結合解離定数KDはそれぞれ、1.2×10-7　(M),　5.1×10-7　(M),　1.0×10-7　(M),　2.2×10-7　(M)と算出された　(表3A)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　4) 本節では、配列番号57のアミノ酸配列(p17と呼ぶ)からなるポリペプチドの結合活性を表面プラズモン共鳴によって測定した例を示す。ポリペプチドの調製は、配列番号86のアミノ酸配列からなるチオレドキシン融合タンパク質p17＿trxをプロテアーゼ切断後、チオレドキシン部分を除去することで調製した。発現ベクターpET-48b (Novagen) によって産生されるチオレドキシン融合タンパク質は、そのアミノ酸配列中にHRV 3C プロテアーゼ切断部位を有するため、このプロテアーゼを用いてC末端に連結した目的のポリペプチドを得ることができる。
　p17を含むチオレドキシン融合タンパク質　(配列番号86)　をコードするDNA　(配列番号124)　をPCRによって合成し、このDNAを発現ベクター　pET-48b　(Novagen)　に導入した。この発現ベクターを用い、実施例1の5)と同様の手順に従い、チオレドキシン融合タンパク質を調製した。チオレドキシン融合タンパク質　40　mgをHRV　3C　Protease　(Novagen)　100　Unitを用いて4℃で消化反応を行った。反応条件は付属マニュアルに従った。反応産物を6Mの塩酸グアニジン溶液に希釈し、Superdex　Peptide　10/300　GL　(GE　Healthcare)　を用いたゲルろ過クロマトグラフィー、次いでμRPC　C2/C18　ST　4.6/100　(GE　Healthcare)　を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製し、配列番号57のアミノ酸配列からなるポリペプチドp17を調製した。
　次いで、調製したp17の結合活性を、表面プラズモン共鳴を用いて測定した。測定にはBiacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。p17をHBS-Tに希釈し、25,　12.5,　6.25,　3.13　nMに調整した。センサーチップCM5へのFc領域の固定化と結合活性測定は実施例2の3)と同様の手順に従った。解析の結果、p17はFc領域に対して結合解離定数KD　=　1.6×10-9　(M)　でFc領域に結合した　(表3B)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この値は線状のポリペプチドとしては極めて高い結合活性を示すものである。また、これまで汎用的に用いられてきたIgG結合性タンパク質プロテインAやプロテインGであっても、その各々のドメイン単独の結合活性はKDにしてそれぞれ1.0×10-8　(M)（非特許文献28）4.9×10-7　(M)（非特許文献29）程度である。さらに、一般に結合活性が線状より高い環状化ポリペプチドと比較しても、本発明のポリペプチドp17は、既報の高結合活性環状ペプチドFcBP-2　(KD　=　2.2　nM)（非特許文献4）を上回る、最上位に属する高結合活性を有している。
　5) 本節では、配列番号24, 26～33, 57～81で示されるアミノ酸配列を含むチオレドキシン融合タンパク質を作製し、その結合活性を表面プラズモン共鳴法を用いて測定した例を示す。
　配列番号24,　26～33,　57～81のポリペプチドをコードするDNAをPCRによって増幅した。これらをEcoRIとHindIIIで消化し、pET-48b　(Invitrogen)　のEcoRI　/　HindIII　部位で消化した領域にそれぞれ導入することで、ポリペプチドをチオレドキシンのC末端に連結した融合タンパク質　(配列番号87～95,　86,　98,　99,　101,　102,　106～113,　116～118,　96,　97,　100,　103～105,　114,　115,　119)　をコードするDNA　(配列番号125～133,　124,　136,　137,　139,　140,　144～151,　154～156,　134,　135,　138,　141～143,　152,　153,　157)　を含む発現ベクターを構築した。この発現ベクターを用い、実施例1の5)と同様の手順に従い、チオレドキシン融合タンパク質を調製した。
　続いて、調製したチオレドキシン融合タンパク質の結合活性を表面プラズモン共鳴法によって測定した。測定装置として、Biacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。実施例2の3)と同様の手順に従いFc領域をセンサーチップCM5　(GE　Healthcare)　にアミンカップリング法により固定化した。次いで、調製したチオレドキシン融合タンパク質をHBS-T緩衝液によって600,　500,　400,　300,　200,　100　nMにそれぞれ調整し、25℃で結合活性測定を行った。データはBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　にて処理した。算出されたKDを表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　6) 本節では、配列番号26,　27,　30～55,　57,　63～72,　79～81で示されるアミノ酸配列をコードする核酸によって形質転換された組換えファージの結合活性を酵素結合免疫吸着法 (ELISA) を用いて測定した例を示す。
　配列番号26,　27,　30～55,　57,　63～72,　79～81のアミノ酸配列をコードするDNAをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。PCRはKOD　DNAポリメラーゼ　(TOYOBO)　を用い、反応条件は添付のマニュアルに従った。増幅したDNAを制限酵素EcoRI及びHindIIIによって消化後、T7ファージゲノムDNA上のg10遺伝子3’末端に連結した。T7ファージゲノムDNAは、T7Select10-3　Cloning　Kit　(Novagen)に添付の試料を用い、反応条件と手順は付属のT7Select(商標登録)　System　Manualに従った。連結したT7ファージゲノムDNAを用い、T7Select　Packaging　Kit　(Novagen)　によってT7ファージの試験管内パッケージングを行った。反応条件はT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従った。続いてT7Select(商標登録)　System　Manual　(Novagen)　に従ってファージプラークを形成させ、この各々のプラークから該ポリペプチドを提示した組換えファージを単離した。MICROTEST　(商標登録)　96　(BECTON　DICKINSON)　に、LB培地でO.D.600　=　1.0まで培養した大腸菌BL5403株の培養液0.2　mlを投入し、プラークからそれぞれ単離した組換えファージを感染させ、37℃にて12時間静置することでファージを増幅した。これらファージを含む培養液10μlを90μlのTBS緩衝液(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　7.4)に希釈し、測定サンプルとした。
　測定サンプルをMEDISORP　96　wellマイクロプレート　(Nunc)　に1時間投入することでファージをプレートに物理吸着させた。上清を取り除き、SuperBlock(商標登録)　T20　(TBS)　Blocking　Buffer　(Thermo　SCIENTIFIC)　150μlを1時間投入してプレート表面をブロッキングした後、TBS-T緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　0.1%　Tween20　(商標登録),　pH　7.4)にて3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ　(HRP)　標識したFc領域　(Jackson　Immunoresearch)(0.2μg/ml)　を含むTBS-T緩衝液を100μl添加し1時間静置した。TBS-T緩衝液で3回洗浄後、ABTS　One　Component　HRP　Microwell　Substrate　(BioFX)　を100μl投入し、結合活性を発色反応として検出した。吸光度測定には、吸光マイクロプレートリーダーSunrise　R　(TECAN)　を用い、415　nmの吸光度　(O.D.415)　を測定した。対照実験として、非ファージ存在のTBS-T緩衝液をネガティブコントロールとして用いた。
　配列番号26, 27, 30～55で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示した組換えファージ、配列番号57, 63～72, 79～81で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示した組換えファージについて、ELISAの結果をそれぞれ表5A、表5Bに示す。いずれの組換えファージもコントロールに対して有意な結合活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　本実施例においては、配列番号11で示される合成ペプチド2A1を用いることにより、天然型IgGサンプル中に微量混入した非天然型IgGを定量的に検出した例を示す。一般に抗体医薬品の品質管理工程においては、迅速かつ簡便な不均一性評価の一つとしてサイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術が汎用される（非特許文献30）。本実施例では、汎用的な手法であるサイズ排除クロマトグラフィーと比較検討することで、本発明のポリペプチドを利用した検出技術の有用性を実証した。
　非天然型IgGは、AFSを生じることが知られている10　mM　Glycine-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　2.0にヒトモノクローナル抗体を18時間透析することで得た。調製した非天然型IgGをTris-HCl　(pH　8.0)によって中和後、HBS-T緩衝液に希釈した天然型IgG　(6.7μM)　に一定希釈率　(10,　5,　1,　0.1,　0.01,　0.001%)　で非天然型IgGを混合し、これを測定サンプルとした。
　続いて測定サンプルを表面プラズモン共鳴及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて解析し、非天然型IgGの検出感度について両者を比較した。表面プラズモン共鳴試験は実施例1の7)に記載の測定装置及びセンサーチップを用いた。
　調製したサンプルの測定データをBicore　T100　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)　を用いて解析し、非天然型IgGの混入量を結合レスポンスとして定量した　(図2)。サイズ排除クロマトグラフィーは、分析機器としてAKTA　purifier　(GE　Healthcare)　を用い、カラムはSuperdex　200　5/150　GL　(GE　Healthcare)　を用いた。測定データはUNICORN　version　4.12　(GE　Healthcare)　を用いて処理し、IgGの単量体画分及び多量体画分　(図3)　として検出されるピーク面積を用いて非天然型IgGの混入量を定量した。
　図4は、表面プラズモン共鳴法及びサイズ排除クロマトグラフィーによって得られたAFS型IgGの検出量を、AFS型IgGの濃度に対して両対数プロットしたグラフを比較したものである。サイズ排除クロマトグラフィーでは混入率0.1%まで有意な検出感度を示すことができるが、本発明のポリペプチドを用いた表面プラズモン共鳴による混入率測定では、ポリペプチドの高い結合活性によって非天然型IgGを高感度に検出できることから、0.01%の混入率においても十分な検出感度を示すことが明らかとなった。すなわち本実施例の結果は、非天然型IgG結合性ポリペプチドを用いることにより、例えば抗体医薬品などの天然型IgGに極微量混入した非天然型IgGを、既存手法に比べて精度良く検出できることを示すものである。
　本実施例においては、IgG結合性ポリペプチドを融合したチオレドキシン融合タンパク質p17＿trx (配列番号86) を固定化したアフィニティーカラムを作製し、これを用いてFc領域の除去・精製に適用した例、及びヒトIgGの精製に適用した例を示す。実施例2の4)に示す通り、本発明のポリペプチドはIgGのFc領域に対し結合解離定数にしてnMオーダーで結合し、既存のIgG結合性タンパク質、IgG結合性ポリペプチドに匹敵あるいはこれらを凌駕する結合活性を有している。この高い結合活性に基づき、Fc領域の選択的な除去、あるいはIgG精製に好適に使用できるアフィニティーカラムとして適用した。
　(1)　本節では、Fc領域の除去が求められる事例として、IgGのパパイン消化産物からのFab領域の精製に適用した。チオレドキシン融合タンパク質の調製は、実施例2の5)と同様の手順に従った。調製したp17＿trx　(12　mg/ml)　を用い、HiTrap　NHS-activated　HP　(GE　Healthcare)　にアミノ基を介して固定化した。固定化条件・方法は添付のマニュアルに従い、固定化量は約10.8　mgと算出された。
　続いてヒトモノクローナルIgGをパパインにより消化した。消化反応にはPierce　Fab　Preparation　Kit　(Thermo　SCIENTIFIC)　を用い、手順は付属のマニュアルに従った。調製したIgGパパイン消化産物をp17＿trx固定化カラムによって精製した。クロマトグラフィー装置としてAKTA　purifier　(GE　Healthcare)　を用い、ランニング緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　7.4)　の存在下でパパイン消化産物をアプライし、溶出緩衝液　(100　mM　Gly-HCl,　pH　2.0)　で溶出した。得られたクロマトグラムを図5に示す。前半のピークである素通り画分と、後半のピークである溶出画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認したところ　(図6)、p17＿trx固定化カラムの適用により、Fabと、Fc領域及び未反応のIgGが完全に分離されていることが明らかとなった。すなわち本実施例は、本発明によるIgG結合性ポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーが、Fc領域の選択的除去にに好適に使用できることを示すものである。
　(2)　本節では、p17＿trx固定化カラムをヒトモノクローナルIgGの精製に適用した例を示す。前節で作製したカラムに、ランニング緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　7.4)　の存在下でヒトモノクローナルIgGをアプライし、50　mM　クエン酸ナトリウム　(pH　7.0)　と0.5　M　酢酸　(pH　2.5)　との混合によるpH勾配により、IgGを溶出した。得られたクロマトグラムを図7に示す。アプライしたIgGはカラムに捕捉され、pH　3.25付近の酸性条件下で溶出することができた。この結果は、本発明によるIgG結合性ポリペプチドをIgG精製に使用できるアフィニティーカラムに好適に使用できることを示するものである。
　本節では、配列番号11で示されるポリペプチド2A1のアミノ酸配列に1アミノ酸残基変異を導入した変異体 (配列番号158～164)
の結合活性を表面プラズモン共鳴によって測定し、各アミノ酸残基が結合に与える影響について評価した例を示す。
　有機化学的に合成した7種類の変異体ポリペプチド、2A1＿Q5R　(配列番号158)、2A1＿W6A　(配列番号159)、2A1＿S7A　(配列番号160)、2A1＿R17A　(配列番号161)、2A1＿S18A　(配列番号162)、2A1＿S19A　(配列番号163)、2A1＿I20A　(配列番号164)　はbioSYNTHESISより購入した。表面プラズモン共鳴測定装置としてBiacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。非天然型構造を有するヒトFc領域は、天然型ヒトFc領域を酸緩衝液　(10　mM　Gly-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　2.0)　に透析したものを用いた。この非天然型ヒトFc領域を、センサーチップCM5　(GE　Healthcare)　にAmine　Coupling　Kit　(GE　Healthcare)　を用いたアミンカップリング法により固定化した。次いで、ポリペプチドをQ5Rについては62.5,　31.3,　15.6　nM、W6Aについては500,　250,　125　nM、S7Aについては1000,　500,　250　nM、R17Aについては500,　250,　125　nM、S18Aについては125,　62.5,　31.3　nM、S19Aについては1000,　500,　250　nM、I20Aについては500,　250,　125　nMまでそれぞれHBS-T緩衝液　(10　mM　HEPES,　150　mM　NaCl,　0.05%　Tween20　(商標登録),　pH　7.4)　にて希釈し、反応温度25℃で結合活性測定を行った。
　測定データをBiacore　T00　Evaluation　Software　(GE　Healthcare)にて処理し、Q5R,　W6A,　S7A,　R17A,　S18A,　S19A,　及びI20Aのそれぞれの結合解離定数KDを算出した（表６）。この結果、5位のグルタミン残基をアルギニン残基に変異することで結合活性が2.5倍上昇することが判明した。また、アラニン残基への変異によって結合活性を大きく減少させるアミノ酸残基が同定され、それぞれ、6位のトリプトファン残基は約1/8、7位のセリン残基は約1/5、17位のアルギニン残基は約1/16、19位のセリン残基は約1/10、20位のイソロイシン残基は約1/50の結合活性低下が認められた。この結果は、これらの残基が結合活性の発現に大きく関与していることを示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本実施例においては、配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド2A1の結合特異性を評価するため、夾雑タンパク質を含む溶液から標的のヒトIgGのFc領域を回収した例を示す。
　0.5　mgのポリペプチド2A1を1.5　mlの炭酸ナトリウム緩衝液　(0.2　M　NaHCO3,　0.5　M　NaCl,　pH　8.3)　に溶解し、これを0.1　mlのNHS-activated　Sepharose　(登録商標)　(GE　Healthcare)　にアミンカップリング法によって固定化した。固定化の手順は付属の添付文書に従った。固定化の反応率は42%であった。夾雑タンパク質を含む溶液は、1　mlのLB培地で培養した大腸菌BLT5403株を1　mlのTBS-T緩衝液　(50　mM　Tris-HCl,　150　mM　NaCl,　0.05%　(w/v)　Tween20　(登録商標),　pH　7.4)　に懸濁し、超音波破砕後、遠心によって得た上清を用いた。非天然型構造を有するヒトFc領域は、天然型ヒトFc領域をグリシン塩酸緩衝液　(10　mM　Glycine-HCl,　150　mM　NaCl,　pH　2.0)　に透析することで調製した。この非天然型Fc領域　5μg相当を、上記の大腸菌破砕液62　μlに添加し、これをTBS-T緩衝液で1　mlまで希釈した溶液を、結合特異性評価のサンプル溶液とした。比較試験のコントロール溶液として、非天然型Fc領域を含まない大腸菌破砕液を調製した。
　調製したサンプル溶液と、2A1ペプチドを固定化したSepharoseを20分間混合した。その後、0.5　mlのTBS-T緩衝液を用いて5回洗浄し、0.2　mlの50　mM　NaOHで溶出した。溶出液は、10　μlの3M　酢酸ナトリウム　(pH　5.2)　で中和した。溶出液及びサンプル溶液を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した　(図8)。溶出液には、他の夾雑タンパク質に比べFc領域に相当するバンドのみが有意に存在した。この結果は、ポリペプチド2A1が多数の夾雑タンパク質の中から標的であるFc領域を特異的に認識することを示しており、本発明によって得た分子が、通常のタンパク質間相互作用に見られる高い標的特異性を有することを示すものである。
　本実施例では、配列番号57からなるポリペプチドp17とヒトIgGのFc領域との複合体についてX線結晶構造解析を行い、その立体構造を決定した方法と結果を示す。
　ポリペプチドp17の調製は、実施例2の4)　と同様の手順に従った。ヒトIgGのFc領域の調製は、実施例2の1)　と同様の手順に従った。ポリペプチドp17とFc領域の複合体を緩衝液　(20　mM　Tris-HCl,　10%　(v/v)　ジメチルスルホキシド,　pH　7.4)　に透析し、限外ろ過によって10　mg/ml　の濃度に濃縮した。結晶化の沈殿剤・緩衝液として、40%　ポリエチレングリコール4000,　0.1　M　クエン酸ナトリウム　(pH　5.6),　0.2　M　酢酸アンモニウムを用い、シッティングドロップ式による蒸気拡散法によって結晶を得た。取得した結晶を用いて、高エネルギー加速器研究機構Photon　Factory　NW-12Aにて回折データを収集した。位相決定はサーチモデル　(プロテイン・データ・バンク　(PDB)　code,　1DN2)　を用いた分子置換法によって行った。CNS　(非特許文献31　Brunger　AT,　Adams　PD,　Clore　GM,　DeLano　WL,　Gros　P,　Grosse-Kunstleve　RW,　Jiang　JS,　Kuszewski　J,　Nilges　M,　Pannu　NS,　Read　RJ,　Rice　LM,　Simonson　T,　and　Warren　GL.　(1998)　Crystallography　&　NMR　system:　A　new　software　suite　for　macromolecular　structure　determination.　Acta　Crystallogr　D　Biol　Crystallogr.　54,　905-921)、CCP4　suite　(非特許文献32　Winn　MD,　Ballard　CC,　Cowtan　KD,　Dodson　EJ,　Emsley　P,　Evans　PR,　Keegan　RM,　Krissinel　EB,　Leslie　AG,　McCoy　A,　McNicholas　SJ,　Murshudov　GN,　Pannu　NS,　Potterton　EA,　Powell　HR,　Read　RJ,　Vagin　A　and　Wilson　KS.　(2011)　Overview　of　the　CCP4　suite　and　current　developments.　Acta　Crystallogr　D　Biol　Crystallogr.　67,　235-242)、Coot　(非特許文献33　Emsley　P　and　Cowtan　K.　(2004)　Coot:　model-building　tools　for　molecular　graphics.　Acta　Crystallogr　D　Biol　Crystallogr.　60,　2126-2132)により構造精密化を行い、分解能2.9Åで複合体の結晶構造を決定した。非対称単位中には、4つの複合体、すなわち、4つのFc領域と8つのp17分子が含まれていた。
　ポリペプチドp17は、4本のβストランド、3つのβヘアピン、1つの短いαヘリックス、1本のループ構造から形成されていた　(図9)。p17に含まれるFc-III　Ala部分の構造は、鋳型としたFc　IIIペプチドの立体構造　(PDB　code,　1DN2)　と、主鎖・側鎖の両面で高い構造相同性　(r.m.s.d.　=　0.639Å)　を示し　(図10)、Fc領域への結合部位も同等の箇所を認識していた　(図11)。このことは、本発明によるペプチドの高機能化は、本来の機能の特性を損なうことなく増強できることを示している。ライブラリに導入したシニョリン由来の領域は、シニョリンと同様にβヘアピンを形成しており、ランダムアミノ酸配列として伸長した領域を、Fc-III　Alaの近傍へ配置する役割を担っていた。このことは、βヘアピンを形成する微小タンパク質の使用が、二つのセグメントを効果的に近接させる役割を担っていることを示している。ランダムアミノ酸配列として伸長した二つの領域は、それぞれ全く異なる立体構造を形成していた。C末端領域は短いαヘリックスを形成しており、ヘリックス表面から突き出た側鎖が、Fc-III　Alaのアミノ酸残基と接触し、結合に有利なコンホメーションを支えていた　(図12)。先行研究において、鋳型としたFc　IIIペプチドのFc領域への結合では、Trp残基の配向性が重要であることが示唆されており　(非特許文献3,　4)、Fc-III　Alaにおいて相当するTrp33の芳香環残基を、αヘリックスに存在するMet51の側鎖が直接支えていた　(図12)。一方、C末端領域と対照的に、N末端はループ構造を形成し、Fc-III　Alaの土台にあたる、導入したシニョリン部分と接触することでこの土台を支えていた　(図12)。これらの結果は、ランダムアミノ酸配列として導入されたセグメントは機能選択の結果それぞれの状況に適した立体構造を形成し、ポリペプチドの高機能化を実現したことを示している。
　本実施例では、p17ポリペプチド (配列番号57) のC末端セグメントに存在するアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体を作製し、結合活性を測定することで、該アミノ酸残基が結合活性に与える影響を評価するとともに、実施例7で得た立体構造情報と照らし合わせることでそれらアミノ酸残基の役割を詳細に解析した例を示す。
　配列番号174~178で示されるアミノ酸配列をコードするDNA　(配列番号179~183)を設計し、これらをPCRによって合成した。実施例2の4)　と同様の手順に従い、チオレドキシン融合タンパク質の発現及びプロテアーゼ処理によって変異体ポリペプチドを調製し、以下の様に名づけた:　p17_P46A　(配列番号174),　p17_D47A　(配列番号175),　p17_W48A　(配列番号176),　p17_R50A　(配列番号177),　p17_M51A　(配列番号178)。
　次いで、調製した5種類のポリペプチドの結合活性を、表面プラズモン共鳴を用いて解析した。測定にはBiacore　T100　(GE　Healthcare)　を用いた。センサーチップCM5　(GE　Healthcare)　へのFc領域の固定化と結合活性解析は、実施例2の4)　と同様の手順に従った。解析の結果得られた、各ポリペプチドの結合活性を表7に示す。アラニン置換を行った全ての変異体において結合活性の低下が確認され、これらの残基が結合活性に関与していることが示唆された。特に、p17_W48Aとp17_M51Aはアラニン置換の結果100倍以上の結合活性の低下を招いていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　次いで、アラニン置換を導入した部位について、構造的観点から考察した。Pro46の部位で、プロリン残基に特徴的な構造配向性によってポリペプチドの主鎖は方向を変えており、その先に生じるαヘリックスを適切な位置へと配向させる微調整の役割を担っている　(図13A)。Asp47は、近傍のArg50と水素結合しており　(図13B)、Pro46と同様にαヘリックスの配向を微調整している。αヘリックスに存在するArg50はその側鎖がAla24と接触することで、結合部位を形成する23~35位のβストランド間の架橋を補助していた　(図13C)。同じくαヘリックスに存在するTrp48とMet51は、Met51を中心としてこれら疎水残基同士で接触しており、結合部位に存在するTrp33の芳香環を直接安定化していた　(図13D)。先行研究　(非特許文献3,　4)において、このTrp33の芳香環側鎖の配向がFc領域への結合に大きく影響を与えることが示されている。また、上述の結合活性試験において、Met51におけるアラニン置換は100倍以上の結合親和性低下を招くことが判明している。これら二つの事実から、Met51の結合関与はTrp33の芳香環を支えることによって結合活性を高めていると考えられる。
　以上の結果は、分子ライブラリ中に導入されたランダムアミノ酸配列が機能選択の結果、機能的・構造的に適したアミノ酸残基を採用し、効果的にポリペプチドを高機能化していることを結合機能解析、立体構造解析の両面から実験的に実証するものである。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
　本発明は、抗体を始めとするタンパク質の検出、精製、固定化又は除去に有用である。
配列番号１：IgG結合ペプチド
配列番号２：IgG結合ペプチド、H6
配列番号３：IgG結合ペプチド、H3
配列番号４：IgG結合ペプチド、D5
配列番号５：IgG結合ペプチド、E7
配列番号６：IgG結合ペプチド、sC12
配列番号７：IgG結合ペプチド、G3
配列番号８：IgG結合ペプチド、G11
配列番号９：IgG結合ペプチド、sA7
配列番号１０：IgG結合ペプチド
配列番号１１：IgG結合ペプチド、2A1
配列番号１２：IgG結合ペプチド、2A4
配列番号１３：IgG結合ペプチド、2F12
配列番号１４：IgG結合ペプチド、2H1
配列番号１５：IgG結合ペプチド、2F2
配列番号１６：IgG結合ペプチド、2F4
配列番号１７：IgG結合ペプチド、2F6
配列番号１８：IgG結合ペプチド、2F7
配列番号１９：IgG結合ペプチド、2F9
配列番号２０：IgG結合ペプチド
配列番号２１：IgG結合ペプチド、2A1Gly
配列番号２２：IgG結合ペプチド、RSS
配列番号２３：IgG結合ペプチド
配列番号２４：IgG結合ペプチド、pep14
配列番号２５：IgG結合ペプチド、pep11
配列番号２６：IgG結合ペプチド、pep21
配列番号２７：IgG結合ペプチド、pep24
配列番号２８：IgG結合ペプチド、pep3
配列番号２９：IgG結合ペプチド、pep9
配列番号３０：IgG結合ペプチド、pep7
配列番号３１：IgG結合ペプチド、pep25
配列番号３２：IgG結合ペプチド、pep27
配列番号３３：IgG結合ペプチド、pep31
配列番号３４：IgG結合ペプチド、pep1
配列番号３５：IgG結合ペプチド、pep2
配列番号３６：IgG結合ペプチド、pep3
配列番号３７：IgG結合ペプチド、pep4
配列番号３８：IgG結合ペプチド、pep5
配列番号３９：IgG結合ペプチド、pep6
配列番号４０：IgG結合ペプチド、pep10
配列番号４１：IgG結合ペプチド、pep12
配列番号４２：IgG結合ペプチド、pep29
配列番号４３：IgG結合ペプチド、pep15
配列番号４４：IgG結合ペプチド、pep16
配列番号４５：IgG結合ペプチド、pep17
配列番号４６：IgG結合ペプチド、pep18
配列番号４７：IgG結合ペプチド、pep19
配列番号４８：IgG結合ペプチド、pep20
配列番号４９：IgG結合ペプチド、pep22
配列番号５０：IgG結合ペプチド、pep23
配列番号５１：IgG結合ペプチド、pep26
配列番号５２：IgG結合ペプチド、pep28
配列番号５３：IgG結合ペプチド、pep29
配列番号５４：IgG結合ペプチド、pep30
配列番号５５：IgG結合ペプチド、pep11_2
配列番号５６：IgG結合ペプチド
配列番号５７：IgG結合ペプチド、p17
配列番号５８：IgG結合ペプチド、p6
配列番号５９：IgG結合ペプチド、p12
配列番号６０：IgG結合ペプチド、p16
配列番号６１：IgG結合ペプチド、p19
配列番号６２：IgG結合ペプチド、p36
配列番号６３：IgG結合ペプチド、p2_2
配列番号６４：IgG結合ペプチド、p4
配列番号６５：IgG結合ペプチド、p5
配列番号６６：IgG結合ペプチド、p13
配列番号６７：IgG結合ペプチド、p14
配列番号６８：IgG結合ペプチド、p15_2
配列番号６９：IgG結合ペプチド、p20
配列番号７０：IgG結合ペプチド、p26
配列番号７１：IgG結合ペプチド、p27
配列番号７２：IgG結合ペプチド、p28
配列番号７３：IgG結合ペプチド
配列番号７４：IgG結合ペプチド、p2
配列番号７５：IgG結合ペプチド、p15
配列番号７６：IgG結合ペプチド、p24
配列番号７７：IgG結合ペプチド、p25
配列番号７８：IgG結合ペプチド、p34
配列番号７９：IgG結合ペプチド、p24_2
配列番号８０：IgG結合ペプチド、p25_2
配列番号８１：IgG結合ペプチド、p31
配列番号８２：チオレドキシン融合タンパク質、H6_trx
配列番号８３：チオレドキシン融合タンパク質、2A1_trx
配列番号８４：チオレドキシン融合タンパク質、2A4_trx
配列番号８５：チオレドキシン融合タンパク質、2F12_trx
配列番号８６：チオレドキシン融合タンパク質、p17_trx
配列番号８７：チオレドキシン融合タンパク質、pep14_trx
配列番号８８：チオレドキシン融合タンパク質、pep21_trx
配列番号８９：チオレドキシン融合タンパク質、pep24_trx
配列番号９０：チオレドキシン融合タンパク質、pep3_trx
配列番号９１：チオレドキシン融合タンパク質、pep9_trx
配列番号９２：チオレドキシン融合タンパク質、pep7_trx
配列番号９３：チオレドキシン融合タンパク質、pep25_trx
配列番号９４：チオレドキシン融合タンパク質、pep27_trx
配列番号９５：チオレドキシン融合タンパク質、pep31_trx
配列番号９６：チオレドキシン融合タンパク質
配列番号９７：チオレドキシン融合タンパク質、p2_trx
配列番号９８：チオレドキシン融合タンパク質、p6_trx
配列番号９９：チオレドキシン融合タンパク質、p12_trx
配列番号１００：チオレドキシン融合タンパク質、p15_trx
配列番号１０１：チオレドキシン融合タンパク質、p16_trx
配列番号１０２：チオレドキシン融合タンパク質、p19_trx
配列番号１０３：チオレドキシン融合タンパク質、p24_trx
配列番号１０４：チオレドキシン融合タンパク質、p25_trx
配列番号１０５：チオレドキシン融合タンパク質、p34_trx
配列番号１０６：チオレドキシン融合タンパク質、p36_trx
配列番号１０７：チオレドキシン融合タンパク質、p2_2_trx
配列番号１０８：チオレドキシン融合タンパク質、p4_trx
配列番号１０９：チオレドキシン融合タンパク質、p5_trx
配列番号１１０：チオレドキシン融合タンパク質、p13_trx
配列番号１１１：チオレドキシン融合タンパク質、p14_trx
配列番号１１２：チオレドキシン融合タンパク質、p15_2_trx
配列番号１１３：チオレドキシン融合タンパク質、p20_trx
配列番号１１４：チオレドキシン融合タンパク質、p24_2_trx
配列番号１１５：チオレドキシン融合タンパク質、p25_2_trx
配列番号１１６：チオレドキシン融合タンパク質、p26_trx
配列番号１１７：チオレドキシン融合タンパク質、p27_trx
配列番号１１８：チオレドキシン融合タンパク質、p28_trx
配列番号１１９：チオレドキシン融合タンパク質、p31_trx
配列番号１２０：オリゴDNA
配列番号１２１：オリゴDNA
配列番号１２２：オリゴDNA
配列番号１２３：オリゴDNA
配列番号１２４：オリゴDNA
配列番号１２５：オリゴDNA
配列番号１２６：オリゴDNA
配列番号１２７：オリゴDNA
配列番号１２８：オリゴDNA
配列番号１２９：オリゴDNA
配列番号１３０：オリゴDNA
配列番号１３１：オリゴDNA
配列番号１３２：オリゴDNA
配列番号１３３：オリゴDNA
配列番号１３４：オリゴDNA
配列番号１３５：オリゴDNA
配列番号１３６：オリゴDNA
配列番号１３７：オリゴDNA
配列番号１３８：オリゴDNA
配列番号１３９：オリゴDNA
配列番号１４０：オリゴDNA
配列番号１４１：オリゴDNA
配列番号１４２：オリゴDNA
配列番号１４３：オリゴDNA
配列番号１４４：オリゴDNA
配列番号１４５：オリゴDNA
配列番号１４６：オリゴDNA
配列番号１４７：オリゴDNA
配列番号１４８：オリゴDNA
配列番号１４９：オリゴDNA
配列番号１５０：オリゴDNA
配列番号１５１：オリゴDNA
配列番号１５２：オリゴDNA
配列番号１５３：オリゴDNA
配列番号１５４：オリゴDNA
配列番号１５５：オリゴDNA
配列番号１５６：オリゴDNA
配列番号１５７：オリゴDNA
配列番号１５８：IgG結合ペプチド、2A1_Q5R
配列番号１５９：IgG結合ペプチド、2A1_W6A
配列番号１６０：IgG結合ペプチド、2A1_S7A
配列番号１６１：IgG結合ペプチド、2A1_R17A
配列番号１６２：IgG結合ペプチド、2A1_S18A
配列番号１６３：IgG結合ペプチド、2A1_S19A
配列番号１６４：IgG結合ペプチド、2A1_I20A
配列番号１６５：IgG結合ペプチド、Fc-III
配列番号１６６：IgG結合ペプチド
配列番号１６７：IgG結合ペプチド
配列番号１６８：IgG結合ペプチドライブラリ
配列番号１６９：グリシンリンカー
配列番号１７０：IgG結合ペプチドライブラリ
配列番号１７１：IgG結合ペプチドライブラリ
配列番号１７２：IgG結合ペプチドライブラリ
配列番号１７３：IgG結合ペプチドライブラリ
配列番号１７４：IgG結合ペプチド、p17_P46A
配列番号１７５：IgG結合ペプチド、p17_D47A
配列番号１７６：IgG結合ペプチド、p17_W48A
配列番号１７７：IgG結合ペプチド、p17_R50A
配列番号１７８：IgG結合ペプチド、p17_M51A
配列番号１７９：オリゴDNA
配列番号１８０：オリゴDNA
配列番号１８１：オリゴDNA
配列番号１８２：オリゴDNA
配列番号１８３：オリゴDNA

Claims (37)

  1. 下記式1：
    　Y-D-P-x-T-G-T-W-R-S-x-[IL]　（配列番号1）　　　（1）
    （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。 [ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）
    で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  2. 配列番号2～6：
    YDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号2）
    YDPGTGTWRSYLRFGGG　(配列番号3）
    YDPYTGTWRSSIWVLSG　(配列番号4）
    YDPGTGTWRSWLSFNVG　(配列番号5）
    YDPWTGTWRSFIWGGGG　(配列番号6）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号2～6のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  4. 配列番号7～9：
    YDPRTGTWLLYASRLLG　(配列番号7）
    YDPVTGTWTSSIASWMG　(配列番号8）
    YDPRTGTWRRSSLSYSG　(配列番号9）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項3に記載のポリペプチド。
  5. 下記式2：
    　R-[QRS]-x-x-[GS]-Y-D-P-R-T-G-T-W-R-S-S-I-A-Y-G-G　（配列番号10）　　　（2）
    （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  6. 配列番号11～14：
    GVVRQWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号11）
    AGSRRAHGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号12）
    ASVRSWSSYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号13）
    SWRRRGSSYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号14）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 配列番号11～14のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  8. 配列番号15～19、及び158～164：
    TGRGRSARYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号15）
    HWVNGRSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号16）
    ERWITWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号17）
    GSVVRWRGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号18）
    GAVYRRSFYDPRTGTWRSSIAYRGG　(配列番号19）
    GVVRRWSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号158）
    GVVRQAQSGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号159）
    GVVRQWAGYDPRTGTWRSSIAYGGG　(配列番号160）
    GVVRQWSGYDPRTGTWASSIAYGGG　(配列番号161）
    GVVRQWSGYDPRTGTWRASIAYGGG　(配列番号162）
    GVVRQWSGYDPRTGTWRSAIAYGGG　(配列番号163）
    GVVRQWSGYDPRTGTWRSSAAYGGG　(配列番号164）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項7に記載のポリペプチド。
  9. 下記式3：
    　G-V-V-R-Q-W-S-G-x-x-x-x-x-x-x-x-R-S-S-I-A-Y-G-G　（配列番号20）　　　（3）
    （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す）
    で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  10. 配列番号21：
    GVVRQWSGGGGSGGGGRSSIAYGGG　（配列番号21）
    で表されるアミノ酸配列からなる、請求項9に記載のポリペプチド。
  11. 配列番号22：
    RSSIAYGGG　（配列番号22）
    で表されるアミノ酸配列からなる、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  12. 下記式4：
    　D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-x-P-D-W-x-x-M
    　（配列番号23）　　　（4）
    （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す）
    で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  13. 配列番号24～54：
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWLYMTTR　(配列番号24）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWRLMQGQ　(配列番号25）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWQTMAQK　(配列番号26）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号27）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWRAMSGR　(配列番号28）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWKWMSTH　(配列番号29）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWKLMQRP　(配列番号30）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWDIMAGH　(配列番号31）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDVMVRQ　(配列番号32）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWERMKQH　(配列番号33）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWSKMRPQ　(配列番号34）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWAVMATP　(配列番号35）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWRMMGVP　(配列番号36）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDYMSSK　(配列番号37）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWMPDWDRMLRR　(配列番号38）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWTPDWNAMSQR　(配列番号39）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWKRMTSR　(配列番号40）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWGRMNSK　(配列番号41）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWNRMRDFNRSFREV　(配列番号42）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWDAMSSR　(配列番号43）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWIPDWTRMQTW　(配列番号44）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWQRMKLH　(配列番号45）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWSQMRPQ　(配列番号46）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWDTMTPR　(配列番号47）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWSVMKSL　(配列番号48）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWVPDWDTMHAAINRSFREV　(配列番号49）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWIPDWRAMSQF　(配列番号50）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWNLMGQH　(配列番号51）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWARMEPM　(配列番号52）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWKPDWQVMSPVSNRSFREV　(配列番号53）
    DAAWHLGELVWATYYDPETGTWQPDWEIMRPF　(配列番号54）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項12に記載のポリペプチド。
  14. 配列番号24～54のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  15. 配列番号55：
    EAWHLGELVWATYYDPETGTWRPDWSRMSGR　(配列番号55）
    で表されるアミノ酸配列からなる、請求項14に記載のポリペプチド。
  16. 下記式5：
    [RSG]-[AGV]-x-Y-D-P-E-T-G-T-W-Y-D-A-A-W-H-L-G-E-L-V-W-A-T-Y-Y-D-P-E-T-G-T-W-E-P-D-W-Q-R-M-L-G-Q　（配列番号56）　　　（5）
    （式中、xは任意のアミノ酸残基を表す。[ ]は[ ]内のアミノ酸残基のいずれか一つを表す。）
    で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、あるいは該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  17. 配列番号57～72：
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号57）
    VISLGSDRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号58）
    IMSVDGSSARYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号59）
    VDLRAHGGAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号60）
    WSRFSSRSVAYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号61）
    GNPSDSASAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号62）
    SNFVRSPSAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号63）
    IPYGFPGRGEYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号64）
    GPYNIPDSAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号65）
    WPLNAPSSAFYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号66）
    VPPRFSSSAQYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号67）
    FLVGLHAGAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号68）
    VVRVDHSSAVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号69）
    WMEFYPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号70）
    DGVGPGSRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号71）
    FVSSLPNSAMYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号72）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項16に記載のポリペプチド。
  18. 配列番号57～72のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が、付加、削除、置換又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  19. 配列番号73～81、及び174～178：
    GRAFSGSRRWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWAPDWRLMQGQ　(配列番号73）
    VMATEVVRGVYDPETGTWYDATWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号74）
    MMVRPPRLGVYDPEPGTWYDATWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号75）
    ERHLVSDYLHYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号76）
    FSDLDSFGVSYDPETGTWYDAAWHRGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号77）
    LFDNKLKHASYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号78）
    GSCKFSSSCHYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号79）
    LIPPGGISPWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRMLGQ　(配列番号80）
    LNDFLTPTAWYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWLPDWQTMAQK　(配列番号81）
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEADWQRMLGQ　(配列番号174）
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPAWQRMLGQ　(配列番号175）
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDAQRMLGQ　(配列番号176）
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQAMLGQ　(配列番号177）
    GPGISAFSPGRGVYDPETGTWYDAAWHLGELVWATYYDPETGTWEPDWQRALGQ　(配列番号178）
    のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項18に記載のポリペプチド。
  20. 請求項1、3、5、7、9、12、14、16、及び18のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端に第２のポリペプチドを伸張した連結型ポリペプチドであって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド。
  21. 配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端に第２のポリペプチドを伸張した連結型ポリペプチドであることを特徴とする、請求項20に記載のポリペプチド。
  22. 請求項1、3、5、7、9、12、14、16、及び18のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端にタンパク質を結合した融合タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すタンパク質。
  23. 配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のいずれかのポリペプチドのアミノ末端あるいはカルボキシル末端あるいは両末端にタンパク質を結合した融合タンパク質であることを特徴とする、請求項22に記載のタンパク質。
  24. 配列番号82～119のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる、請求項22に記載のタンパク質。
  25. 請求項1～24のいずれかに記載のポリペプチドあるいはタンパク質をコードする核酸。
  26. 配列番号120～157、及び179～183のいずれかで表される塩基配列からなる、請求項25に記載の核酸。
  27. 請求項25又は26に記載の核酸を含有する組換えベクター。
  28. 請求項27に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
  29. 請求項25又は26に記載の核酸を含有する組換えファージ又は組換えウイルス。
  30. 請求項1、3、5、7、9、12、14、16、及び18のポリペプチド、請求項20の連結型ポリペプチド、並びに請求項22の融合タンパク質のいずれかに有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方が結合した修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド又はタンパク質。
  31. 配列番号2～9、11～19、21、22、24～55、57～81、158～164、及び174～178のポリペプチド、並びに配列番号82～119の融合タンパク質のいずれかに有機化合物あるいは無機化合物あるいは有機化合物と無機化合物の両方が結合した修飾ポリペプチド又は修飾タンパク質であって、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を示すポリペプチド又はタンパク質。
  32. 請求項1～21のいずれかに記載のポリペプチド、請求項22～24のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項30～31のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化ポリペプチド又は固定化タンパク質。
  33. 請求項1～21のいずれかに記載のポリペプチド、請求項22～24のいずれかに記載のタンパク質、請求項25～26のいずれかに記載の核酸、請求項27に記載の組換えベクター、請求項28に記載の形質転換体、請求項29に記載の組換えファージ又は組換えウイルス、請求項30～31のいずれかに記載のポリペプチド又はタンパク質、及び請求項32に記載の固定化ポリペプチド又は固定化タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つを含む、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を含有するタンパク質を検出、精製、固定化又は除去するためのキット。
  34. 被検試料中の非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を検出するための方法であって、
    (1)　被検試料を、請求項1～21のいずれかに記載のポリペプチド、請求項22～24のいずれかに記載のタンパク質、請求項28に記載の形質転換体、請求項29に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、請求項30～31のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は請求項32に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させる工程、及び
    (2)　被検試料と、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質との間で結合が生じたか否かを判定する工程、
    を含む方法。
  35. 非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を精製するための方法であって、
    (1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を請求項1～21のいずれかに記載のポリペプチド、請求項22～24のいずれかに記載のタンパク質、請求項28に記載の形質転換体、請求項29に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、請求項30～31のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は請求項32に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
    (2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から回収する工程、
    を含む方法。
  36. 非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を除去するための方法であって、
    (1)　非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を含む試料を請求項1～21のいずれかに記載のポリペプチド、請求項22～24のいずれかに記載のタンパク質、請求項28に記載の形質転換体、請求項29に記載の組換えファージ若しくは組換えウイルス、請求項30～31のいずれかに記載のポリペプチド若しくはタンパク質、又は請求項32に記載の固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と接触させて、非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を、ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合させる工程、及び
    (2)　ポリペプチド、タンパク質、形質転換体、組換えファージ若しくは組換えウイルス、又は固定化ポリペプチド若しくは固定化タンパク質と結合した非天然型立体構造を有する抗体、免疫グロブリンGあるいはFc領域含有タンパク質を試料から除去する工程、
    を含む方法。
  37. 還元的環境下において実施される、請求項34～36のいずれかに記載の方法。
     
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